Tại Nghệ An, các nghiên cứu bước đầu về bệnh đốm nâu chanh leo đã xác định nguyên nhân gây bệnh là do nấm Alternaria. Nghiên cứu trình bày trong bài báo này cung cấp thông tin khoa học nhằm xác định chính xác tới mức loài của nấm gây bệnh dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái và trình tự DNA mã hóa vùng Internal Transcribed Spacer (ITS). Vùng ITS hiện được coi là mã vạch phân tử (barcode) phổ biến và quan trọng nhất của nấm (Schoch et al., 2012) và cũng đã được sử dụng để xác định nấm Alternaria (Sanka et al., 2012; Singh et al., 2018).
Trang 1ĐỊNH DANH LOÀI Alternaria sesami GÂY BỆNH
ĐỐM NÂU CHANH LEO TẠI NGHỆ AN
The Identification of Alternaria sesami Causing Brown Spot Disease
of Passion Fruit in Nghe An
Võ Thị Dung 1 , Hà Viết Cường 2 , Hà Minh Thanh 3 và Đỗ Duy Hưng 3
Ngày nhận bài: 15.3.2019 Ngày chấp nhận:16.7.2019
Abstract
Brown spot is a dangerous and common disease of passion fruit in Nghe An The disease has been known to
be caused by several Alternaria species worldwide The major aim of this study is to identify the identity of Alternaria species causing the brown spot diseaseof passion fruit in Nghe An The Alternaria isolates were
isolated from brown spot lesions and cultured on nutrient media The morphological characteristics and
sporulation manner of the Alternaria isolates were evaluated The Internal Transcribed Spacer (ITS) gene of 11 Alternaria isolates collected from Nghe An (7 isolates), Quang Binh (1 isolate), Thanh Hoa (1 isolate), Ha Tinh (1
isolate) and Hoa Binh (1 isolate) were sequenced directly from the PCR amplicons Sequence analysesshowed
that the ITS sequences of the 11 Alternaria isolates were identical with each other and with those of 3 Alternaria species, A sesami, A ricini and A acalyphicola, of the Section Porri Phylogenetic analysis showed the 11 Alternaria isolates, A sesami, A ricini and A acalyphicola formed a separate cluster on the ITS tree In the ITS2 region, 11 Alternaria isolates, A sesami, A ricini and A acalyphicola contain 1 nucleotide (G) distinct from 60 remaining Alternaria species of this Section The conidia of the Alternaria species causing the brown spot disease
were smooth wall and produced singly on conidiophores, meaning that the sporulation manner and conidial
morphology of the Alternaria causing brown spot are similar with those of A sesami but distinct with those of A ricini and A acalyphicola In combination with the result of inoculation on sesame plant conducted previously, the Alternaria species causing brown spot disease of passion fruit in Nghe An is identified as A sesami
Keywords: Alternaria sesami, Internal Transcribed Spacer (ITS), Nghe An, Passion fruit, sporulation
1 ĐẶT VẤN ĐỀ *
Chanh leo là cây trồng có giá trị kinh tế cao,
đang được trồng nhiều tại Việt Nam và ở Nghệ
An, chanh leo là loại cây đã được đưa vào danh
sách cơ cấu cây trồng Tuy nhiên hiện nay,
người trồng chanh leo đang gặp nhiều khó khăn
trong sản xuất do bệnh hại tấn công, trong đó có
bệnh đốm nâu, một trong những bệnh nghiêm
trọng nhất tại Nghệ An Bệnh gây hại trên lá làm
giảm khă năng quang hợp của cây, trên quả làm
hư hại vỏ quả, giảm chất lượng thương phẩm của
quả, ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế
Trên thế giới bệnh đốm nâu chanh leo đã
được xác định do ít nhất 9 loài Alternaria gây ra
gồm A passiflorae, A alternata, A macrospora,
A aliena, A aragakii, A hawaiiensis,
1 Trường Đại học Kinh tế Nghệ An
2 Học viện Nông nghiệp Việt Nam
3 Viện Bảo vệ thực vật
A tenuissima, A tropica, A guangxinesis,
A bannaensis và A tomato (Holliday, 1995;
Chen& Zhang, 1997; Ploetz, 2003; Simmons,
1993; Ram et al., 1977; Fischer& Rezende, 2008) Trong số các loài trên, A passiflorae và
A alternata được xem là 2 loài phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới (Fischer & Rezende, 2008; Joy & Sherin, 2012)
Hiện nay, dựa trên đặc điểm hình thái và
trình tự gen, khoảng 280 loài Alternaria đã được
phân loại và được phân chia vào 27 nhóm loài
gọi là Section (Lawrence et al., 2013, 2016), trong đó Section Porri (từ tên loài đại diện
A porri) là Section lớn nhất với tổng số 63 loài
được ghi nhận (Woudenberg et al., 2014) Các
loài đã công bố gây hại trên chanh leo như
A passiflorae, A macrospora, A aragakii,
A hawaiiensis, A tropica và A tomato thuộc
Section này
Tại Việt Nam, có rất ít nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh đốm nâu chanh leo Gần đây, một
Trang 2nghiên cứu dựa trên đặc điểm hình thái của 71
mẫu nấm Alternaria phân lập trên chanh leo thu
tại Lâm Đồng và Đắk Nông đã xác định nguyên
nhân gây bệnh là nấm A.passiflorae (Phan Thị
Thu Hiền và CS, 2015)
Có thể thấy, tất cả các công bố về nguyên
nhân gây bệnh đốm nâu chanh leo trên thế giới
và Việt Nam ở trên đều dựa trên đặc điểm hình
thái của nấm Giống như đối với nhiều chi nấm
khác, phân loại nấm Alternaria dựa trên đặc điểm
hình thái đã chứng tỏ không chính xác (Lawrence
et al , 2016) Chẳng hạn, loài A hawaiiensis công
bố gây bệnh đốm nâu chanh leo, sau khi phân
tích trình tự gen, đã được phân loại lại là loài
A Passiflorae (Woudenberg et al., 2014)
Tại Nghệ An, các nghiên cứu bước đầu về
bệnh đốm nâu chanh leo đã xác định nguyên
nhân gây bệnh là do nấm Alternaria Nghiên cứu
trình bày trong bài báo này cung cấp thông tin
khoa học nhằm xác định chính xác tới mức loài
của nấm gây bệnh dựa trên phân tích các đặc
điểm hình thái và trình tự DNA mã hóa vùng
Internal Transcribed Spacer (ITS) Vùng ITS hiện
được coi là mã vạch phân tử (barcode) phổ biến
và quan trọng nhất của nấm (Schoch et al., 2012)
và cũng đã được sử dụng để xác định nấm
Alternaria (Sanka et al., 2012; Singh et al., 2018)
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phân lập nấm và đánh giá đặc điểm
hình thái
Mẫu lá, quả chanh leo bị bệnh đốm nâu điển
hình được thu thập và rửa sạch bằng nước vòi
Mẫu được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong
30 giây và được thấm khô trên giấy thấm vô
trùng Các mảnh mô (5 x 5 mm) chứa cả mô
bệnh và mô khỏe được cắt và được đặt trên môi
trường WA (Water Agar) và được ủ ở nhiệt độ
28oC Khi sợi nấm phát triển dài cách mô bệnh
1-2cm, nấm được làm thuần bằng cấy đỉnh sinh
trưởng của sợi nấm sang môi trường PDA
(Potato Dextrose Agar)
Các đặc điểm hình thái của nấm gồm tản
nấm, sợi nấm, cành bào tử phân sinh, bào tử
phân sinh, cách sinh bào tử phân sinh được
quan sát từ các mẫu nấm thuần được nuôi cấy
trên các môi trường dinh dưỡng gồm PDA,
PDA+1%YE (PDA bổ sung 1% Yeast Extract),
PCA (Potato Carrot Agar)
2.2 PCR và giải trình tự
DNA tổng số được chiết từ sợi nấm thuần theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle and Doyle (1987).DNA được hòa trong 50µL đệm TE và bảo quản ở -20°C
Phản ứng PCR được thực hiện với hai mồi
ITS1và ITS4 (White et al., 1990) để nhân vùng
ITS của các mẫu nấm Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 52°C Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết Gel Extraction Kit D2500 (Omega, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự 1 chiều tại Hãng First Base (Singapore)
và Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene)
2.3 Phân tích trình tự
Các trình tự mẫu được xác định danh tính sơ
bộ khi so sánh với các trình tự tại cơ sở dữ liệu MYCOBANK (http://www.mycobank.org/) Căn trình tự đa chuỗi được thực hiện với phần mềm
ClustalX2.1 (Larkin et al., 2007) Cây phả hệ
được xây dựng bằng phần mềm MEGA7.0
(Kumar et al., 2016)
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Đặc điểm hình thái nấm Alternaria gây
bệnh đốm nâu trên chanh leo Nghệ An
Nấm Alternaria trên cây chanh leo chủ yếu gây
hại ở bộ phận lá và quả Trên vết bệnh, nấm hình thành cành bào tử phân sinh riêng rẽ và trên cành hình thành một bào tử phân sinh đơn lẻ có mỏ dài Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo như PDA+1%YE, PCA và PDA, tản nấm tạo các vòng tròn đồng tâm, đều, hơi dày, có màu nâu đậm Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, nấm dễ dàng sinh sản trên bề mặt môi trường (Hình 1A) Cành bào tử phân sinh mọc trực tiếp từ sợi nấm
và vuông góc với sợi nấm, dạng đơn lẻ, có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh Cành bào
tử phân đa bào, kích thước 80 X 3-5 μm, có màu nâu đến nâu đậm.Bào tử phân sinh non và trưởng thành thường có hình elip, kích thước (49
- 102) X (12 - 24) µm Bào tử trưởng thành nhẵn, màu đậm, có 6 - 10 vách ngăn ngang, 0 - 3 vách
Trang 3ngăn dọc, vách ngăn dọc đầu tiên xuất hiện ở vị
trí ngăn thứ 2 - 3 của bào tử và các vách ngăn
dọc khác ở vị trí có đường kính bào tử lớn hơn
so với các vị trí khác Bào tử phân sinh có mỏ
kéo dài theo thời gian sinh trưởng của bào tử,
kích thước 186 - 390 X 2,5 μm) Bào tử phân
sinh mọc đơn lẻ từ đỉnh cành bào tử phân sinh
(Hình 1)
Hình 1 Đặc điểm hình thái nấm Alternaria gây
bệnh đốm nâu chanh leo tại Nghệ An (A, B),
trong đó: A: Cách sinh bào tử của nấm trên
bề mặt môi trường PDA; B: cành bào tử phân
sinh và bào tử phân sinh hình thành từ sợi
nấm nuôi cấy trên môi trường PDA Bào tử
phân và cành bào tử phân sinh loài A sesami
(C) theo Simmons, 2004
3.2 Kết quả giải trình tự vùng ITS và tìm
kiếm chuỗi tương đồng trên Genbank
Vùng ITS của 11 mẫu nấm Alternaria phân
lập từ vết bệnh đốm nâu trên cây chanh leo tím
thu thập từ Nghệ An (7 mẫu), Hà Tĩnh (1 mẫu),
Quảng Bình (1 mẫu), Thanh Hóa (1 mẫu) và Hòa Bình (1 mẫu) đã được nhân bằng PCR và giải trình tự trực tiếp 1 chiều bằng mồi PCR Sau khi loại bỏ các trình tự nhiễu ở 2 đầu, bốn mẫu
Alternaria thu tại Nghệ An, ký hiệu từ NA1 đến NA4, đều có kích thước 518 bp; bảy mẫu còn lại đều có kích thước 532 bp (Bảng 1)
Bảng 1 Nguồn gốc và kết quả giải trình tự
vùng ITS của 11 mẫu nấm Alternaria phân lập
từ vết bệnh đốm nâu chanh leo ở Việt Nam
STT Ký hiệu mẫu
Địa điểm thu mẫu
Kích thước (bp)
Tiếp theo, trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm
Alternaria được căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm Clustal và so sánh trình tự cho thấy chúng đồng nhất 100 % với nhau, chứng tỏ chúng thuộc cùng 1 loài Tuy nhiên, do khác nhau về kích thước nên trình tự của chúng được trình bày cụ thể như sau với phần trùng nhau được đánh dấu:
>Trình tự 4 mẫu NA1, NA2, NA3 và NA4 (518 bp):
TAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGG CACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCTGAATTATTCCACCCGTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTC CTTGGTGGGCTCGCCCACCACAAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGCAATCAGCGTCAG TAACAATGTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGC GCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTG GTGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCGCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCATTGGCAGCC GGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCTAGCATC CAACAAG
>Trình tự 7 mẫu NA5, NA6, NA7, HT1, QB1, TH1 và HB1 (523 bp):
GCGGGCTGGCACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCTGAATTATTCCACCCGTGTCTTTTGCGT ACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGCTCGCCCACCACAAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGC AATCAGCGTCAGTAACAATGTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT
Trang 4GAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCA AGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCGCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCAT TGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCT AGCATCCAACAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA GCATATCAATAAGC
Trình tự của vùng ITS của 11 mẫu nấm
Alternaria ở trên, tiếp theo, được sử dụng để xác
định loài gần gũi từ Cơ sở dữ liệu MYCOBANK
Kết quả tìm kiếm (Bảng 2) cho thấy các loài gần
gũi nhất xác định được gồm A sesami, A ricini
và và A acalyphicola với phần trăm đoạn so
sánh từ 89.9 – 96.9 % và mức đồng nhất trình tự 100% Đáng chú ý, tất cả 3 loài xác định được
đều thuộc Section Porri của chi Alternaria
Bảng 2 Tìm kiếm Cơ sở dữ liệu MYCOBANK xác định loài gần gũi dựa trên trình tự
vùng ITS của các mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo
trình tự (%)
Phần trăm đoạn so sánh (%)
Ghi chú: 1 Chỉ trình bày 10 mẫu gần gũi nhất; 2 là mã mẫu nấm lưu trữ tại CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan)
3.3 So sánh trình tự và phân tích phả hệ
Dựa trên kết quả tìm kiếm loài gần gũi, trình tự
ITS của 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu
chanh leo đã được phân tích với trình tự tương
ứng của tất cả 63 loài Alternaria thuộc Section Porri
được công nhận mới đây nhất (Woudenberget al.,
2014) (Bảng 3) Tổng số 74 trình tự đã được căn
trình tự đa chuỗi, so sánh trình tự và phân tích phả
hệ (Bảng 3, Hình 2, Hình 3)
Kết quả so sánh trình tự cho thấy tất cả 11
mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo đều
đồng nhất trình tự 100% với nhau So sánh cũng
cho thấy các mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu
chanh leo có mức đồng nhất trình tự 100 % với 3
loài A sesami, A ricini và A acalyphicola Đáng
chú ý, so sánh trình tự cho thấy các mẫu nấm
Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo trong nghiên cứu này chỉ có mức đồng nhất trình tự
98,0 % với loài A passiflorae (Bảng 3)
Bảng 3 So sánh trình tự vùng ITS của 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo
với các loài Alternaria thuộc Section Porri1
GenBank
Mức đồng nhất trình
tự (%)
Trang 5TT Loài Ký chủ Quốc Gia Mã
GenBank
Mức đồng nhất trình
tự (%)
tetragonoloba
14 A venezuelensis Phaseolus vulgaris Venezuela KJ718263 99,1
17 A novae-guineensis Citrus sp Papua New
Guinea
KJ718202 98,9
25 A tillandsiae Tillandsia usneoides New Zealand KJ718260 98,7
28 A catananches Catananche caerulea Hà Lan KJ718139 98,0
36 A paralinicola Linum usitatissimum Canada KJ718206 98,0
40 A scorzonerae Scorzonera hispanica Hà Lan KJ718191 98,0
44 A alternariacida Solanum lycopersicum Anh KJ718105 97,8
46 A carthamicola Carthamus tinctorius Iraq KJ718134 97.8
48 Alternaria cirsinoxia Cirsium arvense Canada KJ718143 97.8
50 Alternaria solani-nigri Cyphomandra betacea New Zealand KJ718242 97.8
Trang 6TT Loài Ký chủ Quốc Gia Mã
GenBank
Mức đồng nhất trình
tự (%)
51 Alternaria argyroxiphii Argyroxiphium sp Mỹ KJ718112 97.6
52 Alternaria calendulae Calendula officinalis Đức KJ718127 97.6
53 Alternaria pipionipisi Cajanus cajan Ấn Độ KJ718214 97.6
55 Alternaria bataticola Ipomoea batatas Nhật Bản KJ718117 97.2
57 Alternaria echinaceae Echinacea sp New Zealand KJ718170 97.2
58 Alternaria ipomoeae Ipomoea batatas Ethiopia KJ718175 97.2
59 Alternaria neoipomoeae Ipomoea batatas Nam Phi KJ718198 97.2
60 Alternaria pseudorostrata Euphorbia pulcherrima Mỹ JN383483 97.2
61 Alternaria conidiophora Datura stramonium Síp KJ718145 96.9
62 Alternaria agripestis Euphorbia esula Canada KJ718099 87.3
63 Alternaria anagallidis Anagallis arvensis New Zealand KJ718108 86.4
1Tất cả 63 loài được phân loại mới nhất theo Woudenberg et al.(2014)
Trên vùng ITS của nấm có 2 vùng phụ được
ký hiệu là ITS1 và ITS2, có mức độ biến động
cao (tiến hóa trung tính) nên được xem là 2 vùng
chủ chốt để phân loại nấm (Blaalidet al., 2013;
Yang et al., 2018) So sánh trình tự ITS cho thấy
11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo
và 3 loài A sesami, A ricini và A acalyphicola có
một nucleotide khác biệt so với tất cả 60 loài
Alternaria còn lại của Section Porri Nucleotide
khác biệt này là G, nằm ở vùng ITS2 (Hình 2)
Hình 2 Đoạn trình tự thuộc vùng ITS2 chứa 1 nucleotide (G, đƣợc đánh dấu bằng hình tam
giác) của A sesami, A ricini và A acalyphicola và 11 mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo tại Nghệ An khác biệt duy nhất so với 60 loài Alternaria còn lại của Section Porri
Trang 7Tương tự như kết quả so sánh trình tự, phân
tích phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự ITS cho
thấy tất cả 11 mâu nấm Alternaria gây bệnh đốm
nâu chanh leo và 3 loài A.sesami, A ricini và A
acalyphicola cũng phân nhóm thành một cụm với
nhau, độc lập với các loài Alternaria khác của Section Porri (Hình 3)
Hình 3 Phân tích phả hệ dựa trên toàn bộ trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm
Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leovà tất cả 63 loài Alternaria
thuộc Section Porri theo Woudenberg et al (2014)
Trang 8Nguồn gốc các loài này được trình bày ở
Bảng 3 Cây được xây dựng bằng phần mềm
MEGA7 theo phương pháp Neighbor-Joining
với khoảng cách di truyền được xác định dùng
mô hình thay thế chuỗi Jukes - Cantor Giá trị
ởcác nốt là giá trị thống kê bootstrap dưới
dạng % (1.000 lần lặp) và chỉ trình bày các
giá trị > 50% Thanh bar trình bày khoảng
cách di truyền
3.4 So sánh loài Alternaria gây bệnh đốm
nâu chanh leo với A sesami, A ricini và
A acalyphicola
Dựa trên đặc điểm hình thái, so sánh trình tự
cũng như tìm kiếm loài gần gũi từ cơ sở dữ liệu
MYCOBANK, nơi lưu giữ thông tin các mẫu nấm
đã được thẩm định, tất cả 11 mẫu nấm Alternaria
gây bệnh đốm nâu chanh leo tại Việt Nam thuộc
cùng một loài thuộc Section Porri của chi
Alternaria
Dựa trên so sánh trình tự cũng như phân tích
phả hệ gen ITS,các mẫu nấm Alternaria gây
bệnh trên chanh leo có thể phân biệt được với 60
loài Alternaria thuộc Section Porri nhưng không
thể phân biệt được với 3 loài còn lại của Section
nàylà A.sesami, A ricini và A acalyphicola Các
nghiên cứu phân loại phân tử gần đây về chi
Alternaria cũng cho thấy gen ITS không đủ để
phân loại tới mức loài đối với các loài có quan hệ
gần gũi (Lawrenceet al., 2013, 2016) Chính vì
vậy, một phân tích bổ sung dựa trên đặc điểm
hình thái và sinh học của các mẫu nấm Alternaria
trong nghiên cứu này với 3 loài kể trên đã được
thực hiện (Bảng 4)
Kết quả so sánh cho thấy loài Alternaria gây
bệnh đốm nâu chanh leo và 3 loài A.sesami, A
ricini và A acalyphicola chia sẻ nhiều đặc điểm
hình tháigiống nhau liên quan đến cành bào tử
phân sinh và đặc biệt là bào tử phân sinh cũng
như khả năng sinh bào tử trên môi trường nhân
tạo (Bảng 4)
Về khả năng sinh bào tử trên môi trường
nhân tạo, cả 4 loài đều sinh sản vô tính dễ dàng,
tạo nhiều cành bào tử phân sinh và bào tử phân
sinh trên môi trường nuôi cấy nhân tạo Đặc
điểm này khá quan trọng vì nhiều loài, chủng
nấmkể cả Alternaria yêu cầu các điều kiện dinh
dưỡng hoặc vật lý đặc biệt để sinh sản trên môi
trường nhân tạo (Su et al., 2012; Rodrigueset al., 2010; Chaurasiaet al., 1998)
Nhìn chung, phân loại các loài Alternaria dựa
chỉ trên đặc điểm hình thái tương đối khó vì hình thái của chúng có thể thay đổi theo điều kiện nuôi cấy (Woudenberg, 2015).Tuy nhiên, so sánh các
đặc điểm hình thái cho thấy loài Alternaria gây
bệnh đốm nâu chanh leo có 2 đặc điểm giống với
loài A sesami (Hình 1) và khác với loài A ricini
và A acalyphicola là cách sinh bào tử phân sinh
và bề mặt bào tử phân sinh Bào tử phân sinh
của loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo
và A sesami chỉ hình thành riêng lẻ từ đỉnh cành
bào tử phân sinh, trong khi bào tử phân sinh của
A ricini và A acalyphicola có thể mọc thành
chuỗi 2 bào tử, mặc dù hiếm (Bảng 4, Simmons, 2007) Bề mặt bào tử phân sinh non và trưởng
thành của loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo và A sesami nhẵn trong khi của A
ricini và A acalyphicola không nhẵn (Bảng 3,
Simmons, 2004, 2007) Cũng cần chú ý rằng, bề
mặt nhẵn hay không nhẵn của Alternaria là đặc
điểm khá ổn định, không bị ảnh hưởng bởi điều kiện muôi cấy (Simmons, 2007)
Một đặc điểm sinh học rất hữu ích giúp định
danh loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo
là tính gây bệnh trên cây ký chủ Cho tới nay,
mỗi loài A ricini, A acalyphicola và A sesami
được công bố chỉ gây bệnh trên một cây ký chủ,
lần lượt là cây thầu dầu (Ricinus communis), cây tai tượng xanh (Acalypha indica) và cây vừng (Sesamum indicum) (Woudenberget al., 2014) Chính vì vậy, tính gây bệnh của loài Alternaria
gây bệnh đốm nâu chanh leo Nghệ An cũng đã được đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo trên một
số cây ký chủ và kết quả lây nhiễm (không trình
bày trong bài báo này) cho thấy loài Alternaria
này có thể gây bệnh trên cây vừng
Dựa trên phân tích đặc điểm hình thái, trình
tự vùng gen ITS và tính gây bệnh trên cây vừng,
chúng tôi kết luận loài Alternaria gây bệnh đốm nâu trên chanh leo là loài A.sesami và 11 trình tự
ITS đã được gửi Genbank với danh tính của loài này Như vậy, nghiên cứu này đã (i) lần đầu tiên
phát hiện thấy loài A sesami tại Việt Nam, (ii) phát hiện thêm một ký chủ thứ 2 của A sesami là
cây chanh leo và (iii) phát hiện thêm một loài
Alternaria gây bệnh trên chanh leo
Trang 9Bảng 4 Đặc điểm hình thái và sinh học của loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo và 3 loài Alternaria thuộc Section Porricó mức đồng nhất trình tự 100 % trên gen ITS
Đặc điểm Chỉ tiêu/ đơn vị
A.sesami
(Simmons,
2004)
A acalyphicola
(Simmons,
2007)
A ricini
(Simmons,
2007)
Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo
Nghệ An
Hình thành cành
bào tử phân sinh
và bào tử phân
sinh trên môi
trường nhân tạo
Cành bào tử
phân sinh
Cách mọc
Mọc trực tiếp
từ sợi, ít khi phân nhánh, phình to ở đỉnh
Hình thành như nhánh hoặc đỉnh sợi nấm
Hình thành như nhánh hoặc đỉnh sợi nấm
Cành bào tử mọc trực tiếp
và vuông góc với sợi nấm, Kích thước
(µm)
(60-225) x (5.0-6.5)
(50-100) x (5.0-6.0)
(50-150) x (5-6.0) 80 x (3-5.0) Cách sinh bào
tử phân sinh trên
cành bào tử
phân sinh
Mọc đơn lẻ
Chủ yếu mọc đơn lẻ, đôi khi mọc thành chuỗi
2 bào tử
Chủ yếu mọc đơn lẻ, đôi khi mọc thành chuỗi
2 bào tử
Mọc đơn lẻ
Thân bào tử
phân sinh
Hình dạng
Bào tử non hình elip hẹp, thót nhọn về đỉnh Bào tử trưởng thành hình trứng hẹp
Bào tử non hình elip, trứng hẹp
Bào tử trưởng thành hình elip, trứng rộng
Bào tử non hình trứng hẹp, thót nhọn về đỉnh
Bào tử trưởng thành hình trứng, elip, trứng ngược dài
Bào tử non hình elip hẹp, thót nhọn về đỉnh Bào tử trưởng thành hình trứng hẹp
Chiều dài
Chiều rộng
Số vách
Số vách
Mỏ bào tử
phân sinh
Chiều dài
Phần lớn có mỏ nhắn; nếu có,
mỏ có thể dài 75-125
186 – 390
Chiều rộng
* Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo không trình bày trong nghiên cứu này
Trang 104 KẾT LUẬN
Phân tích đặc điểm hình thái, trình tự vùng
gen ITS, kết hợp với đánh giá tính gây bệnh trên
cây ký chủ được thực hiện từ trước cho thấy loài
Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo thu thập
tại Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Hòa Bình là
loài A.sesami
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Blaalid R., Kumar S., R H Nilsson, Abarenkov,
K., Kirk, P M., & Kauserud, H., 2013 ITS 1 versus ITS
2 as DNA metabarcodes for fungi, Molecular ecology
resources, 13(2): 218-224
2 Chaurasia S., Chand R & Joshi A K.,
1998 A simple technique for the induction of
sporulation in Alternaria triticina incitant of leaf
blight of wheat, Journal of Plant Diseases and
Protection, 17-21
3 Chen W Q., & Zhang T Y., 1997 Two new
species of Alternaria from China, Mycological
Research, 101(10): 1257-1258
4 Doyle J J & Doyle J L., 1987 A rapid DNA
isolation procedure for small quantities of fresh leaf
tissue, Phytochem Bull., 19, 11-15
5 Fischer I H., & Rezende J A., 2008 Diseases
of passion flower (Passiflora spp.), Pest technology,
2(1): 1-19
6 Joy P P & Sherin C G., 2012 Diseases of
Passion fruit (Passiflora edulis): Pathogen, Symptoms,
Infection, Spread & Management, Technical Report,
Kerala Agricultural University
7 Kumar S., Stecher G., & Tamura K., 2016
MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis
version 7.0 for bigger datasets, Molecular Biology and
Evolution, 33(7): 1870-1874
8 Larkin M A., Blackshields G., Brown N.,
Chenna R., McGettigan P A., McWilliam H.,
Valentin F., Wallace I M., Wilm A., and Lopez R.,
2007 Clustal W and Clustal X version 2.0,
Bioinformatics, 23: 2947-2948
9 Lawrence D P., Gannibal P B., Peever T L., &
Pryor B M., 2013 The sections of Alternaria:
formalizing species-group concepts, Mycologia,
105(3): 530-546
10 Lawrence D P., Rotondo F., & Gannibal P B.,
2016 Biodiversity and taxonomy of the pleomorphic
genus Alternaria, Mycological Progress, 15(1): 3
11 Phan Thị Thu Hiền, Đặng Thị Hạnh, Huỳnh
Tiến Đông, Lê Đình Đôn, 2015 Nghiên cứu nấm
Alternaria passiflorae gây bệnh đốm nâu trên cây
chanh dây (Passiflora edulis), Tạp chí Bảo vệ Thực vật, Số 6: 17-23
12 Ploetz R C (Ed.), 2003 Diseases of tropical fruit crops, CABI
13 Ram B., Naidu R., & Singh H P., 1977 Alternaria macrospora Zimm a new record on passion
fruit (Passiflora edulis Sims.) from India, Current Science, 46(5):165
14 Rodrigues T T., Maffia L A., Dhingra O D., & Mizubuti E S., 2010 In vitro production of conidia of
Alternaria solani, Tropical Plant Pathology, 35(4):
203-212
15 Sankar N R., Devamma M N., & Giridhar D.,
2012 First report of Alternaria alternata causing leaf
spot on Rumex vesicarius in India, Australasian Plant Disease Notes, 7(1), 17-18
16 Schoch C L., Seifert K A., Huhndorf S., Robert V., Spouge J L., Levesque C A &Chen W., 2012 Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi,
Proceedings of the National Academy of Sciences,
109(16): 6241-6246
17 Simmons E G., 2004 Novel dematiaceous
hyphomycetes, Studies in Mycology, 50(1): l9-218
18 Simmons E G., 2007 Alternaria: An Indentification Manual (No PA 632.488 S56.)
19 Simmons E G., & Roberts R G., 1993
Alternaria themes and variations (73), Mycotaxon, 48,
109-140
20 Singh N K., Patel D B., Chaudhari S R., Morad B G., Rabari S M., Chattopadhyay A., & Tetarwal M L., 2018 Morphometric and internally transcribed spacer gene sequence-based
characterization of Alternaria burnsii, Current Science,
114(9): 1927
21 Su Y Y., Qi Y L., & Cai L., 2012 Induction of
sporulation in plant pathogenic fungi, Mycology, 3(3),
195-200
22 Woudenberg J H., 2015 Restyling Alternaria,
PhD thesis, Wageningen University
23 Woudenberg J H C., Truter M., Groenewald J Z., & Crous P W., 2014 Large-spored Alternaria
pathogens in section Porri disentangled, Studies in Mycology, 79: 1-47
24 White T J., Bruns T., Lee S J W T., & Taylor
J L., 1990 Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, PCR Protocols: A guide to Methods and Applications 18(1):
315-322