luận án tiến sĩ xác định và phân tích hoàn chỉnh trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa tại một số tỉnh miền bắc việt nam (tt)

Cho đến nay, vẫn chưa có công trình nghiên cứu khoa học đầy đủ về hệ gen của các giống lợn bản địa Việt Nam, qua đó làm sáng tỏ nguồn gốc và quan hệ phát sinh chủng loại, nhằm phục vụ ch

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Bùi Anh Tuấn

XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH HOÀN CHỈNH TRÌNH TỰ

HỆ GEN TY THỂ CỦA 6 GIỐNG LỢN BẢN ĐỊA TẠI

MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã sỗ: 94 20 20 1

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - Năm 2020

Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: GS TS Nghiêm Ngọc Minh

Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Võ Thị Bích Thủy

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

vào hồi … giờ ’, ngày … tháng … năm 20…

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Trong điều kiện chăn nuôi hiện tại, các giống lợn bản địa đang bị giảm dần về số lượng, đang mất đi một nguồn gen quý của địa phương và quốc gia, một số giống đã bị tuyệt chủng hoặc đứng trên bờ tuyệt chủng Cho đến nay, vẫn chưa có công trình nghiên cứu khoa học đầy đủ về hệ gen của các giống lợn bản địa Việt Nam, qua

đó làm sáng tỏ nguồn gốc và quan hệ phát sinh chủng loại, nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn tài nguyên quý hiếm này Việc xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử về nguồn gen của các giống lợn này vẫn chưa được tiến hành và khai thác một cách đầy đủ Từ các vấn

đề cấp bách nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định và phân tích hoàn chỉnh trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam"

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

- Thu được dữ liệu hoàn chỉnh hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa Việt Nam (lợn Ỉ, lợn Móng Cái, lợn Mường Lay, lợn Hương, lợn Mường Khương và lợn Hạ Lang) và đăng ký trên Ngân hàng gen

- Xác định thành phần, cấu trúc hệ gen ty thể, so sánh sự sai khác trình tự, xác định đặc điểm di truyền đặc trưng của sáu giống lợn bản địa trên, qua đó đóng góp vào cơ sở dữ liệu phục vụ công tác nhận dạng và bảo tồn

- Xác định mối quan hệ về di truyền, nhận định nguồn gốc, phát sinh chủng loại của 6 giống lợn bản địa Việt Nam

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

- Điều tra, khảo sát về giống, nơi cư trú, thu thập mẫu máu của của sáu giống lợn bản địa nghiên cứu

- Giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể của sáu giống lợn bản

địa Lắp ráp, xác định trình tự hoàn chỉnh toàn bộ hệ gen ty thể và chú giải

- Phân tích thành phần, cấu trúc hệ gen

- Nghiên cứu đa hình trình tự, so sánh trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn này với một số giống lợn ở Châu Á, Châu Âu

- Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự vùng D-loop và trình tự hoàn chỉnh của hệ gen ty thể, phân tích mối quan

hệ nguồn gốc phát sinh chủng loại giữa 6 giống lợn bản địa và một số giống lợn khác trên thế giới

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân loại và quá trình thuần hóa lợn nhà

Tổ tiên xa xưa của lợn là lợn rừng, đã được săn bắn để cung cấp thực phẩm cho cuộc sống của người nguyên thủy Tất cả các

giống lợn hiện nay được coi là các dạng của Sus scrofa domestica

Các bằng chứng về phát sinh chủng loại địa lý cho thấy quá trình thuần hóa lợn diễn ra nhiều lần ở nhiều nơi trên thế giới Có quan điểm cho rằng tổ tiên của lợn ngày nay được xác định là lợn rừng nguyên thủy và quê hương của chúng chính là vùng Đông Nam Á

1.2 Ứng dụng của hệ gen ty thể trong nghiên cứu phát sinh chủng loại, xác định nguồn gốc

Xác định mối quan hệ về phát sinh chủng loại nhờ trình tự mtDNA dựa trên nguyên lý: thông tin về quá trình tiến hóa có thể thu được qua phân tích dữ liệu về trình tự mtDNA đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu phát sinh chủng loại với những lý do sau: Thứ nhất, sự tiến hóa của mtDNA ở động vật có vú diễn ra trước hết từ sự thay thế từng cặp nucleotide, mà rất hiếm khi xảy ra sự tái sắp xếp các phần chính của hệ gen Thứ hai, tốc độ tiến hóa của mtDNA được cho là nhanh hơn gấp 10 lần so với DNA nhân Thứ ba, mtDNA được di truyền theo dòng mẹ, đơn bội và không xảy ra tái tổ hợp

1.3 Phát sinh chủng loại phân tử, xây dựng và phân tích cây phát sinh chủng loại phân tử

1.3.1 Cây phát sinh chủng loại

Cây phát sinh chủng loại là một biểu đồ hình nhánh biểu diễn mối quan hệ tiến hóa giữa các thực thể sinh vật, nêu lên một giả thuyết về các sinh vật trên cây đã có quan hệ họ hàng với nhau như thế nào Hình học tô-pô của một cây xác định mối quan hệ của các thực thể được đại diện trên cây phát sinh Chiều dài nhánh phản ánh mức độ quan hệ của các đối tượng trên cây Chỉ duy nhất một nhánh

là nối giữa hai nút Các nút đại diện cho các đơn vị phân loại (các taxon mà cụ thể ở đây là các trình tự DNA hoặc protein), nút là giao điểm hay điểm tận cùng của hai hoặc nhiều nhánh Một đơn vị phân loại hoạt động (OTU) là một taxon hiện có có mặt ở một nút ngoài cùng hay còn gọi là lá

1.3.2 Phân tích phát sinh chủng loại

Phân tích phát sinh chủng loại phân tử được chia làm năm bước:

(1) Thu nhận trình tự, lựa chọn trình tự: thu nhận trình tự từ

cơ sở dữ liệu bao gồm hàng ngàn họ protein của sinh vật nhân thực, hay

các kết quả từ công cụ BLAST (2) Dóng hàng đa trình tự: Sử dụng

phép dóng hàng đa trình tự của một nhóm các trình tự tương đồng (homologous) (3) Lựa chọn mô hình thay thế trong chuỗi DNA và amino acid: Đây là mô hình môt tả về các các thức thay thế đơn phân

trong quá trình tiến hóa (4) Xây dựng cây: Có bốn phương pháp

chính để dựng cây: dựa vào khoảng cách, maximum parsimony, maximum likelihood và suy luận Bayes Phương pháp Bayes giúp suy luận dựa trên mô hình để phân tích phát sinh chủng loại MrBayes lượng giá một phân bố xác suất tiên nghiệm, là khả năng

một cây tạo ra thỏa mãn dữ liệu quan sát (5) Phân tích cây phát sinh

chủng loại: Tính chính xác của cây được đánh giá bằng phân tích

bootstrap Bootstrap mô tả độ mạnh về hình học tô-pô của cây Việc xác định gốc của cây giúp đánh giá tổng thể chiều hướng biến đổi

Có thể xác định gốc của cây dựa vào trung điểm hoặc nhờ nhóm đối chứng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

Các cá thể lợn thuộc 6 giống lợn bản địa Việt Nam (Ỉ, Móng Cái, Mường Khương, Mường Lay, Hương và Hạ Lang) được lựa chọn ngẫu nhiên trong các đàn lợn tại một số địa phương: Điện Biên, Lào Cai, Cao Bằng, Hải Phòng và Thanh Hóa

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp điều tra dựa trên đặc điểm ngoại hình lợn

Quan sát bên ngoài con vật bởi các nhóm chỉ tiêu màu sắc lông, da và nhóm chỉ tiêu đánh giá về hình dạng, đặc điểm của các

bộ phận trên cơ thể lợn, đo đạc khối lượng, các chỉ số: dài thân, vòng ngực và cao vai Tiêu chí đánh giá đối chiếu với Át lát Các giống vật nuôi ở Việt Nam và Chuyên khảo Bảo tồn và khai thác nguồn gen vật Nuôi Việt Nam

2.3.2 Xác định trình tự hệ gen ty thể

Tách chiết DNA, khuếch đại phân đoạn mtDNA bằng PCR, giải trình tự hệ gen ty thể bằng phương pháp phân đoạn (shotgun) theo nguyên lý của Sanger

2.3.3 Nhóm phương pháp lắp ráp, dóng hàng trình tự, dự đoán và chú giải hệ gen

2.3.3.1 Lắp ráp hệ gen

Dữ liệu trình tự được đánh giá và chỉnh sửa trên phần mềm BioEdit v7.2.5 Các đoạn contig thu được từ quá trình cắt gọt sẽ

được ghép nối lại dựa trên phần trình tự gối lên nhau ở hai đầu mỗi đoạn bằng phần mềm DNA Dragon v1.6.0 (SequentiX) và phần mềm EditSeq (DNASTAR)

2.3.3.2 Dóng hàng đa trình tự

Các trình tự vùng D-loop và trình tự vùng mã hóa của hệ gen ty thể vừa lắp ráp sẽ được tách riêng Các đoạn trình tự lặp ngắn trước sau 5' -CGTGCGTACA-3' được xác định số lượng đơn vị lặp và loại bỏ Trình tự hệ gen ty thể của các giống lợn trên thế giới được dóng hàng đa trình tự, sử dụng thuật toán MUSCLE Xác định mô hình tiến hóa thích hợp nhất bằng phần mềm MEGA7

2.3.3.3.Phân tích, chú giải hệ gen

Phân tích và chú giải hệ gen và các gen tRNA của các giống lợn bản địa Việt Nam bằng công cụ trực tuyến Dogma và Mitos Web Server Tất cả các chú giải được kiểm tra bằng công cụ BLAST trên

GenBank

2.3.4 Phân tích trình tự và phương pháp xác định mức độ tương đồng trình tự

Với trình tự thu được, chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ

số cơ bản về tỷ lệ bất đối xứng của các loại nucleotide như phần trăm của các loại nucleotide sử dụng phần mềm DAMBE v6.3.17

(http://dambe.bio.uottawa.ca/), cùng với đó là hai chỉ số độ lệch: GC

skew và AT skew được tính toán dựa theo công thức sau:

2.3.5 Phương pháp xây dựng cây và phân tích chủng loại phát sinh

2.3.5.1 Khoảng cách tiến hóa

Khoảng cách p (p-distance) giữa các cặp trình tự được tính toán

sử dụng thuật toán hai thông số của Kimura trong phần mềm MEGA

2.3.5.2 Phân tích phát sinh chủng loại

Trình tự của vùng Dloop và toàn bộ vùng mã hóa của hệ gen

ty thể được sử dụng riêng biệt làm dữ liệu đầu vào để dựng các cây phát sinh chủng loại tương ứng Phương pháp Bayes được sử dụng trong phần mềm BEAST v1.8.3, thiết lập Yule process và MCMC

10000000 để tính toán xác suất hậu nghiệm Cây tối thích được tìm

ra bằng phần mềm Tree Annotater v.1.8.4 Gốc của cây được xác định bằng phương pháp sử dụng nhóm đối chứng (out - group Kiểm tra thứ tự phân nhánh và tính chính xác bằng phân tích bootstrap sau

1000 lần lặp lại Cuối cùng, phần mềm Figure Tree v1.4.2 được sử dụng để đọc tệp tin kết xuất ra và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Chọn lựa, thu thập mẫu

Tính đến nay tại Việt Nam, để nhận diện các giống lợn bản địa các nhà chọn giống chưa có cơ sở dữ liệu phân tử nào mà chủ yếu căn cứ và bộ chỉ tiêu các đặc điểm hình thái đã được công bố và phê chuẩn Để đảm bảo độ tin cậy trong việc thu mẫu phục vụ nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành khảo sát các đặc điểm ngoại hình dựa trên 3 nhóm chỉ tiêu là: (1) Đặc điểm lông, da; (2) tầm vóc, khối lượng và (3) hình dáng cơ thể, số lượng núm vú

a Nhóm chỉ tiêu đặc điểm lông da

Ở giống Mường Lay, qua quan sát thấy sự phân bố màu sắc lông da thường kèm theo với một số chỉ tiêu ngoại hình để tạo thành phân nhóm nhỏ hơn (gọi tên: nhóm A+) Số lượng các cá thể lợn được quan sát màu sắc lông da được phân vào các nhóm A+, A và B theo thứ tự giảm dần các chỉ tiêu đặc trưng của giống Chỉ những cá thể nào có đầy đủ chỉ tiêu của giống (nhóm A hoặc A+) mới được chọn lựa để sàng lọc ở các nhóm chỉ tiêu tiếp theo

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát đặc điểm lông, da của 6 giống

- Thân lang đen trắng, đầu đen, tiếp giáp giữa

- Thân lang đen trắng, đầu đen giữa trán có đốm

trắng, tiếp giáp giữa lông đen và trắng có khoảng mờ 18 A 18,0

Lợn Mường Khương

- Màu sắc lông da đen tuyền Lông thưa và mềm 100 77 B 77,0

- Màu sắc lông da đen tuyền hoặc đen có đốm

Lợn Hương

- Thân và 4 chân trắng, có mảng lông da màu đen

ở mông và da đầu Phần tiếp giáp giữa đen và trắng

rộng khoảng 2-3 cm, trên đó da đen, lông trắng

- Có thêm đặc điểm: giữa trán có một điểm trắng,

Lợn Hạ Lang

- Bụng trắng và có dải trắng vắt vai có dải đen

- Có thêm đặc điểm: Giữa trán có điểm trắng gần

Chỉ những cá thể ở nhóm A và A+ sẽ được chọn lựa để tiến hành khảo sát ở nhóm tiêu chí về tầm vóc, khối lượng

b Đặc điểm về kích thước các chiều đo và khối lượng

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khối lượng và kích thước của 6

Hạ Lang 42,68 ± 042 87,12 ± 1,33 84,34 ± 1,43 43,68 ±0,98 Mường Khương 52,64 ± 0,92 93,94 ± 1,32 90,52 ± 1,46 46,14 ±0,96 Mường Lay 40,43 ± 0,95 85,71 ± 1,38 83,97 ± 1,46 43,25±0,94

(ĐVT: Khối lượng: Kg; kích thước: cm) : Trị số trung bình ± SD: độ lêch chuẩn

Kết quả cho thấy 100% các cá thể được khảo sát về nhóm chỉ

tiêu tầm vóc và kích thước cơ thể đều mang những đặc điểm đặc trưng của từng giống

c Khảo sát trên nhóm chỉ tiêu hình dáng cơ thể

Bảng 3.3 Khảo sát đặc điểm hình dáng cơ thể của 6 giống

lợn bản địa

Đặc điểm hình dáng cơ thể (số lượng núm vú) Tổng

Lợn Ỉ

- Đầu to vừa phải, trán gần phẳng, mặt nhăn,

nọng cổ và má chảy sệ khi béo, mõm ngắn,

- Bụng ít sệ, thân, chân dài và cao hơn so với lợn

Đặc điểm hình dáng cơ thể (số lượng núm vú) Tổng

- Cổ to ngắn, ngực nở và sâu, lưng dài, hơi võng,

bụng hơi sệ, mông rộng và xuôi

Lợn Mường Khương

- Mõm dài thẳng hoặc hơi cong Trán nhẵn, tai tô

cúp rủ về phía trước

- Bốn chân to cao, vũng chắc Lưng hơi cong,

bụng to nhưng không sệ tới sát đất, mông hơi dốc

23 20 86,9

Lợn Hương

- Đầu đen và thô, giữa trán có một điểm trắng

- Chân to, bụng to vừa phải và không chạm đất,

lưng võng nhưng không gãy, bốn chân có mầu

trắng, mông dốc, vai nở, ngực sâu

- Mình thuôn dài, lưng hơi võng, chân to và cao

vừa phải, đi bằng bàn

- Núm vú đều, khi mang thai và nuôi con, núm

vú không sa sệ, không chạm đất

27 13 48,1

(N: Số cá thể được lựa chọn có đặc điểm hình dáng cơ thể phù

hợp với Át lát; %: phần trăm cá thể có đặc điểm phù hợp trên

tổng số cá thể quan sát)

Số cá thể thuộc 6 giống lợn sau khi được chọn lựa qua 3 nhóm chỉ tiêu về ngoại hình đã đạt đầy đủ các tiêu chí đặc trưng của từng giống Mẫu máu của những cá thể này được lựa chọn ngẫu nhiên mỗi

giống 6 mẫu đem tách chiết DNA tổng số phục vụ nghiên cứu

3.2 Trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa

Trình tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa gồm Ỉ, Móng Cái, Mường Khương, Mường Lay, Hương và Hạ Lang

đã được xác định và đăng ký trên GenBank với các mã số truy cập KX094894, KU556691, KY432578, KX147101, KY964306 và KY800118 Công trình của nhóm tác giả Tran Thi Thuy Nhien và cộng sự (2016) tiến hành nghiên cứu độc lập cũng công bố trình tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể của giống lợn Móng Cái (mã số truy cập GenBank: KU556691) Kích thước hệ gen của lợn Móng Cái do nhóm tác giả này công bố là 16.632 bp, ngắn hơn so với trình tự trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi là 79 bp, sự khác biệt chủ yếu chỉ nằm trong vùng D-loop, trong đó có sự khác biệt số lượng motif lặp

‘CGTGCGTACA'

3.3 Phân tích hệ gen ty thể

3.3.1 Phân tích thành phần hệ gen ty thể

Tỷ lệ thành phần các loại nucleotide được liệt kê tại bảng 3.5

Bảng 3.5 Tỷ lệ thành phần base ở hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản

địa Việt Nam

các giống lợn bản địa Việt Nam với các giống lợn khác trên thế

AT skew

sông

AT skew

"-" : Trình tự hoàn chỉnh chưa được công bố

Các chỉ số GC skew ở các giống lợn đều mang giá trị âm,

AT skew đều mang giá trị dương Như vậy, xét về tiến hóa, xu hướng thay đổi thành phần nucleotide giữa các giống lợn là không có khác biệt lớn Đối với trình tự hoàn chỉnh, toàn bộ sáu giống lợn nghiên cứu đều giống nhau về trị số GC skew và AT skew với giá trị tương ứng là -0,33 và 0,15 Ở hai giống Hương và Mường Lay cùng với giống WB-Yunnan của Trung Quốc trình tự hoàn chỉnh ít có sự chênh lệch nhất giữa C và G tương ứng là 0,30 và 0,31 Giống lợn Hương là giống có độ lệch giữa hai loại nucleotide A và T thấp nhất (0,14) So sánh giữa vùng trình tự D-loop và trình tự hoàn chỉnh, có thể thấy vùng D-loop ở đa phần các giống lợn đều có chỉ số AT skew cao hơn, tức là có mức độ biến đổi thành phần nucleotide loại A và T cao hơn Giá trị trung bình cộng của trị số GC skew đối với các giống lợn bản địa Việt Nam (-0,32) cao hơn so với giá trị trung bình cộng của các giống lợn khác trên thế giới (-0,34) Về lý thuyết, các chỉ số độ lệch này cũng cho phép đánh giá một phần độ đa dạng di truyền và gián tiếp xác định các mối quan hệ về phát sinh chủng loại Tuy nhiên sự khác biệt là chưa đủ lớn giữa các đối tượng nghiên cứu, nên chưa thể đưa ra suy luận khoa học cụ thể nào theo hai hướng trên

từ các chỉ số GC skew và AT skew

3.3.2 Chú giải cấu trúc hệ gen ty thể

Kết quả chú giải cấu trúc hệ gen ty thể của các giống lợn