HOÀN CHỈNH QUY TRÌNH kỹ THUẬT PCR để xác ĐỊNH NHỮNG BIẾN đổi của một số GEN mã hóa ENZYM CHUYỂN hóa XENOBIOTIC ở NAM GIỚI vô SINH NGUYÊN PHÁT

Tôi xin cam đoan đề tài: “Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh nguyên phát” là do tự bản thân

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Bác sĩ, tôixin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, ban Giám hiệu, phòng Quản lý đại học và bộmôn Y sinh học – Di truyền, trường đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiệnthuận lợi cho tôi trong suốt thời gian hoàn thành nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS BSNT Vũ Thị Huyền giảngviên bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường đại học Y Hà Nội đã trực tiếphướng dẫn tôi từ khi bắt đầu đến khi kết thúc quá trình nghiên cứu và làm khóaluận, đóng góp cho tôi những ý kiến quý báu hoàn thành bản khóa luận này.Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên bộmôn đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để tôihoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin cám ơn hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp đã đóng gópnhững ý kiến quý báu để tôi hoàn thiện bản khóa luận

Nhân dịp này, tôi kính trọng tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha, mẹ tôi đãdành tất cả điều kiện để tôi được học tập, phấn đấu và trưởng thành trongcuộc sống và sự nghiệp

Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã dành cho tôi nhiều sự động viên và đóng góp

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Tạ Tiên Sinh

Tôi xin cam đoan đề tài: “Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh nguyên phát” là do tự bản thân tôi thực hiện Tất cả những

số liệu do chính tôi thu thập, kết quả trong luận văn này trung thực và chưa có

ai công bố trong bất kỳ một nghiên cứu nào khác

Tôi xin đảm bảo tính khách quan, trung thực của các số liệu và kết quả

xử lý số liệu trong nghiên cứu này

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Tạ Tiên Sinh

ADN Acid Deoxyribonucleic

Bảng 3.1 Đặc điểm độ tuổi của đối tượng nghiên cứu và nhóm chứng 28Bảng 3.2 Kết quả đo nồng độ tinh sạch ADN theo phương pháp Phenol/

Chloroform 28Bảng 3.3 Kết quả đo nồng độ tinh sạch ADN theo phương pháp ADN-ex-

press 29Bảng 3.4 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen CYP1A1

A2455G sử dụng kỹ thuật ARMS – PCR 30Bảng 3.5 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen GSTP1 C341T

sử dụng kỹ thuật ARMS – PCR 31

Bảng 3.6 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen GSTP1

G313A sử dụng kỹ thuật ARMS – PCR 32Bảng 3.7 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen NAT2 C481T

sử dụng kỹ thuật ARMS – PCR 32Bảng 3.8 Kết quả chạy điện di trong nghiên cứu đột biến gen NAT2 G590A

sử dụng kỹ thuật ARMS – PCR 33Bảng 4.1 So sánh một số ưu nhược điểm hai phương pháp tách ADN 37Bảng 4.2 Thành phần 1 mẫu PCR theo khuyến nghị của nhà sản xuất 37

Hình 3.1 Kết quả chạy điện di GSTP1 Ile105Val sử dụng kỹ thuật ARMS –

PCR 30Hình 4.1 Mẫu kết quả chạy điện di kỹ thuật ARMS – PCR 39

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Vô sinh 3

1.1.1 Khái niệm vô sinh và lịch sử các nghiên cứu về vô sinh 3

1.1.2 Nguyên nhân vô sinh nam giới 4

1.2 Xenobiotic 6

1.2.1 Khái niệm xenobiotic và ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể 6

1.2.2 Quá trình biến đổi chung của xenobiotic 8

1.2.3 Gen chuyển hóa xenobiotic 11

1.3 PCR 17

1.3.1 Khái niệm và lịch sử phát triển của kỹ thuật PCR 17

1.3.2 Nguyên lý kỹ thuật PCR 17

1.3.3 Một số phương pháp PCR đặc hiệu 19

1.3.4 Phương pháp di truyền phân tử - kỹ thuật ARMS – PCR 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 23

2.1.3 Số bệnh nhân và số mẫu 23

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2 Đạo đức trong nghiên cứu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Đặc điểm tuổi của đối tượng nghiên cứu 28

3.2 Kết quả tách chiết và đo độ tinh sạch ADN 28

3.3 Kết quả chẩn ARMS-PCR 29

3.3.1 Kết quả chạy điện di 29

3.3.2 Kết quả nghiên cứu đột biến CYP1A1 A2455G sử dụng kỹ thuật ARMS – PCR 30

3.3.4 Kết quả nghiên cứu đột biến GSTP1 G313A sử dụng kỹ thuật ARMS –

PCR 323.3.5 Kết quả nghiên cứu đột biến NAT2 C481T sử dụng kỹ thuật

ARMS – PCR 323.3.6 Kết quả nghiên cứu đột biến NAT2 G590A sử dụng kỹ thuật

ARMS – PCR 33CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 344.1 Đặc điểm sinh học của nhóm đối tượng nghiên cứu 344.2 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi ở các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 354.2.1 Tách chiết ADN 364.2.2 Tiến hành PCR theo phương pháp ARMS và điện di đọc kết quả 37KẾT LUẬN 45KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 46TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh hiện nay là một vấn đề cần được quan tâm nhiều hơn tại ViệtNam cũng như trên thế giới Vô sinh không chỉ ảnh hưởng tới chất lượngcuộc sống mà còn làm tăng tần suất của những cuộc ly hôn Hiện nay vô sinhkhông còn là vấn đề riêng của nữ giới Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO),trong các cặp vợ chồng ở độ tuổi sinh sản gặp vấn đề về sinh con thì 30-40%

do nam giới và 10% là do cả 2 giới, 40% do nữ giới và khoảng 10% không rõnguyên nhân [1] Tại các nước Tây Âu, tỷ lệ vô sinh dẫn đến ly hôn chiếm15%, trong đó nguyên nhân do nam giới chiếm hơn 50% Từ đó vô sinh nam

đã được nghiên cứu một cách sâu sắc và toàn diện hơn

Cơ thể chúng ta là một hệ thống mở luôn tiếp nhận các chất từ môitrường tự nhiên: thức ăn, thuốc, hóa chất,… Xenobiotic là các chất sinh học

lạ đối với cơ thể, nó có thể có những ảnh hưởng tốt đối với cơ thể trong quátrình chống lại các tác nhân lạ (ứng dụng của thuốc trong điều trị các bệnh lýnội ngoại khoa) song bên cạnh đó nó cũng có những tác dụng không tốt cho

cơ thể (hóa chất độc hại, thuốc lá, rượu,…), trong đó có rất nhiều chất có khảnăng gây vô sinh Nhiệm vụ của cơ thể là chuyển hóa các chất độc hại và đàothải chúng, giúp cơ thể có được sự cân bằng trong các hoạt động sống và sinhsản Trong quá trình chuyển hóa xenobiotic, CYP1A1 là gen có vai trò thenchốt, tham gia mã hóa enzym liên quan đến biến đổi nhóm hoạt tính củaxenobiotic trong giai đoạn I của tru trình; GSTP1 và NAT2 là hai gen giữ vaitrò mã hóa hai enzym tham gia biến đổi xenobiotic giai đoạn II, biến đổithành các chất dễ dàng thải trừ ra ngoài môi trường Vì vậy việc nghiên cứuảnh hưởng của đột biến những gen này gây nên vô sinh ở nam giới cũng đãđược tiến hành trên nhiều quốc gia Tuy nhiên, tại Việt Nam hiện chưa có mộtcông trình nghiên cứu nào

PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử giúp chẩn đoán nhanh và rất hữu hiệuđối với các bệnh phân tử Việc thực hiện kỹ thuật ARMS – PCR trong việcnghiên cứu các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 để xác định các biến đổi của cácgen đó ở nam giới vô sinh chưa có một nghiên cứu nào được tiến hành tại ViệtNam Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:

“Hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật PCR để xác định những biến đổi của một số gen mã hóa enzym chuyển hóa xenobiotic ở nam giới vô sinh nguyên phát”

Đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu sau:

1 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật PCR – ARMS để xác định những biến đổi

ở các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 ở nam giới vô sinh nguyên phát.

2 Mô tả một số biến đổi của các gen CYP1A1, NAT2, GSTP1 ở nam giới vô sinh nguyên phát.

Chương 1TỔNG QUAN

Vô sinh được phân thành hai nhóm: vô sinh nguyên phát và vô sinh thứphát Vô sinh nguyên phát là khi người nam hay nữ này chưa từng có con lầnnào Vô sinh thứ phát là trong tiền sử của người nam hoặc nữ này đã từng có con

ít nhất một lần nhưng sau đó không thể có con dù quan hệ tình dục bình thườngtrong vòng 12 tháng mà không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào

Vô sinh nam là vô sinh mà nguyên nhân không có con bắt nguồn từngười nam giới, do chức năng sinh sản của người nam giới không được đảmbảo như người bình thường, cần có sự can thiệp của y tế

1.1.1.2 Lịch sử nghiên cứu về vô sinh

Theo ước tính của WHO (1991), trên thế giới có khoảng 12,15% cặp vợchồng vô sinh tương đương 50-80 triệu người [3]

Năm 2003, nghiên cứu của Krauz và cộng sự cũng kết luận nguyên nhângây vô sinh nam giới khoảng 50%, trong đó khoảng 40-50% những nam giớinày có bất thường về số lượng và chất lượng tinh trùng [4]

Tại Ả Rập, năm 2006, Ali Hellani tiến hành nghiên cứu và cũng chorằng, khoảng 10-15% cặp vợ chồng vô sinh, trong đó nguyên nhân do namgiới chiếm 50% [5]

Tại Singapore năm 2009, Poongothai J và cộng sự tiến hành nghiên cứucũng cho rằng khoảng 15% cặp vợ chồng vô sinh, trong đó nguyên nhân donam giới chiếm 50% [6].

Đến năm 2010, WHO công bố số liệu mới, cho rằng 8-10% cặp vợchồng vô sinh trong đó 35% do vợ, 30% do chồng, 25% do cả hai, 10% chưa

rõ nguyên nhân [7]

Như vậy, theo các nghiên cứu trên, tỷ lệ các cặp vợ chồng vô sinh chiếm

từ 10-20%, trong đó nguyên nhân do nam giới chiếm khoảng 50%

Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam

Theo Ngô Gia Hy (2000), trong các cặp vợ chồng vô sinh, nguyên nhân

do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cả hai chiếm tỷ lệ 10% [8].Theo Trần Thị Trung Chiến và cộng sự (2002), tỷ lệ vô sinh chiếm 5%,trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [9]

Theo Trần Quán Anh (2009) tỷ lệ vô sinh chiếm 15%, và tỉ lệ này đang

có chiều hướng tăng mạnh Trong đó vô sinh nam chiếm trên 50% [10]

Theo Trần Đức Phấn (2010) trong số các cặp vợ chồng vô sinh có 44%

có tinh dịch đồ bất thường [11]

Báo cáo của Nguyễn Viết Tiến tại Hội thảo quốc tế “Cật nhật về hỗ trợsinh sản” (2013) tại Hà Nội cho thấy tỷ lệ vô sinh ở Việt Nam là 7,7% Trong

đó nguyên nhân do nam giới chiếm 25-40% [12]

Như vậy, tại Việt Nam, tỷ lệ vô sinh khác nhau giữa các nghiên cứu,song đều chỉ ra rằng nguyên nhân bắt nguồn từ nam giới khoảng 40-50%

1.1.2 Nguyên nhân vô sinh nam giới

Vô sinh nam do nhiều nguyên nhân gây nên, trong đó có hai nhómnguyên nhân chính là nhóm nguyên nhân do di truyền và nhóm nguyên nhânkhông phải do di truyền

1.1.2.1 Nhóm nguyên nhân do di truyền

Bao gồm những nguyên nhân bất thường trong NST gây mất chức năngsinh sản có từ thời kì bào thai NST bị đột biến có thể là NST thường hoặcNST giới tính Một số bệnh lý thường gặp trong nhóm nguyên nhân này:

- Hội chứng Klinefelter: một người đàn ông có hai NST X và một NST

Y thay vì một NST X và một NST Y (47,XXY) Đây là nguyên nhân hàngđầu gây vô sinh ở nam giới, chiếm tỷ lệ từ 1/500 đến 1/1000 trẻ trai được sinh

ra [13] Điều này gây ra sự phát triển bất thường của tinh hoàn, dẫn đếntestosteron thấp hoặc không có, từ đó gây bất thường tới sự sản sinh tinhtrùng, dẫn đến giảm cả số lượng và chất lượng tinh trùng

- Hội chứng Down: trẻ mới sinh có bộ NST 46, XX,+21, hay còn gọi làtrisomy 21 Trẻ mắc hội chứng Down thường có những bất thường về thể chất

và tâm thần, trong đó thường không có khả năng sinh sản [14]

- Đột biến gen trên NST X: Gen AR là gen thụ thể của androgen, thuộcnhánh dài NST X Nếu gen này bị đột biến sẽ dẫn đến mất một phần hay toàn

bộ thụ thể androgen gây hội chứng kháng androgen trên lâm sàng, gây ảnhhưởng tới việc sản xuất tinh trùng nhưng không gây dị tật bộ phận sinh dục,

từ đó ảnh hưởng trực tiếp tới chức năng sinh sản của nam giới [15]

- Đột biến gen trên NST Y: AZF là một đoạn ở phần xa nhánh dài của NST

Y (Yq11) Người có đột biến gen này thường có số lượng tinh trùng bị giảmnặng hoặc không tạo được tinh trùng, chính là nguyên nhân gây vô sinh [16]

- Đột biến gen trên NST thường: Gen UBE2I được tìm thấy trên nhánhngắn NST số 16 Nam giới bị đột biến gen này ảnh hưởng tới chức năng củathụ thể androgen, làm giảm sự sản sinh tinh trùng và gây nên vô sinh [17].Gen CFTR được tìm thấy trên nhánh dài của NST số 7 Nam giới bị bệnh này

sẽ không có ống dẫn tinh hoặc tắc ống dẫn tinh, dẫn đến không có tinh trùngtrong tinh dịch [18]

- Sự đứt gãy ADN ở tinh trùng: Những tinh trùng bị đứt gãy ADN dẫn tớichất lượng tinh trùng giảm sút, giảm khả năng thụ tinh, tăng nguy cơ sẩy thai.

1.1.2.2 Nhóm nguyên nhân không phải do di truyền

Một số nguyên nhân trong nhóm này như các yếu tố sinh hóa, nội tiết tố,

và các yếu tố môi trường

+ Các yếu tố sinh hóa: quá trình sản xuất tinh trùng cần một số nguyênliệu như kẽm, fructose, acid citric, ion calci… Fructose là nguồn dinh dưỡng

và năng lượng chính của tinh trùng Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự suygiảm nồng độ fructose trong tinh dịch có liên quan đáng kể tới các bất thường

về số lượng, cấu trúc và chức năng tinh trùng [19]

+ Nội tiết tố: nội tiết tố ảnh hưởng tới quá trình sản xuất tinh trùng gồm

3 chất chủ yếu FSH, LH và testosteron Sự điều hòa 3 chất này đảm bảo choquá trình sản xuất tinh trùng diễn ra bình thường Khi có bất thường trong hệtrục dưới đồi – tuyến yên – tinh hoàn gây nên sự bất thường trong nồng độ 3chất này, từ đó làm rối loạn quá trình sản xuất tinh trùng [20]

+ Các yếu tố môi trường: hóa chất độc hại, các chất kích thích, nhiệt độkhông thích hợp, kim loại nặng… không chỉ ảnh hưởng tới chuyển hóa vậtchất và năng lượng nói chung mà còn là nguyên nhân gây suy giảm sản xuấttinh trùng cả về số lượng và chất lượng [21]

1.2 Xenobiotic

1.2.1 Khái niệm xenobiotic và ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể

1.2.1.1 Khái niệm

Xenobiotic là những chất hóa học lạ so với cơ thể sinh vật, là những chất

mà cơ thể sinh vật không tự sản xuất ra Những chất này gồm một vài chất cónguồn gốc thực vật, thuốc, thuốc trừ sâu, mỹ phẩm, hương liệu, nước hoa,phụ gia thực phẩm, hóa chất công nghiệp và chất gây ô nhiễm môi trường[22]…

Khi xenobiotic xâm nhập vào cơ thể con người, nó sẽ được chuyển hóa

và đào thải ra ngoài Nếu quá trình chuyển hóa đó diễn ra không theo đúngtrình tự của cơ thể (do đột biến các gen mã hóa enzym tham gia chuyển hóaxenobiotic), xenobiotic sẽ là các chất độc và sinh ra các gốc tự do, các gốc tự

do đó sẽ tích tụ lại và tiếp tục gây nên các đột biến khác của cơ thể hoặc ảnhhưởng trực tiếp tới chức năng cơ quan, qua đó gây nên bệnh tật

1.2.1.2 Ảnh hưởng của một số xenobiotic tới cơ thể

+ Dioxin: Đây là một chất được xếp vào loại cực độc Việc đốt cháy túinilon từ các hoạt động của con người là một trong các nguồn phát sinh chủyếu của dioxin Đây là chất ít tan trong nước, tồn tại trong đất, qua đó xâmnhiễm qua con đường thực phẩm, vào thực vật, tôm cá, rau quả và cuối cùngđược con người hấp thu Ngoài ra, dioxin cũng có thể gây ngộ độc trực tiếpqua hô hấp, qua da do tiếp xúc hoặc qua nước uống Nếu liều lượng cao,dioxin có thể gây độc cấp tính, nếu liều lượng thấp có thể gây độc mãn tính vàung thư, ảnh hưởng tới chức năng của hệ nội tiết và sinh sản [21]

+ Thuốc lá: Các chât độc từ thuốc lá không chỉ ảnh hưởng đến người hút

mà còn gây nguy hại với những người vô tình hít phải khói thuốc, nhất là phụ

nữ và trẻ em Thành phần khói thuốc lá rất phức tạp, có tới hơn 4000 hợp chấttrong đó 200 loại hóa chất có hại cho sức khỏe và 40 chất có thể gây ung thư(benzopyren, các nitrosamin) Việc hút thuốc làm giảm đáng kể nồng độ củanội tiết tố và các thông số tinh dịch, đó là khuyến cáo cho rằng những ngườiđàn ông đang điều trị vô sinh nên ngừng hút thuốc để tăng cơ hội có con [23].+ Rượu: Quá trình chuyển hóa của rượu trong cơ thể sinh ra acetaldehyd.Đây là chất gây biến dị tế bào sinh dưỡng và tế bào sinh dục Sau thời giannghiện rượu mãn tính, nồng độ acetaldehyd trong máu cao sẽ làm tăng nguy

cơ gây ung thư gan và các tổ chức khác trong cơ thể bởi khả năng làm độtbiến ADN Việc sử dụng rượu mãn tính là một nguyên nhân gây giảm số lượng

và chất lượng tinh trùng [24]

+ Thuốc trừ sâu: thuốc trừ sâu (hay thuốc bảo vệ thực vật) là loại hóa chấtcon người sản xuất ra để trừ sâu bệnh và cỏ dại cho cây trồng Một số chất nhưDDT (hydrocarbon clo hữu cơ) gây ảnh hưởng tới cơ thể sinh vật bằng cách phá

vỡ sự cân bằng Natri/Kali của các sợi thần kinh, khiến các dây thần kinh hoạtđộng truyền tải liên tục, gây ảnh hưởng tới chức năng thần kinh Các chất thuộcnhóm carbamat hoạt động gây ức chế enzym acetylcholinesterase khiếnacetylcholin hoạt động liên tục mà không bị phân hủy và gây ra các bệnh yếuhoặc liệt Nhóm hóa chất diệt cỏ acid benzoic lại có chức năng tương tự như cáchormon tăng trưởng khiến tế bào phân chia không bình thường, gây ra các độtbiến Nhóm người tiếp xúc thường xuyên với các hóa chất diệt cỏ có nguy cơ bịđột biến và vô sinh cao [25]

+ Dược phẩm: dược phẩm là những chất được chế tạo mà khi được hít,tiêm, uống, bôi… sẽ được hấp thu vào cơ thể và gây thay đổi sinh lý học Một sốchức năng của dược phẩm như các chất hướng thần (nicotin, cafein…) ảnhhưởng đến chức năng hệ thần kinh trung ương, làm thay đổi nhận thức, tâm lý, ýthức; các kháng sinh (penicillin, chloramphenicol…) khi được hấp thu sẽ có tácdụng giúp cơ thể chống lại các sinh vật xâm nhập vào cơ thể; các hóa chất chốngung thư (cisplastin, 5-fluo-uracin…) xâm nhập vào các tế bào ung thư và tiêudiệt Bên cạnh tác dụng trợ giúp cơ thể chống lại bệnh tật, dược phẩm còn gây racác tác dụng không mong muốn ảnh hưởng không tốt tới cơ thể như phụ thuộc(hay nghiện) thuốc (các thuốc giảm đau nhóm opioid: morphin và các dẫn xuất),giảm tác dụng dược lý (các kháng sinh)… và đặc biệt các thuốc nhóm hóa chấtchống ung thư có thể ảnh hưởng tới chức năng sinh sản [26]

1.2.2 Quá trình biến đổi chung của xenobiotic

1.2.2.1 Hấp thu

Xenobiotic xâm nhập cơ thể qua đường tiêu hóa, hô hấp, da-niêm mạc,tiêm truyền, trong đó đường tiêu hóa là chủ yếu

Quá trình hấp thu phụ thuộc vào cấu trúc của tổ chức, pH môi trường nơixenobiotic xâm nhập, cấu tạo của xenobiotic…

Cơ chế hấp thu chủ yếu theo qui luật vật lý, vận chuyển theo gradient(bậc thang) nồng độ, từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp

Đối với thuốc: Khả năng hấp thu được đặc trưng bởi đại lượng sinh khảdụng Đó là tỷ lệ thuốc xâm nhập hệ tuần hoàn so với lượng đưa vào.

1.2.2.2 Phân bố

Sau khi xâm nhập cơ thể, xenobiotic được phân bố ở các tổ chức khácnhau, tùy thuộc tính chất hóa học, tính tan của mỗi chất Các chất ít tan trongnước, ưa lipid như chloroform, hexobarbital sẽ phân bố nhiều vào mô mỡ, cơquan nhiều lipid như tổ chức thần kinh

Trong huyết tương, 1 phần xenobiotic gắn với protein huyết tương (chủyếu là với albumin) Đặc điểm của sự gắn xenobiotic với protein:

+ Chất nào càng ít tan trong nước thì gắn với protein huyết tương (proteinHT) càng nhiều

+ Có sự cân bằng động giữa phần tự do và phần gắn với protein

Xenobiotic + Protein HT  Xenobiotic-protein

Quá trình chuyển hóa thường gồm 2 giai đoạn (phase):

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa xenobiotic

+ Giai đoạn I:

Trong giai đoạn I, một loạt các enzym tham gia hoạt động để biến đổinhóm hoạt tính của xenobiotic Phức hợp enzym xúc tác để kết hợp mộtnguyên tử oxy, dẫn đến hình thành các nhóm hydroxyl hoặc N-, S-, =O Phảnứng có thể tóm tắt qua sơ đồ:

RH + O2 + NADPH+ H+ ──────→ ROH + NADP+ + H2O

Các enzym tham gia phản ứng giai đoạn một rất đa dạng và phong phú.Bao gồm hệ thống enzym oxidase, reductase, và hydrolysis, trong đó hệ thốngcytochrom P450 monooxygenase (CYP450) giữ vai trò then chốt CYP1A1 làmột gen mã hóa enzym trong họ CYP450

+ Giai đoạn II:

Trong các phản ứng tiếp theo giai đoạn II, các chất chuyển hóa otic được chia thành các nhóm: glutathion (GSH), sulfat, glycin, hoặc acidglucuronic Các loại phản ứng liên hợp xảy ra bao gồm carboxyl (-COOH), hydroxyl (-OH), amino (-NH2) và nhóm sulfhydryl (-SH) Sản phẩmcủa các phản ứng liên hợp ít phân cực hơn so với ban đầu, không giống nhưphản ứng giai đoạn I thường tạo ra các chất hoạt động hóa học Việc bổ sungcác nhóm anion lớn (như GSH) giải độc các ion phản ứng và sản sinh ra nhiềuchất chuyển hóa phân cực mà không thể khuếch tán qua màng, và có thể phảithông qua cơ chế vận chuyển tích cực.

xenobi-Những phản ứng này được xúc tác bởi một nhóm lớn các transferase đặctrưng, mà khi kết hợp có thể chuyển hóa gần như bất kỳ hợp chất kỵ nước nào[27] Một trong các emzym quan trọng nhất của nhóm này là glutathione S-transferase (GST, GSTP1 là một gen mã hóa enzym trong họ GST) vàN-acetyltransferase 2 (NAT2)

1.2.2.4 Thải trừ

Sau khi phản ứng giai đoạn II, các hợp chất xenobiotic có thể đượcchuyển hóa hơn nữa Một ví dụ phổ biến là việc xử lý hợp chất glutathion đểacetylcystein (acid mercapturic) liên hợp [28]

Con đường thải trừ chủ yếu của cơ thể là qua nước tiểu, còn lại một phầnqua phân, mồ hôi, hơi thở…

Đa số các xenobiotic sau khi được chuyển thành các dẫn xuất tan trongnước, được đào thải ra nước tiểu Một số chất có phân tử lượng lớn, ít tantrong nước, được gan đào thải qua mật, xuống ruột rồi ra ngoài theo phân

Sự thải trừ được đặc trưng bởi đại lượng “thời gian bán thải” (T1/2) làthời gian để thải một nửa lượng chất so với ban đầu

Mức độ thải trừ phụ thuộc nhiều vào chức năng thận Khi thận suy, làmgiảm thải trừ, tăng độc tính

1.2.3 Gen chuyển hóa xenobiotic

1.2.3.1 CYP1A1

Gen CYP1A1 mã hóa 1 enzym là thành viên của họ các enzym CYP450.CYP450 là monooxygenase, thường thấy trong microsom của gan, enzym nàyliên quan đến con đường vận chuyển điện tử NADPH Gen CYP1A1 nằm trênnhánh dài của NST số 15 gồm 6069 cặp base, tại vùng 2 băng 4 băng phụ 1(15q24.1) Chức năng của CYP450 trong chuyển hóa oxy hóa các hợp chấtbao gồm steroid, các acid béo, và xenobiotic [29]

Hình 1.2 Vị trí gen CYP1A1 trên NST 15 Bảng 1.1 Một số đột biến của CYP1A1[30]

2455 gây ra sự biến đổi acid amin Ile thành Val ở vị trí 462 trên exon 7.

Trong nghiên cứu của mình, Fritsche E và cộng sự (1998) đã chỉ ra rằngmột đột biến xảy ra ở exon 7 gây ra sự biến đổi acid amin Ile thành Val gâyảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa xenobiotic, tỷ lệ bị mắc vô sinh trongnhóm mang đột biến này cao hơn so với nhóm chứng (OR = 2,4; 95%CI =0,83-6,95) [31] Aydos S.E và cộng sự (2009) cũng đã chỉ ra rằng đột biến nàygắn với đột biến gen GSTM1 làm tăng nguy cơ vô sinh lên 6,9 lần so với nhómchứng (95%CI = 2,29-19,3) [32]

Luo H và cộng sự (2014) đã chứng minh được rằng đột biến genCYP1A1 làm tăng nguy cơ vô sinh nam [33]

1.2.3.2 GSTs và GSTP1

Glutathione S-transferases (GSTs), gồm các enzym tham gia vào giaiđoạn II của quá trình chuyển hóa xenobiotic, xúc tác cho sự liên hợpglutathion (GSH) với mục đích giải độc Các GSTs bao gồm ba họ: cáccytosolic, mitochondrial, ADN microsomal - còn gọi là MAPEG-protein [34].Các thành viên của GSTs cực kỳ đa dạng trong chuỗi acid amin, và một phầnlớn các chức năng không rõ [35]

GSTP1 là 1 gen thành viên của họ GSTs Gen nằm trên nhánh dài củaNST số 11 gồm 3066 cặp base, tại vùng 1 băng 3 băng phụ 3 (11q13.3).GSTP1 mã hóa enzym đóng vai trò quan trọng trong giải độc bằng xúc táccho sự tiếp hợp của nhiều hợp chất kỵ nước và lực điện tử với glutathion,tham gia hoạt động trong quá trình chuyển hóa xenobiotic [36]

Hình 1.3 Vị trí gen GSTP1 trên NST 11 Bảng 1.2 Một số đột biến của GSTP1

Ala thành Val) Và theo nhóm đột biến như vậy sẽ có 3 type tương ứng: type

A đột biến tại vị trí C341T; type B đột biến tại vị trí G313A; và type C đột biến tại cả hai vị trí G313A và C341T [37]

-Yarosh S.L và cộng sự (2015) đã khẳng định sự đa hình trong genGSTM1, GSTT1 và GSTP1 (Ile105Val) làm tăng nguy cơ vô sinh nam lên 1,5lần (95%CI = 1,02-2,20; p = 0,04), nguy cơ này tăng lên bởi hút thuốc lá [38].Khi tiến hành nghiên cứu đa hình trong nhóm gen GSTs, Xiong D.K vàcộng sự (2015) kết luận sự đa hình trong các đột biến GSTP1 vị trí G313Alàm phát triển các yếu tố nguy cơ vô sinh nam ở nam giới Tứ Xuyên, TâyNam Trung Quốc (OR = 1,53; 95%CI = 1,11-2,11; p = 0.009) [39]

1.2.3.3 NAT và NAT2

Các gen nhóm NAT (N-acetyltransferase) gồm có NAT1 và NAT2, mãhóa enzyme có chức năng acetyl trong quá trình chuyển hóa các xenobiotic.NAT2 mã hóa enzym có hoạt động acetyl hóa cao Các N-acetyltransferasestham gia vào giai đoạn II của quá trình chuyển hóa xenobiotic, mà hoạt độngcủa nó là acetyl sulfamethazine (kháng sinh), song với acid amino benzoic thìkhông chuyển hóa được tất cả [40]

NAT2: Gen NAT2 nằm trên nhánh ngắn của NST số 8 gồm 9974 cặpbase, tại vùng 2 băng 2 (8p22) Gen này mã hóa enzym có chức năng acetylhoá xenobiotic tham gia cùng với các glutathion-S-transferase trong chuyểnhóa xenobiotic ở giai đoạn II [41]

Hình 1.4 Vị trí gen NAT2 trên NST 8 Bảng 1.3 Một số đột biến của NAT2

Theo Cascorbi I (1996), Delomenie C (1996), Magalon H (2008) đãcùng chỉ ra rằng vai trò của NAT2 là tham gia acetyl hóa các xenobiotic trong giaiđoạn II của quá trình chuyển hóa, và các đột biến hay gặp ở gen này đều làm cho

quá trình acetyl hóa bị chậm lại, do đó gây nên sự tích tụ các chất độc hại trong cơthể là nguyên nhân sinh ra một số bệnh di truyền trong đó có vô sinh [42],[43],[44].

Một đột biến điển hình hay gặp của NAT2 xảy ra tại vị trí G590A gâythay đổi acid amin trong quá trình dịch mã Arg197Gln được Yarosh và cộng

sự (2014) nghiên cứu, đột biến gây ra tính nhạy cảm đến vô sinh nam, và nguy

cơ này được tăng cường ở nhóm có sự tiếp xúc với các chất oxy hóa như: khóithuốc lá (OR = 1,71; 95%CI = 1,02-2,87; p = 0,042), lạm dụng rượu (OR =2,14; 95%CI = 1,08-4,27; p = 0,029), lượng thức ăn ít chất xơ (OR = 1,68;95%CI = 1,01-2,79, p = 0,04) [45]

1.3 PCR

1.3.1 Khái niệm và lịch sử phát triển của kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction được dịch là chuỗitrùng hợp hay phản ứng khuếch đại chuỗi gen PCR là một kỹ thuật nhằmkhuếch đại một đoạn ADN mà không cần sử dụng các sinh vật như E.Coli haynấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụnhiều mục đích khác nhau, như xác định bệnh di truyền, nhận dạng, chẩnđoán các bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống [46]

+ Giai đoạn 2 – Gắn mồi: hạ nhiệt độ xuống 52oC Ở nhiệt độ này haiđoạn mồi (Forward primer và Reverse premer) sẽ cặp đôi với hai sợi ADNtheo hướng 5’-3’ Giai đoạn này thường từ 30 giây đến 1 phút

+ Giai đoạn 3 – Tổng hợp ADN: nâng nhiệt độ lên 72oC Ở nhiệt độ nàyADN Taq polymerase hoạt động để kéo dài các mạch ADN Nguyên liệu ởđây là 4 loại nucleotid A, T, G, C (dNTP) Thời gian tùy thuộc vào độ dài củatrình tự ADN, thường từ 30 giây đến nhiều phút.

+ Cứ sau mỗi chu kì gồm ba giai đoạn như trên, một ADN khuôn nhânthành hai Sau 30 chu kì thì từ một phân tử ADN khuôn ban đầu có thể tạo ra

số lượng ADN gấp 230 lần

Toàn bộ quá trình trên được thực hiện nhờ máy luân nhiệt tự động

Hình 1.5 Chu trình 3 giai đoạn PCR 1.3.3 Một số phương pháp PCR đặc hiệu

+ QF – PCR (quantitative fluorescence – PCR, nhân đoạn ADN địnhlượng huỳnh quang): năm 1993, Manfield lần đầu tiên ứng dụng phương pháp

nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang Từ năm 1998 đến nay, một sốphòng thí nghiệm đã thực hiện thành công kỹ thuật này trong chẩn đoán trướcsinh hội chứng Down Ví dụ: dựa vào kết quả định lượng gen DSCR1 (genđược định vị ở vùng 21q21.1 – q22.2 liên quan đến dị tật tim và chậm pháttriển tâm thần của hội chứng Down) để xác định thai bị Down hoặc không.+ RT – PCR (reverse transcriptase – PCR): là một phương pháp dùng đểkhuếch đại cADN từ ARN dựa vào đặc tính phiên mã ngược RT – PCRthường được dùng để tạo ra thư viện cADN (complementary ADN) lớn từmột lượng rất nhỏ mARN, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đahình dựa vào trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mật

độ phân tử gen Ngoài ra, RT – PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa làchúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh virus ARN

+ Real time PCR: là một phương pháp khuếch đại gen và đọc kết quảđược thực hiện trong một ống hay một giếng mẫu Phương pháp này đòi hỏiphải có một máy luân nhiệt đặc biệt, có thiết bị phát huỳnh quang từ mộtgiếng mẫu và được trang bị chương trình vi tính cho phép xử lý kết quả, xácđịnh độ biến đổi cường độ huỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại.+ Multiplex PCR: là kỹ thuật PCR sử dụng các phản ứng chuỗipolymerase để khuếch đại một số trình tự ADN khác nhau cùng một lúc (nhưnếu thực hiện nhiều phản ứng PCR riêng biệt trong cùng một phản ứng) Quátrình này khuếch đại ADN trong các mẫu sử dụng nhiều mồi và một ADNpolymerase nhiệt độ trung gian trong một chu trình nhiệt Thiết kế mồi cho tất

cả các cặp mồi đã được tối ưu hóa để tất cả các cặp mồi có thể làm việc ởcùng nhiệt độ ủ trong PCR

+ Nested PCR: là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặpmồi của PCR được dùng để khuếch đại đoạn ADN Phản ứng Nested PCR

phải được thực hiện hai lần Lần đầu phản ứng được thực hiện trong 15 đến

30 chu kỳ, với cặp mồi thứ nhất, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạngen cần xác định nằm trong đoạn gen được khuếch đại lần một Sản phẩmPCR lần một sau đó sẽ làm mẫu cho lần hai, cặp mồi thứ hai sẽ bắt cặp phíatrong sản phẩm của PCR lần một, và khuếch đại đoạn gen cần xác định

+ RFLP – PCR (Restriction Fragment Length Polymorphisms – PCR):

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phânđoạn ADN dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE).Khi ủ ADN với enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp và ở pH, nhiệt độthích hợp sẽ tạo ra những phân đoạn ADN với kích thước khác nhau, từ đólập nên các bản đồ gen Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên 80đến nay

1.3.4 Phương pháp di truyền phân tử - kỹ thuật ARMS – PCR

ARMS – PCR (amplification refractory mutation system – PCR): là kỹthuật để phát hiện các đột biến điểm được biết đến và mô tả lần đầu tiên bởiNewton C.R [47]

1.3.4.1 Khái niệm về kỹ thuật ARMS – PCR

Kỹ thuật ARMS – PCR dựa trên nguyên tắc của alen mồi cụ thể của quátrình PCR, tức là một mồi cụ thể sẽ chỉ cho phép quá trình khuếch đại diễn rakhi nó được bắt cặp đặc hiệu với alen đột biến

1.3.4.2 Nguyên lý kỹ thuật ARMS – PCR

ARMS – PCR là kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến Nguyên lýcủa kỹ thuật là dựa vào đặc tính của Taq ADN polymerase chỉ khuếch đạihoàn chỉnh 1 phân tử ADN một khi đầu 3’ của mồi và sợi khuôn bổ sung hoàn

toàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn, phản ứng bị

ức chế hoàn toàn

Hình 1.6 Sơ đồ kỹ thuật ARMS – PCR

Kết quả hình ảnh điện di cho thấy nếu vạch sáng xuất hiện ở cả mồi bìnhthường (N) và mồi đột biến (P) thì kết quả dị hợp tử đột biến, nếu kết quảxuất hiện vạch sáng chỉ ở mồi đột biến thì kết quả là đồng hợp tử đột biến,nếu kết quả vạch sáng chỉ ở mồi bình thường thì kết quả là không có đột biến

1.3.4.3 Một số nghiên cứu áp dụng kỹ thuật ARMS – PCR trong chẩn đoán các đột biến nucleotid đặc hiệu

ARMS – PCR là một kỹ thuật PCR hiện đại Kỹ thuật này có tính chấtđặc hiệu cho các đột biến xảy ra trên một nucleotid và là một kỹ thuật được ápdụng rộng rãi trong các nghiên cứu trên thế giới

Laczmanski L và cộng sự (2013) sử dụng kỹ thuật ARMS – PCR nhưmột thử nghiệm kiểm định sự chính xác của kỹ thuật minisequensing trongnghiên cứu đột biến yếu tố V (G1691A) liên quan tới quá trình đông máu và

sự phát triển bệnh thrombophilia [48]

Interferon gamma (IFN-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thông) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thôngqua receptor của nó và đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của bệnhviêm như viêm nha chu mãn tính Nghiên cứu về mối liên quan giữa đột biếncủa gen IFN-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thông (A874T) và các đột biến của gen IFN-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thôngR1 (A611G, T189G,C95T), Heidari Z và cộng sự (2015) đã sử dụng thành công kỹ thuật ARMS –PCR và đánh giá được sự liên quan của đột biến IFN-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thông đối với sự phát triểnbệnh viêm nha chu mãn tính cũng như khẳng định các đột biến trên INF-γ) là một cytokine miễn dịch có tác dụng thôngR1không liên quan tới bệnh này [49].

Khosravi A và cộng sự (2016) trong nghiên cứu phát hiện các đột biếncủa gen α-Globin trong dân tỉnh Khuzestan Province, Iran liên quan tới sựphát triển bệnh α-Thalasemia đã sử dụng kỹ thuật ARMS – PCR và thấy được

11 đột biến hay gặp của gen này trên tổng số hơn 50 đột biến điểm đã đượcphát hiện trên thế giới [50]

Việc ứng dụng kỹ thuật ARMS – PCR trong thực nghiệm cũng như trênnghiên cứu trên thế giới đã được biết đến từ lâu, nhưng hiện tại ở Việt Namcòn hạn chế và chưa có đề tài nghiên cứu nào sử dụng kỹ thuật ARMS – PCRtrong chẩn đoán vô sinh nam Vì vậy chúng tôi tiến hành kỹ thuật này trongnghiên cứu của mình

Chương 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là những bệnh nhân nam được chẩn đoán vô sinh I đãđược xét nghiệm tinh dịch đồ tại Bộ môn Y sinh học – Di truyền, ĐH Y Hà Nội

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu

Đối với nhóm bệnh:

+ Nam giới trong độ tuổi sinh sản

+ Nam giới vô sinh không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng (<15 triệu)(WHO – 2010)

Đối với nhóm chứng:

+ Nam giới trong độ tuổi sinh sản

+ Có ít nhất một con

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

+ Nam giới bị các bệnh ung thư

+ Nam giới vô sinh đã được xác định nguyên nhân: Mất đoạn nhỏ trênNST Y, nhiễm sắc đồ bất thường, tắc nghẽn đường sinh dục, giãn tĩnh mạchthừng tinh

+ Nam giới đang mắc các bệnh cấp tính, bị tâm thần

2.1.3 Số bệnh nhân và số mẫu

Vì là nghiên cứu hoàn chỉnh quy trình nên chúng tôi lấy nhóm nghiêncứu là 10 và nhóm chứng là 10

+ Nhóm bệnh: 10 nam giới không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng trong

độ tuổi sinh sản: tuổi 18 - 49

+ Nhóm chứng: 10 nam giới trong độ tuổi sinh sản: tuổi 18 - 49, đã có ítnhất 1 con

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu

2.1.4.1 Loại hình nghiên cứu

Nghiên cứu bệnh – chứng

2.1.4.2 Cách tiến hành nghiên cứu

Bằng xét nghiệm tinh dịch đồ, chúng tôi đã chọn được 10 đối tượng trongnhóm bệnh và 10 đối tượng trong nhóm chứng phù hợp tiêu chuẩn Sau đó lấymẫu máu bệnh nhân và tiến hành qui trình tách chiết ADN, PCR (theo phươngpháp ARMS), và tiến hành điện di thu thập kết quả

2.1.4.3 Tách chiết ADN

Nguyên lí chung:

Bước 1: Giải phóng ADN ra khỏi màng tế bào (bằng cách nghiền, dùng

áp suất siêu âm hoặc dùng hóa học, sinh học )

Bước 2: Tách bỏ ADN ra khỏi các chất khác (bổ sung chất hoạt hóaADNase và làm biến tính các phân tử protein, dịch hữu cơ )

Bước 3: Kết tủa ADN (thường dùng Ethanol) ADN tủa được để khô ởnhiệt độ phòng và cho tan trong đệm TE, và giữ ở nhiệt độ -40C hoặc bảoquản lâu dài ở -200C đến -800C