Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển miền trung, việt nam (tt)

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Trần Thị Hồng SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vespa

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Trần Thị Hồng

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN

Spheciospongia vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN

TRUNG, VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2020

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS.Phạm Việt Cường

Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS.Nguyễn Thị Kim Cúc

… năm 2019

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1 Nguyen Thi Kim Cuc, Ton That Huu Dat, Tran Thi Hong, Pham

Viet Cuong, Phylogenetic diversity of microorganisms asscociated with three marine sponges from Mien Trung sea of Viet Nam

Journal of Science and Technology, 2017, 55(2), 168-177

2 Tran Thi Hong, Ton That Huu Dat, Pham Viet Cuong, Nguyen

Thi Kim Cuc, Protease inhibitors from marine sponge and associated microorganisms Journal of Science and Technology

sponge-(VAST), 2018, 56(4), 405-423

3 Trần Thị Hồng, Nguyễn Thị Kim Cúc, Tôn Thất Hữu Đạt, Phạm

Việt Cường, Sàng lọc các vi khuẩn ức chế protease liên kết với hải miên Đà Nẵng, Việt Nam Tuyển tập báo cáo hội nghị khoa học

công nghệ sinh học toàn quốc, 2018, 743-748 Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ ISBN: 978-604-913-759-4

4 Trần Thị Hồng, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc, Sàng

lọc gen ức chế protease từ metagenomics của vi sinh vật liên kết với hải miên biển Quảng Trị (Việt Nam) Academia Journal of Biology, 2019, 41(2), 49-60

5 Tran Thi Hong, Ton That Huu Dat, Nguyen Phuong Hoa, Tran

Thi Kim Dung, Vu Thi Thu Huyen, Le Minh Bui, Nguyen Thi Kim

Cuc, Pham Viet Cuong, Expression and characterization of a new serine protease inhibitory protein in Escherichia coli Biomedical

research and therapy, 2020, 7(2): 3633-3644

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Chất ức chế protease (PI), một tác nhân có thể làm cho protease mất khả năng thủy phân protein thành peptide được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là trong y dược như: điều trị kháng phân hủy sợi huyết (antifibrinolytic); ức chế angiotensin trong điều trị tăng huyết áp; ngăn chặn sự nhân lên của một số virus (HIV, viêm gan C… Ví dụ về các thuốc ức chế protease là saquinavir (tên thương hiệu: Invirase) và ritonavir (tên thương hiệu: Novir) được sử dụng chủ yếu trong điều trị HIV/AIDS Chúng được dùng như một phần của một loại cocktail đa thuốc và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm đáng kể mức độ virus HIV trong máu

Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện các phân tử protein mới có hoạt tính ức chế đặc hiệu các protease đích khác nhau, liên quan đến các loại bệnh là một hướng nghiên cứu được quan tâm hiện nay Hải miên và các vi sinh vật liên kết với hải miên được xem là một nguồn để phát hiện và khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học mới phục vụ chế tạo thuốc, các peptide có hoạt tính ức chế protease là một trong số

đó Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật liên kết hải miên thuộc loại không nuôi cấy được nên hạn chế khả năng khai thác chúng Nhờ kỹ thuật metagenomic, với sự hỗ trợ của thiết bị giải trình tự gen hiệu năng cao và công cụ tin sinh cho phép phát hiện các gen, cụm gen có chức năng mã hóa cho các PI, cho phép khai thác được các PI từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy được

Đến nay tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về hải miên, từ việc phân lập vi sinh vật trên hải miên, đến tách chiết các chất

có hoạt tính sinh học từ nhóm vi sinh vật này Tuy nhiên, vẫn còn chưa

có nghiên cứu nào sử dụng công cụ metagenomics và công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới để phát hiện, sàng lọc các gen có hoạt tính sinh học, trong đó có hoạt tính ức chế protease và biểu hiện các gen này

trong hệ Escherichia coli và nấm men Pichia pastoris

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án với tên đề tài: “Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Phát hiện và sàng lọc các gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên thu nhận từ biển Miền Trung, Việt Nam bằng phương pháp metagenomics

Sau đó biểu hiện gen chọn lọc in vitro và xác định hoạt tính

2 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

 Tách DNA của vi sinh vật liên kết với một số mẫu hải miên, xác định nồng độ DNA và độ tinh sạch, lựa chọn mẫu để giải trình tự metagenomics

 Phân tích dữ liệu metagenomics mẫu đã giải trình tự bằng các công

cụ tin sinh học Đánh giá đa dạng sinh học của vi sinh vật liên kết với hải miên Từ CSDL metagenomics khai thác gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế protease

 Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease trong hệ

biểu hiện Escherichia coli và hệ biểu hiện nấm men Pichia pasroris

 Đánh giá hoạt tính ức chế protease của protein tái tổ hợp

4 Những đóng góp mới của luận án

 Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên của mẫu hải miên QT2 thu nhận tại vùng biển Quảng Trị (Miền Trung), Việt Nam Cơ sở dữ liệu thu được có ý nghĩa về mặt khoa học góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển Việt Nam và có tiềm năng khai thác nguồn gen trên để ứng dụng vào thực tiễn

 Thu nhận được gen mới PI-QT mã hóa cho PIs và biểu hiện thành

công ở E coli và P pastoris Hoạt tính ức chế protease của protein

biểu hiện đã được đánh giá và kết quả thu được cho thấy protein

PI-QT tái tổ hợp từ E coli có hoạt tính ức chế trypsin, ức chế chymotrypsin và protein từ P pastoris thể hiện hoạt tính ức chế

ɑ-trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên

1.1.1 Giới thiệu về hải miên

1.1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên

1.2 Sơ lược về metagenomics

1.3 Chất ức chế protease (PIs)

1.3.1 Sơ lược về protease

1.3.2 Chất ức chế protease và phân loại

1.3.3 Cơ chế hoạt động của PIs

1.3.4 Ứng dụng của chất ức chế protease

1.3.5 Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sinh vật liên kết hải miên trong và ngoài nước

1.4 Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Các mẫu hải miên được thu thập tại biển Quảng Trị, Việt Nam và một số vật liệu khácsử dụng trong nghiên cứu

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Vi sinh vật liên kết với hải miên

2.1.3 Hóa chất

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu được mua chủ yếu từ các hãng

uy tín như Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Himedia (Ấn Độ)

2.1.4 Máy móc thiết bị

Sử dụng máy móc thiết bị của Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa

Đô, Viện NCKH Miền Trung, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và một số máy móc của Viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

2.1.5 Dung dịch và môi trường sử dụng

Môi trường sử dụng trong nuôi cấy và biểu hiện gen trong E coli: Luria-Bertani (LB)

Môi trường sử dụng trong biến nạp và biểu hiện gen ngoại lai ở

nấm men P pastoris (theohướng dẫn của Pichia Expression Kit)

Dung dịch được sử dụng trong điện di DNA: TAE 1X, loading dye 6X, ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml

Dung dịch sử dụng trong điện di SDS-PAGE: Bis-acrylamide 30%; Đệm Tris HCl 1,5M pH 8,8; Đệm Tris HCl 1M pH 6,8; Đệm Tris HCl 0.5M pH 6,8; SDS 10%; APS 10%; TEMED…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên

Tách chiết DNA tổng số của VSV liên kết với hải miên theo

phương pháp của Abe và cộng sự (2014) với một số cải tiến nhỏ cho

phù hợp với điều kiện của Việt Nam

2.2.2 Định danh hải miên bằng sinh học phân tử (Medlin et al., 1988)

2.2.3 Phân tích dữ liệu metagenomics

Giải trình tự DNA metagenome bằng hệ thống Illumina HiSeq2500(BaseClear - Hà Lan) Dữ liệu thu được sẽ được phân tích bằng các phần mềm tin sinh học

2.2.4 Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế plasmid mang gen PIs

Gen PI-QT tổng hợp dựa trên trình tự gen contig 000046 từ CSDL metagenomics QT2, và tách dòng vào vectơ pUC57, có thiêt kế

trình tự của enzyme giới hạn EcoRI và NotI ở 2 đầu gen (GenScipt,

Mỹ) Tiếp theo, vectơ pUC57 (Thermo, Mỹ) có chứa gen PI-QT và vectơ biểu hiện pET-32a (+) (Invitrogen, Mỹ) đã được cắt bằng enzyme

giới hạnEcoRI và NotI (Fermentas, Lithuania) Sau đó, gen PI-QT đã

được tinh sạch và đưa vào vectơ biểu hiện pET-32a(+) (biểu hiện trong

E coli) và pPIC9 (biểu hiện trong P pastoris) bằng cách sử dụng

enzyme T4 ligase (Thermo, Mỹ)

2.2.5 Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E coli BL21(DE3)

Phương pháp biến nạp, biểu hiện và tối ưu hóa quá trình biểu

hiện gen trong tế bào E coli (Đỗ Thị Huyền et al., 2008; Nguyễn Thị

Loại bỏ đuôi peptide TRx-His-tag ra khỏi protein tái tổ hợp (Theo hướng dẫn của Novagen)

Nhận diện và phân tích protein bằng phương pháp proteomics/ tin sinh học

2.2.6 Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris

Theo hướng dẫn của Pichia expression kit – Invitrogen với một

số thay đổi nhỏ phù hợp cho quá trình biểu hiện

2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease(Sapna., 2013;

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thu thập mẫu hải miên

Bằng phương pháp SCUBA, đã thu thập được 8 mẫu hải miên tại biển Quảng Trị Hải miên được thu thập tại tọa độ là 107°07'06.0"E; 17°04'50.2"N Các mẫu được lưu trữ trong 30 % glycerol, bảo quản trong đá, vận chuyển về phòng thí nghiệm và tiến hành tách chiết DNA

của vi sinh vật liên kết hải miên

3.2.Kết quả tách chiết DNA metagenome

3.2.1.Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị

DNA tổng số của VSV liên kết hải miên đã được tách chiết từ

8 mẫu hải miên thu thập tại biển Quảng Trị, Việt Nam Kết quả cho thấy lượng DNA tách được ở mỗi mẫu khác nhau.Mẫu tách được nhiều DNA nhất là QT2 và độ tinh sạch cao nhất (Hình 3.1, Bảng 3.1)

Bảng 3.1.Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển

Quảng Trị

DNA (ng/µL) A260/A230 A260/A280

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải miên

biển Quảng Trị (M: Marker 100 bp của hãng Thermo)

3.1.2 Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử

Đoạn gen 18S rRNA dài khoảng 1,9 kb của mẫu hải miên QT2

đã được khuếch đại thành công từ DNA tách chiết Kết quả giải trình tự gen bằng máy ABI PRISM 3100 và so sánh trình tự nhận được bằng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) với các trình tự gen 18S rRNA khác trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) cho thấy đoạn gen 18S rRNA của hải miên QT2 tương đồng 99,9 % với trình tự gen tương ứng của hải miên

Spheciospongia vesparium có mã số AY734440 Vì vậy, chúng tôi đặt tên cho mẫu QT2 là Spheciospongia vesparium QT2

3.3 Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên

kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 bằng tin sinh học 3.3.1 Lắp ráp reads của DNA metagenome

Sau khi giải trình tự shortgun metagenome toàn bộ của mẫu QT2 (Base Clear, Hà Lan) và tinh sạch dữ liệu bằng phần mềm Trimmomatic, thu được hơn 44 triệu đoạn trình tự paired reads Dữ liệu

tinh sạch được sử dụng lắp ráp de novo metagenome sử dụng phần

mềm SPAdes Tổng kích thước hệ lắp ráp thu được là khoảng 418 Mb bao gồm 102.236 contigs Contig có kích thước dài nhất là hơn 855 kb, contigs nhỏ nhất là 1.000 bp, độ dài trung bình là 4.089 bp Gần 90 %

số đoạn trình tự có thể ánh xạ ngược lại với hệ gen lắp ráp Kết quả nhận được cho thấy các contigs chủ yếu phân bố trong khoảng từ 1.000 đến 100.000 bp Tỷ lệ GC % trong hệ gen của mẫu QT2 là 61,82 %

3.3.2 Kết quả dự đoán gen

Kết quả dự đoán gen bằng phần mềm Prodigal và MetageneMark nhận được lần lượt là khoảng 366 Mb (386.416 ORFs) và 361 Mb (380.886 ORFs) Kết quả dự đoán gen của hai phần mềm khá tương đồng nhau, với gen lớn nhất có kích thước là 66.639 bp, độ dài trung bình là 864 bp và tỷ lệ GC là khoảng hơn 62 % Sau khi loại bỏ tất cả

những gen có kích nhỏ hơn 250 bp, sử dụng phần mềm CD-HIT với mức độ tương đồng 90 %, thu được tập gen cuối cùng có tổng kích thước gần 360 Mb bao gồm 372.732 gen đồng nhất (unified genes), trong đó có 262.159 gen hoàn chỉnh (chiếm 70,33 %) (gen có đủ mã

mở đầu và mã kết thúc); 53.162 (14,26 %) gen thiếu mã kết thúc 3’; 49.569 (13,3 %) gen thiếu mã mở đầu 5’ và số lượng gen thiếu cả mã

mở đầu và mã kết thúc chỉ có 7.842 gen, chiếm 2,1 % Phân bố độ dài cho thấy gen dự đoán chủ yếu có kích thước từ khoảng 250 bp đến khoảng 2.000 bp

3.3.3 Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen

Kết quả chú giải bằng các cơ sở dữ liệu cho thấy, với tổng số 372.732 trình tự gen (axit amin), có 360.564 (96,74 %) gen được chú giải trên cở sở dữ liệu NR; 266.553 gen được chú giải trên Swiss-Prot chiếm 71,51 %; 274.632 gen chiếm 73,68 % được chú giải trên cơ sở

dữ liệu COG; chỉ có 11.974 (3,21 %) gen được chú giải trên cơ sở dữ liệu CAZy; số gen được chú giải trên cơ sơ dữ liệu GO là 165.552 gen chiếm 44,42 %, 244.436 gen được chú giải trên cơ sơ dữ liệu KEGG chiếm 65,58 %; đối với cơ sở dự liệu Pfam, có 273.826 (73,46 %) gen

được chú giải

3.3.4 Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2

Đã nhận dạng 10 ngành, 21 lớp, 36 bộ, 22 họ và 16 chi vi

khuẩn liên kết với hải miên Spheciospongia vesparium QT2

3.3.5 Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở

dữ liệu (CSDL) metagenomics

Bằng các công cụ tin sinh học, đã khai thác được 50 gen hoàn chỉnh liên quan đến chất ức chế protease từ CSDL metagenomics QT2 (Quảng Trị) (Bảng 3.8) Trong đó có 28 gen, chiếm 56 % được chú giải

thuộc họ Serpin (Serine protease inhibitor); còn lại 22 gen (44 %) thuộc nhóm Inter-alpha-trypsin inhibitor Gen ngắn nhất là 198 bp, mã hóa cho 66 axit amin; gen dài nhất là 2406 bp, mã hóa cho 802 axit amin Một số gen cũng đã được xác định là gen mới ở Việt Nam

Bảng 3.8 Kết quả sàng lọc các gen có hoạt tính protease inhibitor từ

1 00016 5808 442 Q5RB37 ITIH chain H3 89.4 1.00E-17

2 000019 06418 323 O02668 ITIH chain H2 61.2 5.00E-09

3 000019 0645 398 Q61703 ITIH chain H2 71.6 4.00E-12

5 000046 10705 405 Q5BIR5 Serpin 214 1.00E-63

6 000127 20087 328 Q3T052 ITIH chain H4 62 3.00E-09

7 000172 24210 400 Q8BJD1 ITIH chain H5 71.6 4.00E-12

8 000213 27784 418 Q5BIR5 Serpin B8 216 5.00E-64

9 000213 27785 405 Q99574 Neuroserpin 209 2.00E-61

10 000314 34813 736 A6X935 ITIH 171 6.00E-43

11 000433 41698 419 Q5BIR5 Serpin B8 231 6.00E-70

12 000631 52340 325 Q3T052 ITIH chain H4 58.9 3.00E-08

13 000726 56621 398 Q61703 ITIH chain H2 57 2.00E-07

14 000981 67673 428 Q90935 Neuroserpin 214 1.00E-62

15 001114 72799 419 Q5BIR5 Serpin B8 219 4.00E-65

16 001390 82416 386 A6X935 ITIH 114 4.00E-26

17 001690 91580 454 Q5BIR5 Serpin B8 152 5.00E-40

18 001737 93032 412 Q5BIR5 Serpin B8 214 1.00E-63

19 001737 93033 223 Q99574 Neuroserpin 87.8 6.00E-19

20 001813 95168 412 Q99574 Neuroserpin 207 3.00E-60

21 002069 102253 280 Q8PTN8 Serpin 175 7.00E-50

22 002236 106102 324 A2VE29 ITIH chain H5 64.7 4.00E-10

23 002339 108516 478 Q14624 ITIH chain H4 63.5 2.00E-09

24 002592 114432 355 Q90935 Neuroserpin 197 3.00E-57

25 002838 119867 334 Q14624 ITIH chain H4 55.5 3.00E-07

26 003102 125566 401 Q8BJD1 ITIH chain H5 58.5 5.00E-08

27 003892 140659 323 Q3T052 ITIH chain H4 67 7.00E-11

28 004584 152589 631 Q61703 ITIH chain H2 66.2 6.00E-10

29 005997 173538 430 Q8PTN8 Serpin 206 2.00E-59

30 006820 184178 417 Q5BIR5 Serpin B8 237 5.00E-72