Tình hình nhiễm human papilloma virus (HPV) trên bệnh nhân đến khám phụ khoa tại bệnh viện da liễu hà nội (12008 102008)

Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung PAP Smear ngày càng được cải tiến và ngày nay vẫn là một phương pháp sàng lọc ung thư cổ tử cung có hiệu quả.Tại các nước phát triển, xét nghiệm được coi

ĐẶT VẤN ĐỀ Human Papilloma Virus (HPV) là một loại virus gây nên nhiều bệnh

cảnh lâm sàng trên da và niêm mạc [67] Trong các nhiễm trùng lây truyềnqua đường tình dục, nhiễm HPV là nguyên nhân thường gặp trên cả nam và

nữ Nhiều nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã xác định sự lây nhiễmHPV từ mẹ sang con, có mối liên quan giữa người mẹ nhiễm HPV với bệnh unhú thanh quản ở con [9] Hiện nay, HPV đang được các nhà khoa học đặcbiệt quan tâm vì tính chất gây bệnh nghiêm trọng Các nghiên cứu dịch tễ học,huyết thanh học, mô bệnh học và đặc biệt về sinh học phân tử đã khẳng địnhHPV là virus gây ung thư ở người HPV gây nên hàng chục loại u, ung thưtrong đó đặc biệt là các u, ung thư ở cơ quan sinh dục như ung thư cổ tử cung

và một bộ phận các ung thư vòm họng, thực quản, đường hô hấp trên Một sốtype HPV là nguyên nhân chính gây nên ung thư cổ tử cung ở phụ nữ Mộtnghiên cứu trên 932 bệnh nhân ung thư cổ tử cung ở 22 quốc gia cho thấy:ADN của HPV hiện diện trong 99,7% trên các mẫu bệnh phẩm [73]

Theo nghiên cứu tình hình bệnh nhân nhiễm HPV tại Viện Da liễu Quốc giagiai đoạn 2000 – 2006 cho thấy: số bệnh nhân đến khám và điều trị tại Viện

Da liễu Quốc gia do nhiễm HPV có biến chứng ung thư tế bào vảy dẫn đến tửvong đang ngày càng gia tăng [16]

Nghiên cứu hệ gien đã xác định có hơn 140 type HPV, trong đó 30 – 40type gây bệnh ở hậu môn, sinh dục, 15 - 20 type có khả năng gây ung thư cổ

tử cung Có hai type đặc biệt nguy hiểm đã được khẳng định đó là HPV 16 vàHPV 18 Đây là hai type thường gây ung thư cổ tử cung ở hầu hết các nơi trênthế giới

Tại Việt Nam, phần lớn ung thư cổ tử cung được phát hiện ở giai đoạnmuộn, trong khi quá trình diễn tiến từ nhiễm virus đến ung thư thường lâu dài,trung bình sự tiến triển từ loạn sản nhẹ, vừa, nặng đến ung thư tại chỗ (giai

1

đoạn tổn thương có thể phục hồi) đến ung thư xâm nhập kéo dài từ 10-20 năm[18] Đây chính là một điều kiện rất thuận lợi cho việc sàng lọc ung thư cổ tửcung Sàng lọc sẽ phát hiện những nhóm người có nhiều nguy cơ mắc ung thư

cổ tử cung nhằm giúp cho việc điều trị hiệu quả ung thư giai đoạn sớm và cáctổn thương tiền ung thư [19]

Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung (PAP Smear) ngày càng được cải tiến

và ngày nay vẫn là một phương pháp sàng lọc ung thư cổ tử cung có hiệu quả.Tại các nước phát triển, xét nghiệm được coi là phương pháp sàng lọc cơ bản.Xét nghiệm được thực hiện 1-2 lần/năm hoặc ít nhất cứ 3 năm 1 lần đối vớiphụ nữ đã có quan hệ tình dục cho tới 65 tuổi

HPV là loại virus không thể phát triển trong thực nghiệm và không pháthiện được bằng các xét nghiệm huyết thanh học Sự nhận diện và định typeHPV căn cứ vào các phân tích Acid Nucleic Trong những năm gần đây, việc

áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện HPV, đặc biệt là định ra đượccác type nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung đã trở nên phổ biến Kỹ thuậtPCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đang ngày càng được ứng dụng rộng rãitrên thế giới [14,28] Sự phối hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử phát hiệnnhiễm HPV và xét nghiệm tế bào học cổ tử cung trong sàng lọc phát hiện sớm

đã góp phần đáng kể làm giảm tỷ lệ ung thư cổ tử cung

Với mong muốn góp phần đánh giá tình hình nhiễm HPV và xác định được type HPVcó nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung trên bệnh nhân nhiễm HPV tại Hà Nội, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

Tình hình nhiễm Human Papilloma Virus (HPV) trên bệnh nhân đến khám phụ khoa tại bệnh viện Da liễu Hà Nội (1/2008 – 10/2008)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát hiện HPV

Từ thời Hy lạp cổ, tổn thương u sùi (sùi mào gà) ở bộ phận sinh dục đãđược mô tả giống như một quả dâu

Cuối thế kỷ 19, một số tác giả đã mô tả biểu hiện tế bào học của tổnthương hạt cơm ở da và các sùi mào gà là giống nhau [61] Sau đó người ta đãgây bệnh thực nghiệm ở trên da bằng cách cấy bệnh phẩm lấy từ tổn thươngsùi mào gà ở qui đầu [61]

Năm 1949, Straus và CS đã sử dụng kính hiển vi điện tử phát hiện đượcnguyên nhân gây bệnh hạt cơm ở da là do virus Năm 1954, Beutner và CS đãchứng minh bệnh sùi mào gà là bệnh lây truyền qua đường tình dục Năm

1969, Dunn và CS phát hiện phân tử virus tương tự ở tổn thương sùi mào gà.Cấu trúc của sùi mào gà là những tế bào da chồng lên nhau và có rất nhiềuvirus Cuối thập niên 1970, bộ gien virus đầu tiên được nhân bản thành công

ở vi khuẩn Trong suốt thập niên 80, nghiên cứu về virus gây các u sùi đượckhuyến khích và phân tích Ngày nay, đã có nhiều nghiên cứu về liên quancủa virus gây u sùi với các ung thư, đặc biệt là ung thư cổ tử cung [37]

1.2 Đặc điểm sinh vật học của HPV

1.2.1 Phân type HPV

Papillomavirus (PV) là thành viên trong họ Papovavidae PV được tìm thấy trong rất nhiều loài động vật có vú, trong đó có con người Tính đặc hiệu

theo loài gây bệnh của PV rất cao, khó có thể tìm thấy type PV của loài này

lại gây bệnh cho loài khác PV gây bệnh cho người được gọi là Human papillomavirus (HPV) HPV chỉ thích ứng biểu mô vảy và niêm mạc, gây

tăng sinh tế bào biểu mô ở đường sinh dục, hậu môn, vùng mũi, họng, hạ hầu,thanh quản, thực quản.

PV được chia làm 5 siêu nhóm chính (super-groups), siêu nhóm A (còngọi là alpha), siêu nhóm B (còn gọi là beta, bao gồm 2 phân nhóm B1 và B2),siêu nhóm G (còn gọi là siêu nhóm gamma), siêu nhóm E bao gồm 2 phân

nhóm là Mu và Nu Trong đó siêu nhóm A là nguyên nhân chính gây nên ung

thư cổ tử cung chứa khoảng 60 thành viên Các type HPV của các nhóm beta,gamma, Mu và Nu chủ yếu gây nhiễm trên da

HPV được coi là cùng type, nếu như chuỗi gien L1 trong hệ gien khôngkhác nhau trên 10% Tuy nhiên cũng có nhiều trường hợp, phân type HPVkhông dựa vào chênh lệch phần trăm nucleotid trong chuỗi gien L1, mà cònphải xem xét thêm các đặc tính gây bệnh của các type đó [38,39]

1.2.2 Hình thái, cấu trúc của HPV

HPV có kích thước nhỏ, khoảng 55 nm, không có vỏ ngoài (envelope).Dưới kính hiển vi điện tử, HPV trông giống như quả bóng gôn, nằm cạnhnhau theo một tập hợp (Hình 1.A) Vỏ capsid được cấu tạo bởi 72 capsomer.Mỗi đơn vị capsomer chứa 2 loại protein capsid là L1(layer 1), và L2 (layer2) Pentamer của L1 là thành phần protein chủ yếu của vỏ capsid, được gọi làlớp vỏ lớn, có cấu trúc khối từ các đơn vị 5 góc cạnh (Hình 1.B) Kề cận L1 làprotein cấu trúc của L2 , còn gọi là lớp vỏ bé, gồm nhiều đơn vị xếp lớp theonhau (12 đơn vị / virus) [41]

5

A B

Hình 1.1: Hình thái, cấu trúc của HPV A) Tập hợp HPV quan sát dưới kính hiển vi

điện tử B) Mô hình không gian ba chiều của HPV

1.2.3 Hệ gien của HPV

Genome của HPV là một phân tử ADN kép, khép vòng, dài khoảng

8000 cặp nucleotid (bp), liên kết với nhiều phân tử protein kiềm Các khungđọc mở (ORF-Open Reading Flame) mã hóa cho toàn bộ protein của HPVnằm trên một mạch ADN Genome của HPV mã hóa cho 8-10 protein

Theo chức năng, genome được phân chia làm 3 phân vùng quan trọng:

- Phân vùng thứ nhất: Vùng điều hòa ngược, không có chức năng mã hóa,

có độ dài 400-1000 cặp bazơ- bp, có chức năng điều hoà sao chép và sự nhânlên của virus, là vùng điều hoà lớn, vùng này có chứa promoter p97 là tiểuphần khởi động, các tiểu phần kích hoạt và một số vùng gien câm [31] Phânvùng này có hệ số biến đổi nucleotid cao hơn rất nhiều so với các vùng kháctrong hệ gien của HPV

- Phân vùng thứ hai: Vùng gien sớm, chứa các khung đọc mở có các gien ký

hiệu là E (early region), gồm các gien: E1, E2, E4, E5, E6 và E7, sản phẩm

protein của chúng trợ giúp cho sự nhân lên ADN của virus, tham gia cơ chếhình thành ung thư cổ tử cung

- Phân vùng thứ ba: Vùng gien muộn (late region), gồm các gien mã hóa cho

các protein cấu trúc L1 và L2, là những protein cấu trúc vỏ capsid của virus

tạo nên 72 capsomer

Dựa trên trình tự của các gien E6, E7 và L1 để phân loại HPV thành các typekhác nhau [41]

Hình 1.2: Giản đồ genome của HPV

1.3 Vài nét về dịch tễ học của nhiễm HPV

1.3.1 Đường lây truyền và xâm nhập của HPV

Đường lây truyền của HPV chủ yếu qua da và niêm mạc thông qua cáctổn thương rất nhỏ khó nhận thấy HPV là một trong những căn nguyênthường gặp gây nên nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục có thể là đồnggiới hoặc khác giới Không những HPV gây nhiễm ở hậu môn, cơ quan sinhdục ngoài mà tại các nơi có liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp như âm đạo, cổ

tử cung, hậu môn, niệu đạo đều có thể bị nhiễm HPV QHTD đường miệng

có thể gây lây nhiễm HPV thông qua niêm mạc miệng và từ đó HPV lan tớivùng mũi, họng, hạ hầu, vùng hô hấp trên, thanh quản, thực quản HPV gây

7

lây nhiễm từ mẹ sang con, người mẹ bị nhiễm HPV trong quá trình sinh nở cóthể lây bệnh cho con và dẫn tới bệnh u nhú thanh quản ở trẻ sơ sinh

Sự lây nhiễm HPV thường xuất hiện ở phụ nữ trẻ hoặc phụ nữ có nhiềubạn tình, mắc các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục, nạo hút thainhiều lần, sinh nhiều con, suy giảm miễn dịch Điều này được giải thích

do cơ thể của thiếu nữ chưa trưởng thành, sự bảo vệ của niêm mạc âm đạochưa tốt, các tổn thương niêm mạc do viêm nhiễm là điều kiện thuận lợi

để virus xâm nhập

Người ta cho rằng, thể tiềm ẩn của HPV nhiều hơn các thể nhìn thấy hàngtrăm lần Có thể nhiễm HPV ngay từ khi mới sinh ra hay từ khi còn nhỏ.Trong đa số người nhiễm HPV sinh dục, chỉ có một số ít phát triển thành bệnh

có thể nhìn thấy [11]

Ước tính chung, ít nhất có khoảng 50% nam và nữ ở tuổi hoạt động tìnhdục đã từng bị nhiễm HPV Vào độ tuổi 50, ít nhất 80% phụ nữ bị nhiễm HPVđường sinh dục Hầu hết nhiễm HPV không có triệu chứng và tự khỏi Chính

vì vậy, những người nhiễm HPV không nhận biết được tình trạng nhiễm HPVcủa họ và tiếp tục làm lây truyền HPV sang bạn tình [37]

1.3.2 Tình hình nhiễm HPV trên thế giới

Theo điều tra của cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), tỷ lệnhiễm HPV của phụ nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9-13%, (nghĩa là cứ

10 phụ nữ thì một bị nhiễm HPV) Có vào khoảng 630 triệu phụ nữ trên thếgiới nhiễm HPV, tỷ lệ cao nhất thấy ở các nước Châu phi như Zimbabwe lêntới 41,6% Một số nước Châu Á có tỷ lệ nhiễm HPV tương ứng như TrungQuốc 18%, Ấn Độ 16,9%, Hàn Quốc 10,4% [11]

Độ tuổi nhiễm HPV thay đổi tùy địa phương Ở Phần Lan, nhiễm HPVthường xảy ra trong độ tuổi từ 20-29 Nghiên cứu 10.758 phụ nữ tuổi từ 20-29

của Susanne (K Kjaer) ở Copenhagien tỷ lệ nhiễm HPV là 14% và của Anna(R.Giuliano) ở vùng biên giới Hoa Kỳ- Mexico tỷ lệ nhiễm HPV là 14,4%trong nhóm 2319 phụ nữ từ 15-79 tuổi [69].

1.3.3 Tình hình nhiễm HPV ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong khu vực các nước đang phát triển, những xétnghiệm sàng lọc HPV mới được thực hiện nên những báo cáo về các trườnghợp bệnh mới mắc thường ít hơn thực tế Chưa có một tài liệu về chươngtrình sàng lọc mang tính quốc gia về tình hình nhiễm HPV trên phụ nữ ViệtNam được công bố Tuy nhiên, qua số liệu ghi nhận từ một số đề tài nghiêncứu thí điểm tại Hà Nội và TP Hồ Chí Minh cho thấy, số phụ nữ nhiễm HPV ởhuyện Sóc Sơn, Hà Nội là 1,8% và phụ nữ quận 10, TP Hồ Chí Minh là 9,9%[27,62]

1.4 Bệnh lý nhiễm HPV

1.4.1 Các bệnh cảnh lâm sàng do HPV gây nên

Hiện nay, có hơn 140 type HPV đã được xác định và được xếp thành cácnhóm theo bệnh cảnh lâm sàng như sau:

Bảng 1.1: Các type HPV và các bệnh cảnh lâm sàng có liên quan

Hạt cơm bàn tay, bàn chân 1, 2, 4, 63.

Hạt cơm thông thường. 2, 1, 7, 4, 26, 27, 29, 41, 57, 65, 77, 3, 4,10, 28.

Hạt cơm phẳng 3, 10, 26, 27, 28, 38, 41, 49, 75, 76.

Loạn sản thượng bì dạng hạt cơm 5,8,9,12,14,15,17,19,20-25,36,47,50.

Sùi mào gà, U nhú thanh quản 6, 11

Giảm sản biểu mô miệng 13, 32

Nguy cơ cao 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 59, 66.

Ung thư cổ tử cung 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66.

a Màu nhạt thể hiện ít xuất hiện hơn so với các màu đậm“.

1.4.2 Cơ chế bệnh sinh nhiễm HPV

Ngay sau khi đi vào trong tế bào chủ, HPV nhân lên theo quá trình biệthóa của tế bào nền và phát triển tiến đến bề mặt của biểu bì Trong lớp nền, sựnhân lên của virus không có hiệu quả, virus tồn tại ở dạng thể bổ sung(episome) Sự nhân lên của HPV phụ thuộc vào cơ chế phiên mã của tế bàobiểu mô da hoặc niêm mạc Những hạt thể virus trưởng thành chỉ thấy ở lớp tếbào bề mặt [44]

Hình 1.3: Sơ đồ nhân lên của HPV Quá trình nhân lên của HPV theo các giai đoạn biệt

hoá của tế bào chủ từ khi là các tế bào nền cho đến khi chúng sinh sản tiến lên các lớp trên. Đối với HPV nhóm nguy cơ thấp gây nhiễm tế bào da và niêm mạc(mụn cóc hay hạt cơm), ADN của virus không gắn vào genome của tế bào mà

Các tế bào đang sinh sản

Nhân lên lần 2

Duy trì

Các tế bào đang biệt hoá

Nhân lên lần 1

tồn tại độc lập, virus có thể tái hoạt động nhưng không lây nhiễm vào lớp tếbào sâu

Đối với HPV nhóm “nguy cơ cao” gây nên các khối u và ung thư, ADNcủa HPV có khả năng tích hợp vào bộ gien của tế bào Ngoài dạng tích hợp,còn tồn tại ở dạng plasmid nhưng dạng tích hợp nhiều hơn dạng plasmid Sựtích hợp này gây ra bất hoạt của các gien E1 và E2, do vậy sự sao mã là giớihạn trong các gien E6 và E7 Sau khi tích hợp, vùng gien E6, E7 điều khiểntổng hợp các protein theo chiều hướng bất thường làm kích hoạt những chấtsinh ung thư, bất hoạt những gien ức chế sự tạo khối u p53 (gien E6) và Rb(gien E7), do đó sẽ gây ra sự phát triển hỗn loạn của nhóm tế bào bị nhiễm

1.4.3 Nhiễm HPV và ung thư cổ tử cung

Hình 1.4: Quá trình tiến triển từ nhiễm HPV đến UTCTC

Vào năm 1976, Harold zur Hausen, một nhà nghiên cứu virus học ngườiĐức đã chỉ ra mối liên quan giữa nhiễm HPV và UTCTC Đây là ung thư phổbiến ở phụ nữ chỉ đứng sau ung thư vú Trong nhiều năm gần đây, HPV được báocáo là tác nhân chính, là nguyên nhân cần có của UTCTC HPV gây biến đổi các

11

tế bào bị nhiễm dẫn đến diễn tiến tự nhiên của niêm mạc CTC từ viêm nhiễm mãntính à loạn sản nhẹ à loạn sản vừa à loạn sản nặng à ung thư CTC

Không phải tất cả các trường hợp nhiễm HPV đều tiến triển thành UTCTC.Nhiễm HPV dù bất kỳ nhóm nào đều có khả năng tự lui bệnh và không để lại

di chứng cho người bị nhiễm Hơn phân nửa các trường hợp loạn sản nhẹ cókhả năng tự thoái lui, 10% các trường hợp loạn sản vừa và nặng có khả năngtiến triển nặng hơn trong khoảng 2-4 năm, khoảng 50% loạn sản nặng sẽ trởthành UTCTC [7,8,18]

Hình 1.5: Cơ chế bệnh sinh nhiễm HPV

Gắn hệ gien virus vào nhiễm sắc thể TB chủ

Sau khi gắn hệ gien vào TB chủ gien E6 và E7 hoạt động tổng hợp các protein ức chế hoạt động của P53, pRb ( là các protein ức chế ung thư của TB)

Cùng với tình trạng nhiễm HPV, UTCTC do HPV gây nên đang ngàycàng gia tăng Mỗi năm trên thế giới có 2.274.000 ca UTCTC, trong đó có510.000 ca mắc mới [11]

Tại Việt Nam, theo Nguyễn Bá Đức, năm 2002 có 6.224 ca mắc mới và3.334 ca tử vong Năm 2005, có 4.471 ca mắc mới UTCTC gặp ở những phụ

nữ đang và sau tuổi sinh đẻ (35-55) tuổi

Tỷ lệ mắc và tử vong do UTCTC có xu hướng giảm dần ở các nước pháttriển nhờ các thành tựu đạt được trong phòng bệnh, phát hiện bệnh sớm, cảithiện chất lượng chẩn đoán và điều trị, trong khi đó tỷ lệ lại có xu hướng giatăng ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam Do hầu hết phụ nữ ởcác nước đang phát triển không được tiếp cận với các chương trình y tế khámsàng lọc và điều trị, tỷ lệ tử vong vẫn còn rất cao, trung bình là 50% trongvòng 5 năm [11]

•Tổn thương sùi: sẩn nổi cao, trên có các nhú mềm màu hồng tươi giốngnhư các tinh thể nhô lên, xoè rộng ra giống mào gà, hay giống súp lơ,thương tổn có khi có cuống, không có hiện tượng thâm nhiễm

•Tổn thương dạng mụn cơm: là các sẩn nổi cao hoặc phẳng, màu hồnghoặc màu xám, bề mặt thô, có các nhú rất nhỏ

13

•Tổn thương có thể là một vùng thô mất bóng chỉ có thể nhìn thấy rõ khilàm thử nghiệm Acid axetic 3-5%.

1.5.1.2 Không có triệu chứng

Sau khi xâm nhập, HPV không gây nên bất kỳ triệu chứng lâm sàng nàocho người bị nhiễm, vì vậy phải dựa vào cận lâm sàng để phát hiện

1.5.2 Chẩn đoán cận lâm sàng

1.5.2.1 Xét nghiệm tế bào học cổ tử cung ( PAP Smear ).

Những biểu hiện nhiễm HPV là sự có mặt của tế bào “rỗng” Koilocytehay còn gọi là “tế bào bóng” Tế bào có hình ảnh đặc trưng với màng tế bàodày lên do sự cô đặc của bào tương, protein của tế bào đặc lại ở sát màng tếbào tạo nên hình ảnh tế bào rỗng Tế bào Koilocyte điển hình có vùng sángtrong bào tương, quầng sáng quanh nhân, nhân thường nằm lệch

1.5.2.2 Test Acid axetic

Các biểu hiện lâm sàng không nhìn thấy rõ có thể dùng thử nghiệm này.Sau khi bôi Acid axetic 3-5% khoảng 5 phút, xuất hiện mảng giới hạn rõ màutrắng, hơi nổi cao, bề mặt thô, nếu dùng kính lúp có thể thấy bề mặt thô rõhơn, trên có các nhú là thử nghiệm dương tính

1.5.2.3 Phân lập HPV

Phân lập virus được coi là tiêu chẩn vàng để xác định nhiễm virus Việcphân lập HPV còn gặp nhiều khó khăn do sự nhân lên của virus cần có sự biệthóa của tế bào keratin và cấu trúc tầng của các tế bào biểu mô

Cho tới nay đã có rất nhiều các cố gắng để thiết lập hệ thống phân lậpHPV như: mô hình dị ghép hoặc hệ thống nuôi cấy từ các tổn thương ở trên

da người hoặc mô tử cung đã được nhân lên bằng cách ghép các mô bệnh vàochuột bị gây thiếu hụt miễn dịch [45]

Tuy nhiên hệ thống phân lập này vẫn chưa trở thành thường quy phân lậpvirus HPV phục vụ mục đích chẩn đoán Do đó chẩn đoán tế bào học và mô

15

học là công cụ hữu ích phát hiện nhiễm HPV Gần đây các phương pháp sinhhọc phân tử phát hiện ADN của HPV đang được quan tâm.

1.5.2.4 Xác định ADN của HPV bằng kỹ thuật PCR.

Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Nhờenzym ADN polymerase xúc tác, từ mạch khuôn ADN các mạch đơn mớiđược tổng hợp

PCR sử dụng bộ mồi chung cho tất cả các type HPV là sử dụng các mồi

để khuếch đại một phổ rộng các type HPV Những mồi này nằm ở vùng bảotoàn trong genome của HPV như gien mã hóa protein vỏ capsid L1 Cặp mồiMY09 và MY11 khuếch đại sản phẩm có đích 450bp bên trong khung đọc mởL1 (HPV L1 ORF) Các mồi GP5+ và GP6+ khuếch đại sản phẩm có đích150bp nằm bên trong vùng đích của cặp mồi MY09 và MY11 với độ nhạyphân tích từ 10-200 bản copy mỗi mẫu

Khi sử dụng cặp mồi chung để khuếch đại một đoạn gien có mặt tronggenome của mọi type HPV, có nhiều phương pháp được sử dụng để xác địnhđoạn gien này là của type HPV nào Ta có thể giải trình tự (sequecing) đoạngien này rồi so sánh đối chiếu với trình tự gien của các type HPV, hoặc lai sảnphẩm PCR với các đầu dò ADN đặc hiệu với các type HPV

1.6 Điều trị nhiễm HPV

1.6.1 Mục đích điều trị

Xóa sạch các tổn thương do HPV gây ra

Giảm tối đa ổ bệnh để hệ thống miễn dịch hỗ trợ loại bỏ virus

Giảm lây lan virus tại chỗ, giảm lây lan cho người khác, nhất là bạn tình

Giảm nguy cơ ác tính

Phục hồi lại giải phẫu và chức năng cho cơ quan bị bệnh

1.6.2 Điều trị với các tổn thương ngoài da do HPV gây nên

Phương pháp điều trị được áp dụng: dùng hóa chất gây ức chế sự phânbào như podophyllin 10-20%; hóa chất gây đông hóa như Acid trichloracetic;thuốc miễn dịch; phẫu thuật

Hiện nay, phương pháp điều trị phẫu thuật được áp dụng phổ biến vàmang lại hiệu quả cao: phẫu thuật cắt bỏ, Lazer CO2 , Lazer YAG

1.6.3 Điều trị sớm ung thư cổ tử cung

Theo cách phân type FIGO (Hiệp hội sản phụ khoa quốc tế), UTCTCđược chia làm bốn giai đoạn Trong đó, giai đoạn một là giai đoạn UTCTCchưa xâm nhập, chỉ khu trú ở CTC và giai đoạn bốn là giai đoạn ung thư đãxâm nhập, lan tràn đến các nơi khác trong cơ thể [27]

Ở giai đoạn ung thư chưa xâm nhập, phương pháp điều trị có thể bằngđốt điện, đốt lạnh, khoét chóp CTC bằng dao điện hình vòng hoặc cắt toàn bộ

tử cung Các biện pháp điều trị trên được phối hợp với việc xạ trị tùy theotừng bệnh nhân cụ thể

Ở giai đoạn sớm, tỷ lệ sống thêm sau 5 năm là trên 95%, trong khi nếuphát hiện ở giai đoạn muộn, tỷ lệ sống thêm sau 5 năm chỉ còn khoảng 5%Điều này một lần nữa khẳng định tầm quan trọng của việc sàng lọc UTCTCmột cách thường xuyên sẽ mang lại hiệu quả cao cho điều trị [18]

1.7 Đáp ứng miễn dịch tự nhiên đối với HPV

Những tổn thương ban đầu do HPV gây nên chỉ xảy ra tại biểu mô vảyvốn không có tiếp xúc mạch máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ, không

có virus trong máu, không có sự phá vỡ tế bào sừng nên không có sự phóngthích những cytokin Không có hoạt động của tế bào trình diện kháng nguyênnên không có sự tạo thành nhiều kháng thể để chống lại HPV Vì lý do đó, khi

17

có sự tái nhiễm HPV, cơ thể không có sự miễn dịch vì không có kháng thểkháng HPV.

1.8 Phòng nhiễm HPV

1.8.1 Phòng không đặc hiệu

Quan hệ một vợ một chồng

Hạn chế quan hệ tình dục sớm

Sử dụng các biện pháp tránh thai: sử dụng bao cao su

Phòng tránh các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục

Tuy nhiên, vấn đề sử dụng bao cao su trong QHTD không an toàn có thểgiúp cho việc phòng chống các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục màkhông tránh được sự lây nhiễm của HPV Chỉ cần tiếp xúc với HPV nằm bênngoài sự che phủ của bao cao su cũng đủ để nhiễm bệnh [27]

1.8.2 Phòng đặc hiệu

Hiện nay, đã có Gardasil được xem là biện pháp đột phá trong phòngngừa ung thư CTC và các bệnh lý liên quan đến HPV Gardasil là vaccine tứgiá phòng được HPV 6, HPV 11, HPV 16 và HPV 18 HPV 6 và HPV 11 gâynên 90% các trường hợp SMG sinh dục - hậu môn, U nhú thanh quản, UBuschke Lowenstein; HPV 16 và HPV 18 được coi là thủ phạm của 70% cáctrường hợp UTCTC

Vaccine đã được nghiên cứu thành công và được phép sử dụng tại nhiềuquốc gia trong đó có Việt Nam Các vaccine được cấu tạo bởi HPV có thànhphần bao gồm vỏ capsid virus rỗng chứa các kháng nguyên vỏ của HPV,hoàn toàn không chứa ADN của virus Được sản xuất trên môi trường nấmmen (Saccharomyces Cerevisiae)

Hình 1.6: Mô hình mô tả các vaccine được cấu tạo bởi HPV có thành phần bao gồm

vỏ capsid virus rỗng chứa các kháng nguyên vỏ của HPV, hoàn toàn không chứa ADN

của virus

Tuy nhiên, vaccin không phòng được các trường hợp lây nhiễm HPVthuộc các type khác, giá thành còn cao Vì vậy, vấn đề phòng bệnh không đặchiệu đi cùng với sàng lọc phát hiện sớm nhiễm HPV và UTCTC nên đượcxem là quan trọng hàng đầu

19

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Phụ nữ đã có quan hệ tình dục, đến khám phụ khoa tại bệnh viện Da liễu Hà Nộitrong thời gian từ tháng 1/2008 đến tháng 10/2008

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân đã được khẳng định hoặc nghi ngờ nhiễm HIV

- Bệnh nhân đang có thai

2.2 Phương pháp và cỡ mẫu nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu được tính theo công thức: n = 12 /2 2

) (

) 1

(

ε

p p

tỷ lệ nhiễm HPV trên thế giới dao động từ 9 % đến 13%

Chúng tôi chọn cỡ mẫu với p = 7 6 %

3

% 11

% 9 9

% 8

ε : chọn là 0,4 —> n = 300

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

2.3 Phương tiện và vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Phương tiện và vật liệu cho kỹ thuật PCR

Tách chiết ADN

• Kit QIAamp viral ADN mini kit (Qiagien)

• Ethanol 100%, AAPER Alcohol

• Ultrapure distilled water, Nuclease Free (Gibco-Invitrogien)

• Temperature-regulated centrifuge; Eppendorf 5415 R

• Agarose

2.3.1.2 Trang thiết bị

• Lò vi sóng (Mounlinex)

• Cân điện 10-2 (Mettler Toledo)

• Cân phân tích 10-4 (Mettler Toledo)

• Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)

• Máy đo pH

• Máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5415R)

• Máy lắc ổn nhiệt 370C

• Máy PCR (My cyclerTM Bio-rad và Eppendorf)

• Bộ điện di ADN (Advance Tech, Japan)

• Máy soi chụp ảnh gel (Bio-rad)

• Nồi khử trùng (Japan)

• Tủ lạnh sâu (-200C đến -750C) (Sanyo, Japan)

• Máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI)

• PipetteMan các loại (Gilson), tube eppendorf 1,5; 1; 0,2 ml

2.3.2 Phương tiện và vật liệu sử dụng cho kỹ thuật tế bào học Dụng cụ, trang thiết bị

• Bể nhuộm PAP: 8 bể

• Giá và hộp đựng lam kính

• Quệt bẹt Ayre cải tiến vô trùng, mỗi bệnh nhân 1 chiếc

Hóa chất nhuộm PAP:

• Dung dịch cố định: Cồn tuyệt đối – Ete thể tích 1-1

2.3.3 Phương tiện và vật liệu cho kỹ thuật xét nghiệm vi sinh

• Kính hiển vi quang học với vật kính dầu 1000X, que cấy vô trùng, lamkính vô trùng

• Nước muối sinh lý 0,9%

• Dung dich thuốc nhuộm Gram (nhuộm kép): Tím gientian 2%, Lugol1%, Acetone-cồn 1/5, Fuchsine basic 1%

2.4 Kỹ thuật nghiên cứu

• Kỹ thuật xác định HPV bằng PCR

• Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh: Soi tươi, nhuộm Gram xác định các bệnhlây truyền qua đường tình dục

• Kỹ thuật tế bào học, tìm tế bào Koilocyte là tế bào nhiễm HPV và pháthiện các loạn sản tế bào CTC

25

2.4.1 Chuẩn bị bệnh nhân

Tất cả các bệnh nhân đến xét nghiệm đều được lập hồ sơ theo dõi, đượchỏi kỹ về họ tên, tuổi, địa chỉ, nghề nghiệp, tiền sử bệnh phụ khoa để tránhnhầm lẫn trong trả kết quả, trong việc quản lý số liệu

Bệnh nhân được nằm trên bàn khám phụ khoa ở tư thế thuận lợi nhất choviệc thăm khám và lấy bệnh phẩm

Bật bồn nước nóng, để ở nhiệt độ 56ºC, lấy các ống eppendoff 1,5ml,

số lượng ống tương ứng với số lượng mẫu cần tách Đánh số thứ tựcác ống theo tiêu chuẩn qui định

Bệnh phẩm đã được bảo quản trong dung dịch đệm A, làm tan bằngcách để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

Các bước tiến hành:

Bước 1: Lấy 180µl bệnh phẩm được bảo quản trong dung dịch A cho vào mỗi

ống eppendoff 1,5ml

Bước 2: Hòa tan protein có trong bệnh phẩm bằng cách cho 20µl QIAGIEN

proteinase (protein K), trộn đều nhờ vortex trong 15 giây

Bước 3: Ủ trong bồn nước núng 56ºC trong 10 phỳt.

Sau khi ủ, ly tõm nhanh (spindown) nhằm đưa cỏc phần dớnh trờn nắp

ống xuống phớa dưới ống

Bước 4: Thờm 200 μl đệm AL vào ống, trộn nhờ mỏy vortex trong vũng 15

giõy

Bước 5: Ủ ở 700C trong 10 phỳt Sau khi ủ ly tõm nhanh ống để loại bỏ dịchbỏm trờn nắp

Bước 6: Thờm 200 μl ethanol 100º vào ống và trộn đều nhờ mỏy vortex trong

vũng 15 giõy Sau khi trộn ly tõm nhanh ống để loại bỏ dịch bỏm trờnnắp ống

Bước 7: Chuyển toàn bộ hỗn hợp sang ống eppendoff cú cột (column spin) Bước 8: Đúng nắp kớn, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng/1 phỳt, trong 1 phỳt

Bước 9: Chuyển cột sang tube 2ml mới.

Bước 10: Cho thờm vào 500àl đệm AW1, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng /1 trong

1 phỳt

Bước 11: Chuyển cột sang tube 2ml mới.

Bước 12: Cho thờm vào 500àl đệm AW2, ly tõm ở tốc độ 8000 vũng trong 1

phỳt

Bước 13: Chuyển cột sang tube 1,5ml mới.

Bước 14: Thu hồi ADN bằng 200àl đệm AE, để ở nhiệt độ phũng trong 1

phỳt sau đú ly tõm ở 8000 vũng trong 1 phỳt

Bước 15: Bảo quản mẫu ADN tách triết đợc ở -20ºC cho tới khi phân

tích

2.4.2.2 Phản ứng PCR kiểm tra chất lượng mẫu ADN

Trong nghiờn cứu này, chỳng tụi sử dụng kỹ thuật PCR để phỏt hiện HPV.Đõy là kỹ thuật mang lại kết quả cú độ tin cậy cao Kỹ thuật đũi hỏi người

27

thực hiện phải tuân thủ một qui trình xét nghiệm chặt chẽ ngay từ khâu lấybệnh phẩm.

Bệnh phẩm sau khi lấy được bảo quản trong môi trường bảo quản tế bào(SDS 2%; Tris-HCL; 100 mM EDTA 10 mM) Chúng tôi sử dụng sinh phẩmQIAamp ADN Mini Kit để tách chiết ADN Để đánh giá hiệu quả tách chiếtADN, toàn bộ các mẫu ADN được kiểm tra bằng phản ứng PCR khuếch đạigien beta-globin với cặp mồi PCO3/PCO5 Cặp mồi PCO3/PCO5 có trình tựnhư sau:

PCO3: 5’-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3’

PCO5: 5’-GAAACCCAAGAGTCTTCTCT-3’

Các mẫu ADN có gien beta-globin được khuếch đại sẽ được phân tích đểxác định sự có mặt của HPV ADN, các mẫu không cho sản phẩm gien beta-globin sẽ phải tách triết lại

2.4.2.3 Phản ứng PCR phát hiện HPV

Một phản ứng PCR tối ưu giúp phát hiện và định type HPV cần phải ápdụng được với nhiều loại bệnh phẩm, cặp mồi phải được lựa chọn sao chophản ứng PCR khuyếch đại được vùng gien đích có mặt trong genome của tất

cả các type HPV và vùng nằm giữa 2 mồi phải có dao động đủ lớn để thiết kếđầu dò đặc hiệu với từng type HPV phục vụ việc xác định type Hai gien L1

và E1 là ổn định nhất trong các type HPV, vì vậy các phương pháp phát hiện

và định type HPV dựa trên phản ứng PCR thường tập trung vào 2 gien này Toàn bộ 300 mẫu quệt cổ tử cung đã được kiểm tra phát hiện HPV bằngphản ứng PCR với cặp mồi GP5+/GP6+ khuếch đại một đoạn trình tự dài 150

bp trên gien L1, gien này không bị loại bỏ khi genome của HPV gắn vàogenome của tế bào vật chủ Trong phản ứng PCR này chúng tôi đã sử dụngthêm cặp mồi PCO3/PCO5 khuếch đại trình tự dài 209 bp của gien Beta

globin, để kiểm tra hiệu quả việc tách triết ADN Kết quả phản ứng PCR chỉđược công nhận khi có sản phẩm đặc hiệu dài 209 bp, mẫu bệnh phẩm dương

tính với HPV sẽ cho sản phẩm PCR dài 150 bp, được phát hiện bằng điện di

và nhuộm với Ethidium Bromide, mẫu âm tính không có sản phẩm này

Các mồi GP5+/GP6+ có trình tự như sau:

GP5 + 5’-TTTGTTACTGTGGTAGTACTAC -3’

GP6+ 5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3'

Cặp mồi này cho sản phẩm PCR có độ dài 150 bp,

Hình 2.1: Sơ đồ genome của HPV và vị trí các mồi sử dụng cho phản ứng PCR phát hiện HPV Cặp mồi GP5+/GP6+ giúp phát hiện các type HPV, cặp mồi E6F/E6R và

HP18F/18R đặc hiệu với HPV 16, và HPV 18.

E6 E7 E1

E2 E5

L2

L1 E4

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 7900

Thành phần phản ứng Chu trình gia nhiệt

GP5+/6+ 1μl cho mỗi mồi

HPV type 16 và HPV type 18 là hai type nguy cơ cao gây nên ung thư

cổ tử cung gặp ở khắp nơi trên toàn cầu Vì vậy, việc phát hiện nhiễm HPVtype 16 và HPV type 18 là rất quan trọng Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi đặchiệu E6F/R thiết kế nhằm khuếch đại gien đích có kích thước 321bp để pháthiện HPV type 16 và cặp mồi HPV 18F/R thiết kế nhằm khuếch đại gienđích(L1) có kích thước 561bp để phát hiện HPV type 18 Sau khi chạy PCR,

điện di sản phẩm trên gel agarose 1.5%, nhuộm EtBr và chụp UV

Hai type HPV có nguy cơ cao với UTCTC là HPV 16 và HPV 18 được

xác định bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bởi nhómnghiên cứu của Viện Công nghệ sinh học

• Phát hiện HPV 16

- Mồi E6F/E6R, khuếch đại gien E7, cho sản phẩm PCR dài 321 bp

- Điều kiện PCR

tử của đoạn ADN khuếch đại (tỷ lệ thuận so với số lượng nucleotide) và nồng

độ gel chạy

Các bước tiến hành:

Bước 1: Làm gel Agarose 1.5%

• Chuẩn bị thành phần để làm gel gồm: 160 ml dung dịch đệm TAE1Xhoà với 2.4 g bột gel agarose

• Đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn (khoảng 12phút), sau đó để nguội xuống khoảng 500C

• Đổ thạch vào khay điện di đã cài sẵn răng lược Sau khi gel đã đôngkhoảng 30 phút, gỡ lược ra, nếu sử dụng ngay thì đặt vào bể điện di cònnếu chưa sử dụng ngay thì bao kín bằng giấy bóng và cho vào tủ lạnhbảo quản ở ngăn 40C

Bước 2: Đổ dung dịch đệm TAE1X vào bồn điện di cho tới khi ngập bản gel

độ khoảng 1-2 mm Khi pha gel bằng đệm TAE1X thì khi chạy điện di cũngnên chạy ở đệm TAE 1X để đảm bảo thu được kết quả tốt

Bước 3: Chuẩn bị bồn chứa EtBr bằng cách đổ 300 ml TAE1X vào hộp nhựa

màu tối sau đó cho thêm 15µl EtBr 10 mg/ml, đảo đều nhờ lắc nhẹ

Bước 4: Nhỏ mẫu ADN vào các giếng của bản gel

Lấy 7 µl sản phẩm PCR trộn với 1 µl đệm màu 6X (hợp chất này vừa cótác dụng tạo màu để quan sát quãng đường lớn nhất ADN đã đi vừa có tácdụng làm nặng ADN khiến ADN lắng xuống đáy giếng, không bị trôi lên mặt

và nhiễm sang các giếng khác) Dùng pipet man trộn đều và đưa vào cácgiếng nhỏ trong gel Chọn một giếng thích hợp để cho ADN thang Chạy điện

di ở hiệu diện thế 100V trong vòng 30 phút Chú ý chiều đặt thạch là hànggiếng phải đặt quay về phía cực âm Quan sát sự di chuyển của màubromophenol để biết khi nào nên dừng điện di

Lấy bản gel ra cho vào bồn chứa EtBr đã chuẩn bị, ngâm trong đó 10phút, EtBr sẽ bám vào giữa hai mạch ADN

Lấy bản gel ra cho vào bồn chứa nước sạch độ 2 phút rồi chụp ảnh dướiánh sáng của tia UV của máy chụp gel Tia UV kích thích EtBr phát ra ánhsáng ghi lại được

2.4.3 Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh

Chuẩn bị: 2 lam kính có đánh số, 1 lam kính để soi tươi và 1 lam kính để

nhuộm gram soi trực tiếp

33

2.4.3.1 Soi trực tiếp

Lấy bệnh phẩm

Dùng que cấy vô trùng lấy bệnh phẩm ở 4 vị trí: được dàn mỏng, tròn,đều thành 4 điểm trên mỗi lam kính: tại niệu đạo, tuyến skene và tuyếnbartholin, cổ tử cung, cùng đồ âm đạo Sau khi đã lấy bệnh phẩm ở niệuđạo, tuyến skene và tuyến bartholin dùng mỏ vịt bộc lộ CTC, dùng kẹpbông lau sạch khí hư và chất nhầy phủ trên bề mặt CTC rồi đưa nhẹ quecấy vào sâu CTC khoảng 2 cm để lấy dịch của CTC, vị trí lấy cuối cùng làcùng đồ âm đạo

Cố định tiêu bản

Bệnh phẩm sau khi lấy xong được cố định bằng cách hơ trên ngọn lửađèn cồn với sức nóng vừa phải để giết chết vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyênđược hình thể của chúng

2.4.3.2 Soi tươi

Lam kính dùng cho soi tươi được nhỏ sẵn một giọt nước muối sinh lý,bệnh phẩm được lấy ở cùng đồ và soi ngay để tìm Trichomonas

2.4.4 Kỹ thuật xét nghiệm tế bào học cổ tử cung

Phương pháp nhuộm PAP được áp dụng rộng rãi cũng như đáng tin cậynhất hiện nay trong kỹ thuật nhuộm tế bào học cổ tử cung, là một kỹ thuậtnhuộm đa sắc và có tính chất phân biệt Thành phần của thuốc nhuộm gồm 3dung dịch: Hematoxylin Harris, Orange G và dung dịch đa sắc Hầu hết thànhphần của thuốc nhuộm là cồn, nên khi nhuộm, nguyên sinh chất sẽ rất sáng, tếbào thấy rõ, dù trong phiến đồ tế bào hay bị chập hoặc tụ tập thành đám

2.4.4.1 Kỹ thuật xét nghiệm

Lấy bệnh phẩm:

Bệnh phẩm cho xét nghiệm tế bào học cổ tử cung được lấy bằng quệt

Ayre cải tiến vô trùng.

Sau khi lấy xong bệnh phẩm cho xét nghiệm vi sinh, dùng bệt quẹt Ayređưa nhẹ đầu có ngoàm của bệt quẹt vào trong ống CTC và bệnh phẩm đượclấy qua cạo, gại bằng cách vừa tỳ nhẹ ngoàm vào vùng cổ ngoài vừa xoay từ

từ 360° bệt quẹt suốt dọc vùng chuyển tiếp giữa biểu mô vảy và trụ Tránhgây chảy máu CTC, nhưng cũng đủ để lấy đúng và đủ tế bào cho phép chẩnđoán dễ dàng

Dàn phiến đồ

Dàn mỏng bệnh phẩm lên mặt lam kính, tránh dàn đi dàn lại nhiềulần trên lam kính, vì sẽ làm nát tế bào và tạo ra đám tế bào chồng chất khónhận định

35