Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma co 60 để chế tạo β glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia

xiii TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia” được thực hiện từ tháng 11/2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thành Long

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỨC XẠ GAMMA Co-60 ĐỂ

CHẾ TẠO β-GLUCAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

TAN TRONG NƯỚC CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TỪ BÃ MEN BIA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thành Long

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỨC XẠ GAMMA Co-60 ĐỂ

CHẾ TẠO β-GLUCAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

TAN TRONG NƯỚC CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TỪ BÃ MEN BIA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Lê Quang Luân

2 PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn

Thành phố Hồ Chí Minh – 2020

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

khác

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 05 năm 2020

Tác giả luận án

Nguyễn Thành Long

iii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến PGS.TS Lê Quang Luân và PGS.TS Hoàng Nghĩa

Sơn đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn và góp ý kiến cho luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến:

- Quý Thầy, Cô Học viện Khoa học và Công nghệ

- Quý Thầy, Cô Hội đồng Khoa học, Viện Sinh học Nhiệt đới

- Quý Thầy, Cô Viện CNSH và Môi trường, Trường ĐH Nha Trang

- Các cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Vật liệu và Nano, Trung tâm Công

nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh

- Bộ Khoa học và Công nghệ đã hỗ trợ kinh phí, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ kinh phí và cơ sở vật chất thí nghiệm, Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành nghiên cứu này

- Trân trọng cảm ơn gia đình, các đồng nghiệp và bạn bè, những người luôn

hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu và hoàn

thành luận án

Tác giả luận án

Nguyễn Thành Long

iv

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN II LỜI CẢM ƠN III MỤC LỤC IV DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH IX DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT XII TÓM TẮT XIII SUMMAY XVI

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Giới thiệu tổng quan về β-glucan 6

1.1.1 Nguồn thu nhận β-glucan 6

1.1.2 Cấu trúc của β-glucan 7

1.2 Sơ lược về nấm men Saccharomyces 8

1.3 Phương pháp thu nhận thành tế bào từ nấm men bia Saccharomyces 9

1.3.1 Phương pháp vật lý 10

1.3.2 Phương pháp hóa học 11

1.3.3 Phương pháp sinh học 11

1.4 Phương pháp tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men bia Saccharomyces 12

1.5 Các phương pháp cắt mạch β-glucan 13

1.5.1 Phương pháp hóa học 14

1.5.2 Phương pháp sinh học 14

1.5.3 Phương pháp chiếu xạ 14

1.6 Hoạt tính sinh học của β-glucan 19

1.6.1 Tăng cường khả năng miễn dịch 19

1.6.2 Chống ung thư 20

1.6.3 Hạ mỡ máu và đường huyết 21

1.6.4 Chống oxi hóa và bảo vệ gan 23

1.7 Ứng dụng của β-glucan……… 25

1.8 Ứng dụng của β-glucan Mw thấp……… 28

v

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu……….31

2.1.1 Nguyên vật liệu 31

2.1.2 Thiết bị chính 32

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia 33

2.2.2 Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60 37

2.2.3 Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương pháp chiếu

xạ 39

2.2.4 Thiết lập qui trình chế tạo -glucan có Mw thấp tan trong nước trongkhoảng

liều xạ thấp dưới 100 kGy 47

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 49

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

3.1 Tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bã men bia 50

3.1.1 Thu nhận nấm men từ bã nấm men bia từ nhà máy sản xuất bia 50

3.1.2 Tách và thu nhận thành tế bào nấm men 51

3.1.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết β-glucan từ

thành tế bào nấm men Saccharomyces 52

3.2 Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ 62

3.2.1 Xác định hiệu suất thu nhận β-glucan tan bằng phương pháp

chiếu xạ β-glucan 62

3.2.2 Sự suy giảm khối lượng phân tử 64

3.2.3 Phân tích phổ UV 65

3.2.4 Phân tích phổ FTIR 66

3.2.5 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H và 13 C 68

3.2.6 Phân tích hàm lượng β-glucan 69

3.3 Hoạt tính sinh học của β-glucan tan nước chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ 70

3.3.1 Hoạt tính kháng oxi hóa của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vitro

in vitro 70

3.3.2 Khả năng bảo vệ gan của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo 71

3.3.3 Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ đến các chỉ số miễn dịch ở chuột 75

vi

3.3.4 Khả năng hạ mỡ máu và đường huyết của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện

in vivo trên chuột 78

3.3.5 Hiệu ứng của β-glucan chiếu xạ lên sự tăng trưởng và miễn dịch ở gà Lương

phượng 90

3.4 Thiết lập quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan trong nước trong khoảng liều xạ thấp 94

3.4.1 Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện pH khác nhau 94

3.4.2 Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện hiệu chỉnh pH và

có H 2 O 2 99

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 106

4.1 Kết luận 106

4.2 Đề nghị 107

TÀI LIỆU THAM KHẢO 108

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 115

PHỤ LỤC 1 116

PHỤ LỤC 2 119

PHỤ LỤC 3 120

PHỤ LỤC 4 121

1 Hoạt tính kháng oxi hóa của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vitro theo phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH 121

2 Khả năng bảo vệ gan của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo 122

3 Ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ đến các chỉ số miễn dịch ở chuột 125

4 Khả năng hạ mỡ máu và đường huyết của β-glucan chiếu xạ trong điều kiện in vivo trên chuột 128

5 Hiệu ứng của β-glucan chiếu xạ lên sự tăng trưởng và miễn dịch ở gà Lương phượng ……….141

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc, nguồn thu nhận và hoạt tính của β-glucan 6

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của β-glucan chiếu xạ có Mw

khác nhau lên chỉ số AST, ALT trong máu chuột gây tổn thương gan 41

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát các chỉ số về sinh hóa, công thức máu và miễn

dịch ở chuột khi cho uống bổ sung β-glucan chiếu xạ theo các liều khác nhau 41

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát các chỉ số sinh hóa trên mô hình

chuột béo phì thực nghiệm khi cho uống bổ sung β-glucan chiếu xạ có

Mw khác nhau ………43

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu ứng tăng trưởng và kích kháng bệnh

ở gà lương phượng khi cho ăn bổ sung β-glucan chiếu xạ ở các liều khác nhau 45

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan 52

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất thu nhận β-glucan 53

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan 54

Bảng 3.4.Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi thủy phân đến hiệu suất thu nhận

β-glucan 55

Bảng 3.5 Hiệu suất tách chiết sản phẩm β-glucan từ bã men bia ở quy mô

500 lít/mẻ 56

Bảng 3.6 Hàm lượng các loại glucan trong mẫu tách chiết 57

Bảng 3.7 Các đỉnh các nhóm chức đặc trưng cơ bản của β-glucan 60

Bảng 3.8 Kết quả phân tính hàm lượng các loại glucan trong mẫu β-glucan

tan nước có Mw~25 kDa 69

Bảng 3.9 Số lượng hồng cầu, bạch cầu tổng số, lympho bào và bạch cầu

trung tính trong máu chuột khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau 76

Bảng 3.10 Thể trọng 2 nhóm chuột sau 8 tuần nuôi theo chế độ dinh dưỡng

khác nhau 78

Bảng 3.11 Một số chỉ số sinh hóa của chuột sau 8 tuần nuôi 79

Bảng 3.12 Trọng lượng chuột trước và sau 20 ngày cho uống β-glucan có Mw

khác nhau 80

Bảng 3.13 Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 20 ngày cho

uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau 81

viii

Bảng 3.14 Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 40 ngày cho uống bổ

sung β-glucan có Mw khác nhau 82

Bảng 3.15 Các chỉ số lipid và glucose trong máu chuột sau 60 ngày cho uống bổ

sung β-glucan có Mw khác nhau 83

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của Mw β-glucan có Mw khác nhau lên sự tăng trọng

và chất lượng thịt ở gà sau 8 tuần cho ăn bổ sung 90

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của Mw β-glucan có Mw khác nhau lên các chỉ số miễn dịch

ở gà sau 8 tuần cho ăn bổ sung 92

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của (1,3)/(1,4)- và (1,3)/(1,6)-β-glucan theo Volman và ctv 7

Hình 1.2 Cấu trúc thành tế bào nấm men Saccharomyces 9

Hình 2.1 Dịch bã men bia sử dụng trong nghiên cứu 31

Hình 2.2 Bộ KIT K-YBGL xác định hàm lượng β(1-3,1-6)-glucan

của Megazyme 31

Hình 2.3 Sơ đồ tách chiết từ nguyên liệu bã tế bào nấm men bia β-glucan 34

Hình 2.4 Thiết kế thí nghiệm mô hình tổn thương gan do CCl4 40

Hình 2.5 Mẫu β-glucan tan nước có Mw khác nhau 41

Hình 2.6 Sơ đồ thí nghiệm theo dõi khả năng giảm mỡ máu ở chuột 44

Hình 2.7 Quy trình lấy máu chuột xét nghiệm chỉ số sinh hoá 45

Hình 2.8 Lấy máu trên gà để tiến hành xét nghiệm 46

Hình 3.1 Dịch bã men bia (A), ảnh SEM dịch chưa rửa (B), mấm men bia sau khi

rửa (C) và ảnh SEM tế bào nấm men sau khi rửa (D) 50

Hình 3.2 Sản phẩm thành tế bào nấm men trước (A) và sau khi ly tâm (B)

và ảnh SEM (C) 51

Hình 3.3 Mẫu β-glucan sau khi tách chiết từ thành tế bào nấm men sau khi

thu nhận (A), sau khi sấy khô ở 60oC (B) và ảnh SEM (C) 57

Hình 3.4 Phổ FTIR của mẫu β-glucan tách chiết tách từ thành tế bào nấm men bia

và mẫu β-glucan chuẩn của hãng Sigma 59

Hình 3.5 Sơ đồ khối quy trình tách chiết β-glucan từ dịch bã men bia

quy mô 500 lít/mẻ 61

Hình 3.6 Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan 10%

ở các liều xạ khác nhau 63

Hình 3.7 Sự suy giảm Mw của β-glucan tan theo liều xạ 64

Hình 3.8 β-glucan tan nước từ mẫu β-glucan 10% chiếu xạ ở các liều xạ

khác nhau 65

Hình 3.9 Phổ UV-vis β-glucan chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ 66

Hình 3.10 Phổ IR của β-glucan chiếu xạ nồng độ 10% ở các liều xạ khác nhau 67

Hình 3.11 Sự thay đổi tỷ lệ cường độ đỉnh C-O-C (1156 cm-1)/cường độ đỉnh

C-C (1040 cm-1) của trong phổ của mẫu β-glucan theo liều xạ 67

x

Hình 3.12 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (a) và 13C (b) của β-glucan tan nước

có Mw~25 kDa 68

Hình 3.13 Hoạt tính kháng oxi của β-glucan có Mw khác nhau 71

Hình 3.14 Chỉ số AST giữa các nghiệm thức (a) và mức thay đổi chỉ số này SVĐC(b)

ở nhóm chuột thường và chuột gây độc gan (không tiêm CCl4) được cho uống β-glucan có Mw khác nhau 72

Hình 3.15 Chỉ số AST giữa các nghiệm thức (a) và mức thay đổi chỉ số này

SVĐC (b) ở nhóm chuột thường và chuột gây độc gan (không tiêm CCl4) được cho

uống β-glucan có Mw khác nhau 75

Hình 3.16 Hàm lượng IgG (a) và IgM (b) trong trong máu chuột sau 28 ngày

cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau 77

Hình 3.17 Nhóm chuột HFD (a) và ND (b) sau 8 tuần nuôi 79

Hình 3.18 Mức thay đổi chỉ số cholesterol trong máu chuột so với trước khi cho

uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau ĐC1: Chuột thường không cho uống

β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan 84

Hình 3.19 Mức thay đổi chỉ số triglyceride trong máu chuột so với trước khi

cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan 85

Hình 3.20 Mức thay đổi chỉ số LDL trong máu chuột so với

trước khi cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau ĐC1: Chuột thường

không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan 87

Hình 3.21 Mức thay đổi chỉ số glucose trong máu chuột so với trước khi

cho uống bổ sung β-glucan có Mw khác nhau ĐC1: Chuột thường không cho uống β-glucan, ĐC2: Chuột béo phì không cho uống β-glucan 87

Hình 3.22 Ảnh hưởng của β-glucan có Mw khác nhau đến quầy thịt ở gà 91

Hình 3.23 Độ trương nước bảo hòa và độ tan của mẫu β-glucan ở điều kiện

pH khác nhau 95

Hình 3.24 Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước khi chiếu xạ hỗn hợp

β-glucan 10% ở điều kiện pH khác nhau 96

Hình 3.25 Sự suy giảm Mw của β-glucan khi liều xạ ở các điều kiện pH

khác nhau 97

xi

Hình 3.26 Phổ IR của β-glucan tan trong nước có Mw~25 kDa chiếu xạ ở các

điều kiện pH khác nhau 98

Hình 3.27 Hiệu suất thu nhận β-glucan tan nước khi chiếu xạ hỗn hợp

β-glucan có nồng độ khác nhau ở điều kiện pH~9 và 1% H2O2 100

Hình 3.28 Sự suy giảm Mw của β-glucan khi chiếu xạ hỗn hợp β-glucan có nồng

độ khác nhau ở điều kiện pH~9 và 1% H2O2 102

Hình 3.29 Phổ IR của β-glucan tan nước có Mw~25 kDa chiếu xạ ở các điều kiện

pH khác nhau và kết hợp xử lý H2O2 102

Hình 3.30 Giản đồ XRD của β-glucan tan nước có Mw~25 kDa chiếu xạ ở các

điều kiện pH khác nhau và kết hợp xử lý H2O2 104

Hình 3.31 Sơ đồ khối quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp tan trong nước bằng

phương pháp chiếu xạ ở điều kiện hiệu chỉnh pH và có H2O2 quy mô 1 lít/mẻ…106

xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ABTS Gốc tự do 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) APAP Thuốc giảm đau Acetaminophen

ALF Peptide kháng khuẩn (anti-lipopolysaccharide factors)

ALT Enzyme Alanin amino transferase

AST Enzyme Aspartate amino transferase

Da Đơn vị khối lượng phân tử (Dalton)

Dp Mức độ polymer hóa (Degree of polymerization)

HFD Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet)

IgG Kháng thể globulin G (Immunoglobulin G)

IgM Kháng thể globulin M (Immunoglobulin M)

LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low density lipoprotein)

ND Chế độ ăn bình thường (Normal diet)

NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

xiii

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo β-glucan khối

lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia” được thực hiện từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2019 tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành

phố Hồ Chí Minh và Viện Sinh học Nhiệt đới Mục tiêu của đề tài là hoàn thiện quy

trình thu nhận chế phẩm β-glucan từ bã thải nấm men bia của nhà máy sản xuất bia; xác định được cấu trúc đặc trưng c ng như một số đặc tính hiệu ứng sinh học in

vitro và in vivo của chế phẩm β-glucan sau khi chiếu xạ; và thiết lập được quy trình

công nghệ tạo chế phẩm β-glucan tan trong nước có Mw thấp phù hợp cho mục đích

ứng dụng làm thực phẩm chức năng và chế phẩm bổ sung trong chăn nuôi

Để đạt được mục tiêu nói trên, đề tài tiến hành thực hiện 4 nội dung nghiên

cứu như sau: (1) Tách chiết glucan từ bã tế bào nấm men bia; (2) Cắt mạch

β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60; (3) Xác định hoạt tính sinh

học của β-glucan cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ; (4) Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan có Mw thấp và tan nước bằng phương pháp chiếu xạ Nội dung 1 gồm các thí nghiệm thu nhận thành tế bào nấm men bia phục vụ tách chiết β-glucan tổng

số và xác định các đặc trưng cấu trúc của mẫu β-glucan sau khi tách chiết Nội dung

2 với các thí nghiệm chiếu xạ tạo mẫu β-glucan Mw thấp tan trong nước ở các liều

xạ khác nhau phục vụ xác định hiệu suất β-glucan Mw thấp tan trong nước tạo

thành c ng như các đặc trưng cấu trúc của mẫu sau khi chiếu xạ Nội dung 3 gồm

các thí nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (hoạt tính kháng oxi hoá) và in

vivo trên chuột (giải độc gan, hạ lipid và glucose máu, tăng cường yếu tố miễn dịch)

và trên gà (tăng trọng và tăng cường miễn dịch) Nội dung 4 với các thì nghiệm chiếu

xạ mẫu β-glucan ở các điều kiện pH khác nhau và ứng dụng hiệu ứng cộng hợp (kết

hợp xử lý với H2O2) c ng như xác định hiệu suất các đặc trưng cấu trúc nhằm xây

dựng quy trình chế tạo β-glucan tan nước có Mw thấp phù hợp và có hoạt tính sinh học

cao bằng phương pháp chiếu xạ

Với các nội dung nói trên, kết quả đạt được của đề tài có thể tóm tắt như sau:

- Đã hoàn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men từ bã men bia với sản phẩm β-glucan có độ tinh khiết cao (đạt khoảng 91,8%), có Mw >

64 kDa và có đặc trưng cấu trúc hầu như không khác biệt so với mẫu chuẩn cùng dạng của hãng Sigma

xiv

- Đã chế tạo được β-glucan tan nước có Mw thấp từ 11 - 50 kDa bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co-60 Việc gia tăng độ pH của mẫu β-glucan, đặc

biệt khi xử lý kết hợp với 1% H2O2 đã làm gia tăng mạnh hiệu quả cắt mạch Kết

quả phân tích phổ FTIR, XRD và cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy các mẫu

β-glucan tan nước có Mw thấp chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ có đặc trưng cấu

hầu như không khác biệt so với mẫu β-glucan ban đầu

- β-glucan chiếu xạ có Mw thấp và tan nước có hoạt tính kháng oxi hoá cao

và β-glucan có Mwcàng thấp thì hoạt tính kháng oxi hoá càng cao

- Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy β-glucan chiếu xạ đã có khả năng

bảo vệ gan chuột được gây độc gan bằng CCl4 (chỉ số AST và ALT trong máu

chuột cho uống chế phẩm đều có xu hướng giảm dần khi Mw của β-glucan giảm) và chuột cho uống β-glucan có Mw thấp và tan nước có Mw~25 kDa đã giảm 68% chỉ

số AST và 48% ALT so với chuột gây độc gan chỉ cho uống nước cất Bên cạnh đó, chế phẩm này còn có tác dụng gia tăng gia số lượng bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính và lympho bào c ng như yếu tố miễn dịch dịch thể IgG và IgM Ngoài ra

kết quả thử nghiệm trên chuột béo phì c ng cho thấy β-glucan có Mw~25 kDa là

thích hợp cho mục đích làm giảm mỡ máu với khả năng làm giảm 38% lượng cholesterol tổng số, 33% triglyceride, 39% lượng LDL và 34% lượng glucose sau thử nghiệm 20 ngày Các chỉ số này tiếp tục giảm khi kéo dài quá trình thử nghiệm lên tới 40 ngày Sau 20 ngày ngừng sử dụng chế phẩm, hiệu quả của chế phẩm vẫn khá cao với mức giảm 38% lượng cholesterol tổng số, 41% triglyceride, 40% lượng LDL và 36% lượng glucose trong máu chuột

- Ở gà, khi cho ăn bổ sung chế phẩm β-glucan chiếu xạ có Mw thấp đã có tác

dụng thúc đẩy tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ nuôi sống và hoạt tính miễn dịch ở gà So

với đối chứng, β-glucan có Mw~25 kDa đã có hiệu ứng tối ưu về mức độ tăng trọng

bình quân (tăng 23,63%); tỷ lệ nuôi sống (tăng 54,5%) và gia tăng chất lượng quầy thịt, bạch cầu tổng số, tỷ lệ bạch cầu trung tính và lympho bào; tăng hiệu giá kháng thể kháng bệnh gumboro, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và bệnh newcastle

- Đã xây dựng thành công quy trình chế tạo chế phẩm β-glucan tan trong nước

có Mw ~25 kDa và có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp xử

lý H2O2 Chế phẩm β-glucan Mw thấp tan trong nước chế tạo từ quy trình nói trên

xv

hứa hẹn là hoạt chất bổ sung tốt, hiệu quả, an toàn và đáp ứng nhu cầu nuôi gà sạch không sử dụng kháng sinh c ng như có triển vọng ứng dụng cao cho mục đích làm thực phẩm chức năng nhằm tăng cường miễn dịch c ng như hỗ trợ điều trị các bệnh

mỡ máu, chống oxi hóa và giải độc gan

xvi

SUMMAY

The Thesis entitled “Study on the application of gamma Co-60 irradiation for

preparation of bioactive water-soluble low molecular weight β-glucan product from

spent brewer’s yeast” has been carried out at Biotechnology Center of Ho Chi Minh City and Institute of Tropical Biology from 11/2015 to 5/2019 The aim of the

thesis is to improve the process for preparation of β-glucan product from spent brewer’s yeast; to evaluate the structural characteristics and the in vitro and in vivo biological activities of radiation degraded β-glucan samples; and to build up the process for producing the water-soluble low molecular weight (Mw) β-glucan

product with a suitable Mw for application as functional food and additive feed

This study consists of 4 contents such as: (1) Extraction of β-glucans from spent brewer’s yeast; (2) Degradation of β-glucans by gamma Co-60 irradiation method; (3) Investigation of biological activities of radiation-degraded β-glucans; and (4) built-up of the process for producing the water-soluble low Mw β-glucans

product by irradiation method The fist covers studies on collection of

Saccharomyces yeast cell walls for extraction of β-glucans and characterization of

the structural properties of extracted β-glucans product The second includes the experiments of preparation of water-soluble low Mw β-glucan by irradiation at

various doses in order to determine the water-soluble yields and structural

characteristics of irradiated samples The third involves bioactivity tests in vitro condition (antioxidant activity) and in vivo on mice (the hepatoprotective, reduction

of blood lipid and glucose and immune-stimulation activity) and on broiler (the weight gain and immune-stimulation activity) The fourth describes the experiments for determination of the water-soluble yields and structural characteristics of samples irradiated at various pH conditions and in combination with H2O2 (synergic

effect) aiming to build up the process for producing the water-soluble low Mw

β-glucan product by irradiation method

With the above research contents, the obtained results in this dissertation can

be summaried as bellow:

- The process for extraction of β-glucans from spent brewer’s yeast was successfully improved to produce β-glucans product with high purity (91.8 β-glucan

xvii

in content), Mw > 64 kDa and its structural characteristics almost the same as those

of the standard β-glucans from Simma Ltd

- The low Mw (11 - 50 kDa) and water-soluble β-glucans were successfully

prepared by gamma Co-60 irradiation method The increase of pH conditions, especially, the combined treatment with 1% H2O2 strongly enhanced the degradation yield The results from FTIR, XRD and NMR spectra indicated that the

structural characters of water-soluble low Mw β-glucans prepared by irradiation method were also most similar to those of unirradiated β-glucan

- The water-soluble low Mw β-glucan showed a high antioxidant activity by radical DPPH and the lower Mw of water-soluble β-glucan displayed the higher

antioxidant activity

- The results from test on mine demonstrated that the irradiated β-glucan

showed high hepatoprotective activities in CCl4-induced hepatotoxic mice (the decrease of ALT (Alanine-aminotransferase) and AST (Aspartate-aminotransferase) indexes in blood of the tested mice were directly proportional to the decrease of Mw

of the supplemented irradiated glucans The supplementation of water-soluble

β-glucan with Mw~25 kDa remarkably reduced AST (68%) and ALT (48%) indexes

in blood of CCl4-induced hepatotoxic mice compared to those in blood of mice induced hepatotoxic supplied with only distilled water On the other hand, the

supplementation of this water-soluble low Mw β-glucan also caused a significantly

increase both of cellular immunity indexes (total white blood cells, the rates of neutrophil and lymphocyte) and human immunity indexes (IgG and IgM) in blood

of tested mice In addition to, the test on obese induced mice also pointed out that

the water-soluble β-glucan with Mw~25 kDa decreased the levels of total

cholesterol (38%), triglyceride (33%), LDL-cholesterol (39%) and glucose (34%) in blood of tested mice after 20 days of administration These indexes were further

reduced after 40 days of administration with the water-soluble low Mw β-glucan product Furthermore, after stopping supplementing with water-soluble low Mw β-

glucan, total cholesterol, triglyceride, LDL-cholesterol and glucose in blood of tested mice were still lower than those in blood of the unsupplemmented control ones about 38, 41 and 41%, respectively

xviii

- In broiler, the supplementation with irradiated β-glucan with low Mw

enhanced the growth prmotion, suvival rate and immune activities The

supplementation with water-soluble β-glucan with Mw~25 kDa not only increased

the average body weight (23.6%), survival rate (54.5%) and quality of meat but also stimulated the enhacement of cellular immunity indexes (total white blood cells, the rates of neutrophil and lymphocyte) and specific immune components (antibodies related to anti-newcastle disease virus, anti-infectious bursal disease virus and anti-infectious bronchitis virus)

- The process for producting the water-soluble β-glucan product with Mw~25

kDa and high bio-acivity by irradiation incombination with H2O2 method was

successfully built up The water-soluble low Mw β-glucan product prepared by this

process is promising additive feed for production of clean chicken meat without antibiotic and promising ingredient that can be used in nutraceutical food for therapeutics of diabetic, dyslipidemia and hematoprotective as well

1

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết

Trong hơn hai mươi năm qua, β-glucan đã được nghiên cứu về các tác dụng

sinh học có lợi đối với động vật có vú và người Nó đã được biết đến rộng rãi trong cộng đồng khoa học như là chất kích thích miễn dịch rất mạnh, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lượng đường trong máu, chữa lành vết thương, làm trẻ hóa làn da, kháng ký sinh trùng gây bệnh, kích thích quá trình tạo

máu, chống đông máu, giúp giảm tỷ lệ đột biến β-glucan đã được chứng minh là có

tác dụng làm gia tăng số lượng tế bào miễn dịch và hạn chế sự phát triển của khối u

ở người do vậy nó có hoạt tính phòng chống rất mạnh mẽ khối u lành tính và ác tính Polymer tự nhiên này còn có tác dụng giúp nâng cao hiệu quả điều trị ở những bệnh nhân ung thư, rất hiệu quả để làm chất bổ trợ trong điều trị ung thư, làm giảm tác dụng phụ của hóa trị ở những bệnh nhân ung thư và có tác dụng trong phòng ngừa ung thư kết ruột, v.v

Trong chăn nuôi, β-glucan có tác dụng làm tăng cường hệ miễn dịch, giúp

vật nuôi kháng được một số bệnh c ng như khả năng phục hồi nhanh khi nhiễm phải một số tác nhân gây bệnh, từ đó làm tăng chất lượng sản xuất vật nuôi mà

không cần phải dùng đến kháng sinh Chính vì vậy β-glucan giúp tăng giá trị sản

xuất, tạo ra sản phẩm thịt sạch, chất lượng cao, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và môi trường, đồng thời nhằm hướng đến mục tiêu phát triển bền vững

Tuy nhiên, β-glucan có khối lượng phân tử (Mw) lớn, độ nhớt cao và độ hòa

tan thấp nên rất khó được hấp thu c ng như gây ra một số trở ngại để áp dụng rộng

rãi trên quy mô công nghiệp Nhiều nghiên cứu cho thấy β-glucan có Mw thấp sẽ cho hiệu ứng tốt hơn β-glucan có Mw cao và β-glucan có Mwdưới 30 kDa và tan được trong nước đã cho thấy có tác dụng tăng cường miễn dịch cao hơn so với các

β-glucan có Mw cao β-glucan Mw thấp là những phân đoạn β-glucan dễ tan trong

nước nên dễ dàng được hấp thu và các hoạt tính sinh học được sử dụng một cách

hiệu quả hơn Để có được β-glucan Mw thấp thì cắt mạch bằng phương pháp chiếu

xạ đã được chứng minh là phương pháp rất hiệu quả Với những ưu điểm nổi bật

như thời gian ngắn, quy trình đơn giản, có thể điều chỉnh liều xạ để thu được

β-glucan có Mw thấp như mong muốn, thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao, không

2

cần tinh chế lại, hiệu suất cắt mạch cao, thân thiện với môi trường, đồng thời phương pháp chiếu xạ không phụ thuộc vào nhiệt độ hay điều kiện ngoại cảnh

β-glucan là một trong những hợp chất chính cấu tạo nên thành tế bào nấm

men vốn thường sử dụng trong sản xuất bia, một trong những ngành công nghiệp trọng điểm do đã mang lại lợi ích kinh tế rất lớn trong tăng trưởng cho nền kinh tế nước nhà Hiện nay, cả nước có trên 300 cơ sở sản xuất bia với công suất thiết kế là 1,7 tỷ lít/năm và lượng bã nấm men trong sản xuất bia chiếm tỷ lệ khoảng 1% Bã thải này được sử dụng một phần nhỏ và chủ yếu để sản xuất cao nấm men hoặc thức

ăn gia súc, số còn lại được xử lý và thải ra môi trường nên đây c ng là một trong những nguồn gây ô nhiễm môi trường Chính vì vậy, việc sử dụng nguồn bã thải

nấm men bia để tách chiết β-glucan làm nguyên liệu chế tạo chế phẩm β-glucan Mw

thấp có hoạt tính sinh học là rất hiệu quả và thiết thực, không chỉ tận dụng được nguồn phế thải để tạo sản phẩm có hoạt tính sinh học cao mà còn góp phần giảm thiểu các nguồn gây ô nhiễm môi trường

Mục đích của luận án này là nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết

β-glucan từ thành tế bào bã nấm men bia và thiết lập quy trình công nghệ chế tạo chế

phẩm β-glucan Mw thấp và tan nước bằng phương pháp chiếu xạ đồng thời nghiên cứu các hiệu ứng sinh học của β-glucan sau khi cắt mạch bằng phương pháp chiếu

xạ trong điều kiện in vitro và in vivo trên động vật (gà và chuột) nhằm tìm ra chế phẩm β-glucan Mw thấp có hiệu ứng sinh học cao nhất phù hợp cho mục đích ứng

dụng làm thực phẩm chức năng hoặc chế phẩm bổ sung trong chăn nuôi

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng thành công quy trình công nghệ chế tạo chế phẩm β-glucan Mw

thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã thải nấm men của các nhà máy sản xuất bia bằng phương pháp chiếu xạ

Mục tiêu cụ thể

- Hoàn thiện được dựng quy trình thu nhận chế phẩm β-glucan từ bã thải nấm

men bia của nhà máy sản xuất bia

- Xác định được cấu trúc đặc trưng c ng như một số hiệu ứng sinh học in

vitro và in vivo của chế phẩm β-glucan sau khi chiếu xạ

3

- Thiết lập được quy trình công nghệ tạo chế phẩm β-glucan tan trong nước

có Mw thấp phù hợp cho mục đích ứng dụng làm thực phẩm chức năng và chế phẩm bổ sung trong chăn nuôi

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài là các cơ sở dữ liệu khoa học rất có ý nghĩa

trong việc xác định các thông số kỹ thuật tối ưu liên quan đến tách chiết β-glucan độ tinh khiết cao từ thành tế bào nấm men từ bã men bia và chế tạo β-glucan tan nước

có Mw thấp bằng phương pháp cắt mạch bức xạ c ng như xác hoạt tính tăng cường

miễn dịch, hạ mỡ máu, đường huyết và bảo vệ gan của β-glucan Mw thấp ở chuột

và mức độ tăng trọng hoặc tăng cường khả năng miễn dịch của chế phẩm này trên

gà là tiền đề rất quan trọng trong việc chế tạo thực phẩm chức năng β-glucan Mw

thấp cho người và chế phẩm tăng trọng và kháng bệnh cho gia cầm Các kết quả này

có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo cho mục đích nghiên cứu, giảng dạy và chuyển giao công nghệ

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Các quy trình được xây dựng từ kết quả của đề tài bao gồm quy trình tách

chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men từ bã men bia là rất hiệu quả và thiết thực,

có thể áp dụng để sản xuất β-glucan độ tinh khiết cao từ bã men bia giúp nâng cao

giá trị kinh tế của nguồn bã thải vô cùng lớn từ công nghiệp sản xuất bia; đặc biệt

quy trình chế tạo chế phẩm β-glucan tan nước với Mw~25 kDa và có hoạt tính sinh

học cao bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2 là hoàn toàn mới và có thể

ứng dụng để sản xuất một cách hiểu quả chế phẩm thực phẩm bổ sung β-glucan Mw

thấp rất có giá trị cho người và gia cầm

Các sản phẩm β-glucan, đặc biệt là β-glucan tan nước với Mw~25 kDa từ kết

quả của luận án hứa hẹn là hoạt chất bổ sung tốt, hiệu quả, an toàn và đáp ứng nhu cầu nuôi gà sạch không sử dụng kháng sinh c ng như có triển vọng ứng dụng cao cho mục đích làm thực phẩm chức năng nhằm tăng cường miễn dịch c ng như hỗ trợ điều trị các bệnh mỡ máu, đái tháo đường và giải độc gan

Tính mới và tính sáng tạo

Đề tài được thực hiện theo hướng nghiên cứu mới ứng dụng công nghệ cao

để tạo sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên có độ tinh khiết và có hoạt tính sinh học

Điểm mới của đề tài:

- Đã hoàn thiện quy trình và tách chiết thành công β-glucan có độ tinh khiết

cao (đạt khoảng 91,8%) từ thành tế bào nấm men trong bã men bia Đây là quy trình đầu tiên được xây dựng trong nước tạo được sản phẩm có đặc trưng cấu trúc hầu như không khác biệt so với mẫu chuẩn cùng dạng của Hãng Sigma

- Đã xây dựng thành công quy trình chế tạo β-glucan tan nước có Mw~25

kDa và có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp xử lý H2O2

mẫu β-glucan nấm men không tan nước Đây là quy trình đầu tiên được xây dựng

trên thế giới

- β-glucan tan nước có Mw~25 kDa chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ có hoạt tính kháng oxi hoá cao hơn nhiều so với β-glucan không chiếu xạ

- β-glucan chiếu xạ đã có khả năng bảo vệ gan ở chuột được gây độc gan bằng

CCl4 và chuột cho uống β-glucan tan nước có Mw~25 kDa đã giảm 68% chỉ số AST

và 48% ALT so với chuột gây độc gan chỉ cho uống nước cất

- Chế phẩm này c ng đã làm giảm 38% lượng cholesterol tổng số, 33% triglyceride, 39% lượng LDL và 34% lượng glucose trong máu chuột béo phì sau 20 ngày uống

- β-glucan chiếu xạ còn có tác dụng gia tăng gia số lượng bạch cầu tổng số,

bạch cầu trung tính và lympho bào c ng như yếu tố miễn dịch IgG và IgM

- Ở gà, chế phẩm β-glucan tan nước có Mw~25 kDa c ng đã làm tăng trọng

bình quân (tăng 23,63%), tỷ lệ nuôi sống (tăng 54,5%) và chất lượng quầy thịt; tăng

số lượng bạch cầu tổng số, tỷ lệ bạch cầu trung tính và lympho bào; và tăng hiệu giá kháng thể kháng bệnh gumboro, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và bệnh newcastle

Đối tƣợng nghiên cứu

- Bã nấm men bia do nhà máy bia Sài Gòn Bình Dương,

5

- Chuột nhắt trắng dòng Swiss khỏe mạnh do Viện Pasteur Tp.HCM cung cấp,

- Gà Lương phượng (Gallus gallus domesticus) khoẻ mạnh và không bị bệnh

do Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm Tp.HCM cung cấp

- Các thí nghiệm trên chuột nhắc dòng Swiss được thực hiện tại Viện Sốt

rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Tp Hồ Chí Minh và Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp

Hồ Chí Minh

- Các thí nghiệm trên gà Lương phượng được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu tổng quan về β-glucan

1.1.1 Nguồn thu nhận β-glucan

β-glucan là một polysaccharide gồm nhiều phân tử đường glucose liên kết

với nhau trong phân tử và được thu nhận chủ yếu từ thành tế bào nấm men, vi

khuẩn, yến mạch, lúa mạch, tảo và từ nhiều loại nấm dược liệu β-glucan thu nhận

từ các nguồn khác nhau có cấu trúc và chức năng khác nhau Trong đó,

(1,3)/(1,6)-β-glucan thường được tìm thấy ở thành tế bào nấm men (Saccharomyces), nấm

phục linh (Poria cocus), nấm linh chi (Ganoderma lucidum) và nấm đông cô (Lantinus edodes) Đối với (1,3)/(1,4)-β-glucan được chiết xuất từ vỏ cám của hạt

yến mạch và lúa mạch, một ít từ lúa mạch đen và lúa mì [1]

Bảng 1.1 Cấu trúc, nguồn thu nhận và hoạt tính của β-glucan [2]

β (1,3)/(1,6)

S cerevisiae

Kháng ký sinh trùng, vi khuẩn và nấm Chống ký sinh trùng

Kích thích hoạt động miễn dịch Kháng khối u và ngăn chặn sự hình thành khối u Kích thích tạo máu

Gây phân bào và giảm tỷ lệ đột biến

Candida albicans Kích thích hoạt động miễn dịch

Agaricus blazei

Cảm ứng sinh cytokine

Ức chế isoenzyme CYP450 Ngăn chặn hình thành khối u và giảm tỷ lệ đột biến

Cấu trúc và nguồn thu nhận c ng như hoạt tính của một số loại β-glucan được thể hiện qua bảng 1.1 β-glucan trong yến mạch và lúa mạch thường có hoạt

7

tính sinh học thấp β-glucan tìm thấy trong nấm lớn thường chỉ có phân nhánh với

một phân tử glucose và đo vậy chúng có hoạt tính sinh học (tăng cường miễn dịch)

đến một mức độ nào đó Trong khi đó, β-glucan chiết từ thành tế bào nấm men có cấu

trúc phân nhánh rất mạnh và có hoạt tính sinh học cao với khả năng tăng hoạt tính miễn

dịch mạnh nhất trong tất cả các loại β-glucan [2, 3]

1.1.2 Cấu trúc của β-glucan

Cấu trúc của β-glucan gồm các đơn phân tử D-glucose liên kết với nhau qua liên kết β-glycoside Tùy thuộc vào nguồn thu nhận, β-glucan có cấu trúc mạch thẳng và nhánh khác nhau Theo Mantovani và ctv, mạch thẳng của β-glucan được tạo thành bởi các liên kết β-(1,3)-D-glycoside và các mạch nhánh được tạo bởi các liên kết β-(1,6)-D-glycoside (thường được gọi là (1,3)/(1,6)-β-glucan) hoặc β-(1,4)-

D-glycoside (thường được gọi là (1,3)/(1,4)-β-glucan) (hình 1.1.) [2] Những khác

biệt về cấu trúc có thể làm thay đổi độ hòa tan, khối lượng phân tử, v.v dẫn đến ảnh

hưởng tới chức năng, tác dụng điều hòa miễn dịch của β-glucan [4-7]

Trong tế bào nấm men, β-glucan là hợp chất cấu thành chủ yếu của thành tế bào Trong đó, (1,3)/(1,6)-β-glucan chiếm khoảng 50 - 60% hàm lượng chất khô của thành tế bào [8] β-glucan nằm ở lớp giữa của thành tế bào, gần với màng tế bào, có

chức năng duy trì và ổn định hình dạng của tế bào

Hình 1.1 Cấu trúc của (1,3)/(1,4)- và (1,3)/(1,6)-β-glucan theo Volman và ctv [6]

Khả năng tan của β-glucan phụ thuộc vào mức độ polymer hóa Độ polymer hóa trung bình của β-glucan thường là ~1500 đơn phân, tương đương với Mw~240 kDa [8] β-glucan thường không tan trong nước khi độ polymer hóa lớn và khả năng

hoà tan của chúng tăng khi mức độ polymer hóa trong phân tử giảm [2]

8

1.2 Sơ lƣợc về nấm men Saccharomyces

Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, nước, lương thực thực phẩm, v.v đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt

Trong đó, nấm men Saccharomyces được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học, các công nghiệp lên men, thực phẩm [9, 10] Nấm men Sacchamyces thường

có dạng hình trứng, hình bầu dục Hình dạng nấm men không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi, giống và điều kiện ngoại cảnh Ví dụ, trong môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng có hình bầu dục Trong điều kiện yếm khí thường có hình tròn, trong điều

kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn Nấm men Sacchamyces được cấu tạo bởi:

Thành tế bào, màng tế bào chất (nằm sát vách tế bào, có cấu tạo chủ yếu là lipoprotein) và tế bào chất gồm có mạng lưới nội chất là vị trí của nhiều hệ thống enzyme khác nhau [11]

Nấm men Saccharomyces được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công

nghiệp như trong sản xuất bánh mì và lên men đồ uống có cồn Chúng chuyển hóa đường trong bột mì thành rượu và CO2, chính CO2 là tác nhân làm nở bánh mì và

giúp tăng chất lượng bia Ngoài ra, Saccharomyces còn được sử dụng trong sản xuất

chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp; sản xuất glycerol, enzyme invertase và

dược phẩm [9, 12] Hơn thế nữa, Saccharomyces còn đóng vai trò quan trọng trong

việc thúc đậy sự phát triển, góp phần tăng tính đa dạng và phong phú của các dòng nước uống lên men, đồng thời giúp làm tăng giá trị sử dụng của trái cây, giảm thiểu

sự thất thoát kinh tế cho người sản xuất và kinh doanh Mặt khác, nấm men còn được sử dụng như nguồn bổ sung amino axít, vitamin, v.v [13]

Ở Saccharomyces, thành tế bào chiếm khoảng 10 - 25% trọng lượng khô của

tế bào [14] Thành tế bào nấm men được cấu thành chủ yếu từ mannoprotein và

β-glucan (chiếm 85-90% trọng lượng khô của thành tế bào), một phần nhỏ chitin 3%) và lipid (2-5%) [15] Tuy nhiên, cấu trúc, độ dày của thành tế bào, thành phần

(1-và tỷ lệ các hợp chất cấu thành nên thành tế bào thay đổi rất lớn tùy thuộc (1-vào chủng nấm men và điều kiện nuôi cấy [16]

9

Hình 1.2 Cấu trúc thành tế bào nấm men Saccharomyces [8]

Thành tế bào nấm men Saccharomyces được chia thành 3 lớp (hình 1.2) Trong đó, (1,3;1,6)-β-glucans chiếm tới 50 - 60% thành tế bào nấm men, hình thành nên một cấu trúc lõi Cấu trúc lõi này liên kết đồng hóa trị với chitin, (1,6)-β-glucan,

hoặc mannoprotein, những thành phần chiếm gần 40% thành tế bào nấm men Các mannoprotein được tìm thấy chủ yếu ở bề mặt bên ngoài của thành tế bào liên kết

với (1,6)-β-glucan thông qua các gốc neo glycosylphosphatidylinositol [8, 14] Các

hợp chất này liên kết với nhau một cách chặt chẽ, giúp duy trì hình dạng và tính thấm chọn lọc giúp tế bào chống lại các tác động vật lý c ng như giới hạn tính thấm của thành tế bào [14]

1.3 Phương pháp thu nhận thành tế bào từ nấm men bia Saccharomyces

Thu nhận tế bào nấm men là một trong những công đoạn đầu tiên của quy

trình chế tạo β-glucan từ bã nấm men bia của các nhà máy sản xuất bia hoặc dịch

nuôi cấy tế bào nấm men Để thu nhận tế bào nấm men từ bã men bia hoặc dịch nuôi cấy tế bào nấm men, thông thường trong sản xuất công nghiệp người ta có thể

sử dụng phương pháp ly tâm hoặc lọc qua các màng lọc có kích thước nhỏ và sử dụng hệ hút chân không hoặc bơm áp lực Tuy nhiên trong nghiên cứu thì phương pháp ly tâm thường được áp dụng phổ biến hơn vì có thể đẩy nhanh quá trình sản xuất

Sau khi thu nhận tế bào tiến hành thu nhận thành tế bào nấn men, thông thường người ta sử dụng phương pháp phá vỡ thành tế bào Hiện nay, nhiều phương

10

pháp phá vỡ tế bào đã được nghiên cứu và ứng dụng, tùy thuộc vào đối tượng và mục đích phá vỡ mà lựa chọn phương pháp thích hợp Trong đó, đối với tế bào động vật hay thực vật thì việc phá vỡ tế bào không mấy khó khăn Tuy nhiên, quá trình phá vỡ tế bào vi sinh vật lại rất phức tạp vì kích thước tế bào rất nhỏ và có cấu trúc thành tế bào khá đặc trưng Do đó, quá trình phá vỡ tế bào vi sinh vật cần chú ý một số yếu tố sau: độ bền của sản phẩm, các thành phần trong sản phẩm (protein, DNA, lipid, v.v.), thời gian thực hiện, chi phí Có 3 nhóm phương pháp được sử dụng để phá vỡ tế bào vi sinh vật

1.3.1 Phương pháp vật lý

- Sử dụng sóng siêu âm: Sử dụng sóng siêu âm với tần số lớn hơn 20 kHz

được sử dụng để phá vỡ tế bào nấm men Hiệu quả mà phương pháp này đem lại là rất cao, có thể điều chỉnh hàm lượng protein, pollysaccharide phân giải thông qua các yếu tố phụ đi kèm trong quá trình xử lý [17] Phương pháp này có hiệu quả cao

ở quy mô phòng thí nghiệm nhưng hạn chế ở quy mô lớn Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm đòi hỏi mức năng lượng lớn, thiết bị gây ồn, vấn đề truyền tải nhiệt và không thực hiện được liên tục

- Đồng hóa bằng áp lực cao: Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi

nhất để phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng va chạm rất mạnh vào vành ống và tế bào bị phá vỡ bởi lực cắt và sức nén Tùy thuộc vào tính chất, cấu tạo của tế bào đòi hỏi áp lực khác nhau Phương pháp này thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn Khác biệt giữa các thiết bị là rất lớn nên cần lựa chọn thiết bị phù hợp khi chuyển từ quy mô nhỏ sang quy mô lớn [18, 19]

- Nghiền bi: phương pháp này c ng được sử dụng để phá vở tế bào Với máy

dùng trong phòng thí nghiệm, bi có kích thước khoảng 0,2 mm có thể được sử dụng nhưng với quy mô sản xuất thì kích thước hạt nên lớn hơn hay bằng 0,4 mm Kinh nghiệm cho thấy kích thước tối ưu của hạt bi nghiền phụ thuộc vào kích thước của sinh vật như: vi khuẩn: 0,2 - 0,45 mm, nấm men: 0,5 - 0,75 mm và nấm: trên 0,85

mm

11

Số lượng hạt dùng trong quá trình nghiền còn phụ thuộc vào phần trăm thể tích trống của buồng nghiền và cần phải tính toán chừa đủ khoảng trống cho hạt giãn nở khi gia nhiệt [19, 20]

1.3.2 Phương pháp hóa học

Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh hoặc khả năng oxi hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào Ưu điểm của phương pháp này là không đòi hỏi áp suất cao nên chi phí thấp và dễ thực hiện ở các quy mô Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện sử dụng hóa chất nên chúng thường lẫn vào sản phẩm đòi hỏi quá trình tách phức tạp Trong đó, người ta thường dùng axít để thủy phân các thành phần tế bào Tuy nhiên, hàm lượng axít quá nhiều

có thể dẫn đến những thay đổi về bản chất hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản phẩm có trong tế [18] C ng có thể sử dụng kiềm (NaOH hoặc KOH) để thủy phân Phương pháp này đảm bảo sẽ không còn tế bào sống sau khi phá vỡ tế bào [20] Khi nồng độ NaOH cao thường gây mất hoạt tính, phân hủy protein và các thành phần khác trong tế bào (lipid, axít nucleic, v.v.) tạo điều kiện thu nhận thành tế bào và tinh sạch sản phẩm dễ dàng hơn [3] Ngoài ra, các dung môi như cacbon tetrachloride, toluene, isopropanol và ethanol có thể làm thủng vách tế bào Phương pháp này dễ xảy ra hiện tượng biến tính protein nhưng lại làm giảm khả năng hòa tan của thành tế bào [20]

1.3.3 Phương pháp sinh học

Hai phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân

và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào

Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải một số thành phần của thành tế bào Các enzyme phân giải protein như protease tấn công và phá vỡ các protein thành những phân đoạn nhỏ hơn, chẳng hạn như peptide và amino axít Tương tự, các enzyme glucanase, nuclease hoạt động làm phân hủy DNA, RNA, glucan, monnoprotein, v.v làm thành tế bào bị suy thoái và giải phóng dịch nội bào ra bên ngoài [21] Bên cạnh đó, một số enzyme thủy phân c ng được sử dụng để tác động phá vở tế bào từ bên ngoài Các enzyme này (chitinase, glucanase, protease) thường liên kết với thành phần của thành tế bào nấm men và phân cắt chúng làm màng tế bào lỏng lẻo,

12

phá vỡ tế bào [18] Phương pháp này khá đơn giản, hiệu quả nhưng tốn kém và quá trình tinh sạch khá phức tạp do sự có mặt của enzyme

Phương pháp này thường được áp dụng trong việc phá vỡ thành tế bào nấm

men Nhiều tác giả khi nghiên cứu tách chiết β-glucans trên thế giới chủ yếu sử

dụng phương pháp này Suphantharika và ctv đã nghiên cứu tối ưu hoá thành công

quy trình tự phân tế bào nấm men Sacchromyces để thu nhận thành tế bào [22] Nhiều nghiên cứu về tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men Sacchromyces sau đó

c ng sử dụng phương pháp này ở công đoạn thu nhận thành tế bào [23, 24] Để tiến hành tự phân, các tác giả nói trên thường áp dụng các điều kiện như sau:

- Nhiệt độ: 50 - 55oC (trong hệ ổn nhiệt)

- Tốc độ khuấy 100 - 200 vòng/phút

- Thời gian tự phân: 15 - 24 giờ

Thông thường hỗn hợp sau khi tự phân được xử lý bất hoạt các yếu tối sinh học trong hệ tự phân bằng nhiệt độ cao (đun sôi hoặc hấp ở 121oC)

1.4 Phương pháp tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men bia

Saccharomyces

Thông thường để tách chiết được β-glucan có độ tinh khiết cao từ thành tế

bào nấm men, người ta tiến hành nhiều công đoạn khác nhau gồm các bước theo tự

là chiết protein để thu nhận β-glucan thô, sau đó tiến hành tinh chế bằng cách loại

bỏ các chất còn lại như manoprotein, glycogen, chitin và lipid [25, 26]

- Chiết protein: Để tách chiết protein trong thành tế bào nhiều tác gỉa chủ yếu

sử dụng NaOH William và ctv đã sử dụng NaOH 3% ở nhiệt độ sôi và trong nhiều giờ với tỷ lệ thành tế bào nấm men/dịch NaOH là 1/7 theo thể tích [25] Trong khi

đó Suphantharika và ctv đã sử dụng NaOH 1-2% trong 2 giờ ở nhiệt độ 90oC với tỷ

lệ thành tế bào nấm men/dịch NaOH là 1/5 theo thể tích [26] Thành tế bào nấm

men S cerevisiae sau khi được xử lý với kiềm thì protein và một phần lipid sẽ bị thủy phân và tan trong kiềm Khi ly tâm có thể thu nhận β-glucan thô một cách dễ dàng Sản phẩm β-glucan chế tạo được theo các phương pháp này có hàm lượng protein khá thấp (< 2%) và độ tinh khiết sản phẩm (hàm lượng β-glucan trong sản

phẩm) là trên 50%

13

Ngoài ra, phương pháp sinh học sử dụng enzyme protease để phân huỷ protein trog thành tế bào c ng đã được nhiều nghiên cứu sử dụng Kết quả đã cho thấy rằng thành tế bào nấm men thu được sau khi tự phân được phân tán trong đệm

Na2PO4 (0,02 M, pH 7,5) tạo dạng dung dịch huyền phù 30% và tiến hành xử lý với protamex ezymen ở 55oC trong 5 giờ để loại bỏ protein đã có thể thu nhận β-glucan

thô [23, 24]

- Tinh chế: Để tinh chế β-glucan thô, nhiều nghiên cứu sử dụng HCl (0,94 -

2,45 M) [23] hoặc axít phosphoric (4%) [27] để loại bỏ protein còn lại c ng như các chất khác như glycogen, chitin, v.v Trong khi đó một số nghiên cứu khác sử dụng phương pháp đun trong nước nóng (85oC) trong nhiều giờ trước khi hấp ở 121oC và

xử lý với sóng siêu âm (35 kHz, trong 6 phút) [23, 24] Sau cùng để loại bỏ lipid nhiều tác giả sử dụng dung môi như isopropanol, petroleum ether, v.v [26, 27]

Thêm vào đó, Kardono và ctv c ng đã thu nhận β-glucan từ nấm tuyết (Tremella fuciformis) bằng phương pháp hoàn toàn khác là chiết phân đoạn với các

dung môi thay đổi với độ phân cực tăng dần (hexan, ethylacetate và ethanol) kết

hợp với xử lý gia nhiệt để thu nhận β-glucan thô [28] Tuy nhiên, phương pháp này

thường dễ gây ô nhiễm môi trường (sử dụng nhiều dung môi), khó ứng dụng ở quy

mô lớn và hiệu quả kinh tế không cao nên ít được ứng dụng

Bên cạnh đó, trong nước c ng đã có những nghiên cứu của Phạm việt Cường

[3], Bủi Duy Du [29] và Lý Thị Minh Hiền [30] về tách chiết β-glucan từ tế bào

nấm men bằng phương pháp tự phân hoặc protease để thu nhận thành tế bào và sau

đó sử dụng NaOH Tuy nhiên, các tác giả này hầu như chỉ xác định polysaccharide

tổng trong sản phẩm mà chưa phân tích cụ thể hàm lượng β-glucan bằng phương

pháp đặc trưng

1.5 Các phương pháp cắt mạch β-glucan

Để cắt mạch các polysaccharide nói chung và β-glucan nói riêng, hiện có 3

phương pháp chủ yếu được sử dụng đó là phương pháp hoá học (sử kiềm, axít hoặc các tác nhân có tính oxy hoá mạnh như H2O2, v.v.), phương pháp sinh học (sử dụng các emzyme đặc hiệu) và phương pháp chiếu xạ (sử dụng tia gamma hoặc chùng tia điện tử gia tốc) Mỗi phương pháp điều có ưu và nhược điểm riêng tuy nhiên tuỳ

14

vào mục đích ứng dụng và điều kiện sản xuất mà người ta sử dụng chúng để chế tạo

β-glucan

1.5.1 Phương pháp hóa học

β-glucan là polysaccharide được hình thành từ các đơn phân D-glucose nối

với nhau nhờ liên kết glycoside Liên kết glycoside không bền với axít Dưới tác dụng của axít như HCl, H2SO4, v.v liên kết glycoside bị thủy phân và tạo thành mạch ngắn hơn Dựa trên đặc điểm này, nhiều nghiên cứu sử dụng axít để cắt mạch

β-glucan Jamas đã tiến hành cắt mạch β-glucan tách chiết từ nấm men bằng axít

formic 98% [31] Năm 1998, Dallies đã sử dụng H2SO4 (72%) và HCl (2N) để thủy

phân β-glucan [15] Ngoài ra, Bùi Duy Du c ng đã sử dụng phương pháp hấp thuỷ

nhiệt với H2O2 nồng độ cao để chế tạo β-glucan Mw thấp và tan nước [29] Mặc dù

phương pháp này có những thuận lợi nhất định nhưng gặp phải một số hạn chế như: hiệu suất của quá trình cắt mạch phụ thuộc nồng độ các chất phản ứng và điều kiện phản ứng, khó kiểm soát được quá trình cắt mạch, có thể tổn hại đến cấu trúc nguyên thủy của polymer, chi phí cao và gây ô nhiễm môi trường Bên cạnh đó, sản phẩm sau khi cắt mạch phải tinh chế lại [32]

1.5.2 Phương pháp sinh học

Phương pháp này được xem là thân thiện môi trường vì sử dụng các enzyme

glucanase để cắt mạch phân tử β-glucan Việc sử dụng enzyme để cắt mạch có thể

giảm mức độ phá hủy cấu trúc của polymer, mỗi loại emzyme thườngchỉ cắt đặc

hiệu những liên kết nhất định nào đó, ví dụ như enzyme (1,3)-β-glucanase chỉ thủy phân (1,3)-β-glucan mà không tác dụng với (1,6)-β-glucan [15] C ng như phương

pháp hóa học, phương pháp sinh học c ng có một số hạn chế: cần có một hệ đệm và xúc tác thích hợp cho phản ứng, khó kiểm soát quá trình cắt, đòi hỏi dùng enzyme đặc hiệu và chi phí cao [32]

1.5.3 Phương pháp chiếu xạ

Công nghệ bức xạ là công nghệ sử dụng bức xạ làm nguồn năng lượng trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ bức xạ được biết đến như là một bộ môn khoa học mới, nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vực từ vật lý, hoá học cho đến sinh học nhằm tạo ra các sản phẩm với những phẩm chất, tính năng và công dụng mới phục vụ con người [33]

15

Hiện nay, nguồn bức xạ được dùng phổ biến là nguồn gamma phát ra từ đồng

vị Co60, Cr157 và Ce137, chùm điện tử gia tốc bằng điện từ (Electron Beam) và chùm tia ion phát từ máy gia tốc ion (Ion Beam) [34]

Trong đó, bức xạ ion hoá năng lượng cao được sử dụng để tạo ra các biến đổi

ở mức nguyên tử Một số dạng bức xạ ion hóa phổ biến như hạt alpha, hạt beta, tia gamma, tia X Hạt alpha (tia α) là hạt nhân He (He2+) bị phân rã ở trạng thái kích thích để cho phân rã gamma nhằm giải phóng năng lượng, hạt beta là tên chung cho các điện tử (e-, β-) và positron (e+, β+) trong quá trình phân rã beta Năng lượng hấp thụ bức xạ trên một đơn vị khối lượng vật chất được tính bằng Gray (Gy), theo hệ

đo lường chuẩn SI thì 1 Gy= 1 J/kg [34]

Một số khái niệm và định nghĩa thường sử dụng trong lĩnh vực công nghệ bức xạ bao gồm [35]:

- Bức xạ ion hóa là bức xạ khi đi qua môi trường gây ra quá trình ion hóa

Bức xạ ion hóa bao gồm loại sóng điện từ như tia X,  và loại bức xạ hạt như , , các sản phẩm phân hạch, v.v

- Đơn vị năng lượng electron volt (eV) là năng lượng nhận được bởi 1 điện

tử dưới điện thế 1 volt Một ngàn eV gọi là kiloelectron-volt (keV), một triệu eV gọi là megaelectron-volt (MeV)

- Sự truyền năng lượng tuyến tính (LET, Linear Energy Transfer) là biểu thị tốc độ mất năng lượng trên đơn vị chiều dài khi bức xạ đi qua môi trường, LET = dE/dx, đơn vị thường dùng eV/Ao Đối với bức xạ gamma Co-60 năng lượng trung bình E = 1,25 MeV, thì LET = 0,02 eV/Ao

- Hoạt độ phóng xạ là số nguyên tử đồng vị phóng xạ phân rã trong một đơn vị thời gian Đơn vị là Curie (Ci), 1 Ci = 3,7 x 1010 phân rã/s Đơn vị mới là Bequerel (Bq), 1Bq = 1 phân rã/s

- Liều chiếu xạ X = dQ/dm, là khả năng ion hóa của tia X hoặc là tia

gamma trong đơn vị thể tích không khí Đơn vị là C/kg là liều lượng tia X hoặc là tia gamma gây ra trong 1g không khí khô ở điều kiện tiêu chuẩn (0oC, 760 mmHg) các ion mang điện tích 1 culông điện mỗi dấu

- Suất liều chiếu xạ là khả năng ion hóa của bức xạ trong một đơn vị thời

gian Đơn vị là R/s, R/min và R/h

16

- Liều hấp thụ D = dE/dm là năng lượng bức xạ được hấp thụ bới một đơn

vị khối lượng vật chất Đơn vị là Gray (Gy), 1 Gy = 1 J/kg

- Suất liều hấp thụ D = dD/dt là năng lượng bức xạ hấp thụ bởi một đơn vị

vật chất trong một đơn vị thời gian Đơn vị là Gy/s, kGy/h, v.v

Ngoài ra, tốc độ của các quy trình bức xạ ion hoá hầu như không phụ thuộc vào nhiệt độ, nhiều quy trình thực hiện ở nhiệt độ thấp và không cần tới các chất khơi mào và xúc tác Thêm vào đó, các quá trình thường dễ điều khiển (thông qua liều hấp thụ hoặc thời gian chiếu xạ) và thân thiện với môi trường: Giảm lượng hoá chất sử dụng, không tạo ra chất độc, chất lây nhiễm Hơn thế nữa, khả năng áp dụng

ở quy mô lớn khá cao do chiếu xạ có thể thực hiện ở tốc độ cao bằng các máy gia tốc hoặc nguồn xạ công suất lớn

Có thể nói, cho đến nay, công nghệ bức xạ đã đóng góp một cách khá hữu hiệu trong phát triển kinh tế xã hội Ở các nước phát triển như Nhật, Mỹ, Úc, v.v., tỹ

lệ đó góp của công nghệ bức xạ là rất lớn so với đóng góp chung của ngành năng lượng hạt nhân Ở Việt nam, tuy ngành này còn khá mới mẽ, nhưng c ng đã có những đóng góp hiệu quả trong phát triển kinh tế xã hội Các hướng ứng dụng chính của công nghệ bức xạ có thể kể đến là [35]:

- Khâu mạch nhựa nhiệt dẻo (vật liệu cách điện, màng hoặc ống tự co, đệm mút, foam xốp);

- Sơn phủ bề mặt bìa bìa giấy, gỗ, kim loại, v.v

- Lưu hóa cao su sản xuất lốp (vỏ) xe;

- Khử trùng dụng cụ, bao bì dùng trong y tế và các lĩnh vực khác;

- Chiếu xạ thực phẩm, mỹ phẩm;

- Chiếu xạ gây bất dục côn trùng (Sterile Insect Technique-SIT);

- Kích thích và gây tạo đột biến trong chọn tạo giống cây trồng mới (Mutation Breeding);

- Chế tạo vật liệu tương hợp (Bio-compatable material) và vật liệu có hoạt tính sinh học (Bio-functional material);

- Biến tính gia tăng chất lượng gỗ, vải, da thuộc;

- Lưu hóa bức xạ latex cao su thiên nhiên;

17

- Chiếu xạ xử lý nước thải, khí thải;

- Chiếu xạ cắt mạch polyme bao gồm polysacarit tự nhiên;

- Một số quá trình khác

Tác động của bức xạ đến các polysaccharide đã được nghiên cứu từ khá lâu

và đã cho thấy bức xạ tia gamma có khả năng cắt mạch các polysaccharide ở cả dạng khô và dạng dung dịch trong nước tuy nhiên hiệu quả cắt mạch của chúng trong dung dịch là cao hơn so với dạng khô và quá trình cắt mạch bức xạ trong dung dịch nước có thể tóm tắt như sau [36-40]:

Khi nước bị chiếu xạ sẽ diễn ra quá trình xạ ly nước theo phương trình sau:

H2O  H2, H2O2, e-aq, H, OH, H3O+ (1)

Các gốc tự do OH sau khi được hình thành từ phản ứng (1) sẽ tấn công vào các phân tử polysaccharides (R-H) để cắt mạch chúng thành các phân đoạn có Mw nhỏ hơn (R1 và R2) theo các phản ứng (2) và (3) như sau:

R-H + OH  R + H2O (2)

Như vậy có thể thấy khi chiếu xạ các polysaccharide trong nước thì các gốc

tự do OH đóng vao trò chính trongquá trình cắt mạch

Trong những năm gần đây, tia gamma được sử dụng khá phổ biến để cắt mạch các polysaccharide như tinh bột, cellulose, pectin và alginate Cắt mạch polysaccharide bằng tia bức xạ được đánh giá là một phương pháp khá hữu hiệu với những ưu điểm như: dễ dàng điều chỉnh Mw của polysaccharide thông qua điều chỉnh liều xạ, sản phẩm tạo thành có độ tinh khiết cao, hiệu suất cắt mạch cao, v.v đồng thời nó c ng không phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt độ, điều kiện ngoại cảnh, v.v Mặt khác, phương pháp này c ng thân thiện với môi trường và dễ dàng

áp dụng trên quy mô công nghiệp hơn những phương pháp thông thường khác [32]

Hiệu quả cắt mạch của tia gamma đã được chứng minh khi chiếu xạ các

polysaccharide như chitosan, pectin, alginate, v.v nhưng chiếu xạ β-glucan hầu như chỉ được nghiên cứu rất ít Đầu tiên là Byun và ctv nghiên cứu chiếu xạ β-glucan

bằng tia gamma từ nguồn Cobalt-60 và tác giả này đã cho thấy khả năng cắt mạch

β-glucan bằng chiếu xạ đạt hiệu quả khá cao [32] Trong nghiên cứu này tác giả sử

β-glucan sau chiếu xạ có hoạt tính cao hơn β-glucan không chiếu xạ Cụ thể là kết

quả thử nghiệm in vitro và in vivo đều cho thấy β-glucan chiếu xạ đã làm tăng khả năng hoạt hóa các tế bào miễn dịch Trong in vitro, nghiệm thức sử dụng β-glucan chiếu xạ có số lượng tế bào miễn dịch tăng hơn 18% so với nghiệm thức sử dụng β- glucan không chiếu xạ Trong in vivo, hoạt tính tăng cường miễn dịch của β-glucan chiếu xạ còn thể hiện cao hơn so với in vitro, số lượng tế bào miễn dịch trong cơ thể chuột sử dụng β-glucan chiếu xạ tăng hơn 74% so với chuột sử dụng β-glucan

không chiếu xạ Nghiên cứu tiếp theo là của Methacanon và ctv trong đó đã sử dụng

β-glucan tan nước tách chiết từ nấm đông trùng hạ thảo Ophiocodyceps dipterigana

có Mw ban đầu là 590 kDa và sau khi chiếu xạ ở các liều 5, 10, 25, 50 và 100 kGy

đã thu được các sản phẩm cắt mạch có Mw tương ứng là 120, 35, 9,5 và 5 kDa [41]

Tác giả này c ng cho thấy β-glucan sau khi chiếu xạ cắt mạch đã có hoạt tính cao hơn

trong việc kích thích nguyên bào sợi sinh Interleukin-8 mạch hơn nhiều lần so với sản

phẩm không cắt mạch Với hoạt tính cải thiện như vậy, chiếu xạ β-glucan sẽ là hướng

đi mới giúp tạo ra chế phẩm β-glucan có hoạt tính sinh học cao và qua đó sẽ nâng cao

hơn nữa giá trị của loại polymer tự nhiên này

Bên cạnh đó, nhằm tăng hiệu quả cắt mạch β-glucan nói riêng, polysaccharide

nói chung, nhiều nghiên cứu c ng đã sử dụng H2O2 như là một tác nhân tạo ra hiệu ứng cộng hợp với cắt mạch bức xạ Quá trình này được diễn ra như sau [42-44]: Tia γ

19

eaq + H2O2  •OH + OH- (6)

Các phản ứng (4), (5) và (6) sẽ góp phần gia tăng hình thành các gốc tự do hydroxyl (OH) và tham gia cắt mạch β-glucan hiệu quả hơn

1.6 Hoạt tính sinh học của β-glucan

1.6.1 Tăng cường khả năng miễn dịch

Đặc tính sinh học quan trọng nhất của β-glucan là tác dụng lên hệ thống miễn dịch β-glucan được coi là chất giúp tăng cường khả năng miễn dịch mạnh nhất đến

từ thiên nhiên Nhiều nghiên cứu cho thấy β-glucan giúp tăng cường tạo ra

Interleukin-1 và Interleukin-2, tăng cường sản xuất lymphokine c ng như giúp tăng cường hoạt động của tế bào NK, tế bào T và đại thực bào Các nghiên cứu khác còn

cho thấy β-glucan giúp tăng cường sức đề kháng chống lại sự nhiễm khuẩn như

Mycobacterium bovis, Staphylococcus aureus hoặc nhiễm trùng Eimeria vermiformis ở chuột Chức năng miễn dịch có thể được nâng cao bằng cách cho

uống hoặc tiêm β-glucan, những phản ứng tăng cường miễn dịch có thể đóng một

vai trò quan trọng trong việc cung cấp khả năng chống nhiễm khuẩn và ký sinh trùng Phương pháp điều trị hiện tại bằng thuốc đối với các bệnh nhiễm trùng có thể

được tăng cường khi kết hợp với β-glucan [1] Các thử nghiệm trên người đã được thực hiện bằng cách tiêm truyền PGG-glucan (betafectin) thu được từ nấm men S

cerevisiae cho các bệnh nhân giải phẫu cho kết quả tốt khi nguy cơ nhiễm trùng

giảm và có thể rút ngắn được thời gian điều trị kháng sinh [45]

Hệ thống miễn dịch nhận diện β-glucan là một hợp chất lạ do cơ thể không thể tổng hợp β-glucan Hệ thống miễn dịch bẩm sinh đáp ứng với các tác nhân gây

bệnh xâm nhập qua các thụ thể nhận dạng khuôn mẫu, thường được biểu hiện bởi các tế bào miễn dịch Các thụ thể nhận biết các mô hình phân tử liên quan đến vi

khuẩn, trong đó β-glucan được coi là một trong những mô hình chính cho cảm biến

trung gian với các thụ thể nhận dạng khuôn mẫu khi nhiễm nấm Các thụ thể nhận

dạng quan trọng nhất với β-glucan là thụ thể dectin-1, thụ thể CR3 và các thụ thể

TLR, được tìm thấy trên các tế bào miễn dịch khác nhau như bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào đuôi gai, bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toàn, tế bào NK và

trên cả các tế bào biểu mô ruột [7, 46-48] Khi β-glucan gắn kết với thụ thể dectin-1

sẽ gây ra các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đáp ứng như thực bào, tế

20

bào tua và đại thực bào sản xuất các cytokine và chemokine, kích hoạt

interleukin-1β [46]

Cơ chế tác động của β-glucan lên hệ miễn dịch có thể khác nhau tùy vào cách

thức điều trị bằng đường tiêm tĩnh mạch hay đường uống Những nghiên cứu từ

năm 1990 đã cho thấy tác dụng mạnh mẽ của β-glucan lên hệ thống miễn dịch khi được sử dụng theo đường tiêm Đối với đường uống, β-glucan cho thấy khả năng

tác động lên hệ miễn dịch thông qua tương tác với các tế bào M trong ruột non [49]

Các tế bào M sẽ lấy β-glucan và vận chuyển chúng từ ruột đến các tế bào miễn dịch

nằm tại các phiến Peyer trong ruột Nghiên cứu của Hong và ctv trên chuột cho thấy

cả hai loại β-glucan dạng hạt và dạng tan đều được hấp thụ bởi đại thực bào trong

ruột và sau đó được vận chuyển đến các hạch bạch huyết, lá lách và tủy xương [50]

Khả năng hòa tan c ng là một yếu tố ảnh hưởng đến cơ chế tác động lên hệ

thống miễn dịch của β-glucan Các thử nghiệm in vivo và in vitro cho thấy β-glucan

dạng hạt, không hòa tan có khả năng hoạt hóa cả hệ thống miễn dịch bẩm sinh và

đáp ứng β-glucan không hòa tan được thực bào bởi các tế bào đuôi gai và đại thực

bào thông qua con đường thụ thể dectin-1 qua đó gây ra đáp ứng ở tế bào T và giải

phóng cytokine [43] Tuy nhiên, không phải tất cả các β-glucan không hòa tan đều

có thể liên kết và kích hoạt thụ thể dectin-1 Các nghiên cứu sử dụng β-glucan sản xuất tổng hợp cho thấy rằng việc kết hợp với thụ thể dectin-1 là đặc hiệu đối với β- glucan có mạch chính là β-(1,3)-glucan Do đó, β-glucan với mạch chính gồm hỗn hợp β-(1,3)/(1,4)-glucan như β-glucan từ lúa mạch sẽ không được thụ thể này nhận biết Ngoài ra, mạch chính của β-glucan cần phải có ít nhất bảy đơn vị glucose để có

thể gắn kết với thụ thể dectin-1 Mw của β-glucan càng cao càng cho khả năng gắn

kết cao với thụ thể dectin-1 [51] β-glucans hòa tan c ng được nhận biết bởi các thụ

thể dectin-1, tuy nhiên β-glucans hòa tan không thể kích hoạt phản ứng miễn dịch thông qua con đường này β-glucan hòa tan có thể liên kết với thụ thể CR3, dẫn đến

kích hoạt hệ thống miễn dịch thông qua bổ thể cùng các kháng thể đặc hiệu [52]

1.6.2 Chống ung thư

Bên cạnh khả năng tăng cường miễn dịch β-glucan còn có khả năng chống lại ung thư và các khối u Cơ chế chống khối u của β-glucan được thực hiện thông qua

gây độc tế bào ung thư thông qua quá trình apoptosis trong tế bào ung thư tuyến tiền

liệt [54] Một nghiên cứu khác về β-glucan được tiến hành trên 23 bệnh nhân nữ bị

ung thư vú tiến triển có độ tuổi trung bình là 52 tuổi và 16 phụ nữ khỏe mạnh c ng

cho thấy β-glucan đã kích thích sự gia tăng và kích hoạt của các tế bào bạch cầu đơn

nhân ở những bệnh nhân ung thư vú tiến triển [55]

Nghiên cứu của Lee và ctv cho thấy β-glucan kích hoạt chức năng đại thực bào bằng cách tăng sản xuất oxit nitric, tăng biểu hiện interleukin (IL)-1β và yếu tố

hoại tử khối u (TNF)-α [56] Ngoài tác động bằng cách tăng cường hệ thống miễn

dịch, Kim và ctv c ng báo cáo rằng β-glucan còn giúp làm giảm đáng kể trọng

lượng khối u của tế bào ung thư ruột kết CT-26 ở chuột bằng cách kích hoạt đại thực bào và ức chế sự hình thành mạch, can thiệp vào nguồn cung cấp máu của khối

u để giảm sự phát triển của khối u và ngăn ngừa di căn [57]

Theo một nghiên cứu tại đại học Regensburg ở Đức cho thấy β-glucan có

hoạt động hiệu quả chống khối u rắn Sarcoma 180 ở chuột Trọng lượng khối u đã giảm 72 - 99% chỉ trong ba mươi ngày mà không điều trị bằng một phương pháp nào khác Tại Viện Nghiên cứu Quốc gia ở Cairo, glucan được nhận thấy có các hoạt động mạnh mẽ chống lại ung bướu ở chuột với thử nghiệm điều trị cho chuột mang ung thư biểu mô thể rắn Ehrlich bằng glucan đã làm tăng lên đáng kể tỉ lệ sống sót c ng như thời gian tồn tại trung bình của các loài động vật được điều trị, so với phương pháp kiểm soát ung bướu và đạt kỷ lục tỷ lệ ức chế khối u (T/C%) lến

đến 87,67% Ngoài khả năng kháng ung thư, β-glucan còn giúp tăng cường sức

mạnh của vắc xin chống ung thư, tăng cường hiệu quả của các kháng thể tự nhiên

và tăng cường hệ thống miễn dịch, hỗ trợ mạnh mẽ hiệu quả chống ung bướu của kháng thể đơn dòng chống lại các khối u hình thành ở chuột [1]

1.6.3 Hạ mỡ máu và đường huyết

Trong suốt hơn hai thập kỷ qua β-glucan được biết đến là có đặc tính làm

giảm cholesterol và chất béo trung tính Rất nhiều trong số các nghiên cứu này được