Đánh giá kết quả của kỹ thuật Realtime PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục...27 3.2.1.. Đã có rất nhiều phương pháp xét nghiệm đ
Trang 1TR ƯỜ NG Đ I H C Y HÀ N I Ạ Ọ Ộ
NGUY N TH QUỲNH Ễ Ị
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
REALTIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2013 – 2019
HÀ NỘI – 2019
Trang 2TR ƯỜ NG Đ I H C Y HÀ N I Ạ Ọ Ộ
NGUY N TH QUỲNH Ễ Ị
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT
REALTIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC
Ngành đào tạo : Bác sĩ đa khoa
Trang 3MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN 3
1.1 Khái niệm bệnh lây truyền qua đường tình dục 3
1.2 Dịch tễ học bệnh STD trên thế giới và tại Việt Nam 3
1.3 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn hệ tiết niệu – sinh dục hiện nay 4
1.3.1 Quan sát trực tiếp 4
1.3.2 Nuôi cấy 6
1.3.3 Giải trình tự gen 7
1.3.4 Phản ứng chuỗi polymerase 10
1.3.5 Realtime PCR 12
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1 Đối tượng nghiên cứu 16
2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 16
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 16
2.2 Địa điểm nghiên cứu 16
2.3 Thời gian nghiên cứu 16
2.4 Phương pháp nghiên cứu 16
2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 16
2.4.2 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 17
2.4.3 Thu thập mẫu nghiên cứu 17
2.4.4 Quy trình nghiên cứu 18
2.5 Quy trình kỹ thuật định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục 18
2.5.1 Hóa chất và dụng cụ 18
2.5.2 Quy trình định tính DNA 12 khuẩn gây bệnh đường tiết niệu – sinh dục 19
2.6 Phân tích kết quả 23
2.7 Xử lý số liệu 24
2.8 Đạo đức nghiên cứu 24
Trang 43.1.1 Kết quả tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm 25
3.1.2 Hình ảnh kết quả Realtime PCR sau khi tách DNA 27
3.2 Đánh giá kết quả của kỹ thuật Realtime PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục 27
3.2.1 Kết quả Realtime PCR từ các mẫu bệnh phẩm 27
3.2.2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục ở nhóm nghiên cứu 27
Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 28
4.1 Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm 28
4.2 Đánh giá kết quả của kỹ thuật Realtime PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 5Bảng 2.1 Danh sách 12 khuẩn đường tiết niệu – sinh dục được định danh 19
Trang 6Hình 1.1 Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo nhận định nấm và Trichomonas
vaginalis 5
Hình 1.2 Trichomonas vaginalis 6
Hình 1.3: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP 10
Hình 1.4 Các bước cơ bản trong phản ứng PCR 11
Hình 1.5 Biều đồ khuếch đại của Realtime PCR 13
Hình 1.6 Biểu đồ chuẩn của Realtime PCR 14
Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 18
Hình 2.2: Máy đo quang phổ Nanodrop 2000 21
Hình 2.3 Hình minh họa đo OD của DNA bằng máy Nanodrop 2000 22
Hình 2.4 Kết quả Realtime PCR của mẫu dương tính 24
Hình 2.5 Kết quả Realtime PCR của mẫu âm tính 24
Trang 7ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) hiện là nhóm bệnh truyềnnhiễm phổ biến nhất ở hầu hết các quốc gia, đặc biệt là ở nhóm tuổi 15-50,ảnh hưởng trầm trọng đến sức khỏe con người, đặc biệt là sức khỏe sinh sản.Mặc dù có những tiến bộ quan trọng về mặt chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa(ví dụ như tiêm chủng), chúng vẫn là những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm vàphổ biến nhất [1] Tỷ lệ mắc STD trên toàn thế giới do vi khuẩn và virus đượcước tính là hơn 125 triệu trường hợp mỗi năm [2] Theo thống kê của Tổ chức
Y tế thế giới (WHO), hàng năm có ít nhất 1/10 người ở độ tuổi hoạt động tìnhdục mắc một bệnh trong nhóm STD Tại các nước đang phát triển thuộc châuPhi, châu Á, STD là một trong năm bệnh thường gặp nhất [3] Nhiễm trùngtiết niệu sinh dục cũng là một trong số những lý do phổ biến nhất khiến chomột người phụ nữ quyết định đến thăm khám bác sĩ phụ khoa hoặc chuyên giatiết niệu [4] Ở Việt Nam, theo ước tính thì mỗi năm có gần 1 triệu trường hợpmới mắc bệnh STD, trong đó các bệnh STD phổ biến là chlamydia, lậu, giangmai, trichomonas, HPV, HSV [5], [6]
Thuật ngữ bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) đề cập đến mộtloạt các hội chứng lâm sàng do mầm bệnh truyền từ người bị nhiễm sangngười không nhiễm qua quan hệ tình dục bằng đường âm đạo, hậu môn hoặcqua đường miệng [7] Nhóm bệnh này chủ yếu do vi khuẩn, virus, vi nấm, kýsinh trùng gây ra, có triệu chứng lâm sàng đa dạng và phương pháp điều trịcũng khác nhau [5] Tuy nhiên, có đến 90% các bệnh lây truyền qua đườngtình dục không có triệu chứng dẫn đến chẩn đoán và điều trị chậm trễ [8] Nếukhông được điều trị kịp thời và kỹ lưỡng, chúng có thể gây ra các biến chứng
đe dọa đến tính mạng như ung thư, vô sinh, thai ngoài tử cung, phá thai tựphát, chết thai, trọng lượng sơ sinh thấp, tổn thương thần kinh và thậm chí tửvong [9] Không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe, tính mạng của người nhiễmbệnh, STD còn gây nên những hậu quả nghiêm trọng về mặt kinh tế và xã hội
Trang 8[10] Tại Hoa Kỳ, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) ướctính chi phí cho các hệ thống chăm sóc sức khỏe của Mỹ để điều trị tám bệnhSTD phổ biến nhất là khoảng 16 tỷ đô la Mỹ mỗi năm [11].
Từ thực tế trên đặt ra vấn đề trong chẩn đoán sớm và điều trị sớm bệnhSTD Đã có rất nhiều phương pháp xét nghiệm để chẩn đoán các tác nhân visinh vật và ký sinh trùng gây STD như nhuộm soi, nuôi cấy vi sinh, miễn dịchnhưng hầu hết các phương pháp này độ nhạy và độ đặc hiệu đều khá thấp.Trong những năm gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của ngành sinh học phân tử
đã cho ra đời nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán, phát hiệnnhanh chóng và chính xác các tác nhân gây nhiễm bệnh STD, có thể kể đến
kỹ thuật tách chiết và điện di DNA, kỹ thuật PCR, kỹ thuật xác định trình tựnucleotid trong phân tử DNA, kỹ thuật lai acid nucleic trong đó kỹ thuậtRealtime PCR là một kỹ thuật phổ biến và đang trở thành công cụ chẩn đoánnhạy cảm nhất mà cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp [12], [13].Realtime PCR tuân thủ thường quy chung của PCR nhưng cho một đườngcong khuếch đại tương tự đường cong phát triển vi khuẩn gồm ba giai đoạn(kéo dài đến khi dấu hiệu của sản phẩm PCR lớn hơn dấu hiệu nền của hệthống, tăng gia tốc kéo dài và tạo hình phẳng), do đó, cả quá trình PCR đượchoàn thiện rõ hơn chứ không phải chỉ là một sản phẩm cuối cùng của phảnứng sau một số chu kỳ nhất định [14] Vì vậy, với mục đích sàng lọc, phát
hiện và điều trị sớm bệnh STD, tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Hoàn thiện
quy trình kỹ thuật Realtime PCR từ các bệnh phẩm sinh học để định danh
vi sinh vật hệ tiết niệu - sinh dục” với hai mục tiêu:
1 Hoàn thiện kỹ thuật tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm (nước tiểu, tinh dịch, dịch niệu đạo, dịch âm đạo, dịch màng tinh hoàn ).
2 Đánh giá kết quả của kỹ thuật Realtime PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu – sinh dục.
Trang 9Chương 1 TỔNG QUAN1.1 Khái ni m b nh ệ ệ lây truy n qua đ ề ườ ng tình d c (STD) ụ
B nh lây lan qua đệ ường tình d c (STD) ch m t nhóm b nh lâyụ ỉ ộ ệtruy n c nam và n gi i, b ng con đề ở ả ữ ớ ằ ường ti p xúc tình d c đ ng gi iế ụ ồ ớhay khác gi i, bao g m c giao h p qua âm đ o, qua mi ng hay qua h uớ ồ ả ợ ạ ệ ậmôn Kh năng lây truy n c a lo i b nh này r t cao và b t c ai cũng cóả ề ủ ạ ệ ấ ấ ứ
th m c căn b nh này n u có đ i s ng tình d c không lành m nh ể ắ ệ ế ờ ố ụ ạ [5],[15]
Có thể chia các bệnh STD ra thành các nhóm lớn theo căn nguyên gâybệnh: do vi khuẩn (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae,Treponema pallidum, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma), vi nấm (nấmCandida), ký sinh trùng (Toxoplasma, Trichomonas vaginalis) Cho đến nay
đã phát hiện ra trên 40 tác nhân vi sinh vật gây bệnh STD, mỗi tác nhân gâybệnh có một bệnh cảnh lâm sàng đặc trưng riêng [16]
1.2 D ch t h c b nh STD trên th gi i và t i Vi t Nam ị ễ ọ ệ ế ớ ạ ệ
STD là b nh ph bi n trên th gi i, có tác đ ng sâu s c đ n v n đệ ổ ế ế ớ ộ ắ ế ấ ề
s c kh e sinh d c và sinh s n Theo WHO, h n ứ ỏ ụ ả ơ 1 tri u ca STD đệ ược ghi
nh n m i ngày M i năm, có kho ng 357 tri u ca nhi m m i ch tínhậ ỗ ỗ ả ệ ễ ớ ỉriêng trong nh ngữ b nh STD ph bi n: chlamydia (131 tri u), b nh l uệ ổ ế ệ ệ ậ(78 tri u), giang mai (5,6 tri u) và trichomonas (143 tri u)ệ ệ ệ [3]
T i Vi t Nam, STD là m t trong nh ng b nh r t hay g p đ tu iạ ệ ộ ữ ệ ấ ặ ở ộ ổ
ho t đ ng tình d c Theo báo cáo c a Vi n Da li u Qu c gia, h ng năm ạ ộ ụ ủ ệ ễ ố ằ ở
nước ta ghi nh n kho ng 200.000 trậ ả ường h p m i m c STD Tuy nhiênợ ớ ắtheo ước tính c a các chuyên gia thì con s này vào lên đ n 800 nghìnủ ố ế
Trang 10đ n 1 tri u ngế ệ ười, trong đó có kho ng 500.000 trả ường h p nhi mợ ễchlamydia đường sinh d c, 150.000 trụ ường h p nhi m l uợ ễ ậ [5]
M c dù t l nhi m b nh cao và gây nhi u bi n ch ng nguy hi m,ặ ỷ ệ ễ ệ ề ế ứ ể
nh ng m c đ quan tâm c a c ng đ ng t i v n đ này ch a th t sư ứ ộ ủ ộ ồ ớ ấ ề ư ậ ự
tương x ng M t s nghiên c u cho th y ki n th c c a ngứ ộ ố ứ ấ ế ứ ủ ười dân v cácề
b nh STD, v h u qu c a b nh cũng nh v phệ ề ậ ả ủ ệ ư ề ương pháp đi u tr cácề ị
b nh này là th p T l ngệ ấ ỷ ệ ười bi t v các b nh này ch chi m dế ề ệ ỉ ế ưới 60%,
hi u bi t c a các đ i tể ế ủ ố ượng v h u qu và cách đi u tr và phòng b nhề ậ ả ề ị ệSTD còn m c dở ứ ưới 50% [17] Đi u tra Qu c gia v V thành niên vàề ố ề ịthanh niên Vi t Nam (2004) cho k t qu : có 0,3% thanh thi u niên nóiệ ế ả ế
đã t ng m c b nh STD Ph n l n thanh thi u niên đã đi đi u tr t i cácừ ắ ệ ầ ớ ế ề ị ạ
c s y t công, m t s nh t i đi u tr t i các phòng khám t , m t s tơ ở ế ộ ố ỏ ớ ề ị ạ ư ộ ố ựmua thu c đi u tr và m t vài ngố ề ị ộ ười nói là không đi u tr gì ề ị [18]
1.3 Các ph ươ ng pháp phát hi n vi ệ khu n h ti t ni u – sinh d c ẩ ệ ế ệ ụ
Trang 11Phương pháp nhuộm gram là một trong những kỹ thuật cơ bản và quantrọng nhất trong phân tích vi khuẩn ở giai đoạn đầu nhằm xác định sơ bộ đặctính của các dòng vi khuẩn muốn nghiên cứu theo tính chất bắt màu gram củachúng Vi khuẩn bắt mầu hỗn hợp crystal violet - iodin sẽ có màu tím nâu khiquan sát dưới kính hiển vi quang học và được xếp vào nhóm vi khuẩn gramdương Những dòng vi khuẩn khác không giữ được mầu crystal violet và bắtmàu fuchsin (đỏ) được xếp vào nhóm vi khuẩn gram âm.
Phương pháp nhuộm gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet củathành tế bào tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn Việc xác địnhthời gian tẩy mầu là yếu tố quan trọng trong việc phân biệt vi khuẩn gramdương và vi khuẩn gram âm Nếu kéo dài thời gian tẩy mầu, ngay cả vi khuẩngram dương cũng không giữ được mầu nhuộm ban đầu Ngoài ra, một số loài
vi khuẩn gram dương cũng có thể bị tẩy mầu dễ dàng và vì thế chúng đượccoi là các dòng vi khuẩn có tính chất bắt mầu gram thay đổi (có thể âm lẫn
Trang 12dương) Chất nhuộm fuchsin (hoặc có thể thay bằng safranin) tạo cho vikhuẩn gram âm có màu hồng đỏ Fuchsin nhuộm màu mạnh hơn và có màu dễ
nhìn hơn safranin (Haemophilus spp., và một vài dòng vi khuẩn kỵ khí không
ăn màu safranin) [20]
Trang 13- Xác định độc lực, gây bệnh thực nghiệm
- Xác định độ nhạy cảm của chủng phân lập được với kháng sinh (khángsinh đồ)
1.3.3 Giải trình tự gen
Trình tự nucleotid của một đoạn DNA có thể được xác định bằng cách
sử dụng một quy trình hóa học theo nguyên lý của Alan Maxam và WalterGilbert hay một quy trình enzym được phát triển bởi Fred Sanger Quy trìnhcủa Sanger thường được gọi là phương pháp dideoxynucleotid, và hiện nayquy trình này là cơ sở để phát triển những phương pháp giải trình tự hiện đại.Phương pháp enzyme được phát triển bởi Sanger và các cộng sự năm 1977 đãnhanh chóng trở thành phương pháp được lựa chọn rộng rãi vì dễ tiến hành và
có độ tin cậy cao
- Phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert [21]: Năm 1976-1977,
Allan Maxam và Walter Gilbert đã phát triển một phương pháp giải trình tựDNA dựa trên sự cải biến hóa học DNA và sự phân cắt giới hạn tại nhữngnucleotid đặc hiệu Phương pháp này đòi hỏi phải gắn phóng xạ tại đầu 5’ kếtthúc của sợi DNA (thường bằng một phản ứng kinase sử dụng gamma-32PATP) và đoạn DNA giải trình tự phải được tinh sạch DNA được xử lý với hóachất tạo ra các điểm gãy ở một vị trí nhỏ của một hoặc hai trong số bốnnucleotid của một trong bốn phản ứng (Dimethyl sunphat phá hủy G,Glicosidic phá hủy A + G, Hydrazin phá hủy C, Hydrazin+ NaCl phá hủy C +T) Phân tử DNA cải biến này sau đó được làm đứt bởi piperidine nóng ở vịtrí các nucleotid cải biến Nồng độ của các chất hóa học được điều khiển đểtrung bình chỉ có một cải biến trên mỗi phân tử DNA Như vậy, một loạt cácđoạn đứt có đánh dấu được tạo ra Các đoạn đứt trong bốn phản ứng đượcđiện di trong làn cạnh nhau trên gel polyacrylamide Để quan sát kích thước
Trang 14các đoạn đứt, gel được đưa lên phim chụp phóng xạ tự ghi X-ray để phát hiệnvạch, từ các vạch đó đó ta suy ra trình tự đoạn DNA ban đầu.
Phương pháp giải trình tự của Maxam-Gilbert ít được sử dụng vì nhữngnhược điểm bộc lộ ngày càng rõ như những phức tạp về mặt kỹ thuật khôngthể sử dụng trong các kit sinh học phân tử tiêu chuẩn, cũng như việc phươngpháp này sử dụng nhiều hóa chất độc hại và gặp những khó khăn trong việc
mở rộng quy mô và cải tiến phương pháp
- Phương pháp enzym (phương pháp Sanger) [22]: Vì phương pháp
Sanger có hiệu quả cao hơn đồng thời sử dụng ít hóa chất độc hại cũng như ítcác chất phóng xạ hơn phương pháp của Maxam và Gilbert, nó nhanh chóngtrở thành phương pháp được chọn lựa phổ biến hơn
Ví dụ: Nếu ta thêm ddCTP vào hỗn hợp phản ứng đang tổng hợp DNAthì quá trình tổng hợp chuỗi polynucleotide sẽ dừng lại ở vị trí C
+ Điện di các đoạn DNA này với việc bổ sung 1% các loại ddNTP riêngbiệt (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) sẽ được bốn bản điện di khác nhau Cácbăng DNA xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các ddNTP.Dưa vào đó để đọc trình tự DNA
Trang 15Các vạch DNA được hiện hình bằng cách chụp phóng xạ tự ghi hoặc soitrên tia cực tím, và trình tự DNA có thể được đọc trực tiếp trên film X-rayhoặc hình ảnh của gel.
Những thay đổi trong kỹ thuật giải trình tự bằng chất kết thúc chuỗi chủyếu nằm ở việc gắn các nucleotid với đuôi phospho có chứa phóng xạ, hoặc
sử dụng mồi có gắn chất nhuộm huỳnh quang ở đuôi 5’ Việc gắn chất nhuộmvào mồi tạo điều kiện phát triển một hệ thống quang học để có thể phân tíchnhanh hơn, kinh tế hơn và dễ dàng tự động hóa Sau này, Leroy Hood và cácđồng nghiệp của ông đã sử dụng hai phương pháp gắn chất nhuộm huỳnhquang lên các ddNTPs và mồi để mở ra kỷ nguyên tự động hóa và giải trình
tự công suất lớn
- Phương pháp giải trình tự tự động [23]: Cấu tạo của máy giải trình tự
tự động gồm hai phần chính yếu: phần điện di với gel pop7 và capilary36 vàphần phát hiện peak điện di Các mạch đơn DNA trong ống phản ứng giảitrình tự được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơnnày phát sáng khi đi qua chùm tia laser
Nguyên tắc hoạt động: trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có mộtvạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và con mắtcảm quang sẽ ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu
đồ Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnhtương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự DNA
Ngày nay, người ta dùng bốn màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấubốn loại ddNTP, nhờ vậy, phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉtrong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di một hàng mà khôngcần phải trên bốn hàng khác nhau như trước đây
Trang 16Hình 1.3: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP
1.3.4 Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction: PCR)
Phương pháp này do Mullis và cộng sự đề xuất năm 1985 Mục đíchcủa phương pháp là phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần trong ống nghiệm
Để thực hiện phương pháp cần có: phân tử DNA ban đầu; hai đoạnDNA mồi (primers), mỗi đoạn gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở haiđầu của phân tử DNA ban đầu: mồi ngược và mồi xuôi; bốn loại Nu (dATP,dCTP, dGTP, dTTP); Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt
độ cao, được tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus [24]
Trang 17Mỗi chu kỳ PCR gồm ba giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:
(1) Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng sợi kép thànhdạng sợi đơn ở nhiệt độ 94 – 950 C trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1
– 1,5 phút)
(2) Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống 40 –
650C cho phép hai đoạn mồi gắn vào DNA mẫu ở vị trí tương đồng theonguyên tắc bổ sung (A – T, G – C) ở hai đầu DNA cần nhân
(3) Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 720C, DNA Taq polymerase hoạtđộng kéo dài đoạn DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới được tổng hợptheo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu
Sau môt chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một đoạn DNA khuôn đượcnhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại đượccoi là DNA khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Chính vì vậy, sau k chu kỳnhân bản sẽ tạo ra 2k đoạn DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu [25]
Trang 18Hình 1.4 Các bước cơ bản trong phản ứng PCR (Andy Vierstraete, 1999)
1.3.5 Realtime PCR
1.3.5.1 Khái niệm
Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sựphân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gelsau khi phản ứng kết thúc Ngược lại, phương pháp Realtime PCR cho phépphát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đangdiễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về sốlượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang
Realtime PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phépchúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độnhạy cao trên một phạm vi động học lớn Các kết quả của Realtime PCR cóthể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng(số bản copy của DNA) Số liệu của Realtime PCR có thể đánh giá mà khôngcần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưavào quá trình được tăng lên Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệuđược đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn đượcgiảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ [13]
1.3.5.2 Các vấn đề kỹ thuật cơ bản của Realtime PCR
* Biểu đồ khuếch đại của Realtime PCR
Biểu đồ này có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ốngphản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt.Cường độ huỳnh quang trải qua ba giai đoạn:
Trang 19- Giai đoạn ủ (giai đoạn tiềm phục): cường độ huỳnh quang mà máy ghinhận được trong những chu kỳ đầu sẽ rất thấp và hầu như không thay đổi, hiểnthị bằng một đường thẳng nằm ngang, vì trong giai đoạn này dù DNA đích đã
có thể được nhân bản thành các bản sao nhưng do số lượng chưa đủ để giúpcho chất phát huỳnh quang nhận được ánh sáng kích thích phát ra ánh sánghuỳnh quang đủ cường độ để máy ghi nhận
- Giai đoạn lũy thừa: một khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đếnmột ngưỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ đểđược máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy đường biểu diễn khuếch đạibắt đầu ngóc lên Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi
sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA đích tănggấp đôi sau mỗi chu kỳ
- Giai đoạn bình nguyên: cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽtăng trưởng đến một mức nào đó thì độ tăng trưởng sẽ chậm dần và đạt đếnbình nguyên vì các bản sao của DNA đích, do phản ứng đã cạn dần dNTP và
enzyme Taq polymerase không hoạt động hiệu quả nữa, nên sẽ không còn gia
tăng số lượng theo cấp số hai nữa [13]