Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma co 60 để chế tạo b glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã men bia tt

Để có được β-glucan Mw thấp và tan trong nước thì cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ được chứng minh là rất hiệu quả với những ưu điểm nổi bật như thời gian ngắn, quy trình đơn giản, có

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thành Long

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG BỨC XẠ GAMMA Co-60 ĐỂ CHẾ TẠO β-GLUCAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP TAN TRONG NƯỚC CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Lê Quang Luân

Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn

… năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

Luận án “Nghiên cứu ứng dụng bức xạ gamma Co-60 để chế tạo

β-glucan khối lượng phân tử thấp tan trong nướ oạt t n in

ọ từ n ia” được thực hiện từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2019

tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh và Viện Sinh học Nhiệt đới

1 Tính cấp thiết

β-glucan đã được biết đến rộng rãi như là chất kích thích miễn dịch

rất mạnh, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lượng

đường trong máu, chữa lành vết thương, làm trẻ hóa làn da, v.v

β-glucan còn có tác dụng làm gia tăng số lượng tế bào miễn dịch và hạn chế sự phát triển của khối u ở người nên có hoạt tính phòng chống rất mạnh mẽ khối u giúp nâng cao hiệu quả điều trị ung thư, và làm giảm

tác dụng phụ của hóa trị, v.v Trong chăn nuôi, β-glucan có tác dụng làm

tăng cường hệ thống miễn dịch, giúp vật nuôi kháng được một số bệnh,

từ đó làm tăng năng suất và chất lượng sản sản phẩm mà không cần phải dùng đến kháng sinh hoặc chất kích thích

Tuy nhiên, β-glucan có khối lượng phân tử (Mw) lớn, độ nhớt cao và

khó hòa tan nên rất hấp thu kém nên gặp một số trở ngại khi ứng dụng

thực tiễn Nhiều nghiên cứu cho thấy β-glucan có Mw thấp sẽ có hiệu ứng sinh học tốt hơn β-glucan và β-glucan tan nước có Mw trong khoảng từ 1-30 kDa đã cho thấy có tác dụng tăng cường miễn dịch cao

hơn so với các β-glucan có Mw cao β-glucan Mw thấp và tan trong nước là những phân tử β-glucan dễ tan trong nước nên dễ dàng được hấp

thu và có hoạt tính sinh học cao do đó được sử dụng hiệu quả hơn Để

có được β-glucan Mw thấp và tan trong nước thì cắt mạch bằng phương

pháp chiếu xạ được chứng minh là rất hiệu quả với những ưu điểm nổi bật như thời gian ngắn, quy trình đơn giản, có thể điều chỉnh liều xạ để

thu được β-glucan có Mw như mong muốn, sản phẩm có độ tinh khiết

cao, không cần tinh chế lại và thân thiện với môi trường

β-glucan là một trong những hợp chất chính cấu tạo nên thành tế bào

nấm men bia và cả nước hiện có trên 300 cơ sở sản xuất bia với công suất thiết kế 1,7 tỷ lít/năm, trong đó lượng bã nấm men là ~1% Bã thải

này hiện chỉ được sử dụng một phần và số còn lại được xử lý và thải ra môi trường Chính vì vậy, việc sử dụng nguồn bã thải nấm men bia để

tách tạo β-glucan làm nguyên liệu để chế tạo chế phẩm β-glucan Mw thấp

và tan trong nước có hoạt tính sinh học cao là rất hiệu quả và thiết thực nhằm tận dụng được nguồn phế thải để tạo sản phẩm có giá trị cao và góp phần giảm thiểu các nguồn gây ô nhiễm môi trường

Luận án này nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ

thành tế bào bã nấm men bia và thiết lập quy trình công nghệ chế tạo chế

phẩm β-glucan Mw thấp và tan trong nước bằng phương pháp chiếu xạ đồng thời nghiên cứu các hiệu ứng sinh học của β-glucan sau khi cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ trong điều kiện in vitro và in vivo trên động vật (gà và chuột) nhằm tạo ra chế phẩm β-glucan có Mw thích hợp

cho hiệu ứng sinh học cao phù hợp cho mục đích ứng dụng làm thực phẩm chức năng hoặc chế phẩm bổ sung trong chăn nuôi

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng thành công quy trình công nghệ chế tạo chế phẩm

β-glucan Mw thấp và tan trong nước có hoạt tính sinh học từ bã thải nấm men của các nhà máy sản xuất bia bằng phương pháp chiếu xạ

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

- Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia

- Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma Co-60

- Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương

pháp chiếu xạ

- Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan Mw thấp và tan trong nước

bằng phương pháp chiếu xạ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu tổng quan về β-glucan

Phần này giới thiệu tổng quan đặc trưng về cấu trúc và nguồn thu

nhận β-glucan

1.2 Sơ lược về nấm men Saccharomyces cerevisiae

Phần này tổng quan về tế bào nấm men S cerevisiae và cấu trúc của thành tế bào, trong đó nhấn mạnh β-glucan

1.3 P ƣơng p áp t u n ận thành tế bào từ nấm men bia

Phần này trình bày các phương pháp thông dụng được sử dụng để

phá vỡ tế bào nấm men Saccharomyces thu nhận thành tế bào

1.4 P ƣơng p áp tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bia

Phần này trình bày các phương pháp phổ biến phá vỡ tế bào, chiết

protein và tinh chế để thu nhận β-glucan

1.5 Các p ƣơng p áp cắt mạch β-glucan

Phần này trình bày các phương pháp thông dụng đã và đang được sử

dụng để cắt mạch β-glucan

1.6 Hoạt tính sinh học của β-glucan

Trình bày đặc tính sinh học và cơ chế tác động của β-glucan

- Bã men bia (nhà máy bia Sài Gòn Bình Dương), mẫu chuẩn β-glucan

nấm men (Sigma, Mỹ), và KIT xác định hàm lượng β(1-3,1-6)-glucan

(Megazyme) và các hóa chất tinh khiết khác (Meck)

- Gà Lương phượng (Gallus gallus domesticus) (Đại học Nông Lâm

Tp.HCM) và chuột nhắt trắng dòng Swiss (Viện Pasteur Tp.HCM), kháng thể sơ cấp Anti-mouse IgG produced in goat và thứ cấp Anti-goat IgG-Alkaline phosphatase (Sigma-Aldrich, Mỹ) và đĩa ELISA 96 giếng (Santa Cruz Biotechnology, Canada)

2.2 Nội dung và p ƣơng p áp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết β-glucan từ bã tế bào nấm men bia

2.2.1.1 Thu nhận thành tế bào nấm men Saccharomyces:

Bã tế bào nấm men bia được ly tâm 5000 vòng/phút, rửa và tiến hành

tự phân trong 20 giờ ở 50oC Ly tâm thu nhận phần không tan

2.2.1.2 Tách chiết β-glucan tổng số

a Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ: Tiến hành ở 70, 90 và 100oC 400

g thành tế bào được khuấy với 2000 mL NaOH 3%, đun trong 9 giờ và

ly tâm thu nhận phần rắn Phần rắn được tiếp tục chiết 3 lần với 2000

mL dung dịch HCl có nồng độ lần lượt là 2,45; 1,75 và 0,94 M ở 750C trong 2 giờ Ly tâm 7000 vòng/phút thu phần không tan, rửa 3 lần với cồn tuyệt đốivà chiết 3 lần với diethyl ether Sấy khô và tính như sau:

x100

Mẫu β-glucan sau đó được kiểm tra hàm lượng protein (theo phương pháp AOAC 987.04-1997) và β-glucan (bằng kít K-YBGL)

b Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH: Các bước được tiến hành

tương tự như mục a nhưng nồng độ NaOH thay đổi là 1, 2, 3 và 4%

c Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết: Được tiến hành tương tự

mục a nhưng sử dụng nồng độ NaOH tối ưu từ mục b và thời gian chiết được khảo sát là 3, 4, 6, 9 và 12 giờ

d Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi: Các bước cũng được

tiến hành tương tự mục a nhưng thể tích dung dịch NaOH có nồng độ tối

ưu (từ mục b) sử dụng là 1200, 2000 và 2800 mL, với nhiệt độ và thời gian phản ứng tối ưu đã được xác định tương ứng ở các mục a và c

2.2.1.3 Đo phổ hồng ngoại: Mẫu β-glucan được nghiền nhỏ, trộn đều

với KBr và ép tạo viên nén Tiến hành đo mẫu trên máy quang phổ hồng

ngoại model FT/IR-4700 (Jasco, Nhật Bản)

2.2.2 Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma

2.2.2.1 Chuẩn bị mẫu và chiếu xạ tạo mẫu β-glucan Mw thấp và tan trong nước: Hòa 100 g β-glucan trong 100 mL nước cất để tạo hỗn hợp huyền phù β-glucan 10% (w/v) Chiếu xạ ở các liều khác nhau trên

nguồn xạ gamma Co-60 với xuất liều 3 kGy/h

2.2.2.2 Xác định hiệu suất glucan tan nước sau chiếu xạ: Mẫu

β-glucan sau chiếu xạ được ly tâm 11000 vòng/phút để thu dịch nổi Tủa dịch nổi với ethanol với tỷ lệ 1/9 (v/v), ly tâm thu tủa và sấy khô Hàm

lượng của β-glucan tan nước được tính theo công thức:

Hàm lượng β-glucan tan nước (%) = x100

2.2.2.3 Đo phổ UV-vis của β-glucan tan nước: Mẫu β-glucan được đo

trên máy quang phổ tử ngoại GENESY 10S UV-Vis (Thermo, Mỹ) ở nồng độ 0,025% và bước sóng từ 200-600 nm

2.2.2.4 Xác định khối lượng phân tử của glucan: Mw của mẫu

β-glucan 0,1% (20 µL) được đo trên hệ máy GPC e2695 sử dụng cột Ultrahydrogel (Water, Mỹ) ở 40oC và tốc độ bơm là 1 mL/phút

2.2.2.4 Đo phổ hồng ngoại: Thực hiện như mục 2.1.2.3

2.2.2.5 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ 1H- và 13C-NMR của

β-glucan được đo trên máy Utrashield 500 plus (Brucker, USA) ở tầng số lần lượt là 500 MHz và 125 MHz sử dụng D2O (Cambridge, USA) với nồng độ mẫu là 5 mg/L

2.2.3 Xác định hoạt tính sinh học của β-glucan cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ

2.2.3.1 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa in vitro: Cho 1,5 mL dung dịch β-glucan 100 ppm phản ứng với 1,5 mL dung dịch DPPH 0,1 mM

Lắc đều để trong tối 30 phút Đo OD ở bước sóng 517 nm (mẫu chứng

là nước cất) Hoạt tính bắt gốc tự do được tính như sau: H (%) = (1 – A/Ao) x 100 Trong đó: A là OD của mẫu thử, Ao là OD của mẫu đối chứng ở 517 nm

2.2.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa in vivo trên chuột: Chuột được

chia thành hai nhóm (mỗi nhóm 45 con gồm 5 NT, mỗi NT 3 con và lặp lại 3 lần): Nhóm bình thường không tiêm CCl4 và nhóm gây độc gan được tiêm phúc mô 3 lần bằng CCl4 với liều 10 mL/kg thể trọng chuột (cho nhịn đói 15 giờ trước khi tiêm cách ngày) Sau tiêm 60 phút, cho

uống β-glucan (2 mg/con) liên tục 1 tuần Chuột ĐC chỉ cho uống nước

cất Sau 8 ngày, lấy máu để định lượng AST và ALT trên máy sinh hóa BioSystem A15 (Bỉ)

2.2.3.3 Khảo sát công thức máu và miễn dịch ở chuột: Gồm 5 NT, lặp lại 3 lần Hàng ngày chuột được cho uống 100 µL dung dịch β-glucan

2% (2 mg/con) Sau 28 ngày, lấy máu để xét nghiệm công thức máu (hồng cầu, bạch cầu tổng số (BCTS), bạch cầu trung tính (BCTT) và lympho bào), IgG và IgM

2.2.3.4 Khảo sát hoạt tính giảm lipid và glucose máu

a Tạo chuột béo phì thực nghiệm: Nhóm nuôi béo bằng ăn thức ăn giàu

chất béo (HFD-high fat diet) và nhóm ăn thường được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (ND-normal diet) trong 8 tuần, sau đó lấy máu xét nghiệm

các chỉ số glucose, cholesterol, triglycerid và LDL

b Khảo sát các chỉ số sinh hóa trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm: Chuột béo phì được cho chuột uống hàng ngày với 100 µL β-glucan 2%

Đối chứng chỉ cho uống nước cất Theo dõi, lấy máu, kiểm tra chỉ số

sinh hóa ở 3 giai đoạn (Giai đoạn 1: Sau 20 cho uống β-glucan trong 20 ngày và vẫn cho ăn giàu chất béo; Giai đoạn 2: Tiếp tục cho uống thêm β-glucan 20 ngày (sau 40 ngày); và Giai đoạn 3: Ngừng cho chuột uống β-glucan trong 20 ngày (sau 60 ngày) Các chỉ số theo dõi: Cholesterol,

triglycerid, LDL và glucose máu

2.2.3.5 Khảo sát hiệu ứng tăng trưởng và miễn dịch ở gà: Gồm 5 NT,

mỗi NT 18 con và lặp lại 3 lần Gà được cho ăn thức ăn có bổ sung 500

ppm β-glucan có Mw khác nhau Các chỉ tiêu theo dõi gồm: Trọng

lượng bình quân (TLBQ), mức tăng trọng tuyệt đối, hệ số tiêu tốn thức

ăn (FCR), tỷ lệ nuôi sống tích lũy, các chỉ tiêu về sinh hóa (BCTS/1

mm3, tỷ lệ bạch cầu lympho và BCTT), hiệu giá các kháng thể (HGKH) (kháng lại các bệnh gumboro, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm

và newcastle), và chất lượng thịt (tỷ lệ móc hàm, tỷ lệ quầy thịt, tỷ lệ ức

khi chiếu xạ như mục 2.2.2.1

2.2.4.2 Cắt mạch β-glucan bằng phương pháp chiếu xạ ở điều kiện có

H 2 O 2 : Được tiến hành như mục 2.2.4.1 nhưng nồng độ hỗn hợp huyền phù β-glucan là 5, 10 và 15% (w/v) trong 1% H2O2

2.2.4.3 Đo giản đồ nhiễu xạ tia X: Giản đồ nhiễu xạ tia X của mẫu

β-glucan được đo trên máy D8 Advance ECO (Bruker, Đức) sử dụng ống phát bức xạ CuKα (lq= 1.5406 Å, U= 40 kV, I= 25 mA) ở góc từ 30-

100o (2θ) với kích thước bước 0,05o (2θ) và thời gian đếm là 0,5/s

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được xử lý bằng phần mềm Excel và thống kê theo phần mềm SPSS 16.0 Dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng phương pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tách chiết β-glucan từ tế bào nấm men bã men bia

3.1.1 Thu nhận nấm men từ bã nấm men bia từ nhà máy bia

Hình 3.1 Dịch bã men bia (A), ảnh SEM dịch chưa rửa (B), mấm men bia sau khi rửa (C) và ảnh

SEM tế bào nấm men sau khi rửa (D)

Bã nấm men sau khi thu nhận được ly tâm 5000 vòng/phút để thu nhận tủa, rửa và ly thu nhận phần tế bào mấm men (hình 3.1)

3.1.2 Tách và thu nhận thành tế bào nấm men

Tế bào nấm men sau khi

tự phân được tâm thu phần

không tan thì chủ yếu là

thành tế bào và có màu trắng

ngà (hình 3.2)

Hình 3.2 Sản phẩm thành tế bào nấm men trước

(A) và sau khi ly tâm (B) và ảnh SEM (C)

3.1.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết glucan từ thành tế bào nấm men Saccharomyces

β-3.1.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan

Nhiệt độ ( oC) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lượng protein (%)

Kết quả bảng 3.1 cho thấy khi nhiệt độ càng tăng thì hiệu suất thu

nhận sản phẩm β-glucan tách chiết được càng giảm Ở 70oC thì hiệu suất

thu sản phẩm β-glucan cao nhất với 17,11% và ở 100C hiệu suất sản phẩm là thấp nhất với 14,28% Tuy nhiên có thể thấy khi nhiệt độ phản ứng càng cao thì hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm càng thấp và

C

B

A

độ tinh khiết của sản phẩm càng cao và nhiệt độ chiết 90o

C là thích hợp nhất

3.1.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH: Kết quả bảng 3.2 cho thấy hiệu

suất sản phẩm β-glucan thu được giảm khi tăng nồng độ NaOH, hiệu suất này là 17,55% khi tăng nồng độ NaOH lên 3% và thấp nhất (16,82%) khi sử dụng 4% NaOH Ngoài ra ở NT xử lý NaOH với nồng

độ 1 và 2% thì hàm lượng protein vẫn còn cao (trên 2%) và độ tinh khiết thấp (85,11%) Trong khi đó, ở NT xử lý NaOH với nồng độ 4%, hàm lượng protein thấp và độ tinh khiết cao nhưng hiệu suất giảm mạnh Do

đó để tách chiết β-glucan đạt hiệu suất cao, hàm lượng protein thấp và

độ tinh khiết sản phẩm cao thì NaOH 3% là lựa chọn tối ưu

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất thu nhận β-glucan

Nồng độ NaOH (%) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%)

hiệu suất thu được giảm đi đáng kể Ngoài ra, hàm lượng protein còn lại

trong β-glucan khi tách chiết trong thời gian từ 3-12 giờ đều dưới 2% và

độ tinh khiết của sản phẩm xử lý 9-12 giờ là khá cao Kết quả này cho thấy thời gian chiết 9 giờ là hiệu quả nhất

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan

Thời gian chiết (giờ) Tỷ lệ sản phẩm β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) Hà lƣợng protein (%)

lý mẫu với tỉ lệ chiết 1/3 cao hơn so với tỉ lệ 1/5 và 1/7 Ở NT xử lý với

tỉ lệ 1/7, hàm lượng β-glucan thu được là tương đương với NT xử lý với

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi thủy phân đến hiệu suất thu nhận β-glucan

Tỉ lệ mẫu/dung môi (g/mL) Tỷ lệ β-glucan (%) Độ tinh khiết (%) HL protein (%)

tỉ lệ 1/5 (~16%) Hàm lượng protein trong sản phẩm β-glucan thu được

đều dưới 2% nhưng độ tinh khiết sản phẩm khi xử lý ở tỉ lệ 1/5 và1/7 là cao hơn Có thể thấy tỷ lệ 1/5 là tối ưu

3.1.3.5 Hoàn thiện quy trình chế tạo β-glucan từ bã nấm men bia

a Tách chiết β-glucan từ bã nấm men bia quy mô 500 lít/mẻ: Từ kết quả

Bảng 3.5 Hiệu suất tách chiết sản phẩm β-glucan từ bã men bia ở quy mô 500 lít/mẻ

KL khô thành tế bào nấm men (kg)

KL sản phẩm

β-glucan (kg)

Hiệu suất (%)

TB 500 16,17±0,32 4,521±0,22 0,7273±0,01 16,11±0,62

trên, quy trình tách chiết mẫu β-glucan được hoàn thiện và chế tạo thử

nghiệm với số lượng bã thải nấm men bia lớn hơn (500 lít/mẻ) Kết quả thu nhận được từ 3 mẻ khác

nhau ở bảng 3.5 cho thấy lượng

sản phẩm β-glucan thu được là

2,18 kg Như vậy quy trình này

có hiệu suất tạo sản phẩm

β-glucan từ thành tế bào nấm men

trung bình ~16,1% (hình 3.3)

Hình 3.3 Mẫu β-glucan sau khi tách chiết từ

thành tế bào nấm men sau khi thu nhận (A),

b Xác định hàm lượng β-glucan: Hàm lượng β-glucan trong mẫu chế tạo

ở bảng 3.6 cho thấy độ tinh khiết của sản phẩm β-glucan thu nhận được từ quy trình là khoảng 91,78% β-glucan và có chứa một lượng nhỏ α-glucan

Bảng 3.6 Hàm lượng các loại glucan trong mẫu tách chiết Glucan tổng số (%) α-glucan (%) β-glucan (%)

c Xác định đặc trưng cấu trúc mẫu β-glucan sau khi chế tạo

Đặc trưng cấu trúc Sản phẩm β-glucan được khảo sát bằng phổ hồng

ngoại và so sánh với mẫu chuẩn cùng loại của Sigma Kết quả từ hình 3.4 cho thấy các đỉnh chính xuất hiện từ 400-4000 cm-1 và được liệt kê ở bảng 3.7 cho thấy đỉnh xuất hiện ở 3333 cm-1 thuộc liên kết O-H xuất có cường độ cao và vai rộng, đỉnh 2896 cm-1

có cường độ trung bình và vai hẹp cùng với đỉnh có cường độ yếu ở 2088 cm-1 điều thuộc liên kết C-H Các đỉnh tại số sóng 1640 và 1079 cm-1 là đặc trưng của liên kết CO

C

B

A

Trong khi đó các đặc trưng của liên kết CCH, C-O-C và CC được biểu hiện ở các

Hình 3.4 Phổ FTIR của mẫu β-glucan tách chiết tách từ thành tế bào nấm

men bia và mẫu β-glucan chuẩn của Hãng Sigma

Bảng 3.7 Các đỉnh của các nhóm chức đặc trưng cơ bản của β-glucan

d Thiết lập quy trình tách chiết β-glucan quy mô 500 lít mẻ

Hình 3.5 Sơ đồ khối quy trình tách chiết β-glucan từ dịch bã men bia quy mô 500 lít/mẻ

Từ những kết quả nhận được nói trên, quy trình tách chiết β-glucan

từ bã thải nấm men bia được hoàn thiện như mô tả ở hình 3.5

3.2 Cắt mạch β-glucan bằng p ƣơng p áp iếu xạ

3.2.1 Xác định hiệu suất thu nhận β-glucan tan bằng phương pháp chiếu xạ β-glucan

Hình 3.6 cho thấy hàm lượng β-glucan tan

thu được tăng tuyến tính theo sự gia tăng của

liều xạ, Cụ thể khi chiếu xạ ở 100 kGy thì hàm

lượng β-glucan tan thu nhận được là ~25,8%,

tại liều 200 kGy tăng ~23,2% so với liều 100

kGy, và ở liều 300 kGy thì hàm lượng thu

được là ~ 66,7%

3.2.2 Sự suy giảm khối lượng phân tử

Hình 3.7 cho thấy Mw của β-glucan tan

nước giảm dần và tỷ lệ nghịch với sự gia tăng

của liều xạ Ở khoảng liều chiếu xạ 100 kGy

thì Mw của β-glucan tan nước thu được giảm

mạnh (từ trên 64 kDa xuống còn ~31 kDa) và

sau đó giảm chậm hơn và đạt khoảng 11 kDa

ở liều xạ 300 kGy

3.2.3 Phân tích phổ UV

Hình 3.6 Hiệu suất thu nhận

β-glucan tan nước khi chiếu xạ hỗn

hợp β-glucan 10% ở các liều xạ

khác nhau

Hình 3.7 Sự suy giảm Mw của

β-glucan tan theo liều xạ

Hình 3.8 β-glucan tan nước từ mẫu β-glucan 10% chiếu xạ ở

các liều xạ khác nhau

Hình 3.8 cho thấy các dung dịch β-glucan

tan thu được sau chiếu xạ có màu sắc thay đổi

từ nâu đến nâu đậm Kết quả từ

Hình 3.9 Phổ UV-vis β-glucan chế

tạo bằng phương pháp chiếu xạ

hình 3.9 cho thấy rằng ở mẫu không chiếu xạ thì hoàn toàn không có sự

xuất hiện đỉnh trong dải bước sóng từ 200-400 nm do chưa có β-glucan

Mw thấp trong dung dịch Trong khi đó phổ của các mẫu β-glucan chiếu

xạ đều xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 273 nm

3.2.4 Phân tích phổ FTIR

Kết quả từ hình 3.10 cho thấy đối với

mẫu β-glucan chiếu xạ hầu như không

thay đổi số lượng và vị trí đỉnh so với

mẫu không chiếu xạ Tuy nhiên có sự

xuất hiện đỉnh 1731 cm-1 biểu hiện của

liên kết C=O trong phân tử sau khi cắt

mạch với cường độ theo liều xạ, trong khi

cường độ của đỉnh 1156 cm-1

biểu hiện của nhóm C-O-C (liên kết glucoside) của

các mẫu chiếu xạ giảm giảm dần theo sự

gia tăng của liều xạ Nếu so sánh cường

độ của đỉnh này và đỉnh 1040 cm-1

biểu

hiện cho liên kết C-C vốn được xem là

bền với bức xạ cho thấy tỷ lệ giữa cường

của trong phổ của mẫu β-glucan theo liều xạ

3.2.5 Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H và 13 C

Phổ NMR-1H và 13C của mẫu

β-glucan tan nước có Mw~25

kDa (hình3.12a&b) cho thấy độ

β-glucan sau khi chiếu xạ Trong

khi độ dịch chuyển hóa học biểu

400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000

1/cm

0kGy

250kGy 200kGy 150kGy 100kGy 300kGy