Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia a bằng kỹ thuật microsatellite DNA

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng những tiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rất nhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BÙI THỊ MINH PHƯỢNG

PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A

BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA

Chuyên ngành: Hóa sinh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn,

PGS.TS Trần Vân Khánh, là cán bộ hướng dẫn, đ tận tình chỉ bảo và truyền

đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi

trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

Các cán bộ viên chức Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein trường Đại học

Y Hà Nội đ giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện các kỹ thuật nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn:

Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Bộ môn Hóa sinh

Trường Đại học Y Hà Nội

Đảng ủy, Ban Giám hiệu, các Phòng chức năng, Bộ môn-khoa Hóa sinh, Trường Đại học Y Dược Thái Bình đ tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Nhà khoa học trong hội đồng đánh giá luận án tiến sỹ cấp cơ sở, cấp trường đ đóng góp cho tôi nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thiện luận án được tốt hơn

Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu thương của cha mẹ tôi, cha mẹ chồng cùng sự ủng hộ, giúp đỡ, động viên của chồng và hai con, người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đ luôn động viên giúp đỡ tôi cả về tinh thần, vật chất để tôi có thể hoàn thành được nhiệm vụ học tập, nghiên cứu của mình

Trân trọng cám ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2019

Tác giả

Bùi Thị Minh Phượng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Bùi Thị Minh Phượng, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học

Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy GS.TS Tạ Thành Văn và Cô PGS.TS Trần Vân Khánh

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đ được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đ được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này./

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

NGƯỜI VIẾT CAM ĐOAN

Bùi Thị Minh Phượng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BVSKTE Bảo vệ sức khoẻ trẻ em

DMD Duchenne Muscular Dystrophy (Bệnh Duchene)

FISH Fluorescent In Situ Hybridization ( Lai huỳnh quang)

ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection

IVF In Vitro Fertilization ( Thụ tinh trong ống nghiệm)

MLPA Multiplex Ligation Probe Amplification

PGD Preimplantation Genetic Diagnosis

PGT Preimplantation genetic testing

RT – RCR Reverse Transcription PCR

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A 4

1.1.1 Định nghĩa 4

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu 4

1.1.3 Dịch tễ bệnh học 4

1.1.4 Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A 5

1.2 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A 8

1.2.1 Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A 8

1.2.2 Cơ sở phân tử bệnh hemophilia A 9

1.3 NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A 14

1.3.1 Đặc điểm chung người mang gen bệnh 14

1.3.2 Cơ chế di truyền của người mang gen bệnh hemophilia A 14

1.3.3 Triệu chứng của người mang gen 16

1.3.4 Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh 17

1.4 CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH HEMOPHILIA A 23

1.4.1 Sàng lọc thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A 23 1.4.2 Xét nghiệm chẩn đoán trước sinh 24

1.5 PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) VÀ QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ (PGD) 25

1.5.1 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) 25

1.5.2 Quy trình chẩn đoán gen trước làm tổ (PGD) 27

1.5.3 Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng trong việc chẩn đoán trước làm tổ 32

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI

VỀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ 40

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam 40

1.6.2 Tình hình nghiên cứu chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A 43 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 47

2.2 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 48

2.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị 48

2.2.2 Hoá chất 49

2.2.3 Trình tự mồi cho phản ứng 51

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 52

2.3.2 Địa điểm nghiên cứu 54

2.3.3 Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 54

2.3.4 Quy trình xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA 58

2.3.5 Quy trình chẩn đoán trước làm tổ 61

2.4 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU TRONG Y HỌC 64

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 65

3.1 KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN F8 BỊ ĐỘT BIẾN BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA 65

3.1.1 Kết quả xác định marker dị hợp tử gen F8 trên bệnh nhân và người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite DNA 65

3.1.2 Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA 69

3.2 KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA BẰNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA 91

3.2.1 Kết quả kích thích buồng trứng và thực hiện ICSI 91

3.2.2 Kết quả chẩn đoán tiền làm tổ của các gia đình hemophilia A 93

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 109

KẾT LUẬN 139

KHUYẾN NGHỊ 140 CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Trình tự mồi khuếch đại các STRs sử dụng trong nghiên cứu 51Bảng 2.2: Thành phần phản ứng master mix 56Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR sequencing 56Bảng 2.4: Thành phần và điều kiện của phản ứng single-PCR khuếch đại

các STR đặc hiệu trên gen F8 59Bảng 2.5: Chu trình nhiệt phản ứng single-PCR 59Bảng 2.6: Thành phần và điều kiện phản ứng multiplex-PCR khuếch đại

các STR đặc hiệu trên gen F8 và vùng gen đặc hiệu trên NST giới tính 62Bảng 2.7: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex-PCR 62Bảng 2.8: Thành phần hóa chất sử dụng cho điện di mao quản 63Bảng 3.1: So sánh kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng 2

phương pháp 88Bảng 3.2: Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật

microsatellite DNA 89Bảng 3.3: Kết quả đánh giá về tỷ lệ phôi phát triển sau khi thụ tinh 91Bảng 3.4: Kết quả đánh giá sự phát triển của các phôi thu được ngày 3 92Bảng 3.5: Kết quả sinh thiết phôi chẩn đoán gen và đánh giá sự phát triển

phôi sau sinh thiết 3 ngày 93

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A 5Hình 1.2 Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A 6Hình 1.3 Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau 8Hình 1.4 Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương 10Hình 1.5 Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X 10Hình 1.6 Cấu trúc gen và protein FVIII 11Hình 1.7 Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng 12Hình 1.8 Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường15Hình 1.9 Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh 15Hình 1.10 Sơ đồ phả hệ của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường 18Hình 1.11 Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh 19Hình 1.12 Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm 27Hình 1.13 Sinh thiết phôi bào giai đoạn blastomere cho chẩn đoán PGD 30Hình 1.14 Ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán xác định giới tính

và số lượng nhiễm sắc thể 34Hình 1.15 Sơ đồ phả hệ của một gia đình mang gen đột biến đảo đoạn

intron 22 gây bệnh hemophilia A 44Hình 1.16 Hình ảnh các marker dị hợp tử xác định đột biến gen F8 gây

bệnh hemophilia A 45Hình 1.17 Kết quả multiplex PCR sử dụng marker amel, SRY, FXS1108,

DXS9798, trên phôi bào sinh thiết 46Hình 2.1 Kết quả STR lựa chọn marker dị hợp tử 59Hình 2.2 Kỹ thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán đột biến gen gây

bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X 60Hình 2.3 Kết quả STR xác định giới tính 63Hình 3.1 Kết quả đồng hợp tử và đồng hợp tử của STR 65

Hình 3.2 Kết quả khuếch đại các marker DXS9901, FXS1108, F8int22 và

DXS9897 66

Hình 3.3 Tần suất alen của marker FXS 1108 67

Hình 3.4 Tần suất alen của marker DXS9897 67

Hình 3.5 Tần suất alen của marker F8int22 68

Hình 3.6 Tần suất alen của marker DXS9901 68

Hình 3.7 Sơ đồ phả hệ gia đình HA 61 69

Hình 3.8 Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA61 70

Hình 3.9 Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108, DXS9897 và F8int22 của gia đình HA61 71

Hình 3.10 Sơ đồ phả hệ gia đình HA37 sau khi phân tích bằng hai phương pháp 73

Hình 3.11 Ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA37 74

Hình 3.12 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker DXS9901 và DXS9897 của gia đình m số HA37 75

Hình 3.13 Sơ đồ phả hệ gia đình HA50 sau khi phân tích bằng hai phương pháp 76

Hình 3.14 Hình ảnh giải trình tự gen gia đình HA50 77

Hình 3.15 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker DXS9901, DXS9897 và FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA50 78

Hình 3.16 Sơ đồ phả hệ gia đình HA16 80

Hình 3.17 Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình m số HA16 81

Hình 3.18 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker DXS9901 và DXS9897 của gia đình HA16 82

Hình 3.19 Sơ đồ phả hệ gia đình HA30 sau khi phân tích 84 Hình 3.20 Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số HA30 85

Hình 3.21 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker DXS9901 và

FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA30 86Hình 3.22 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker F8int22,

DXS9897 và DXS9901 của gia đình m số HA09 90Hình 3.23 Kết quả khuếch đại các marker FXS1108, F8int22, và DXS9897 95Hình 3.24 Kết quả multiplex PCR khuếch đại 3 marker dị hợp tử FXS1108,

DXS9897 và F8int22 và 2 marker giới tính Amel và SRY trên mẫu bệnh nhân HA61 96Hình 3.25 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS 1108,

F8int22, DXS 9897 xác định phôi nam bình thường của gia đình HA61 97Hình 3.26 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS 1108,

F8int22, DXS9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA61 98Hình 3.27 Sơ đồ phả hệ phôi gia đình HA61 99Hình 3.28 Kết quả khuếch đại các marker FXS1108 và DXS9897 100Hình 3.29 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108 và

DXS9897 của người mẹ so sánh với bệnh nhân HA28 101Hình 3.30 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,

DXS9897 xác định phôi nam bình thường gia đình HA28 103Hình 3.31 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,

DXS9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA28 104Hình 3.32 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,

DXS9897 xác định phôi nữ mang gen gia đình HA28 105Hình 3.33 Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng marker FXS1108,

DXS9897 xác định phôi nữ không mang gen gia đình HA28 106Hình 3.34 Sơ đồ phả hệ gia đình HA28 107Hình 3.35 Tỷ lệ phôi bất thường và không bất thường về gen 108

dự trao giải thưởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn và hiệu quả mà phương pháp này mang lại [2] Phương pháp này đ mang lại niềm vui, niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy nhiên không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh được những đứa con mong muốn bằng phương pháp này Tỷ lệ thành công của phương pháp này chỉ đạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia [3] Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công của phương pháp này như: tuổi bố mẹ, tình trạng sức khỏe, tinh thần tâm lý, chất lượng tinh trùng và trứng… và đặc biệt chất lượng phôi sau khi thụ tinh Các phôi có thể bất thường nhiễm sắc thể (NST) thường hay NST giới tính đều làm giảm khả năng mang thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung,

có thể gây sảy thai hoặc sinh ra những đứa con không khỏe mạnh [4],[5], [6],[7] Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứa con không khỏe mạnh và làm tăng

tỷ lệ thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm, thời gian gần đây các nhà khoa học đ áp dụng quy trình chẩn đoán phôi “Pre-Implantion Genetic Diagnosis, PGD” còn gọi là “chẩn đoán di truyền trước làm tổ” nhằm có được những phôi tốt nhất cho quá trình chuyển phôi [8],[9],[10]

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng những tiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rất nhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thường trên NST, cả các đột biến gen quan trọng gây ung thư đều có thể được sàng lọc bằng kỹ thuật PGD [11],

[12],[13],[14-15] Trong số đó, bệnh hemophilia A (bệnh ưa chảy máu) là loại bệnh có tỷ lệ mắc cao, bệnh cảnh lâm sàng nặng nề và thường gây ra những sang chấn lớn về tâm lý cho gia đình và cho người bệnh Vì vậy vấn đề đặt ra

là chúng ta phải làm sao giúp cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh

hemophilia A sinh được những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh

Hemophilia A là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu VIII [16],[17] Hemophilia A là bệnh di truyền alen lặn trên NST X không có alen trên NST Y, nên người mẹ mang gen bệnh sẽ di truyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng [18] Theo thống kê của tổ chức hemophilia A thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A và chỉ có khoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu [19] Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000 người mang gen bệnh hemophilia A [20] Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy máu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảy máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ biểu hiện trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong huyết tương

Việc tầm soát trước sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quan trọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh Việc xác định đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A đ được nghiên cứu khá nhiều ở Việt Nam Việc quản lý bệnh nhân và người mang gen của bệnh lý này là tiền đề vững chắc để triển khai thành công quy trình chẩn đoán trước làm tổ trong sàng lọc phôi Phương pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho người mẹ khi mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khi chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh ở cộng đồng Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử phát hiện các đột biến gây bệnh hemophilia A, kỹ thuật

microsatellite DNA là kỹ thuật sử dụng các primer gắn huỳnh quang để khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn (short tandem repeat-STR) và phân tích kích thước của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen

để xác định các alen đột biến Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là dễ dàng phát hiện alen đột biến mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ giảm được chi phí cho gia đình bệnh nhân Hiện nay kỹ thuật này còn khá mới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền Xuất

phát từ thực tế đó đề tài: “Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn

đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA”

được đưa vào nghiên cứu với mục tiêu:

1 Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA

2 Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A

1.1.1 Định nghĩa

Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương - thiếu hụt yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, thiếu hụt yếu tố XI gây bệnh hemophilia C Bệnh hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất [21], [22]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu

Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kết với giới tính được phát hiện từ những năm 80 của thế kỷ 19 Vào thời điểm này, các nhà khoa học nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho con trai nhưng truyền gen bệnh cho con gái và người con gái này có thể truyền gen bệnh cho con trai mình Bệnh hemophilia A còn được biết đến như căn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang gen bệnh này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau

1.1.3 Dịch tễ bệnh học

Theo thống kê của tổ chức hemophilia thế giới (World Federation

of Hemophilia - WFH), hiện nay có khoảng 500.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có khoảng 1/3 được chẩn đoán [23] Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A gần giống nhau ở các vùng địa lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000 dân Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000  1/5.000 trẻ trai [24] Tại Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000 bệnh nhân hemophilia Số liệu điều tra những năm 1994  1996 về tình hình bệnh hemophilia ở miền

Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là 25  60/1.000.000 dân Tại mít tinh hưởng ứng ngày hemophilia thế giới (17-4-2016), hội rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đ công bố có

6000 người bị bệnh chảy máu di truyền [25]

1.1.4 Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A

1.1.4.1 Đặc điểm chảy máu trong bệnh hemophilia A

Bệnh đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy máu Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết Xuất huyết có thể tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu dưới da,

tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp

Chảy máu khớp thường gặp nhất ở bệnh nhân hemophilia A Đây là loại chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp [26] Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương Nếu điều trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sưng và việc điều trị

bị kéo dài tới vài ngày Trẻ lớn có thể nhận biết được chảy máu khớp trước khi đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp Điều trị sớm

trạng khuyết tật trong chứng chảy máu Chảy máu trong cơ cũng thường gặp

và xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương Những cơ hay bị chảy máu là:

cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vài ngày Một dấu hiệu quan trọng và kín đáo trong chảy máu cơ là cảm giác đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì Nếu không được điều trị sớm cơ sẽ bị phá huỷ và có thể gây liệt [23]

Hình 1.2 Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A

(Nguồn: http://hemoviet.org.vn)

Ngoài ra bệnh nhân có thể bị chảy máu não, chảy máu ở các vị trí khác nhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da có thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị Chảy máu miệng, lợi và mũi cũng hay gặp Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu

1.1.4.2 Các xét nghiệm cận lâm sàng để chẩn đoán bệnh

Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân hemophilia A:

- Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1

giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài…

+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm hoặc không có

+ Yếu tố Von - Willebrand trong máu bình thường

+ Số lượng tiểu cầu trong máu bình thường

1.1.4.3 Chẩn đoán bệnh

 Chẩn đoán xác định [21]

- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu

- Dựa vào tiền sử gia đình

- Dựa vào xét nghiệm máu:

+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (Prothrombin Time: thời gian prothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated Partial Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài

> 1,5 giá trị bình thường

+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%

+ Yếu tố Von Willebrand bình thường

+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII

 Chẩn đoán mức độ bệnh

Mức độ

Nồng độ yếu tố VIII (%) (hoạt tính (UI/ml))

Biểu hiện chảy máu

Nặng

Chảy máu tự nhiên không liên quan đến chấn thương, thường chảy máu ở khớp và cơ

Trung bình

Chảy máu tự nhiên hoặc liên quan đến chấn thương nhỏ Chảy máu nặng sau chấn thương, phẫu thuật

Nhẹ

Chảy máu sau chấn thương lớn hoặc phẫu thuật

1.2 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A 1.2.1 Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A

Đây là một bệnh di truyền lặn liên kết với NST giới tính X, không có alen trên NST Y: Ở nam chỉ có một NST giới tính X nên nếu NST giới tính

X mang gen bệnh thì lượng yếu tố VIII tạo ra không đủ và người đó bị bệnh hemophilia A [27] Đối với nữ giới nhờ có hai NST giới tính X nên nếu một NST giới tính X mang gen bệnh thì gen bình thường trên NST còn lại vẫn tổng hợp yếu tố VIII bình thường Người phụ nữ không bị bệnh nhưng mang một gen bị bệnh sẽ truyền cho con trai và người con trai sẽ bị bệnh, nếu truyền cho con gái thì người con gái sẽ trở thành người mang gen bệnh

Hình 1.3 Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau

1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh (XHXh) và 100% con trai bình thường (XH

Y)

3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (Xh

Xh) đồng hợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XH

Xh), 50% con trai bị bệnh và 50%

con trai bình thường (XHY) Như vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thương tổn: Xh

Xh), nữ mang gen bệnh khi mang dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XHXh)

4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc

từ người mẹ: thường chiếm khoảng 1/3 các trường hợp hemophilia A Tỉ lệ đột biến gây bệnh hemophilia xảy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trong một thế hệ [31] Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam cao hơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ Gần đây, người ta đ chứng minh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến Đột biến đảo đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bào mầm sinh dục nữ Hiện tượng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thể thứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phân bào giảm nhiễm ở nam

1.2.2 Cơ sở phân tử bệnh hemophilia A

Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đ cho thấy những

hiểu biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein FVIII, mở

đường cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophilia A và các dạng

đột biến gen F8 gây bệnh

Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồng yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca2+

và phospholipid tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thành thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu tố thành mạch Việc thiếu hụt hoặc bất thường chức năng yếu tố VIII làm ngừng trệ dòng thác đông máu theo con đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu kéo dài, không cầm ở bệnh nhân hemophilia A

Hình 1.4 Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương 1.2.2.1 Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII

Gen F8 quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới

tính X, là một trong những gen lớn nhất của người, có kích thước 186 Kb gồm

26 exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62bp đến 262bp và 2 exon lớn nhất là exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), m hóa 9 Kb mRNA Người

đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối

loạn quá trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A [28]

Hình 1.5 Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X

(Nguồn: www.hemophilia.com)

Fibrinogen Fibrin ổn đinh fibrin

Nhiễm sắc thể X

Gen mã hóa yếu tố VIII có chuỗi nặng với đầu cuối là N, gồm các domain A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A3-C1-C2 và vùng B Khi thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và threonin Vùng B không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình dịch m , domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII

1.2.2.2 Protein yếu tố VIII

Hình 1.6 Cấu trúc gen và protein FVIII [29]

Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3-Cl-C2, gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước 200 kD, chuỗi nhẹ

là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD Cấu trúc của phức hợp này được giữ

ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ nước với yếu tố von Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tố VIII) và Ca2+ Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các vùng A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối

là C, gồm các vùng A3-C1-C2 Vùng B được mã hóa bởi một exon lớn và

không có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đ biết Khi thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và threonin Vùng B không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII

Hình 1.7 Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng

(Nguồn w.w.w nature.com/revieus/genetics)

ng ( 1 2 3) là nơi bám c a các ion Ca 2+

, Cu 2+ và các yếu t I trong quá tr nh đ ng máu ng C (C1 C2) là vị tr bám cho yếu t v

và c a các phân t phospholipid một hi III đư c ho t h a ng chứa

vị tr cắt c a thrombin đ đư c lo i bỏ trong phân t III trong quá tr nh

ho t h a FVIII

1.2.2.3 Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A

Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Nghiên cứu

của Oldenburg và cộng sự đ chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%) tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và intron 22 (36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 – 15% Tùy

thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặng

ị tr bám cho yếu t vWF, X

Đột biến điểm

Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen Nghiên

cứu của Shima và cộng sự chỉ ra rằng đột biến thay thế arginin thành histidin tại vị trí 372 gây biến đổi vị trí cắt của thrombin và làm quá trình hoạt hóa yếu tố VIII bị rối loạn, hoạt tính yếu tố VIII giảm mạnh còn 3  5% [30] Năm 2000, Jacquemin và cộng sự đ chứng minh đột biến thay thế Serin thành Tyrosin tại vị trí 2119 (vùng C2) làm giảm đột ngột khả năng tương tác giữa yếu tố VIII và yếu tố vWF, dạng đột biến này thường gặp ở thể nhẹ

và trung bình [31]

Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hưởng tới acid amin arginin, phần lớn các bệnh nhân mang đột biến này đều ở thể nặng [16-19]

Đột biến đảo đoạn

Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trình

hoạt hóa yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chính gây

ra các dạng đột biến đảo đoạn ở bệnh nhân hemophilia A thể nặng [32]

Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn

50% các thể bệnh nặng Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu mút

telomere, NST X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tự tương đồng

đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1) Quá trình tái

tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùng int22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26) cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tố VIII [32]

Đột biến mất đoạn và thêm đoạn của gen yếu tố VIII

Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng

Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen Cơ chế phân tử của dạng đột biến này đ được kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tượng lặp lại alu

[17] Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tượng alu làm đứt g y gen F8 và gây

bệnh hemophilia A thể nặng Xóa đoạn và thêm đoạn nhỏ cũng thường thấy trong hemophilia A thể nặng, trong đó thay đổi 1-55 nucleotid Phổ biến nhất

là xóa hoặc thêm nucleotid adenin vào exon 14, thường xảy ra trong vùng từ c.3637 đến c.4379 [33]

1.3 NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A

Hemophilia A là bệnh rối loạn di truyền do gen lặn nằm trên NST giới tính X, gây nên do đột biến yếu tố VIII Việc chẩn đoán người lành mang gen bệnh là rất quan trọng để ngằn ngừa sự ra đời của những đứa trẻ bị bệnh hemophilia A [34]

1.3.1 Đặc điểm chung người mang gen bệnh

Người lành mang gen bệnh là người mang một NST X có đột biến gen

F8 và một NST X bình thường Biểu hiện lâm sàng có thể nặng hoặc nhẹ

Người lành mang gen bệnh có triệu chứng như một người bị hemophilia

A thể nhẹ Những người mang gen bệnh hemophilia A có hoạt tính yếu tố VIII huyết tương thấp hơn bình thường, tuy nhiên cũng có những người mang gen bệnh có hoạt tính yếu tố VIII rất thấp dưới 4% gây chảy máu như thể nặng Khoảng 20% người lành mang gen bệnh biểu hiện triệu chứng chảy máu với các mức độ khác nhau, bao gồm cả những người có hoạt tính yếu tố VIII huyết tương trong giới hạn bình thường (40 đến 60%) [35]

1.3.2 Cơ chế di truyền của người mang gen bệnh hemophilia A

Nếu người mẹ mang gen bệnh kết hôn với một người bố bình thường thì xác suất mỗi lần sinh con của họ là: 25% con trai bình thường, 25% con trai bị bệnh, 25% con gái bình thường, 25% con gái mang gen bệnh

Hình 1.8 Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường

Nếu một người bố bị bệnh hemophilia A kết hôn với người mẹ bình thường thì có khả năng sinh 100% con gái mang gen bệnh hemophilia A, 100% con trai bình thường

Hình 1.9 Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh

Tất cả những người phụ nữ mang gen và những người có khả năng mang gen bệnh đều cần làm xét nghiệm tình trạng mang gen

Mẹ mang

thường

Con gái bình thường Con gái manggen

Con trai bị bệnh

Con trai bình thường

Mẹ bình

Con gái mang gen Con trai bình thường

1.3.3 Triệu chứng của người mang gen

- Chảy máu sản, phụ khoa:

+ Kinh nguyệt kéo dài (hơn bảy ngày), rong kinh là một trong những triệu chứng phụ khoa phổ biến nhất Có thể nặng nề với số lượng máu mất trong khoảng thời gian dài Theo thống kê, có đến 1/3 số phụ nữ bỏ lỡ đáng

kể thời gian học hoặc làm việc do rong kinh Đó cũng có thể là nguyên nhân của tình trạng thiếu sắt, thiếu máu và làm giảm chất lượng cuộc sống ở phụ nữ mang gen bệnh Chảy máu nặng trong kỳ kinh nguyệt đầu tiên của một người lành mang gen bệnh có thể dẫn đến phải nhập viện [35]

+ Chảy máu bất thường âm đạo (băng huyết)

Băng huyết liên quan đến chảy máu bất thường xảy ra ngoài chu kỳ kinh nguyệt bình thường Chảy máu bất thường xảy ra đôi khi trong khoảng thời gian giữa phần cuối của một chu kỳ kinh nguyệt với kỳ kinh bắt đầu tiếp theo Nếu chảy máu nặng nề cần nghỉ ngơi tại chỗ hoặc nhập viện để theo dõi

+ Chảy máu ổ bụng (hemoperitoneum)

Máu có thể chảy vào các mô xương chậu và dây chằng, đôi khi vào ổ bụng và vùng chậu, gọi là chảy máu ổ bụng, là một cấp cứu ngoại khoa có thể

đe dọa đến tính mạng

+ Chảy máu sau khi sinh:

Người mang gen bệnh hemophilia A có nguy cơ bị xuất huyết trong thai kỳ Tuy nhiên, trong thực tế, do ảnh hưởng của hormon làm tăng hoạt tính yếu tố VIII trong huyết tương nên nguy cơ này giảm xuống

- Các chảy máu khác:

 Dễ bầm tím

 Chảy máu kéo dài từ vết thương nhỏ

 Chảy máu cam

 Chảy máu kéo dài sau khi nhổ răng

 Chảy máu nặng sau khi chấn thương hoặc phẫu thuật

Chảy máu khớp và cơ bắp không phải là triệu chứng hay gặp ở những người mang bệnh hemophilia A trừ trường hợp hoạt tính yếu tố VIII huyết tương rất thấp (dưới 4%) Nghiên cứu gần đây đ chỉ ra rằng nguy cơ chảy máu kéo dài (nhiều hơn năm phút) từ vết thương nhỏ hoặc sau khi phẫu thuật ở người mang gen bệnh hemophilia A có triệu chứng có thể cao gấp đôi so với những người mang gen bệnh không biểu hiện triệu chứng trong cùng một gia đình

1.3.4 Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh

Người phụ nữ mang gen bệnh ngoài việc sinh ra những đứa trẻ bị bệnh

và những đứa con mang gen bệnh, những đứa con mang gen bệnh này lại có khả năng sinh ra những đứa con bị bệnh Vì vậy, nếu không quản lý hay phát hiện được những người phụ nữ mang gen bệnh thì thế hệ tiếp theo sẽ gia tăng

tỷ lệ những đứa con mang bệnh và mang gen bệnh Vì vậy, việc xác định sớm những người phụ nữ mang gen bệnh sẽ giúp cho họ có định hướng, chủ động trong việc kết hôn và sinh ra những đứa con khỏe mạnh

1.3.4.1 Định lượng các yếu tố đông máu

Người phụ nữ mang gen thường có yếu tố VIII thấp hơn người phụ nữ bình thường, một số người cũng có biểu hiện chảy máu lâu cầm như người bệnh hemophilla A thể nhẹ Sử dụng nồng độ yếu tố VIII phát hiện người lành mang gen đúng được 70-90% theo Nguyễn Anh Trí viện huyết học truyền máu Trung ương [36]

1.3.4.2 Phát hiện người lành mang gen bệnh dựa vào phân tích phả hệ

Phả hệ là sơ đồ di truyền của một gia đình Để xây dựng phả hệ cần phải

có tối thiểu 3 thế hệ gần nhất cần phải khai thác kỹ tiền sử bản thân bệnh nhân và các thành viên của gia đình bệnh nhân

Phân tích phả hệ sẽ phát hiện được quy luật di truyền của bệnh hemophilia A Trong bệnh lý hemophilia A, gen đột biến gây bệnh nằm trên NST X, không alen có trên NST Y, nên theo quy luật di truyền menden, sơ đồ phả hệ có thể phát hiện nam giới bị bệnh, nam giới bình thường, nữ giới mang gen và nữ giới bình thường

Nếu một người mẹ mang gen bệnh lấy một người bố bình thường thì xác suất sinh con của họ là: 25% con gái mang gen bệnh, 25% con gái bình thường, 25% con trai bị bệnh, 25% con trai bình thường

Hình 1.10 Sơ đồ phả hệ của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường

Nếu một người mẹ mang gen bệnh kết hôn với người bố bị bệnh thì xác suất sinh con của họ: 25% con gái bị bệnh, 25% con gái mang gen bệnh, 25% con trai bị bệnh, 25% con trai bình thường

Hình 1.11 Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh [23]

Theo những phân tích di truyền phả hệ thì:

Một người phụ nữ mang gen khi chắc chắn thỏa m n một trong bốn điều kiện sau:

Có ít nhất hai con trai bị bệnh, là con của bệnh nhân hemophilia A; Có một con trai bị bệnh có ít nhất một người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh; Có một con trai bị bệnh và trong gia đình họ mẹ có ít nhất một người được chẩn đoán là mang gen bệnh

Một người có khả năng mang gen bệnh khi thỏa m n một trong ba điều kiện sau: Có một con trai bị bệnh và trong gia đình không có ai bị bệnh cũng như mang gen bệnh; có ít nhất một người đàn ông trong họ mẹ bị bệnh và không có con trai bị bệnh, là con của một người mang gen bệnh [37]

Trong những gia đình có người con trai mắc bệnh hemophilia A, người

ta thường lập phả hệ để xác định tình trang mang gen của người mẹ Tuy nhiên, phương pháp này cung cấp rất ít thông tin về tình trạng mang gen của người phụ nữ nên cần phải có số lượng gia đình lớn để có thể tính toán [38]

1.3.4.3 Phát hiện người lành mang gen bệnh dựa vào phân tích gen

 Phân tích trực tiếp

Việc phân tích gen của bệnh nhân hemophilia A có thể phát hiện được

đột biến trên gen F8 Để chẩn đoán một người phụ nữ mang gen bệnh hay

không người ta thường dựa vào việc phân tích đột biến trên của người phụ nữ

ấy có cùng kiểu đột biến với bệnh nhân hemophilia A hay không? Quy trình chung cho các kỹ thuật phân tích đột biến trực tiếp bắt đầu từ việc lấy máu tĩnh mạch của bệnh nhân, tách chiết DNA và thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định loại đột biến: đột biến điểm, đảo đoạn, mất đoạn… Sau

đó sẽ dựa vào đột biến đó xác định được đột biến trên người mang gen

Việc phát hiện đột biến trực tiếp chủ yếu dựa vào kỹ thuật PCR và giải trình tự gen Với những kỹ thuật này có thể phát hiện 89,3% đột biến và vẫn

bỏ xót những đột biến chưa phát hiện được [39] Tuy nhiên, do gen F8 có kích thước và trọng lượng phân tử lớn và sự đa dạng về kiểu đột biến nên phương pháp phân tích trực tiếp đòi hỏi phải có kỹ thuật cao có độ chính xác cao, và chi phí đắt

* Phát hiện đột biến điểm bằng ỹ thuật giải tr nh tự gen

Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng dideoxynucleotid (ddNTP) do Sanger và cộng sự phát minh Với các máy thế

hệ sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng, không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây Đối với phương pháp giải trình tự tự động, hệ thống điện di thường sử dụng là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3‟ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó

biết được trình tự của DNA đích Phương pháp này giúp xác định các đột biến điểm của gen dystrophin như đột biến điểm, đột biến xoá đoạn….và là một

tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện các đột biến gen F8

*Phát hiện đột biến đảo đo n gen 8

a/ Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22

Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn 45% các thể bệnh nặng [17] Inversion- PCR (I-PCR) là kỹ thuật chính được

sử dụng để phát hiện đột biến đảo đoạn này Phương pháp được miêu tả bởi Rosetti và cộng sự năm 2005 [40] Quy trình gồm 3 bước: (1) Cắt bằng enzym BclI,(2) Nối bằng T4 ligate, (3) Khuếch đại bằng phản ứng Multiplex PCR Phương pháp I-PCR có ưu điểm là dễ tiến hành Enzym BclI tác dụng rất đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym có tính đặc hiệu cao Sản phẩm PCR được khuếch đại dễ dàng trong thời gian khoảng 30 phút do các đoạn DNA có kích thước ngắn (487 và 559 bp) Như vậy xét nghiệm phân tích gen được tiến hành nhanh chóng, kết quả thu được có độ tin cậy cao, dễ thực hiện

b Phương pháp phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1

Hiện tượng tái tổ hợp cũng diễn ra tương tự giữa int1h1 (nằm trong intron 1) có kích thước 900 bp và vùng trình tự tương đồng int1h2 cách gen

F8 một đoạn 140 kb về phía đầu mút telomere gây nên dạng đột biến đảo đoạn intron 1 xuất hiện ở 5% các thể bệnh nặng [21]

Phương pháp xác định đảo đoạn intron 1 được mô tả bởi Bagnal và cộng

sự năm 2002 [41]:

+ Thiết kế hai phản ứng Multiplex PCR có thể phát hiện được các bệnh nhân bị đột biến Phản ứng 1 có chứa các cặp mồi đặc hiệu cho int1h1 cộng với một mồi đặc hiệu cho chuỗi int1h2; phản ứng 2 chứa cặp mồi đặc hiệu cho int1h2 cộng với một mồi đặc hiệu cho int1h1 Dựa vào kích thước khác nhau của các đoạn DNA sau khi điện di để phát hiện đột biến Trường hợp không có đột

biến đảo đoạn intron 1, phản ứng 1 chỉ có mồi int1h1 bắt cặp cho kích thước

1908 bp Ở phản ứng 2 chỉ có mồi đặc hiệu cho int1h2 bắt cặp cho kích thước

1191 bp Nếu đột biến xảy ra, mồi int1h1 bắt cặp với int1h2 ở cả hai phản ứng sẽ cho các kích thước 1323 bp và 1776 pb tương ứng ở phản ứng 1 và phản ứng 2

*Phát hiện đột biến mất đo n lặp đo n gen 8

Trong những năm gần đây, MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) là phương pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8 Kỹ thuật MLPA (khuếch đại đa đoạn dò) được mô tả lần đầu vào năm 2002 bởi Schouten J.P và CS, đây là phiên bản mới của phản ứng PCR, trong đó nhiều đoạn DNA đích được khuếch đại chỉ bằng 1 cặp mồi [42]

- Kỹ thuật MLPA sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai hóa với phân tử DNA đích đặc hiệu và vấn đề thiết kế các probe rất quan trọng

Mỗi đoạn dò gồm 2 chuỗi oligonucleotide có kích thước khác nhau (gọi

là đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược)

+ Đoạn dò xuôi: gồm Đầu 5‟và đầu 3‟, đoạn ngược gồm: Đầu 3‟, đầu 5‟và phần nối giữa đầu 5‟ với đầu 3‟ Các đoạn probe sẽ gắn đặc hiệu vào các exon của phân tử DNA đích, sau đó enzym ligase được thêm vào để nối hai đoạn probe này lại với nhau tạo thành đoạn probe hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Phân tích kết quả MLPA là bước quan trong trong kỹ thuật Phân tích được tiến hành dựa trên hành ảnh,

dữ liệu thô tương ứng với từng probe

 Phân tích gián tiếp

Phân tích gián tiếp dựa trên việc phân tích di truyền sự đột biến dựa vào sự

đa hình thái của các alen Đa hình là những thay đổi dựa trên trình tự nucleotid của gen dẫn đến tính đa dạng tạo ra sự khác biệt giữa người này và người khác nhưng không ảnh hưởng tới chức năng của gen đó, đa hình phải nằm trên NST

X, di truyền cùng gen yếu tố VIII và mang thông tin Giá trị thông tin đa hình là tần suất xuất hiện, tỷ lệ dị hợp tử và tương tác liên kết với đa hình khác Giá trị này khác nhau giữa các chủng tộc người Người dị hợp tử về đa hình nào là người có hai alen khác nhau về đa hình đó trên hai NST X của mình và được gọi là có thông tin Tỷ lệ dị hợp tử đa hình càng cao thì khả năng chẩn đoán càng tốt Tỉ lệ dị hợp tử của các marker đa hình này rất thay đổi ở các tộc người khác nhau Bên cạnh đó, có một số đa hình liên kết tương quan với nhau Nói cách khác là có một alen của đa hình này liên kết với một alen của đa hình khác

vì vậy khi phối hợp 2 đa hình này với nhau sẽ ít làm tăng tỉ lệ có thông tin Chính vì vậy, để đảm bảo hiệu quả cho việc chẩn đoán, việc chọn lựa sử dụng

đa hình nào cần căn cứ vào tỉ lệ dị hợp tử cũng như sự liên kết tương quan giữa các đa hình của quần thể người đó

1.4 CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH HEMOPHILIA A

1.4.1 Sàng lọc thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A

Các thai phụ đ có con bị bệnh hemophilia A là những người có nguy

cơ cao mang gen bệnh, do vậy được xếp vào nhóm thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A

Kết quả phân tích gen cho biết thai phụ có mang gen bệnh hay không Nếu thai phụ mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp tử, việc lấy mẫu tế bào thai nhi để phân tích phát hiện đột biến là điều không tránh khỏi, cho dù việc lấy mẫu xâm phạm thai có thể ảnh hưởng an toàn đến thai nhi Nếu thai phụ

không mang gen F8 đột biến, có thể tư vấn cho gia đình không cần tiến hành

chẩn đoán trước sinh vì các phương pháp chẩn đoán trước sinh hiện nay vẫn thực hiện quy trình lấy mẫu bằng kỹ thuật chọc hút dịch ối, ảnh hưởng không tốt đến thai phụ và thai nhi

Sau quá trình phân tích sàng lọc, những thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemophilia A sẽ được tiến hành lấy mẫu tế bào thai nhi để phân tích và xác định đột biến

1.4.2 Xét nghiệm chẩn đoán trước sinh

Muốn chẩn đoán xác định thai bị bệnh lý di truyền phải dựa vào các xét nghiệm di truyền Các xét nghiệm này có thể phân tích ở mức độ tế bào (phân tích NST), ở mức độ phân tử (phân tích DNA, RNA) hoặc cả ở mức độ tế bào

và phân tử (kỹ thuật FISH) Tất cả xét nghiệm này cần phải lấy được tế bào hoặc DNA có nguồn gốc từ thai, do đó việc lấy được mẫu tế bào và DNA có nguồn gốc từ thai nhi trong chẩn đoán trước sinh đóng một vai trò quan trọng Hai phương pháp lấy mẫu xét nghiệm để chẩn đoán trước sinh là phương pháp xâm phạm thai và phương pháp không xâm phạm thai

1.4.2.1 Phương pháp chẩn đoán trước sinh lấy mẫu xâm phạm thai

* Chọc hút dịch ối: được thực hiện khi thai được 16 đến 18 tuần Bác sĩ thực hiện sẽ dùng một dụng cụ như cây kim dài, chọc vào bụng thai phụ, lấy

ra một ít nước ối để xét nghiệm mà không gây hại cho em bé Quá trình chọc

ối diễn ra nhanh chóng, đơn giản và thường không gây đau đớn nên không cần gây mê Tỉ lệ sẩy thai do chọc ối khoảng 0,5-1,0%

* Lấy mẫu nhung mao màng nuôi (Chorionic Villus Sampling-CVS): kỹ

thuật CVS được thực hiện đầu tiên vào những năm 1960 Từ năm 1983, CVS

đ trở thành một xét nghiệm phổ biến để chẩn đoán trước sinh trong 3 tháng đầu của thai kỳ Lấy mẫu lông nhung màng đệm là một xét nghiệm tiền sản, trong đó một mẫu lông nhung màng đệm được lấy ra từ nhau thai để xét nghiệm Mẫu có thể được lấy qua cổ tử cung hoặc thành bụng Ưu điểm của xét nghiệm này so với thủ thuật chọc ối là có thể được thực hiện ở những tuần thai sớm Một bất lợi của CVS so với chọc ối là tỷ lệ sẩy thai cao hơn, chiếm 2-3% trường hợp; theo nghiên cứu của Viện Sức khỏe Hoa Kỳ, tỷ lệ sẩy thai

ở nhóm chọc hút nhung mao màng nuôi tăng 0,8% so với nhóm chọc ối

1.4.2.2 Phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai

Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫu thai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai Phương pháp lấy mẫu không xâm nhập giúp tránh được nguy cơ có thể xảy ra đối với thai nhi và thai phụ Có hai phương pháp lấy mẫu không xâm phạm thai đó là:

Phương pháp thu thập tế bào thai nhi trong máu mẹ

Sự xuất hiện tế bào thai nhi trong máu mẹ là do tế bào máu thai nhi có thể đi vào tuần hoàn mẹ thông qua nhung mao nhau thai Những tế bào thai nhi có thể được thu thập một cách an toàn từ khoảng tuần thứ 18 của thai kỳ trở đi Hiện nay, với những kỹ thuật hiện đại, người ta có thể thu thập các tế bào này vào tuần thứ 12 của thai kỳ

Có nhiều loại tế bào thai nhi xuất hiện trong máu mẹ, tuy nhiên nguyên hồng cầu được sử dụng nhiều nhất để phân tích và xác định bệnh lý di truyền nói chung Sau khi lấy máu mẹ, cần phải tiến hành các công đoạn gồm (1) làm giàu các tế bào thai nhi do số lượng của chúng trong một mẫu máu là rất hạn chế, (2) nhận diện tế bào thai nhi trong số các tế bào được làm giàu và (3) thực hiện các chẩn đoán di truyền học

1.5 PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) VÀ QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ (PGD)

1.5.1 Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

Sự thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm được đánh dấu bằng sự ra đời của đứa trẻ đầu tiên theo phương pháp này vào năm 1978 [43] Tính trung bình ở các nước như Thụy Điển, Úc và Hoa Kỳ thì cứ khoảng 50-80 trẻ thì có một trẻ được sinh ra bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm Hàng năm có khoảng hơn 120 nghìn cặp vợ chồng ở Hoa Kỳ thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm [44] Trong tương lai, số trẻ ra đời bằng phương pháp này sẽ còn tăng cao bởi sự gia tăng độ tuổi trung bình khi kết

hôn, độ tuổi trung bình khi mang thai lần đầu và sự gia tăng về tỷ lệ vô sinh của các cặp vợ chồng trên thế giới [45]

Quy trình thường quy của IVF được thực hiện theo trình tự bắt đầu từ

việc kích thích các nang noãn bằng FSH (Hình 1.12) Các bệnh nhân được

chọc hút trứng sau khi tiêm HCG từ 34-36 giờ [46] Tinh trùng của bệnh nhân được lấy vào lọ vô trùng, không độc trong ngày chọc hút trứng Mẫu tinh trùng được ly giải và xử lý theo quy trình chuẩn rồi đánh giá mật độ tinh trùng

và độ di động theo tiêu chuẩn của WHO-2010 Trứng được thụ tinh in vitro

bằng cách nuôi cấy với tinh trùng hoặc tiêm trực tiếp tinh trùng vào bào tương của trứng (Intracytoplasmic sperm injection, ICSI) và nuôi cấy trong vòng 2-5 ngày [47] Đánh giá chất lượng phôi vào ngày thứ 2, thứ 3 và thứ 5 dựa vào

số lượng, độ đồng đều của phôi bào, độ chiết quang, độ liên kết phôi bào, phần trăm mảnh vỡ và tốc độ phân chia của phôi bào Các phôi làm PGD còn được đánh giá thêm số phôi bào thoái hóa và số phôi phân chia tiếp sau PGD [48] Phôi được chuyển vào tử cung bằng catheter chuyển phôi dưới siêu âm đường bụng, kỹ thuật chuyển phôi đạt tiêu chuẩn khi chuyển phôi dễ, catheter sau chuyển phôi sạch, không nhầy máu, không sót phôi, không kẹp cổ tử cung

và không nong cổ tử cung

Tỷ lệ trẻ sinh sống sau khi chuyển phôi ở các bà mẹ có độ tuổi 34 hoặc trẻ hơn dao động trong khoảng 30-49% Sau đó, khi độ tuổi của các bà mẹ tăng thêm một tuổi thì tỷ lệ này giảm đi tương ứng từ 2-6% và đối với phụ nữ

có độ tuổi 43 trở lên thì tỷ lệ trẻ sinh sống sau chuyển phôi chỉ còn khoảng 5% Như vậy, tỷ lệ thành công của phương pháp IVF liên quan chặt chẽ đến

độ tuổi của người mẹ, đến chất lượng trứng và nguyên nhân có thể do các bất thường nhiễm sắc thể gia tăng đối với các bà mẹ lớn tuổi

Khi thực hiện IVF, thông thường các bác sỹ cùng lúc cấy chuyển nhiều phôi vào tử cung để gia tăng tỷ lệ mang thai Điều này làm tăng tỷ lệ mang thai đôi và thai ba Bên cạnh đó việc mang thai đôi, thai ba cũng làm gia tăng

tỷ lệ sinh non và trẻ sinh ra bị thiếu cân [49-50] Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng, thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm đ mang lại hạnh phúc khi được làm cha mẹ cho rất nhiều cặp vợ chồng hiếm muộn Đây thực sự là những thành tựu y học mà các bác sỹ và nhân viên y tế đ mang đến cho nhiều gia đình và cho x hội

Hình 1.12 Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm

A, B: Kích thích nang noãn chín và theo dõi bằng siêu âm C: Chọc hút trứng dưới sự hướng dẫn c a siêu âm D-F: Thụ tinh in vitro bằng cách tiêm trực tiếp tinh

tr ng vào bào tương c a trứng G-I: Phôi tiếp tục đư c nuôi cấy và đánh giá chất

lư ng c a phôi và chuyển vào t cung (I)

1.5.2 Quy trình chẩn đoán gen trước làm tổ (PGD)

Kỹ thuật PGD (Preimplantation genetic Diagnosis) hay PGT (Preimplantation genetic testing) hiện nay là một kỹ thuật hoàn chỉnh, cho phép các cặp vợ chồng có nguy cơ truyền các bệnh lý di truyền cho con có thể có cơ hội sinh con không mắc bệnh mà không phải chẩn đoán tiền sản sau khi mang thai và

bỏ thai khi phát hiện bệnh lý ở thai [51] Kỹ thuật PGT-M: chẩn đoán các bệnh đơn gen, giúp các cặp vợ chồng xác định thai không bị bệnh về gen do

di truyền từ cha mẹ mang gen đột biến (bệnh thiếu máu tán huyết Thalassemia, bệnh máu khó đông hemophilia ) Kỹ thuật này dựa trên việc

phát hiện các bất thường di truyền ở phôi (in-vitro) và chỉ cấy trở lại vào lòng

tử cung các phôi không có các bất thường về di truyền [52-54]

1.5.2.1 Lịch sử phát triển của kỹ thuật chẩn đoán trước làm tổ

PGD được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1990 [3],[55] Chỉ định chẩn đoán PGD áp dụng cho các trường hợp bệnh lý vùng Địa trung hải như Cystic Fibrosis (CF) và các bệnh lý di truyền liên kết với nhiễm sắc thể X (X-linked disorders) [3] Trong báo cáo đăng trên tạp chí Nature, Handyside và cộng sự đ báo cáo trường hợp có thai từ các phôi đ được sinh thiết và chẩn đoán di truyền bằng cách khuếch đại các đoạn DNA đặc trưng trên NST Y thông qua kỹ thuật PCR Handyside và cộng sự đ thực hiện cho 5 cặp vợ chồng có bệnh lý liên quan đến NST X, phôi gái được chọn và cấy vào tử cung, kết quả là có 2 trường hợp thai đôi và 1 thai đơn khỏe mạnh Tuy nhiên, trong 3 năm đầu phát triển, chỉ có 1 số trường hợp sinh sống từ phôi PGD được báo cáo [55-56] Vào năm 1993-1994, kỹ thuật FISH (Fluorescent in situ hybridization) bắt đầu được áp dụng trong PGD để chẩn đoán các bất thường

NST FISH được sử dụng để phân tích các rối loạn NST, chủ yếu các lệch bội

thể (aneuploids) và cho phép chẩn đoán chính xác hơn và giảm tỷ lệ sai sót so với phương pháp PCR [57] PGD đ phát triển nhanh chóng và số trường hợp sinh sống từ phôi PGD trên thế giới bắt đầu tăng mạnh Chỉ trong vòng 2 năm sau đó, hơn 100 trường hợp sinh sống từ phôi PGD đ được báo cáo trên thế giới Vào năm 1996, PGD tiếp tục một bước phát triển mới khi người ta bắt đầu xác định được chuyển đoạn NST và ứng dụng vào PGD Kỹ thuật chẩn đoán di truyền này giúp xác định các phôi không có bất thường về cấu trúc NST trước khi cấy vào tử cung [58] Từ năm 1999, PGD lại được mở rộng chỉ định để chẩn đoán phôi có mang các gen liên quan đến các bệnh lý sau này ở đứa trẻ Đây là một chỉ định mới so với các chỉ định trước đây của chẩn đoán tiền sản Chỉ định này cho phép bố mẹ có mang gen tiềm ẩn một bệnh lý được dự báo trước có thể sinh ra một trẻ hoàn toàn không mang gen bệnh Điều này mang