Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen MATK, ITS của cây bảy lá một hoa thu tại huyện bắc sơn, tỉnh lạng sơn

Một số mã vạchDNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dượcliệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó, gen matK nằm trong lục lạp được xác định mang l

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

TRƯƠNG MẠNH TIẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ

ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI

HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

TRƯƠNG MẠNH TIẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, GIẢI PHẪU VÀ TRÌNH TỰ

ĐOẠN GEN MATK, ITS CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA THU TẠI

HUYỆN BẮC SƠN, TỈNH LẠNG SƠN

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy

THÁI NGUYÊN - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sựhướng dẫn của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Các kết quả nghiên cứu là trungthực, một phần đã được công bố trên Tạp chí Khoa học và công nghệ - Đại họcThái Nguyên với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả Phần còn lạichưa được ai công bố ở bất cứ công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019

Tác giả

Trương Mạnh Tiến

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy,khoa Sinh học trường Đại học sư phạm Thái Nguyên là người đã chỉ bảo,hướng dẫn em suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Sinhhọc, Trường Đại học Sư Phạm - ĐH Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn,truyền dạy kiến thức cho em trong suốt khóa học

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Bangiám hiệu trường Đại học Sư phạm - ĐH Thái Nguyên, thầy, cô các phòng banchức năng đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp và ban giám hiệu trường THPT

Số 3 Bảo Thắng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập

Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè và gia đình đãluôn quan tâm, động viên, ủng hộ và giúp đỡ em

Luận văn là sản phẩm của Nhiệm vụ quỹ GEN cấp Bộ có mã số TNA-04-GEN do PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáodục sinh học làm chủ nhiệm

B2018-Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019

Tác giả

Trương Mạnh Tiến

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Bảy lá một hoa 3

1.1.1 Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa 4

1.1.3 Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa 5

1.1.4 Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa 6

1.2 Một số phương pháp định danh thực vật 9

1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu 9

1.2.2 Phương pháp phân loại học phân tử 12

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Vật liệu thực vật 22

2.1.2 Vật liệu nhân gen matK, ITS 22

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 23

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Nhóm phương pháp nghiên cứu hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa 23

2.2.2 Phương pháp phân lập và xác định trình tự nucleotide của gen 24

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, giải phẫu cây Bảy lá một hoa 26

3.1.1 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái 26

3.1.2 Kết quả nghiên cứu về đặc điểm giải phẫu 27

3.2 Đặc điểm đoạn gen matK và vùng gen ITS của mẫu cây Bảy lá một hoa 30

3.2.1 Đặc điểm đoạn gen matK 31

3.2.2 Đặc điểm vùng gen ITS 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool

DNA : Deoxyribose nucleic acid

ITS : Internal Transcribed Spacer

NCBI : The National Center for Biotechnology Information

PCR : Polymerase Chain Reaction

rpoC1 : RNA polymerase beta' subunit

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng danh lục đỏ cây thuốc thuộc chi Paris Việt Nam 8 Bảng 1.2 Một số thông tin về gen matK của chi Paris 14 Bảng 1.3 Một số thông tin về vùng ITS của chi Paris 16 Bảng 1.4 Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS trong

phân loại thực vật 17

Bảng 1.5 Mã vạch DNA trong định danh cây Bảy lá một hoa tại Thái Nguyên

20

Bảng 2.1 Trình tự nucleotide mồi matK, ITS sử dụng trong kỹ thuật PCR 22

Bảng 3.1 Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập

tại Bắc Sơn- Lạng Sơn dựa trên trình tự đoạn gen matK 33

Bảng 3.2 Độ tương đồng và phân ly của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập

tại Bắc Sơn - Lạng Sơn dựa trên trình tự vùng gen ITS 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa 4

Hình 1.2 Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam 8

Hình 1.3 Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS 15

Hình 2.1 Mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn 22

Hình 3.1 Hình thái mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn trồng trong vườn trường Đại học Sư phạm 26

Hình 3.2 Hình ảnh giải phẫu cuống lá mẫu cây Bảy lá một hoa 28

Hình 3.3 Hình ảnh giải phẫu thân cây Bảy lá một hoa 29

Hình 3.4 Hình ảnh giải phẫu rễ cây Bảy lá một hoa 30

Hình 3.5 Hình ảnh kết quả tách chiết DNA tổng số trên gel agarose 1% 31

Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn 31

Hình 3.7 Kết quả phân tích gen matK bằng BLAST trong NCBI 32

Hình 3.8 Trình tự đoạn gen matK của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn .32

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên đoạn gen matK của mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn .33

Hình 3.10 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen ITS từ mẫu cây Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn 34

Hình 3.11 Kết quả phân tích bằng BLAST trình tự nucleotide vùng gen ITS trong NCBI 34

Hình 3.12 Trình tự vùng gen ITS của mẫu thu thập tại Bắc Sơn, Lạng Sơn 35

Hình 3.13 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên vùng gen ITS của các mẫu nghiên cứu 36

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Bảy lá một hoa là tên gọi chung thông dụng ở Việt Nam của nhiều loài

thuộc chi Paris Bảy lá một hoa còn gọi là củ rắn cắn, hưu túc nhiều lá, hưu túc

vân nam, trọng lâu hải nam … thuộc loại dược liệu quý hiếm có nguy cơ tuyệtchủng cần bảo vệ ở Việt Nam Theo Nguyễn Tâp (2004, 2007), nhiều loài

thuộc chi Paris nằm trong sách đỏ Việt Nam ở cấp độ đánh giá theo IUCN (International Union for Conservation of Nature) ở mức nguy cấp (tiếng

Anh: Endangered, viết tắt EN) hoặc sắp nguy cấp (tiếng Anh: Vulnerable, viếttắt VU) [20], [21] Cây Bảy lá một hoa có khả năng chữa trị nhiều bệnh từ cácbệnh thông thường như sốt nóng, sốt rét, mụn nhọt, chữa ho…đến các bệnh nan

y như: rắn độc cắn, ung thư… Vì vậy, Bảy lá một hoa là đối tượng nghiên cứucủa nhiều nhà khoa học

Trên thế giới, chi Paris có 22 loài và nhiều thứ [56] Ở Việt Nam cây được

tìm thấy chủ yếu ở các vùng núi phía Bắc, như một số tỉnh: Lào Cai, Hà Giang,Lai Châu, Cao Bằng, Hòa Bình Cây sống trong điều kiện núi cao, nhiệt độlạnh, sống dưới tán rừng Mỗi năm cây chỉ ra hoa 1 lần vào khoảng tháng 4 -6,tạo quả vào khoảng tháng 7-11 sau đó lụi đi, thời gian ủ đông của cây khá lâu

Các loài trong chi Paris khá đa dạng và có sự tương đồng cao về hình thái.

Năm 2016, Nguyen Quynh Nga và đtg đã được thiết lập khóa phân loại bằngviệc mô tả hình thái, giải phẫu của 8 loài (species) và 2 thứ (varieties) ở ViệtNam [43]

Có thể nhận diện thực vật bằng nhiều phương pháp khác nhau Cácphương pháp thường dùng như nghiên cứu và so sánh các đặc điểm về hìnhthái, giải phẫu, sinh lý, hóa sinh hướng nghiên cứu này đã thành công trênmột số đối tượng cây trồng như Hà thủ ô đỏ [9], Sóng rắn [28], Phong lữ thảo[6]… Tuy nhiên, phương pháp nhận diện này sẽ kém hiệu quả nếu như câykhông còn nguyên vẹn

Công nghệ sinh học hiện đại phát triển đã bổ sung vào hệ thống phân loạiphương pháp nhận diện dựa vào các chỉ thị phân tử Trong đó, mã vạch DNAđược lựa chọn là một trong các phương tiện nhận biết mới Một số mã vạchDNA được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong phân loại các cây dược

liệu như matK, rpoC1, trnH-psbA, ITS, rbcL… Theo đó, gen matK nằm trong

lục lạp được xác định mang lại những thành tựu nhất định trong nhận diện cây

trồng [37],… Vùng gen ITS nằm trong nhân tế bào, bao gồm trình tự 5.8S-ITS2 cũng là đối tượng được nghiên cứu nhiều trong định danh thực vật.

ITS1-Các nghiên cứu xác định mối quan hệ của các loài thực vật dựa trên trình tự

vùng gen ITS ở cây gỗ Sưa, gỗ Trắc, gỗ Cẩm lai [18], hay các các chi Erica [45], Scrophularia [48], Potamogeto [55] và nhiều thực vật khác là minh chứng cho vai trò của vùng gen ITS trong nhận diện cây trồng [34], [53]…

từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hình

thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS của cây Bảy lá một hoa thu tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mô tả được đặc điểm hình thái, giải phẫu và trình tự đoạn gen matK, ITS

của cây Bảy lá một hoa thu tại huyện Bắc Sơn, tỉnh Lạng Sơn

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu cây Bảy lá một hoa thuthập được ở Bắc Sơn - Lạng Sơn

3.2 Nghiên cứu đặc điểm trình tự vùng ITS, đoạn gen matK từ mẫu cây

Bảy lá một hoa thu thập tại Bắc Sơn - Lạng Sơn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây Bảy lá một hoa

1.1.1 Vị trí của cây Bảy lá một hoa trong hệ thống phân loại

Paris là tên gọi chung của một chi của thực vật có hoa, được mô tả bởi

Linnaeus từ năm 1753 [12] Đến nay, việc phân loại chi Paris vẫn chưa có sự

thống nhất Dưới dây là 3 cách phân loại đang được sử dụng:

(1) Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi

Paris thuộc phân giới thực vật bậc cao; ngành Ngọc lan (Magnoliophyta); lớp

Hành (Liliopsida); phân lớp Loa kèn (Lilidae); bộ Củ nâu (Dioscoreales); họ

Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae), chi Bảy lá một hoa, Tảo hưu (Paris)

[4]

(2) Thực vật chí Trung Quốc (năm 2000) đã mô tả hình thái và xếp chi

Paris vào họ Loa kèn (Liliaceae) với 22 loài (species) và 16 thứ (variety-var.)

trong đó có 12 loài đặc hữu [40]

(3) Theo hệ thống phân loại mới nhất APG III - A n gi o s p erm P h y lo g e n y G

r o u p - (năm 2009) dựa trên những dẫn liệu về sinh học phân tử, chi Paris (chi

Trọng lâu) được xếp vào họ Hắc dược hoa (Melanthiaceae) với tổng số 26 loài

và 13 thứ [56]

Chi Paris phân bố chủ yếu ở châu Âu và châu Á, đặc biệt tập trung nhiều

ở Trung Quốc Theo tạp chí “Flora of China” (2000), chi Paris được mô tả gồm

22 loài với nhiều thứ khác nhau

Trong chi Paris, Paris polyphylla Smith là loài được tìm thấy sớm nhất

(năm 1813) Loài này hiện được công bố chi tiết có tới 10 thứ [40]

Mười thứ (variety) thuộc chi Paris gồm:

1) Paris polyphylla var polyphylla (tên tương ứng Daiwa polyphylla Sm.);

2) Paris polyphylla var yunanensis;

3) Paris polyphylla var chinensis;

4) Paris polyphylla var nana;

5) Paris polyphylla var alba;

6) Paris polyphylla var stenophylla;

7) Paris polyphylla var minor;

8) Paris polyphylla var latifolia;

9) Paris polyphylla var pseudothibetica;

10) Paris polyphylla var kwantungensis

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Bảy lá một hoa

Bảy lá một hoa là cây thân cỏ một năm Một cây Bảy lá một hoa hoànchỉnh sẽ gồm các phần: rễ, thân củ, thân thảo, lá, hoa/quả [12], [21], [40], [43].Một số cơ quan của cây Bảy lá một hoa được mô tả trên hình 1.1

c Thân

a Hoa

b Lá

d Quả

và hạt

e Thân củ

f Rễ

Hình 1.1 Hình ảnh các cơ quan chính của cây Bảy lá một hoa

(Hình ảnh là sản phẩm của nhiệm vụ quỹ GEN cấp Bộ GD-ĐT giai đoạn 2016-2019)

Thân cỏ là phần thân nằm trên mặt đất, thường lụi đi vào cuối thu Kiểuthân cỏ sẽ không có cấu tạo thứ cấp [17] Thân cỏ của cây Bảy lá một hoa cao

hàng chục cm đến hàng trăm cm (Paris dunniana cao 1,5-3 m) Thân cỏ thon

dài, trơn nhẵn, mọng nước, không có cành, phía gốc có một số lá thoái hoáthành vẩy, bao lấy thân Giữa thân có một tầng lá mọc vòng khoảng 3 đến 12

lá, đa số các loài có từ 4 đến 6 lá Cuống lá dài 2-3 cm, màu tím Phiến lá hìnhmác, hình trứng, bầu dục… dài 20-23 cm, rộng 6-7 cm Đầu phiến lá nhọn, mặttrên màu xanh đậm, mặt dưới màu nhạt hơn [40].

Mỗi cây chỉ có một hoa mọc trên đỉnh cây Mỗi hoa đều có cuống dàihàng chục cm Hoa có đầy đủ các phần đài, tràng, nhị, nhụy

Quả của cây Bảy lá một hoa là quả đơn, có một mầu duy nhất Vỏ quảmàu xanh, khi quả chín vỏ có màu xám- đen Quả chín sẽ tự mở vỏ để cho hạtthoát ra ngoài Hạt của cây bảy lá một hoa thuộc kiểu hạt có nội nhũ Hạt gồm

có vỏ màu đỏ bao bọc phôi và nội nhũ (hình 1.1 d) Về mặt lý thuyết, ở nhữnghạt kiểu này, phôi thường nhỏ, đôi khi còn chưa có sự phân hóa hoàn toàn [17]

Thân củ là phần nằm dưới mặt đất Thân củ của cây Bảy lá một hoa cóchứa chất dự trữ để cây sử dụng khi ra hoa, tạo quả, mọc chồi [17] Thân củphình to, thường nằm ngang, cứ mỗi năm có thêm 1 đốt hiện ra rõ ràng, màuxám đen Trên thân củ có những mắt mang các sẹo của lá thoái hóa, trong náchcác sẹo đó có các chồi nách

Cây Bảy lá một hoa có kiểu rễ của “cây có rễ phụ” [17] Rễ phụ mục ra

từ thân củ Các rễ tương đối đồng đều về kích thước, thường màu nâu và cóhình trụ

Cây Bảy lá một hoa thường mọc hoang ở những khe núi ẩm ướt, có độcao trên 600m và ưa bóng, hoặc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiềumùn Trong tự nhiên, thường chỉ những cây lớn có chiều dài thân rễ trên 5cmmới thấy có hoa, quả [30]

1.1.3 Giá trị y học của cây Bảy lá một hoa

Theo y học cổ truyền, cây Bảy lá một hoa có công dụng trong điều trị một

số bệnh nan y như: bệnh gan, ung thư phổi và thanh quản, ung thư biểu mô.Thân rễ Bảy lá một hoa có vị đắng, hơi cay, tính hơi lạnh, hơi độc, có tác dụnglợi tiểu, tiêu đờm, thanh nhiệt, giải độc, chữa sốt nóng, sốt rét, mụn nhọt, chữaho… [23], [30]

Ở Ấn Độ và Nê-pan, thân rễ Bảy lá một hoa trị giun sán bằng cách uốngbột thân rễ mỗi lần một thìa cà phê, ngày một lần, liền trong 2 ngày Để trị mụnnhọt và nhọt độc, hằng ngày bôi bột nhão chế từ thân rễ Bảy lá một hoa mộtcách đều đặn Ngoài ra, thân rễ Bảy lá một hoa còn được sử dụng để chống cothắt, dễ tiêu hóa ở dạ dày, dùng làm thuốc long đờm, giải độc rắn cắn và dùng

để làm giảm ảnh hưởng của thuốc mê [12]

Một số bài thuốc quý được tuyên truyền phổ biến trong dân gian để chữabệnh bằng cây Bảy lá một hoa [58]

* Chữa rắn độc cắn bằng cách kết hợp thuốc uống và đắp ngoài Theo đó,

sử dụng thân và rễ cây khoảng 4 - 8 g, Thanh mộc hương 4 g, nhai sống uốngvới nước đun sôi để nguội Đắp ngoài bằng cách dùng thuốc giã với dấm đắplên vùng rắn cắn

* Trị ung nhọt, áp xe vú, quai bị, lao hạch cổ: Dùng thân rễ 8g, Bồ cônganh 40 g sắc lấy nước uống và phần bã đắp bên ngoài vết thương

* Trị viêm phế quản mạn tính: Dùng thân rễ nghiền thành bột, mỗi lầnuống 3 g với nước, ngày uống 2 lần

Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại còn cho thấy các thành phần trongcây Bảy lá một hoa có Saponin được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh ung thư[38], [41], chống các chất oxy hóa [49] Cơ chế chống ung thư của các dượcchất trong cây Bảy lá một hoa còn chưa rõ ràng, tuy nhiên theo hướng cácsaponin kích thích tế bào chết theo chương trình (apoptosis) [41] Bên cạnhsaponin là dược chất quan trọng, trong thân rễ của cây Bảy lá một hoa người tacũng phát hiện thấy 1 glucoside được gọi là paristaphin Khi thuỷ phânparistaphin sẽ cho glucose và một glucoside mới gọi là paridin, thuỷ phânparidin, ta lại được glucose và một chất nhựa gọi là paridol [12]

1.1.4 Vấn đề bảo tồn cây Bảy lá một hoa

Cây Bảy lá một hoa có những đòi hỏi riêng biệt về điều kiện sống Theo

đó, kết quả nghiên cứu cho thấy đa số các loài được phát hiện mọc hoang ở

những khe núi ẩm ướt, có độ cao so với mặt nước biển hàng trăm mét và ưabóng Ngoài ra, cây còn mọc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiềumùn, cây không chịu được úng Phần thân trên mặt đất lụi đi hàng năm,thường vào cuối thu Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa đông vàmọc lại vào giữa mùa xuân năm sau Cây chưa được trồng trên quy mô lớn

mà chỉ ở phạm vi các vườn cây thuốc tại một số địa phương theo phươngthức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân rễ Theo đó, hàng năm vàokhoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo trong vườn ươmhoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo Mỗi cây chỉ có một hoa,mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao , tuy nhiênđây vẫn là hình thức chính để cây tái sinh trong tự nhiên Thân rễ Bảy lámột hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng Thời

vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu [30]

Ở Ấn độ, kế hoạch bảo tồn Paris polyphylla đã được thiết lập Theo nhóm nghiên cứu ở Ấn Độ, lượng mưa là yếu tố chi phối khu phân bố của Paris

polyphylla, và nhiệt độ thích hợp với Paris polyphylla là 19OC [42]

Nghiên cứu của Y Teerawatsakul và đtg (2014) việc nuôi cấy chồi đỉnh

của Paris polyphylla chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, trong đó nuôi cấy chóp rễ

khoảng nhiệt độ này sau 45 ngày nuôi cấy mẫu tăng hơn 7,5 cm [54]

Việc đánh giá và phân hạng các cây thuốc thuộc diện quý hiếm có nguy

cơ bị tuyệt chủng, cần bảo vệ ở Việt Nam được Nguyễn Tập đề cập đến trong

các năm 2004, 2007 [20], [21] Theo đó, ở Việt Nam chi Paris thuộc họ Trọng

lâu (Trilliaceae) có các loài trong danh lục đỏ cần bảo vệ trình bày ở bảng 1.1

STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân hạng theo IUCN, 1994

Tài liệu tham khảo

1 Paris delavayi Franch Trọng lâu lá dài EN.A1c,d [20] 2

Paris fargesii Franch

(Paris petiolata Baker ex Wight

var ramembnaceae Wight)

Củ rắn cắn, Bảy

lá một hoa

EN.A1c,d

3 Paris hainanensis Merr Trọng lâu hảinam VU.B2a,b(ii,iii,v) [15]

4 Paris polyphylla Smith Bảy lá một hoa EN.B2a,b(ii,iii,v)

5 Paris yunnanensis Franch. Trọng lâu vânnam EN.B2a,b(ii,iii,v)

6 Paris chinensis Franch. Trọng lâu tàu VU.B2a,b

Bảng 1.1 Bảng danh lục đỏ cây thuốc thuộc chi Paris Việt Nam

(ii,iii,v)

A B C

F G

A P fargesii [25E B] C PF vietnamensis [52D] G

E

Hình 1.2 Một số hình thái cây Bảy lá một hoa ở Việt Nam

(Hình ảnh thuộc sản phẩm của nhóm nghiên cứu, trong nhiệm vụ quỹ GEN

cấp bộ giai đoạn 2016-2019)

Cây Bảy lá một hoa được tìm thấy ở một số tỉnh thành của Việt Nam nhưSapa- Lào Cai, Cúc Phương- Ninh Bình, Đại Từ- Thái Nguyên, Tam Đảo - PhúThọ và đã được xếp vào Sách Đỏ Việt Nam ở cấp độ đánh giá theo IUCN ởmức nguy cấp (tiếng Anh: Endangered, viết tắt EN) hoặc sắp nguy cấp (tiếngAnh: Vulnerable, viết tắt VU) [4], [10], [12], [20], [21] Hiện nay tại một số địaphương miền núi phía Bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn đã thành lập Banchỉ đạo dự án trên cơ sở phân tích các điều kiện khí hậu, đối chiếu với đặcđiểm sinh thái cây trồng nhằm đánh giá mức độ thích nghi của một số cây dượcliệu đối với điều kiện khí hậu Từ đó kết hợp với đánh giá tác động môi trường

và phân tích chi phí lợi ích để đưa ra những định hướng quy hoạch mở rộngdiện tích một số cây dược liệu trong vùng, trong đó có thảo dược Bảy lá mộthoa [2],[19], [57]

1.2 Một số phương pháp định danh thực vật

1.2.1 Phương pháp so sánh hình thái, giải phẫu

Trong lịch sử phát triển thực vật học thì hình thái, giải phẫu thực vật pháttriển tương đối sớm Từ những năm 371-286 TCN, Theophraste được gọi làngười sáng lập môn thực vật học Ông đã công bố các dẫn liệu hình thái giảiphẫu của cơ thể thực vật trong các tác phẩm “Lịch sử thực vật”, “Nghiên cứu

về cây cỏ” [9]

Phương pháp nghiên cứu chủ yếu nhất về thực vật vẫn là quan sát, sosánh trên cơ sở các dữ kiện ngoài thiên nhiên, sau đó tiến hành giải phẫu trongphòng thí nghiệm, so sánh các mẫu thu thập khác đã được lưu giữ, cuối cùng làphân tích, tổng hợp và rút ra nhận xét Để phân biệt các loại tế bào hay thànhphần cấu tạo các loại mô trong cơ quan, thường các lát cắt được nhuộm màu vàtùy theo yêu cầu quan sát phần nào mà sẽ nhuộm màu gì cho phù hợp Trongphòng thí nghiệm thực vật, để nhận biết tế bào có vách bằng celulose sẽ nhuộm

đỏ bằng carmin, tế bào có vách tẩm mộc tố sẽ được nhuộm xanh với lục iod,nhân tế bào được nhuộm bằng hematoxylin…[17]

Ở Việt Nam, dưới thời Pháp đô hộ chỉ có công trình nghiên cứu về giảiphẫu gỗ của H Lecomte và sau khi miền Bắc được giải phóng năm 1954 thìviệc nghiên cứu và giảng dạy hình thái giải phẫu được chú ý nhiều ở các trườngphổ thông và đại học Hiện nay ngày càng có nhiều công trình đi sâu tìm hiểu

về hình thái và giải phẫu của các loài thực vật, nhất là những loài thực vật cógiá trị làm thuốc và những loài suy giảm nghiêm trọng về số lượng, cần đượcbảo tồn

Năm 2015, trong “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và giải phẫu loài Hà

thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) ở Việt Nam” của Phạm

Thanh Huyền và đtg đã sử dụng phương pháp so sánh hình thái, đối chiếu khóaphân loại và các bản mô tả trong các thực vật chí để xác định tên khoa học củacác mẫu Hà thủ ô đỏ [9] Theo đó, nghiên cứu trên 37 mẫu Hà thủ ô đỏ -

Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson thu tại 10 địa điểm thuộc 8 tỉnh thành,

nhóm nghiên cứu đã xác định được ở Việt Nam hiện có 3 thứ của loài Fallopia

multiflora (Thunb.) Haraldson gồm: F multiflora var multiflora (Thunb.)

Haraldson; F mutiflora var angulata (S.Y Liu) H J Yan, Z J Fang & S X.

Yu và F multiflora var ciliinervis (Nakai) Yonek & H.Ohashi Nghiên cứu về

hình thái đã giúp các tác giả xây dựng được khóa phân loại cho các thứ của loài

này ở Việt Nam Đã mô tả được chi tiết đặc điểm hình thái loài Fallopia

multiflora (Thunb.) Haraldson, cũng như các thứ của loài, cùng với đặc điểm

giải phẫu các bộ phận rễ, thân, lá Kết quả thu được là những dẫn liệu bổ sung

cho các tài liệu trong nước về loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson,

đồng thời đây cũng là dẫn liệu khoa học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và

phát triển loài Hà thủ ô đỏ - Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson để tạo

nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc ở Việt Nam [9]

Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Phong lữ thảo (Pelargonium

hortorum L H Bailey) của Tạ Lê Mai Hậu và đtg (2016) lần đầu tiên đã mô tả

đầy đủ các đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu của loài Phong lữ thảo ở Việt

Nam, góp phần bổ sung thêm bộ cơ sở dữ liệu về lý lịch loài nghiên cứu, làm

cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng từ loài cây này [6]

Sóng rắn là một loài cây thuốc được trồng và mọc hoang dại nhiều nơi ởtỉnh Thái Nguyên Loài cây này đã được sử dụng như một vị thuốc y học dângian để chữa một số bệnh như zona và các bệnh ngoài da phổ biến Với mụcđích làm rõ đặc điểm và nâng cao giá trị sử dụng của loài cây này, nhóm nghiêncứu của Nông Thị Anh Thư và đtg (2017) tại trường Đại học Y dược, Đại họcThái Nguyên đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phầnhóa học và tác dụng giảm đau, chống viêm của dược liệu Sóng rắn thu hái tạiThái Nguyên” Nhóm nghiên cứu đã thu thập, xác định tên khoa học của cây

Sóng rắn thu ở Thái Nguyên là Albizia myriophylla Benth., thuộc họ Trinh nữ (Mimosaceae), trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, giải phẫu thực vật

của cây Sóng rắn ở Thái Nguyên, giúp tránh được việc nhầm lẫn trong thu háiloài cây này làm dược liệu [28]

Việc sử dụng phương pháp so sánh hình thái đã hỗ trợ trong các nghiêncứu để định loài Trong nghiên cứu của Đỗ Văn Hài và đtg (2017) về chi Bạch

hạc (Rhinacanthus Nees) ở Việt Nam đã mô tả đặc điểm nhận biết chi, xây dựng khóa định loại 2 loài là Rh calcaratus - Kiến cò móc và Rh nastusus -

Kiến Nghiên cứu cũng đã cung cấp các thông tin tóm tắt về phân bố, sinh học

và sinh thái, mẫu nghiên cứu và hình vẽ của các loài thuộc chi này ở Việt Nam[5] Hay với nghiên cứu của Bùi Hồng Quang và đtg (2017) đã bổ sung thêm

một loài vào khóa phân loại các loài thuộc chi Ngân hoa (Silvianthus) ở Việt

Nam Theo Phạm Hoàng Hộ (2000), Nguyễn Tiến Bân (2005), ở Việt Nam chi

Silvianthus có 1 loài là Silvianthus tonkinensis (Gagnep.) Ridsdale Trong quá

trình nghiên cứu các mẫu vật của chi này ở Việt Nam, loài Silvianthus

bracteatus Hook f trước đây được ghi nhận có ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc

(Vân Nam), nay được nhóm nghiên cứu phát hiện có phân bố Thanh Hóa (KhuBTTN Pù Hu), Nghệ An (VQG Pù Mát), Việt Nam Kết quả nghiên cứu đã xácđịnh được 1 loài bổ sung thêm vào hệ thực vật Việt Nam [16]

Bảy lá một hoa (Paris) cũng là loài được các nhà nghiên cứu quan tâm

và có các công trình nghiên cứu về đặc điểm hình thái giải phẫu, giúp bước đầu

phân biệt các loài trong chi Paris Phải kể đến đầu tiên là bộ sách “Cây cỏ Việt

Nam” năm 1999 của Phạm Hoàng Hộ đã có những mô tả sơ bộ về hình thái của

một số loài thuộc chi Paris ở Việt Nam bằng hình vẽ [7] Đến năm 2016, với đề

tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học của cây Bảy lá một hoa ở ViệtNam” đã mô tả chi tiết đặc điểm cấu tạo giải phẫu của các bộ phận thân khísinh, lá, thân rễ, rễ, và bột của thân rễ bảy lá một hoa Đây là báo cáo lần đầu

tiên về cấu tạo giải phẫu của cây Bảy lá một hoa - Paris chinensis Franch [22].

Nghiên cứu của Nguyễn Tiến Dũng và đtg (2018) về loài Bảy lá một hoa Việt

Nam - Paris vietnamensis (Takht.) H.Li đã xác định được điểm đặc trưng giúp phân biệt với các loài khác thuộc chi Paris là nhị có trung đới kéo dài hình trụ

ngắn 1 - 1,5mm; cánh hoa dài hơn đài 1,2 - 2 lần; lát cắt ngang qua bầu hìnhsao, cánh bầu lõm sâu, nhụy có vòi nhụy (phần hợp) rất ngắn; hạt có áo hạt màu

đỏ [3] Đặc biệt trong nghiên cứu của Nguyen Quynh Nga và đtg (2016) đã mô

tả đặc điểm hình thái và xây dựng khóa định loại cho 8 loài và 2 thứ thuộc chi

Paris ở Việt Nam [43].

1.2.2 Phương pháp phân loại học phân tử

Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử,một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành

và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trêncác dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm củachúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựachọn các gen khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen để làm căn

cứ phân loại sinh vật [35]

800 bp) được chuẩn hóa về nguyên tắc nên dễ dàng tạo ra và đặc trưng cho tất

cả các loài trên hành tinh [46]

Đối với thực vật việc lựa chọn mã vạch DNA cần phải quan tâm đến các

yếu tố như: (i) khuếch đại PCR mang tính tổng thể, thành công trên nhiều loại cây, (ii ) phạm vi đa dạng phân loại, sử dụng được cho nhiều loài khác nhau, (iii) có sự sai khác, đặc trưng phân loại các loài, (iv) sử dụng công cụ tin sinh

học trong phân tích và ứng dụng [35] Sau khi kiểm tra rộng rãi các vùng gentrong hệ gen của ty thể, lục lạp và nhân thì bốn đoạn gen/vùng gen chính là

rbcL , matK, trnH - psbA và ITS thường được thống nhất là mã vạch DNA tiêu

chuẩn được lựa chọn cho thực vật [31], [36], [37], [39], [47], [51]

Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA thực vật cho mục đích nhận dạngđòi hỏi hai bước cơ bản: (1) xây dựng thư viện mã vạch DNA của các loài đãbiết và (2) so sánh mã vạch DNA của một mẫu chưa biết với thư viện mã vạchDNA

1.2.2.2 Nghiên cứu trên thế giới sử dụng mã vạch DNA

Các mã vạch DNA đã được phát triển, thử nghiệm và sử dụng để giảiquyết các câu hỏi cơ bản về hệ thống, sinh thái, sinh học tiến hóa và bảo tồn,bao gồm lắp ráp cộng đồng, mạng lưới tương tác loài, khám phá phân loại vàđánh giá các lĩnh vực ưu tiên bảo vệ môi trường

Gen matK nằm trong hệ gen lục lạp, có chiều dài hơn 150000 bp, mã hóa

cho maturase K- là những enzyme có kích thước khoảng 498-515 amino acid

Bảng 1.2 Một số thông tin về gen matK của chi Paris

Mã số trên

Năm công bố

Kích thước đoạn mã

chinensis (Korea) 2015 1497 AIW53094, 498

Gen matK thường được sử dụng trong việc định danh, phân loại ở các

loài thực vật hạt kín, là loài chiếm đa số trong các hệ sinh thái hiện nay

Layhaye và đtg (2008) đã lựa chọn gen matK là một mã vạch ưa thích trong phân loại thực vật Nghiên cứu của Lahaye và đtg (2008) chỉ ra rằng mã vạch

DNA thực vật có thể được sử dụng để đánh giá nhận dạng loài trong các điểmnóng đa dạng sinh học giúp bảo tồn cũng như áp dụng giả thuyết để giám sátthương mại quốc tế trong các loài Lan đang bị đe dọa [37]

Nhóm nghiên cứu do Savolainen và đtg (2005) sử dụng gen matK để

nhận dạng 1600 loài Lan Trong quá trình thực hiện, họ phát hiện một loạitrước đây được cho là Lan thực ra lại là hai loài tách biệt Loài này sống trênnhững dốc khác nhau trên núi và có hoa hình dạng khác nhau để thích nghi vớinhững loài côn trùng thụ phấn khác nhau [50]

ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn đệm nằm giữa gen của tiểu

phần nhỏ và tiểu phần lớn của ribosome (vùng gồm các đoạn ITS1-5,8S-ITS2,hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc đoạn DNA mang vùng gen ITS

Vùng ITS nằm trong nhân tế bào được phiên mã trong quá trình tổng hợp rRNA Tuy nhiên, trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt và nhanh chóng phân hủy Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locut riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locut 5.8S Một số thông tin về vùng

ITS của chi Paris được trình bày trên bảng 1.3.

Bảng 1.3 Một số thông tin về vùng ITS của chi Paris [60]

Mã số trên

Năm công bố

ITS1-5,8S-ITS2

(bp)

Vùng ITS có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phát sinh và đánh giá sự đa dạng di truyền của các loài như trình tự nucleotide vùng gen ITS mang các đặc

tính di truyền của cả bố và mẹ, số lượng trình tự DNA lặp lại thích hợp choviệc khuếch đại và xác định trình tự DNA ribosome Trình tự nucleotide vùng

gen ITS đã được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới khá

phong phú và đa dạng, thuận lợi cho việc phân tích so sánh

Vùng gen ITS được chứng minh đặc biệt hữu ích trong việc làm sáng tỏ

mối quan hệ ở các loài trong bảng 1.4 dưới đây:

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng vùng gen ITS

trong phân loại thực vật

Đối tượng phân loại

Cấp độ phân loại

Năm Tài liệu tham khảo

Chi Plantago ( P l an t a g in a c e a e ) Loài 2002 Ronsted và đtg [35]

Chi Potamogeton

Một ví dụ về sự khác biệt giữa Schisandra chinensis - Ngũ vị tử bắc với các loài khác trong chi Schisandra Li và đtg (2013) đã thấy sự sai khác tại vị trí 86 bp trên vùng gen ITS, qua sát thấy C → thay A trong các quần thể hoang

dã khi so sánh với quần thể người dân trồng Vùng ITS2 còn phân biệt rõ ràng

Schisandra chinensis với Schisandra sphenanthera [39].

Một nghiên cứu khác nhằm xác định chi Hoàng kỳ (Astragalus) gồm

nhiều loài có sự tương đồng về hình thái Trong nghiên cứu này của Gao và đtg

(2009), bốn gen mã hóa (trnH-psbA, rpoC1, rbcL, matK) và hai vùng gen không mã hóa (ITS, ITS2) được so sánh giữa 319 loài Mã vạch ITS2 và ITS có

hiệu quả cao hơn đối với việc phân biệt loài [32]

1.2.2.3 Nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA ở Việt Nam

Việt Nam cũng đã bắt kịp xu hướng khi sử dụng mã vạch DNA vào côngcuộc giám định thực vật phục vụ cho công tác bảo tồn nguồn gen các loài thực

vật quý hiếm Những năm gần đây các công trình nghiên cứu sử dụng các đoạngen/vùng gen làm mã vạch DNA trong việc phân tích quan hệ di truyền, phânloại thực vật ngày càng phổ biến.

Năm 2011, Dương Văn Tăng và đtg đã phân lập và xác định trình tự đầy

đủ vùng gen ITS thuộc hệ gen nhân của ba loài gỗ quý Trắc (D.

cochinchinensis), Cẩm lai (D oliveri) và Sưa (D tonkinensis) ở Việt Nam và

bổ sung cho Ngân hàng trình tự DNA gen quốc tế Qua việc phân tích quan hệ

di truyền sử dụng trình tự ITS cho thấy: Sưa (D tonkinensis) có họ hàng gần nhất với D sisso và nằm trong một nhóm lớn với các loài D frutescens, D.

decipularis, D brasiliensis và D congestiflora Loài Trắc (D cochinchinensis)

họ hàng gần nhất với Cẩm lai (D oliveri) [18].

Năm 2014, Nguyễn Thị Phương Trang và đtg đã sử dụng kết hợp 3 vùng

gen lục lạp rbcL, matK, trnH-psbA để nghiên cứu đặc điểm di truyền ba loài Sao (Hopea) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam gồm Sao hòn gai (Hopea

chinensis), Sao hải nam (H hainanensis) và Sao mặt quỷ (H mollissima) Mức

độ khác biệt di truyền rất thấp từ 0,2 đến 0,6 giữa cặp loài nghiên cứu, dùng đểnhận biết và so sánh với các loài khác trên thế giới [29]

Phan Kế long và đtg (2014) cũng sử dụng kết hợp 2 vùng gen matK và ITS

trong việc phân tích mối quan hệ di truyền của các mẫu Sâm thu ở Lai Châutrên cơ sở phân tích trình tự nucleotide 2 vùng gen đã chọn Kết quả nghiên cứu

đã giải mã được 1485 nucleotide vùng gen matK và 588 nucleotide vùng gen

ITS-rDNA cho tổng số 17 cá thể của 2 loại Sâm ở Lai Châu bao gồm sâm Lai

Châu (P vietnamensis var fuscidiscus) và Tam thất trắng (P stipuleanatus) Kết quả phân tích trình tự nucleotide vùng gen matK và ITS-rDNA chỉ ra các loài Sâm trong chi Panax có cùng nguồn gốc tiến hóa Hai thứ sâm Lai Châu (P vietnamensis var fuscidiscus) và sâm Ngọc Linh (P vietnamensis Ha & Grushv var vietnamensis) của loài sâm Việt (P vietnamensis Ha & Grushv.)

có quan hệ chị em [11]