Bài viết tiến hành xác định các nguyên nhân gây bệnh thán thư trên cây cà phê, cũng như xác định được sự đa dạng của các loài nấm Colletrotichum gây bệnh cho cà phê ở tỉnh Sơn La.
Trang 1XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN GÂY BỆNH THÁN THƢ
TRÊN CÀ PHÊ CHÈ TẠI SƠN LA
Morphological and Molecular Identification of Colletotrichum Species
Associated with Anthracnose Disease of Arabica Coffee in Son La Province
Hoàng Văn Thảnh 1* , Nguyễn Văn Tuất 2 , Trịnh Xuân Hoạt 3 và Lê Thị Thảo 1
Ngày nhận bài: 24.7.2018 Ngày chấp nhận: 17.8.2018
Abstract
The research collected 32 isolates of Colletotrichum in coffee trees in Son La province, which included C
siamense accounted for 50%, C theobromicola accounted for 18.75%, C gloeosporiodes accounted for 12.50%,
C fragariae accounted for 12.50% and C acutatum accounted for 6.25% of isolates number When infected on
coffee seedlings and on coffee berries, the disease symptoms were present in all infected Colletotrichum isolates
and symptoms were similar with symptoms in the field The latent period time of disease cause by 32 isolates of
Colletotrichum in coffee seedling was from 15.70-23.33 days The disease latent period time from 13.30 to 16.30
days in green coffee berries without wound, from 8.13-13.30 days in green coffee berries with wound, from 12.07
to 15.53 days on ripe coffee berries without wound, from 8.03-10.27 days on ripe coffee berries with wound The anthracnose severity in coffee seedling stems ranged from 15.00 to 42.50% after 35 days of infection The anthracnose severity in coffee berries with wound tend to be higher than those without wound The anthracnose severity in coffee berries with wound of ripe berries tends to be higher than the green one
Keywords: Arabica coffee, Colletotrichum, Coffee Berry Disease, Gromerella,
1 ĐẶT VẤN ĐỀ *
Chi nấm Colletotrichum giai o n hữu t nh
quan trọng cả trong sản xuất v sau thu ho ch
trên nhi u lo i cây tr ng kh c nhau M t số
lo i thu c nấm Colletotrichum l những lo i a
th c c th gây h i trên nhi u lo i cây ký ch
kh c nhau, Colletotrichum gloeosporioides c
th gây h i trên xo i, bơ, cây c m i v nhi u
cây tr ng kh c [8] m t số lo i nấm
b nh trên trên c phê [Freeman, 2000] Trong
nghiên cứu d a trên kỹ thu t phân t Hyde et
al miêu tả 66 lo i thu c
sinh trên cây tr ng [6] Ở m t số vùng tr ng c
phê thế giới, nấm Colletotrichum spp l
nguyên nhân ch nh gây hi n tư ng rụng quả
ối với cây c phê chè [2] D a v o phân t ch
ặc i m hình th i, ặc i m sinh trưởng s i
nấm, sinh h a v trình t DNA, Prihastuti
1 Trường Đ i học Tây Bắc
2 Vi n Khoa học Nông nghi p Vi t Nam
3 Vi n Bảo v th c v t
Corresponding author: hoangthanhtbu@gmail.com
(2009) ph t hi n ư c lo i nấm C
trên cây c phê ở mi n Bắc Th i Lan [9]; lo i
b nh th n thư trên cây c phê Coffea spp.)
tr ng t i Vi t Nam Nguyễn Thị Hằng Phương
nnk (2010) [8]
Hi n nay, di n t ch tr ng c phê ở t nh Sơn La
t 3 ha, giống Catimor ư c s dụng
tr ng ph biến B nh th n thư l ối tư ng gây
h i nghiêm trọng trên cây c phê t i Sơn La Hằng năm, b nh l m rụng 3 - % số quả, ảnh hưởng lớn ến năng suất v chất lư ng c phê Song cho ến nay, vi c x c ịnh nguyên nhân gây b nh b nh th n thư h i trên cây c phê t i Sơn La ch yếu d a v o tri u chứng b nh trên cây v hình th i c a nấm chưa c những nghiên cứu chuyên sâu X c ịnh ch nh x c nguyên nhân gây b nh th n thư trên cây c phê, c ng như x c ịnh ư c s a d ng c a c c lo i nấm
g p ph n cho công t c quản lý dịch h i theo hướng t ng h p t hi u quả, l cấp thiết v mặt
khoa học v th c tiễn
Trang 22 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thu thập và phân lập mẫu nấm gây
bệnh thán thư trên cây cà phê chè tại Sơn La
Đi u tra, thu th p mẫu b nh th n thư t i 3 khu
v c tr ng c phê ch nh c a Sơn La bao g m
huy n Thu n Châu, huy n Mai Sơn v th nh phố
Sơn La Tiến h nh i u tra 6 vườn
> ha/vườn /huy n, thu th p quả bị
b nh/vườn Thời gian lấy mẫu t th ng -7/2016
Mô tả tri u chứng v ặt ký hi u cho t ng mẫu
thu th p ư c [1] Mỗi mẫu b nh ư c cắt 3 mẩu
nhỏ × mm ph n tiếp gi p giữa mô b nh v mô
khỏe, kh trùng b mặt bằng c ch nh ng c c
mẩu v o dung dịch NaOCl % trong ph t R a
s ch ba l n bằng nước cất kh trùng v ặt
lên giấy thấm vô trùng l m khô Đặt c c mẩu
trên ĩa môi trường nước cất v agar WA ,
trong i u ki n nhi t 8oC Khi nấm ph t
tri n trên b mặt môi trường, cắt s i nấm ở ph n
mép tản nấm v chuy n sang môi trường PGA
Nấm gây b nh ư c nh n di n d a v o ặc
i m c a tản nấm b o t phân sinh S dụng
phương ph p cấy ơn b o t thu ư c c c
mẫu c a nấm thu n [5]
2.2 Đánh giá tính gây bệnh của nấm
Colletotrichum
2.2.1 Đặc điểm gây bệnh của nấm
đoạn cây con
Mỗi mẫu s dụng nh gi t nh gây b nh
bằng phương ph p lây b nh nhân t o Cấy ơn
b o t c a t ng mẫu trên môi trường PGA với
ng y trong i u ki n 8oC với i u ki n giờ
chiếu s ng v giờ tối Tiến h nh chuẩn n ng
b o t t 6 b o t /ml bằng bu ng ếm
h ng c u p dụng công thức c a Duncan v
Torrance (1992) [4] Lây b nh trên thân ư c
th c hi n theo phương ph p c a Wokocha
(2010) [19] Cây con c phê giống Cartimor ư c
tr ng trong t i nilon trong nh lưới, ảm bảo s ch
b nh, tiến h nh lây nhiễm nhân t o khi cây t
số l 6- l /cây Th nghi m ư c bố tr lặp l i 3
l n, cây/mẫu nấm/l n lặp l i Mỗi cây ư c
t o vết thương cơ giới bằng kim ư c kh
trùng ở o n thân giữa c c l Dùng b t lông
nh ng v o cốc chứa dung dịch b o t 6 b o
t /ml v chải nh lên to n b thân cây con Cây lây nhiễm ư c che ph bằng nilon trong 8 giờ
ở i u ki n nhi t 8± oC trước khi lây nhiễm
l n thứ hai theo c ch tương t như mô tả ở trên Sau khi lây nhiễm xong, tiến h nh ph nilon
ảm bảo ẩm >8 % trong v ng 3 ng y, ở i u
ki n nhi t 8± oC, sau bỏ nilon ra v duy trì ẩm >6 % Demelash Teferi, [14] Cây ối chứng ư c lây nhiễm bằng nước cất vô trùng theo c ch tương t Sau khi lây nhiễm, ghi
nh n v nh gi thời gian b nh Sau , ,
3 , 3 ng y lây b nh l n u, tiến h nh ki m tra
nh gi mức gây h i h i theo cấp Waller, 1998) [17]
T nh tỷ l b nh theo công thức
T nh ch số b nh theo công thức
P Trong + P l ch số b nh % + ni l số cây con bị b nh tương ứng ở mỗi cấp b nh
+ vi l số cấp tương ứng;
+ N l t ng số cây con th nghi m;
+ V l cấp b nh cao nhất
2.2.2 Đánh giá đặc điểm gây bệnh của nấm Colletotrichum sp trên quả cà phê chè
B o t nấm c a t ng mẫu i di n cho c c mẫu nấm ư c chuẩn bị theo c ch mô tả ở trên
S dụng quả c phê s ch b nh ph t tri n t
ư c k ch thước g n như tối a với lo i quả xanh v quả ch n ỏ trên cùng cây Quả c phê
th nghi m ư c kh trùng bằng c ch ngâm v o dung dịch NaOCl % trong v ng ph t, r a s ch
3 l n bằng nước cất vô trùng, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng Quả c phê th nghi m ư c giữ tươi bằng c ch quấn bông ẩm vô trùng ở u cuống quả
Quả ư c lây nhiễm theo hai c ch l t o vết thương TVT trên quả bằng c ch s dụng m i kim châm mm v o quả c phê v không t o vết thương KTVT Tiến h nh nhỏ 6 µl dung dịch chứa b o t nấm 6 b o t /ml lên vết châm Quả ối chứng nhỏ 6 µl nước cất lên vết châm Quả lây b nh ặt trong h p nh a kh trùng, ở
Trang 3i u ki n nhi t ph ng th nghi m 8± oC Th
nghi m ư c bố tr 3 l n nhắc l i, quả xanh
hoặc quả ch n/mẫu nấm/l n nhắc Đ nh gi tỷ
l % quả bị nhiễm, vết b nh v ch số b nh %
trong khoảng thời gian - ng y sau lây nhiễm
[15] Phân cấp quả bị b nh theo thang cấp theo
Quy chuẩn Vi t Nam số -38: 2010/BNNPTNT
[10] Sau qu trình lây nhiễm, phân l p nấm ph t
tri n trên cây con v quả bị b nh trên môi trường
PGA phục vụ ki m tra ặc i m hình th i c a
nấm x c ịnh nguyên nhân gây b nh theo chu
trình Koch’s
2.3 Xác định tên loài nấm Colletotrichum
gây bệnh thán thư trên cây cà phê
T ch chiết DNA t ng số theo phương ph p
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide d a
theo t i li u mô tả c a Doyle Doyle [3]
S dụng cặp primer ITS ’-CCT CCG CTT ATT
GAT ATG C-3’ v ITS ’- GAA AGT AAA AGT
CGT AAC AAG G-3’ khuếch i o n gen
vùng ITS Internally Transcribed Spacer với k ch
thước sản phẩm PCR khoảng 6 bp v th c
hi n phản ứng, chu trình PCR d a theo t i li u
mô tả c a White v c ng s [18] Sản
phẩm PCR ư c i n di trên agarose gel % v
chụp ảnh bản i n di bằng GelDoc-IT® 310
Imaging System United Kingdom Sản phẩm
PCR ư c tinh s ch t agarose gel s dụng
QIAquick PCR Purifcation Kit Qiagen, Đức v
giải m trình t bằng m y ABI3 Trình t c c
mẫu ư c so s nh với Ngân h ng Gen bằng
ph n m m tr c tuyến http://blast.ncbi nlm nih
gov/Blast.cgi [11] Cây phả h xây d ng theo
phương ph p Neighbor-joining với khoảng c ch
di truy n giữa c c chuỗi ư c x c ịnh d a trên
mô hình thay thế Kimura hai tham số, gi trị
thống kê bootstrap % với l n lặp l i trong
ph n m m MEGA 6 [13]
2.4 Phương pháp xử lý số liệu
C c số li u ư c ư c phân t ch thống kê bằng s dụng ph n m m MINITAB , Excel
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Triệu chứng bệnh thán thư gây hại trên cây cà phê chè tại Sơn La
B nh xuất hi n v gây h i trên tất cả c c giai o n ph t tri n c a cây v ặc bi t gây h i nặng t khi cây c phê ra hoa ến khi quả ch n hình
Vết bệnh trên lá thường c hình tr n, m u
nâu ến nâu en, mô b nh bị lõm xuống, c
qu ng s ng bên ngo i, trên b mặt vết b nh c những ường tr n ng tâm, ường k nh , -2,5
cm Vết b nh ban u thường xuất hi n ở mép l
v lan d n v o bên trong phiến l
Vết bệnh trên cành thường xuất hi n ở g n
c c ốt c nh t o ra vết m u nâu en hơi lõm xuống, khi bị nặng to n b c nh biến m u nâu
en, trên c nh c c c vết nứt bi u bì chứa c c khối b o t m u v ng nhỏ khoảng mm, l trên
c nh bị b nh c m u v ng v t n lụi d n
Vết bệnh trên quả thường bắt u t vị tr
cuống quả d nh với c nh hay t i i m tiếp x c giữa quả; c c vết b nh ban u rất rõ với c c
ốm nhỏ trên vỏ quả b nh l m cho vỏ quả lõm
v o v trở nên sẫm m u; vết b nh ph t tri n lan
r ng d n ở vỏ quả v ăn sâu v o trong l m quả khô en trên c nh hoặc rụng
Hình 1 Triệu chứng bệnh thán thư gây hại trên lá, cành và quả cà phê chè tại Sơn La
Trang 43.2 Một số đặc điểm hình thái nấm gây
bệnh thán thƣ hại cà phê chè tại Sơn La
Đ phân l p ư c 3 mẫu nấm thu n bằng
phương ph p cấy ơn b o t trên môi trường PGA ở
i u ki n 8oC v tối ho n to n Sau nuôi cấy ng y, tiến h nh o, quan s t ặc i m tản nấm hình
Hình 2 Tản nấm và bảo tử phân sinh nấm Colletotrichum
D a v o ặc i m hình th i, m u sắc tản nấm
v b o t phân sinh, chia c c mẫu nấm
Nhóm I: tản nấm c m u trắng ến trắng nâu,
s i nấm b mặt nhi u v m u trắng; thường xuất
hi n b o t m u v ng xanh, nhỏ li ti, nằm rải r c
trên b mặt môi trường nuôi cấy; b o t phân sinh
hình trụ, thường c m t u tù v m t u nhọn,
nhìn rõ c c giọt dịch; sau ng y nuôi cấy, k ch
thước tản nấm t t 68, -8 ,33 mm, k ch thước
b o t phân sinh 3, 3× ,6 - 8, × , µm
Nhóm II: tản nấm c m u x m ến x m nâu,
s i nấm b mặt nhi u v m u x m trắng; sau
ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t t 68,6
-81,6 mm; b o t phân sinh hình trụ d i, thường
c hai u tù, m t số c u tù v u nhọn, k ch
thước ,86× ,68- 8, × , µm
Nhóm III: tản nấm c m u x m ến en x m,
s i nấm b mặt t v c m u trắng nâu; sau
ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t
,67-8 ,33 mm; b o t hình trụ m t u tù, m t u
nhọn, m t số ở giữa hơi t p l i, k ch thước
,6 × , - , × , 3 µm
Nhóm IV: tản nấm m u phớt h ng s i nấm b
mặt t, ngắn, m u trắng h ng sau ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t 66,6 -77,53 mm;
b o t hình trụ, thường c hai u nhọn, k ch thước , × , - 8, 6× , 8 µm
Nhóm V: tản nấm m u x m ến x m en, s i
nấm mọc th nh c c vùng ki u v ng tr n ng tâm, s i nấm b mặt ngắn v c m u nâu en; sau ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t 79,33-82,00 mm; b o t phân sinh thuôn d i, thường c u tù, m t u nhọn, m t số c hai
u tù, k ch thước , × , 6- , × , µm Đặc i m ph t tri n c a c c mẫu nấm kh c nhau c th do ch ng thu c c c lo i hoặc ch ng
kh c nhau Kết quả n y trùng với nghiên cứu c a James v c ng s , Prihastuti v c ng s , Nguyễn Thị Hằng Phương , MacKenzie v c ng s 8 [7]
3.3 Lây nhiễm nhân tạo trên thân cây cà phê chè giai đoạn cây con
Sau 16- 3 ng y lây nhiễm, cây bi u hi n tri u chứng b nh ban u xuất hi n trên vỏ cây l c c
ốm m u nâu, sau c c vết ốm lan r ng ra bao quanh thân, l m cho vết b nh hơi lõm v o Cây bị b nh nặng c l chuy n m u v ng v dễ
Trang 5bị rụng Tri u chứng n y trùng với tri u chứng
b nh h i trên c nh c phê ngo i ng ru ng Trong khi , cây c phê ở công thức ối chứng không bi u hi n tri u chứng bảng , hình 3
Hình 3 Triệu chứng bệnh thán thƣ trên cây con sau 35 ngày lây nhiễm
Tất cả c c mẫu nấm th nghi m u gây
b nh cho cây c phê Ở i u ki n th nghi m,
thời gian ti m dục c a b nh t ,6 - 3, 3 ng y
trên cây con giai o n 6- l Thời gian ti m dục
phụ thu c nhi u yếu tố trong c khả năng gây
b nh c a c c mẫu nấm kh c nhau mẫu nấm
CBMS c thời gian ti m dục ngắn nhất ,
ng y v d i nhất l mẫu nấm MNTC 8 tới 3, 3
ng y Sau 3 ng y lây nhiễm, tỷ l cây bị b nh
c a c c mẫu t 3,33-66,6 % trong 3 mẫu
nấm c mẫu c khả năng gây b nh cho c c cây th nghi m trên % C c mẫu nấm c khả năng gây b nh cho c phê cao như CBMS v CBMS với tỷ l b nh tương ứng l 63, 66% v 66,6 % v ch số b nh tương ứng l , % v 39,17% Trong i u ki n th nghi m, ch số b nh
th n thư h i trên cây con tăng nhanh t ở sau 20-3 ng y lây nhiễm v mức bị b nh c a cây
c phê c s kh c nhau giữa c c mẫu nấm lây nhiễm bảng
Bảng 1 Kết quả lây bệnh nhân tạo các mẫu nấm Colletotrichum spp lên cây cà phê chè
Mẫu
nấm
Thời
gian
ti m dục
ng y
Tỷ l b nh v ch số b nh %
Trang 6Mẫu
nấm
Thời
gian
ti m dục
ng y
Tỷ l b nh v ch số b nh %
Ghi chú: hời gian tiềm dục được theo dõi, đánh giá hằng ngày sau lây nhi m lần cuối
3.4 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên quả cà
phê chè
Tri u chứng trên quả ư c lây nhiễm c ặc
i m trùng với tri u chứng b nh h i trên quả c
phê ngo i ng ru ng, quả trong công thức ối
chứng không bi u hi n tri u chứng
S xây x t c a quả t o i u ki n thu n l i cho nấm xâm nh p gây h i cho quả c phê Trong trường h p không c vết thương, thời gian
ti m dục c a b nh d i hơn so với trường h p t o vết thương t 3- ng y bảng v 3, hình
Hình 4 Triệu chứng bệnh thán thƣ trên quả cà phê xanh sau lây nhiễm 20 ngày
Trang 7Trên quả c phê xanh c t o vết thương, thời
gian ti m dục c s kh c nhau giữa c c mẫu
nấm, thời gian ti m dục c a MNTC ngắn nhất,
MNTC d i nhất t 8, 3 ng y v 3,3 ng y,
tương ứng Trên quả c phê xanh không t o vết
thương, thời gian ti m dục c a CBMS ngắn
nhất, MNTC d i nhất t 3,3 ng y v 6,3
ng y, tương ứng
Trên quả c phê ch n c t o vết thương, thời
gian ti m dục c a CBMS 3 ngắn nhất t 8, 3
ng y, MNTC8 d i nhất t ,83 ng y Trên quả
c phê ch n không t o vết thương, thời gian ti m
dục c a CBMS ngắn nhất t , ng y,
CBMS v CBMS d i nhất t , 3 ng y
Sau ng y lây nhiễm trên quả c phê xanh
c t o vết thương, tỷ l b nh lây bằng mẫu
MNTC thấp nhất t 3,33%, MNTC v
MNTC8 cao nhất t %; ch số b nh ở c c
mẫu nấm MNTC thấp nhất t ,3 %, MNTC
t cao nhất 38, % Sau ng y lây nhiễm trên
quả c phê xanh c t o vết thương, tỷ l b nh
ư c thấp nhất ở MNTC t 36,6 % v cao nhất ở MNTC8 t 6,6 %, ch số b nh c a CBMS thấp nhấp t 8,8 %, ch số b nh c a CBMS cao nhất t 68, %
Sau ng y lây nhiễm trên quả c phê xanh không t o vết thương, ngo i tr mẫu nấm CBMS v MNTC chưa bi u hi n tri u chứng
b nh, c c mẫu nấm kh c u gây tri u chứng
Tỷ l b nh thấp nhất ở c c mấu nấm CBMS , CBMS 6, MNTC t 6,6 %; tỷ l b nh cao nhất ở mẫu nấm MNTC t %; ch số b nh ở mẫu nấm CBMS 6 l thấp nhất t , % v MNTC cao nhất t , 3%
Sau ng y lây nhiễm trên quả không gây vết thương, tỷ l b nh thấp nhất ở CBMS v CBMS 6
t 6,6 %, tỷ l b nh cao nhất ở CBMS , MNTC6, MNTC v MNTC t 33,33%, ch số
b nh thấp nhất ở CBMS 6 t 3,33%, ch số b nh cao nhất ở CBMS t ,8 % bảng
Bảng 2 Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh thán thƣ (Colletotrichum spp.)
trên quả cà phê xanh sau lây nhiễm
Mẫu nấm
Thời gian ti m
dục ng y
Tỷ l b nh v ch số b nh sau lây nhiễm %
CBMS1 10,13 14,67 30,00 24,07 10,00 1,85 56,67 47,04 23,33 11,48 CBMS2 10,20 14,60 43,33 29,26 10,00 1,85 56,67 50,74 20,00 8,15
CBMS4 9,65 13,74 50,00 30,00 16,67 4,81 70,00 46,30 33,33 14,81 CBMS5 10,23 13,67 16,67 11,48 16,67 2,59 40,00 28,89 30,00 11,48 CBMS6 10,00 13,37 33,33 14,07 16,67 4,81 60,00 33,33 30,00 15,93
CBMS8 9,30 14,67 33,33 20,00 16,67 4,07 56,67 42,59 30,00 12,96 CBMS9 10,07 13,47 26,67 17,04 13,33 3,70 56,67 41,11 26,67 12,59 CBMS10 10,27 14,30 23,33 15,19 13,33 3,70 50,00 36,67 26,67 8,89 CBMS11 10,20 14,47 26,67 14,07 16,67 4,81 60,00 39,26 30,00 10,74 CBMS12 10,07 13,30 33,33 13,33 16,67 3,33 50,00 40,37 20,00 8,15
CBMS14 10,33 14,30 43,33 28,52 13,33 2,96 70,00 67,78 23,33 10,00
MNTC1 10,26 14,70 26,67 10,37 16,67 4,81 53,33 40,74 26,67 12,59 MNTC2 10,62 14,31 36,67 26,30 10,00 1,85 73,33 54,81 20,00 5,93 MNTC3 10,47 14,61 23,33 13,70 13,33 2,96 46,67 34,07 26,67 11,11 MNTC4 10,38 14,31 36,67 19,63 20,00 5,93 66,67 48,89 30,00 12,22 MNTC5 10,41 14,61 43,33 25,56 16,67 3,33 66,67 48,15 26,67 9,63 MNTC6 10,59 14,19 33,33 20,00 16,67 4,81 56,67 45,56 33,33 11,85 MNTC7 10,47 13,57 50,00 38,15 13,33 3,70 60,00 57,04 26,67 12,59
MNTC10 10,57 14,57 20,00 15,56 6,67 1,48 36,67 31,48 30,00 11,48
Trang 8Mẫu nấm
Thời gian ti m
dục ng y ng y sau nhiễm Tỷ l b nh v ch số b nh sau lây nhiễm % ng y sau nhiễm
MNTC11 8,13 13,70 33,33 20,00 13,33 2,96 53,33 42,96 30,00 12,22 MNTC12 10,71 14,91 36,67 18,15 13,33 2,96 56,67 42,59 33,33 12,59 MNTC13 10,56 14,61 40,00 30,37 13,33 2,22 73,33 54,81 26,67 11,11
MNTC15 12,37 14,13 36,67 33,70 10,00 1,85 56,67 46,30 26,67 8,15 MNTC18 10,20 14,47 26,67 14,07 13,33 2,22 46,67 40,00 23,33 8,52
Ghi chú: V – tạo vết thương; K V – không tạo vết thương; LB – ỷ lệ bệnh; CSB – Chỉ số bệnh
Sau ng y lây nhiễm trên quả c phê ch n c
t o vết thương, tri u chứng b nh ư c lây bằng
c c mẫu nấm u c bi u hi n rõ; tỷ l b nh thấp
nhất ở CBMS v MNTC t 6,6 , tỷ l b nh
cao nhất ở CBMS8 t 6,6 %, ch số b nh thấp
nhất ở MNTC t 8,8 %, ch số b nh cao nhất
ở MNTC t ,63% Sau ng y lây nhiễm
trên quả c phê ch n c t o vết thương, tỷ l b nh
thấp nhất ở CBMS t 33,33%, CBMS c tỷ l
b nh cao nhất t 86,6 %, ch số b nh thấp nhất
ở CBMS t , %, ch số b nh cao nhất ở
CBMS t 6 ,8 %
Trên quả c phê ch n không t o vết thương,
sau lây nhiễm ng y tri u chứng b nh chưa xuất hi n ở trên quả lây nhiễm bằng mẫu nấm CBMS15, -, mẫu nấm MNTC c tỷ l b nh thấp nhất t 6,6 %, tỷ l b nh cao nhất ở MNTC t 3 %, MNTC ch số b nh thấp nhất t , %, ch số b nh cao nhất ở MNTC
t 8, % Sau ng y lây nhiễm Trên quả c phê ch n không t o v t thương, tỷ l b nh thấp nhất ở CBMS t 3,33%, tỷ l b nh cao nhất ở MNTC t %, ch số b nh thấp nhất ở CBMS v CBMS t , %, ch số b nh cao nhất ở MNTC t ,8 % bảng 3
Bảng 3 Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh thán thƣ (Colletotrichum spp.)
trên quả cà phê chín sau lây nhiễm (Sơn La, 2017)
Mẫu nấm
Thời gian ti m
CBMS1 10,13 13,37 46,67 25,93 13,33 2,96 86,67 59,26 16,67 6,30
CBMS3 10,17 13,43 43,33 13,70 13,33 2,22 83,33 55,93 20,00 6,67 CBMS4 10,13 13,53 36,67 16,67 13,33 2,22 66,67 45,93 26,67 7,41 CBMS5 10,23 12,67 43,33 16,67 20,00 2,96 76,67 58,89 33,33 10,37 CBMS6 10,07 13,33 33,33 20,00 16,67 3,33 70,00 52,96 36,67 10,37 CBMS7 10,26 14,43 40,00 15,56 20,00 5,19 56,67 37,41 26,67 15,93 CBMS8 9,03 13,43 56,67 29,26 16,67 4,07 83,33 52,22 26,67 10,37 CBMS9 10,00 13,67 26,67 13,33 13,33 2,22 63,33 50,74 30,00 6,67 CBMS10 10,00 12,54 43,33 18,89 20,00 5,19 73,33 51,85 40,00 12,22 CBMS11 10,27 13,26 40,00 18,52 26,67 7,41 43,33 30,74 13,33 22,96 CBMS12 10,03 12,07 33,33 11,11 10,00 2,59 83,33 61,85 20,00 5,19
CBMS14 10,00 12,80 43,33 14,44 20,00 3,70 33,33 24,44 23,33 9,26
CBMS16 10,07 13,33 33,33 12,59 20,00 3,70 56,67 36,67 46,67 10,00 MNTC1 10,20 14,10 46,67 22,96 26,67 6,67 56,67 32,22 40,00 20,00 MNTC2 10,00 13,41 36,67 18,15 26,67 5,93 56,67 30,00 40,00 19,26
MNTC4 10,17 13,26 46,67 18,52 20,00 5,19 80,00 51,85 26,67 14,07
Trang 9Mẫu nấm
Thời gian ti m
MNTC7 10,27 12,67 30,00 11,48 23,33 4,07 50,00 41,11 33,33 7,41 MNTC8 10,83 13,71 43,33 18,15 26,67 6,67 76,67 50,00 40,00 16,30
MNTC10 10,30 12,53 33,33 14,07 20,00 3,70 56,67 44,81 16,67 12,22 MNTC11 9,03 13,53 36,67 10,74 20,00 4,44 76,67 53,70 50,00 5,56 MNTC12 10,50 14,31 53,33 28,15 30,00 8,52 80,00 53,33 33,33 24,81 MNTC13 10,00 14,19 40,00 21,48 10,00 1,85 56,67 39,63 23,33 10,37 MNTC14 10,07 14,57 26,67 8,89 6,67 0,74 56,67 38,89 20,00 11,48 MNTC15 10,23 12,67 36,67 13,70 20,00 4,44 80,00 54,07 26,67 9,63 MNTC18 10,10 14,07 43,33 16,67 20,00 4,44 56,67 43,33 16,67 12,59
Ghi chú: V – tạo vết thương; K V – không tạo vết thương; LB – ỷ lệ bệnh; CSB – Chỉ số bệnh
Ch số b nh ở th nghi m lây nhiễm trên quả
c phê ư c t o vết thương cao hơn so với quả
c phê không t o vết thương Khi quả c phê c
vết thương cơ giới sẽ t o i u ki n thu n l i cho
nấm Colletotrichum sp
Kết quả th nghi m ch ra rằng s xây x t
v c vết thương trên quả l i u ki n thu n l i
nấm Colletotrichum sp xâm nhiễm v gây
b nh trên quả c phê ở c c giai o n ph t tri n
Sau khi nấm xâm nhiễm gây b nh cho quảs
ph t tri n c a ch số b nh trên quả phụ thu c v o
khả năng gây b nh c a c c mẫu nấm
3.4 Xác định loài nấm bằng kỹ thuật PCR
và phân tích cây phả hệ
D a trên hình th i tản nấm v b o t phân
sinh chia c c mẫu th nh nh m, mỗi nh m
lấy % số mẫu nấm 6/3 mẫu tiến h nh
giải trình t gen Mỗi mẫu nấm ư c phân l p
thu n bằng phương ph p cấy ơn b o t v giải
trình t o n ITS bằng cặp primer ITS /ITS Kết
quả phân t ch mẫu nấm gây b nh th n thư trên
cây c phê t i Sơn La x c ịnh ư c lo i
nấm Colletotrichum gây b nh cho c phê ở Sơn
La , trong 6 mẫu nấm c 8 mẫu thu c lo i C
lo i C fragariae chiếm , % v mẫu thu c
C c nghiên cứu nấm Colletotrichum gây b nh
trên cây c phê x c ịnh c c c lo i C asianum,
C siamense, C fructicola, C gloeosporiodes, C
kahawae, C coffaeophilum C coffenum, C
cứu c a Prihastuti , c 3 lo i thu c nấm Colletotrichum gây b nh trên c phê t i m t số
vùng mi n Bắc - Th i Lan, g m c c lo i C
asianum, C siamense, C fructicola Theo Nguyen
et al , x c ịnh ư c c c lo i nấm C
gloeosporiodes, C acutatum, C capsici, C
vùng tr ng c phê ch nh c a Vi t Nam
Hình 9 Phân tích phả hệ mẫu nấm
Colletotrichum phân lập trên cây cà phê chè (Sơn La, 2017)
Trang 104 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
B nh th n thư h i c phê ở Sơn La do c c nấm
C siamense, C theobromicola, C gloeosporiodes,
C fragariae và C acutatum gây ra giải trình t gen
6 mẫu bằng cặp primer ITS /ITS c 8 mẫu
thu c lo i C siamense chiếm %, 3 mẫu thu c
lo i C theobromicola chiếm 8, %, mẫu thu c
lo i C gloeosporiodes chiếm , %, mẫu
thu c lo i C fragariae chiếm , % v mẫu
thu c lo i C acutatum chiếm 6, %
Tất cả c c mẫu nấm u c khả năng gây
b nh cho c phê tri u chứng b nh trên cây th
nghi m giống với tri u chứng b nh ngo i ng
ru ng Thời gian ti m dục c a b nh trên cây con
t ,6 - 3,33 ng y C c mẫu nấm CBMS v
CBMS c khả năng gây b nh cho cây c phê
con cao
Thời gian ti m dục c a b nh t 8, 3 -16,30
ng y trên quả xanh, t 8, 3- , 3 ng y trên quả
ch n Quả bị thương thời gian ti m dục ngắn hơn
cả trên quả xanh v quả ch n S ph t tri n, c a
b nh trên quả c vết thương v quả chin c ng
nhanh hơn quả không bị thương v quả xanh
Tiếp tục nghiên cứu s ph t sinh gây h i c a
b nh th n thư Colletotrichum spp trên cây c
phê chè ngo i ng ru ng t i Sơn L v th
nghi m c c bi n ph p ph ng tr xây d ng
ư c quy trình ph ng tr b nh hi u quả, an to n
Lời cảm ơn
Kết quả l m t ph n n i dung c a t i khoa
học v công ngh cấp B Gi o dục v Đ o t o
“Nghiên cứu c c giải ph p khoa học công ngh
quản lý b nh th n thư h i c phê chè
(Colletotrichum spp t i Sơn La”, m số B
-TTB - 8 do Ho ng Văn Thảnh l m ch trì t i
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 A.S.F, W Gish, W Miller, E.W Myers, D.J
Lipman, 1990 Basic local alignment search too, l J
Mol Biol 215, 403-410
B NN PTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc
gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây
trồng, QCN 01-38: 2010/BNNPTNT
3 C Duncan, L Torrance, 1992 Techniques for
the Rapid Detection of Plant Pathogens, Blackwell
scientific Publishers, London
4 D Teferi, 2014 Status of Released Coffea
Arabica varities for their Resistance to Colletotrichum
kahawae (Coffee Berry Disease) under laboratory
condition, Discourse Journal of Agriculture and Food
Sciences 2, 197-202
5 H Prihastuti, 2009 Characterization of
Colletotrichum species associated with coffee berries
in northern Thailand, online 9 December 2009,
http://www.fungaldiversity.org/fdp/jinds3.php
6 H.J Tode, 1790 Fungi Mecklenbergensis
Selecti
7 J.A.M Bedimo, D Bieysse, I Njiayouom, J
Deumeni, C Cilas, J Nottéghem, Effect of
cultural practices on the development of arabica coffee berry disease, caused by Colletotrichum kahawae,
European Journal of Plant Pathology 119, 391-400
8 J.J Doyle, J.L Doyle, 1990 Isolation of plant
DNA from fresh tissue, Focus, 12, 13-15
9 J.M Waller, B.J Ritchie, M Holderness, 1998
Plant Clinic Handbook IMI Technical Handbooks, CAB
International, Egham 3, 94
10 K.Hy de L Cai, P Cannon, J Crouch, P Crous, U Damm, P Goodwin, H Chen, P Johnston,
E Jones, 2009 Colletotrichum –names in current use,
Fungal Diversity 39, 147-183
11 K Tamura, G Stecher, D Peterson, A Filipski,
S Kumar, 2013 MEGA6: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis version 6.0, Molecular Biology and
Evolution 30, 2725-2729
12 M Abdi, J Abu, 2015 Importance and
Characterization of Coffee Berry Disease (Colletotrichum kahawae) in Borena and Guji Zones,
Southern Ethiopia, Plant Pathology & Microbiology 6
13 N T H Phương, Colletotrichum spp
associated with anthracnose disease on coffee in Vietnam and on some other major tropical crops,
Doctoral Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Alnarp
14 P.P Than, R Jeewon, K.D Hyde, S Pongsupasamit, O Mongkolporn, P.W.J.Taylor,
2008 Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with anthracnose
on chilli (Capsicum spp.) in Thailand, Plant
Pathology 57, 562 - 572
15 R.C Wokocha, N.E Nneke, C.I Umechuraba,
2010 Screening Colletotrchum gloeosporioides F.SP
manihotis isolates for virulence on cassava in Akwa Ibom State of Nigeria, Tropical Agriculture 9 56-63
16 S.Freeman, 2000 Genetic diversity and host
specificity of Colletotrichum species on various fruits,
In D Prusky, S Freeman & M B Dickman (Eds.), Colletotrichum: Host specificity, pathology, and host-pathogen interaction (pp.131–144) St Paul: APS
17 S.J MacKenzie, J.C Mertely, T.E Seijo, N.A
Peres, 2008 Colletotrichum fragariae Is a Pathogen on
Hosts Other Than Strawberry, Plant Dis 92
18 T.J White, T Bruns, S Lee, J Taylor, 1990
Amplication and direct sequencing of fungal ribomsomal RNA genes for phylogenetics, San Diego,
CA, UAS: Academic Press, 315-322
19 T.K Goh, 1999 Single-spore isolation using a
hand-made glass needle, Fungal Diversity, 47-63
Phản biện: TS Đặng Vũ Thị Thanh