Bài viết tiến hành định danh đến loài xạ khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái, đặc tính hóa sinh và trình tự gene vùng 16S-rRNA. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Trang 1sâu bệnh hại rừng trồng” NXB Nông nghi p, H
N i,
7 Nguyễn Viết Tùng, 6 Bảng tra phân loại các
bộ côn trùng (theo pha trưởng thành), NXB Nông
nghi p, H N i
8 Ph m Quang Thu, 6 Danh mục sinh vật gây
hại trên 17 loại cây lâm nghiệp ở Việt Nam NXB Nông
nghi p H N i, 6
Phản biện: PGS.TS Lê Văn Trịnh
ĐỊNH DANH XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM FUSARIUM SOLANI
GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ CÂY CÓ MÖI Identification of Actinomycete as Potential Antagonistic Ability Control Yellow
Leaf and Root Rot Disease on Citrus
Lê Minh Tường, Ngô Thành Trí và Nguyễn Hồng Quí
Nghiên cứu viên ngành Bảo vệ hực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng,
Trường Đại học Cần hơ Ngày nhận bài: 16.07.2018 Ngày chấp nhận: 08.08.2018
Abstract
Three actinomyces isolates that have inhibit growth of Fusarium solani cause yellow leaf and root rot on citrus
are collected and isolated from citrus fields in Long My district, Hau Giang province (LM6 and LM25) and Lai Vung
district, Dong Thap province (LV74) of the Mekong delta in 2017 (Le Minh Tuong et al., 2018) In this research, the
these actinomycete isolates were identified based on morphological characteristics of cultured colony on the ISP mediums and their biochemical characteristics In addition, the these isolates were also identified based on the 16S-rRNA gene sequence The results showed that LM6 and LM25 isolates are straight form of spore-bearing mycelium and spore chains; LV isolate’s spore-bearing mycelium belongs to straight form, spore chains with hooks form; surface spores was smooth with three isolates The colors of substrate of the LM6 isolate belongs to red group, LM25 isolate belongs to light yellow group and LV74 isolate be long to white group The LM6 and LM25 isolates can product melanin pigment, the LV isolate can’t product melanin pigment and all isolates have ability to product extracellular enzymes such as protease, lipase, amylase Comparison of the 16S-rDNA gene sequence with existing
on Gene bank indicated that LM6 isolate showed 99% similarity with Streptomyces capoamus isolate, LM25 isolate showed 100% similarity with Streptomyces bacillaris isolate and LV74 isolate showed 99% similarity with Streptomyces lavendulae isolate The results of this study will be a basis for further researchs, contributing in
applications of actinomycetes as biocontrol to yellow leaf and root rot disease on citrus
Key words: Actinomycete, biochemical characteristics, identification, morphological characteristics
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhằm ph t tri n nông nghi p theo hướng b n
vững v khắc phục những như c i m c a thuốc
h a học, nhi u bi n ph p quản lý dịch h i bằng
bi n ph p sinh học ư c s dụng như k ch th ch
t nh kh ng b nh, s dụng vi sinh v t ối kh ng
Hi n nay, vai tr c a x khuẩn trong vi c ph ng
trị b nh cây tr ng ng y c ng ư c quan tâm
nghiên cứu v ứng dụng nhi u bởi vì những ặc
i m tốt ối kh ng với m m b nh thông qua
nhi u cơ chế như khả năng tiết enzyme ngo i
b o, tiết kh ng sinh, c nh tranh dinh dưỡng,…
v cả k ch th ch sinh trưởng cho cây tr ng
tăng sức kh ng với m m b nh v g p ph n
gia tăng năng suất (Watve et al., 2001) Theo
nghiên cứu c a Lê Minh Tường v cs (2018) phân l p ư c ba ch ng x khuẩn l LM6, LM
v LV c khả năng ối kh ng với nấm F solani
gây b nh v ng l thối rễ trên cây c m i Bên
c nh , 3 ch ng x khuẩn n y c ng c khả năng tiết ra enzyme chitinase v β-glucanase cao, m t ặc t nh quan trọng trong cơ chế ấu tranh sinh học ph ng tr nấm b nh c a x khuẩn
g p ph n tăng hi u quả ối kh ng c a x khuẩn
ối với b nh Tuy nhiên chưa c ịnh danh ến
lo i c a ba ch ng x khuẩn n y Do , mục tiêu
Trang 2c a nghiên cứu n y ịnh danh ến lo i x khuẩn
d a v o ặc i m hình th i, ặc t nh h a sinh v
trình t gene vùng 6S-rRNA
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Ba mẫu x khuẩn LM6, LM v LV dùng
trong nghiên cứu ư c cung cấp bởi B môn
Bảo v th c v t, Trường Đ i học C n Thơ Ba
mẫu x khuẩn n y ư c thu th p v phân l p t
vườn tr ng cây c m i ở t i huy n Long Mỹ, t nh
H u Giang LM6 v LM v huy n Lai Vung,
t nh Đ ng Th p LV
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ
sợi cơ chất và sắc tố tan
Th nghi m ư c tiến h nh theo phương
ph p c a Shirling and Gottlieb (1966) C c ch ng
x khuẩn ư c nuôi cấy trên môi trường ISP
International Streptomyces Project ở i u ki n
nhi t ph ng Ch tiêu ghi nh n l quan s t
m u sắc h s i cơ chất, h s i kh sinh v sắc tố
tan tiết ra ngo i môi trường nuôi cấy ở thời i m
, v ng y sau th nghi m Ghi nh n c c
m u v ng nâu, v ng nâu nh ỏ hoặc da cam,
v ng nâu nh xanh da trời hoặc t m, v ng nâu
lẫn xanh l cây Shirling v Gottlieb, 66
Quan sát cuống sinh bào tử và hình dạng
bề mặt bào tử
Th nghi m ư c tiến h nh theo phương ph p
c a Tresner et al 6 C c ch ng x khuẩn ư c
nuôi cấy trên môi trường MS trong ng y nhân
m t số Chuỗi b o t ư c quan s t dưới k nh hi n
vi quang học x c ịnh d ng chuỗi b o t c a x
khuẩn như sau d ng thẳng, d ng hình m c câu v
d ng xoắn ốc Hình d ng b o t ư c quan s t
dưới k nh hi n vi i n t x c ịnh c c d ng b o
t như sau b o t d ng trơn, b o t d ng gai, b o
t d ng khối u, b o t d ng c lông…
2.2.2 Đặc tính sinh hóa
Khả năng tiết enzym protease của các
chủng xạ khuẩn
Th nghi m ư c th c hi n theo phương
ph p c a Mitra and Chakrabartty C c
ch ng x khuẩn ư c nhân nuôi trên môi trường
MS trong ng y nhân m t số X khuẩn ư c
cấy th nh 3 i m, mỗi i m l m t khoanh giấy
thấm c ường k nh mm c tẩm huy n phù
x khuẩn trên ĩa petri c chứa môi trường Skim
milk agar Sau , tiến h nh o b n k nh v ng
phân giải protein ở thời i m , , 6 v 8 ng y sau th nghi m
Khả năng tiết enzym lipase của các chủng
xạ khuẩn
Th nghi m ư c th c hi n theo phương ph p
c a Ertuğrul et al., (2007) C c ch ng x khuẩn
ư c nhân nuôi trên môi trường MS trong ng y nhân m t số X khuẩn ư c cấy th nh 3 i m, mỗi i m l m t khoanh giấy thấm c ường k nh
mm c tẩm huy n phù x khuẩn trên ĩa petri c
chứa môi trường Tween 8 agar Sau , tiến h nh
o b n k nh v ng phân giải lipid ở thời i m 3, v
ng y sau th nghi m
Khả năng tiết enzym amylase của các chủng xạ khuẩn
Th nghi m ư c th c hi n theo phương
ph p c a Santos X khuẩn ư c nhân nuôi trên môi trường MS trong ng y nhân
m t số X khuẩn ư c cấy th nh 3 i m, mỗi
i m l m t khoanh giấy thấm c ường k nh
mm c tẩm huy n phù x khuẩn trên ĩa petri
c chứa môi trường tinh b t Sau , tiến h nh
o b n k nh v ng phân giải tinh b t ở thời i m , , 6, 8 ng y sau th nghi m
Sự hình thành sắc tố melanin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng
Th nghi m ư c th c hi n theo phương ph p
c a Shirling and Gottlieb (1966 X khuẩn ư c nuôi cấy trên môi trường ISP6 ở nhi t ph ng Sau , quan s t m u c a môi trường ở thời i m , ng y sau th nghi m Nếu sinh sắc tố melanin, thì m u c a môi trường nuôi cấy sẽ chuy n t
m u v ng sang m u nâu cho ến m u en
2.2.3 Định danh đến loài các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân t
T ch chiết DNA c a 3 ch ng x khuẩn ư c
th c hi n theo phương ph p c a Weisburg et al.,
(1991) Cặp m i ư c s dụng khuyếch i o n gen 16S-rRNA c a c c ch ng x khuẩn trong nghiên cứu l R ’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ v ’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ (Weisburg et al., 1991) Th nh ph n phản ứng PCR hỗn h p phản ứng PCR c th t ch µl với th nh
ph n h a chất g m 3,3 µl nước; , µl buffer; MgCl2 µl; dNTPS µl; DMNSO , µl; , µl Taq polymerase; , µl m i F; , µl m i R v
µl DNA c a x khuẩn Phản ứng PCR với chu kì nhi t bắt u bằng giai o n biến t nh DNA ở o
C trong ph t, tiếp theo l 3 chu kỳ lặp l i c a giai
o n biến t nh ở oC trong ph t, giai o n bắt cặp
ở 3oC trong 3 giây v giai o n kéo d i ở o
C trong giây Tiếp theo l giai o n kéo d i trong
ph t ở oC chắc chắn rằng c c s i DNA
Trang 3ư c b sung ho n to n bởi dTNPS Sau sản
phẩm PCR sẽ ư c ưa v o bảo quản ở oC Sản
phẩm PCR ư c i n di trên agarose gel , % Tinh
s ch sản phẩm PCR bằng b QIA quick PCR
Purification Kit c a QIAGEN Mẫu phân t ch ư c
giải trình t t i ph ng th nghi m B nh cây, Khoa
Nông nghi p, trường Đ i học Nông nghi p v Công
ngh Tokyo, Nh t Bản (Giải trình t trên h thống
m y ABI 3 3 XL Phân t ch kết quả bằng ph n
m m sequecing analysis 6 v so s nh với kết quả
trên ngân h ng gen x c ịnh tên c a x khuẩn
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Định danh xạ khuẩn dựa vào đặc điểm
hình thái và đặc điểm sinh hóa
Kết quả v ặc i m nuôi cấy, ặc i m hình th i v ặc i m sinh lý c a 3 ch ng x khuẩn th nghi m ư c trình b y ở bảng 1, hình v hình
Ch ng x khuẩn LM6 c chuỗi b o t d ng thẳng R , cuống sinh b o t d ng thẳng RF v
b mặt b o t c d ng trơn Ch ng LM6 c hình
th nh sắc tố tan trên c c môi trường nuôi cấy v
c khả năng sinh melanin Bên c nh d a v o
c c ặc i m chung c a x khuẩn ư c nghiên cứu trước ây x c ịnh c c ặc i m
nh n d ng x khuẩn v x c ịnh ư c ch ng x khuẩn LM6 thu c Gram dương v c khả năng tiết c c enzyme ngo i b o như protease, amylase v lipase Bảng 2)
Bảng 1 Đặc điểm về hình thái và đặc điểm sinh lý - sinh hóa của ba chủng xạ khuẩn thí nghiệm
Tiết enzym Proteas, lipase, amylase Proteas, lipase, amylase Proteas, lipase, amylase
Ch ng LM c chuỗi b o t d ng thẳng R ,
cuống sinh b o t thu c d ng thẳng RF , b mặt
b o t trơn Ch ng LM c hình th nh sắc tố
tan trên c c môi trường nuôi cấy v c khả năng
sinh melanin Bên c nh d a v o c c ặc i m
chung c a x khuẩn ư c nghiên cứu trước
ây x c ịnh c c ặc i m nh n d ng x khuẩn
v x c ịnh ư c ch ng x khuẩn LM25 thu c
Gram dương v c khả năng tiết c c enzyme
ngo i b o như protease, amylase v lipase
Ch ng x khuẩn LV c chuỗi b o t d ng g n s ng
(F), cuống sinh b o t d ng mốc câu RA v c b mặt b o t trơn Ch ng LV không hình th nh sắc tố tan trên c c môi trường nuôi cấy v không
c khả năng sinh melanin Bên c nh d a v o
c c ặc i m chung c a x khuẩn ư c nghiên cứu trước ây x c ịnh c c ặc i m
nh n d ng x khuẩn v x c ịnh ư c ch ng x khuẩn LM25 thu c Gram dương v c khả năng tiết c c enzyme ngo i b o như protease, amylase v lipase Bảng 2)
Hình 1 Hình dạng chuỗi bào tử dạng thẳng
A ; chuỗi b o t d ng g n s ng B ; cuống sinh b o t d ng mốc câu B v b mặt b o t trơn C
Chuỗi bào tử
Cuống sinh bào tử
Trang 4Hình 2 Khả năng tạo sắc tố melanin
(A) v không t o sắc tố melanin
B trên môi trường nuôi cấy ISP6
c a x khuẩn ở NSKC
Bảng 2 Khả năng tiết enzyme amylase, lipase
và protease của các chủng xạ khuẩn
Nghi m
thức
B n k nh v ng phân giải cơ chất
mm c a 3 ch ng x khuẩn ở
ng y sau khi th nghi m amylase protease lipase
Mức ý
Ghi chú: Các trung bình trong cùng một cột
được theo sau bởi một hay những chữ cái giống
nhau thì khác biệt không có ý ngh a thống kê
trong phép th Duncan (*) khác biệt ở mức ý
ngh a 5
Sau khi tiến h nh so s nh c c ặc i m nuôi
cấy, ặc i m hình th i, sinh lý với kh a phân
lo i x khuẩn c a International Streptomyce
Project Shirling v Gottlieb, ; Pridham et al.,
; Waksman, 6 ta c th xếp 3 ch ng
x khuẩn LM6, LM v LV v o chi
Streptomyces Trong , ch ng LM6 c th l
lo i Streptomyces capoamus, ch ng LM c th
l lo i Streptomyces bacillaris v ch ng LV c
th l lo i Streptomyces lavendulae
Đ c th x c ịnh ch nh x c ến tên lo i c a
c c ch ng x khuẩn trên c n phải kết h p c c
ặc i m phân lo i theo phương ph p truy n
thống với vi c x c ịnh bằng phương ph p sinh
học phân t
3.2 Định danh các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử
Ba ch ng x khuẩn ư c ly tr ch DNA v th c
hi n phản ứng PCR với cặp m i chung F v 1492R (Weisburg et al., 1991)
Hình 3 Sản phẩm PCR được khuếch đại với cặp mồi thuộc vùng 16S-rRNA của 3 chủng xạ khuẩn nghiên cứu
Sản phẩm PCR thu ư c c k ch thước khoảng bp Hình 3 , phù h p với trọng
lư ng phân t c c ch ng x khuẩn thu c lo i Streptomyces
D a v o kết quả bảng 3 cho thấy c c ch ng
x khuẩn th nghi m c mức tương ng t
99 – % khi so s nh với lo i chuẩn d a v o trình t gen vùng 6S rRNA Cụ th l ch ng
LM6 c mức tương ng với lo i Streptomyces
capoamus l %; ch ng LM c mức tương
ng với lo i Streptomyces bacillaris l % v
ch ng LV c mức tương ng với lo i lo i
Streptomyces lavendulae l % Theo kết quả nghiên cứu c a Lê Minh Tường
v ctv , (2015) x c ịnh ư c ch ng x
khuẩn c tên khoa học l Streptomyces bacillaris
v Streptomyces capoamus l ch ng x khuẩn
c khả năng ph ng trị b nh ch y bìa l l a ở
ng bằng sông C u Long Theo kết quả nghiên cứu c a Dương Thị Ngọc cho thấy ch ng
x khuẩn c khả năng ph ng trị b nh o ôn h i
l a ở ng bằng sông C u Long c tên khoa học
l Streptomyces lavendulae
Trang 5Bảng 3 Kết quả xác định ba mẫu xạ khuẩn dựa trên trình tự vùng 16S-rDNA
Mẫu x
k ch thước trình
t (bp)
Mức tương
ng %
M số c a ch ng tương ng trên GenBank
4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
- Ba ch ng x khuẩn nghiên cứu thu c lo i
Streptomyces capoamus , lo i Streptomyces
bacillaris, v lo i Streptomyces lavendulae
- Đ nghị nh gi khả năng ph ng trị b nh
v ng l thối rễ cây c m i c a 3 ch ng x khuẩn
trên ở i u ki n ngo i ng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Dương Thị Ngọc, 2014 Định danh c c ch ng
x khuẩn c tri n vọng trong quản lý m t số b nh h i
l a Lu n văn tốt nghi p th c sĩ ng nh Bảo v Th c
v t Trường Đại học Cần hơ
2 Ertuğrul, S , G Dönmez and S Takaç
Isolation of lipase producing Bacillus sp from olive mill
wastewater and improving its enzyme activity Journal
of Hazardous Materials, 149(3): 720-724
3 Lê Minh Tường, Lý Văn Giang, Ph m Tuấn
V 2015 Định danh x khuẩn c tri n vọng trong
ph ng trị b nh ch y bìa l h i l a T p ch Khoa học
Trường Đ i học C n Thơ 1 Tr 46-52
4 Lê Minh Tường, Nguyễn Ngọc Sơn, Lê Thị
Ngọc Xuân v Nguyễn Trường Sơn 8 Khả năng
ối kh ng c a c c ch ng x khuẩn ối với nấm
Fusarium solani gây b nh v ng l thối rễ trên cây c
m i T p ch Bảo v th c v t, 3 tr 6-32
5 Mitra, P., and P Chakrabartty (2005) An
extracellular protease with depilation activity from
Streptomyces nogalator Journal of Scientific and
Industrial Research, 64(12): 978
6 Pridham, T G., Hesseltin, C W., and Benedict,
R G (1970) A guide for the classification of streptomycetes according to selected groups
Placement of strains in morphological sections App Microbiol 6: 52
7 Santos, É R D , Z N S Teles, N M Campos, D.A.J.D Souza, A.S.D.R Bispo and R.P.D Nascimento, Production of α-amylase from
Streptomyces sp SLBA-08 strain using agro-industrial by-products Brazilian Archives of Biology and Technology, 55(5): 793-800
8 Shirling, E.T and D Gottlieb (1966) Methods for characterization of Streptomyces species
International journal of systematic bacteriology, 16(3):
313-340
9 Shirling, E.T and Gottlieb, D., 1972 Cooperative description of type strains of
Streptomyces V Additional descriptions International Journal of Systematic Bacteriology, 22(4): 265-394
10 Waksman, S.A, 1961 The Actinomycetes: Classification, identification and descriptions of genera and species The Williams & Wilkins Co.,
Baltimore, 2, USA
11 Watve, M.G., R Tickoo, M.M Jog and B.D Bhole, 2001 How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces? Archives of microbiology, 176(5): 386-390
12 Weisburg, W.G., S.M Barns, D.A Pelletier, and D.J Lane, 1991 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study Journal of bacteriology,173(2),697-703
Phản biện: TS Nguyễn Đức Huy