Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)

Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ

PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia

vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ

PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia

vesparium QT2 THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT

NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường

2 PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc

Hà Nội, 2020

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường, nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam- Nhà Khoa học mẫn cán, người thầy mẫu mực- người đã giúp tôi định hướng nội dung, giúp đỡ về tinh thần, kiến thức chuyên môn, cơ sở vật chất và chỉ bảo tận tình giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn để hoàn thành Luận án trong suốt những năm qua

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc, Chủ nhiệm đề tài ĐTĐLCN.17/14 “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên tại biển miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện và sàng lọc các chất hoạt tính sinh học mới” đã định hướng cho luận án của tôi và quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã cử tôi đi học, tập thể Trung tâm sinh học Phân tử Nghĩa Đô, Ths.NCS Tôn Thất Hữu Đạt, phòng quản lý tổng hợp Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã tạo điều kiện cho tôi làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và hoàn thiện các nội dung trong nghiên cứu này

Tôi trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận án của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

NCS Trần Thị Hồng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quả lần đầu tiên được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng

ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

NCS Trần Thị Hồng

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên 3

1.1.1 Giới thiệu về hải miên 3

1.1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên 6

1.2 Sơ lược về metagenomics 14

1.3 Chất ức chế protease (PIs) 19

1.3.1 Sơ lược protease 19

1.3.2 Chất ức chế protease và phân loại 20

1.3.3 Cơ chế hoạt động của PIs 25

1.3.4 Ứng dụng của chất ức chế protease 28

1.3.5 Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sịnh vật liên kết với hải miên trong và ngoài nước 31

1.4 Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris 35

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu nghiên cứu 37

2.1.1 Vật liệu… 37

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu… 39

2.1.3 Hóa chất… 39

2.1.4 Máy móc thiết bị 39

2.1.5 Dung dịch và môi trường sử dụng 40

2.2 Phương pháp nghiên cứu 42

2.2.1 Phương pháp tách DNA metagenome của VSV liên kết hải miên 43

2.2.2 Định danh hải miên bằng sinh học phân tử 43

2.2.3 Phân tích dữ liệu metagenomics 43

2.2.4 Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế plasmid mang gen PIs 47

2.2.5 Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E coli (DE3) 48

2.2.6 Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris 49

2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease 50

2.2.8 Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs tái tổ hợp 52

2.2.9 Phân tích thống kê 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Thu thập mẫu hải miên 53

3.2 Kết quả tách chiết DNA metagenome 54

3.2.1 Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị

54 3.2.2 Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử 55

3.3 Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị, Việt Nam bằng tin sinh học 56

3.3.1 Lắp ráp reads của DNA metagenome 56

3.3.2 Kết quả dự đoán gen 58

3.3.3 Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen 60

3.3.4 Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị

64 3.3.5 Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ liệu (CSDL) metagenomics

71 3.4 Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia coli 75

3.4.1 Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI-QT 76

3.4.2 Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs 78

3.4.3 Biểu hiện gen PIs trong E coli chủng BL21(DE3) 79

3.4.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT ở trạng thái tan cao nhất 81

3.4.5 Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E coli và nhận diện bằng khối phổ

87 3.4.6 Thử hoạt tính ức chế của protein tái tổ hợp PI-QT với protease 89

3.5 Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ nấm men Pichia pastoris 91

3.5.1 Tạo plasmid pPIC9 mang gen PI-QT 91

3.5.2 Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT 92

3.5.3 Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P pastoris SMD1168 93

3.5.4 Kết quả thử hoạt tính ức chế của protein PI-QT biểu hiện trong nấm men 96

3.5.5 Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 % 97

3.5.6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện P pastoris SMD 1168 [pPIC9/PI-QT]

98 3.5.7 Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong nấm men P pastoris qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B

104 3.5.8 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT 106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO 114

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitrile

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp, kb, kDa Base pair, Kilo base, Kilo dalton

CFU Colony forming units

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr Ethidium bromide

HMA High microbial abundance

IAA 3-Indolebutyric acid

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

KH&CN Khoa học và Công nghệ

LB: Luria-Bertani LMA Low microbial abundance

NCBI National Center for Biotechnology Information

P pastoris Pichia pastoris

PCR Polymerase Chain Reaction

PIs Protein inhibitors

RNA Ribonucleic acid

RNase Ribonuclease

SCUBA Self contained underwater breathing apparatus

SDS Sodium dodecyl sulphate

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2 Chất ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên……… 32

Bảng 2.1 Thành phần của bản gel polyacryamide 42

Bảng 3.1 Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển

Quảng trị 54

Bảng 3.2 Kết quả lắp ráp DNA metagenome của mẫu QT2 57

Bảng 3.3 Kết quả dự đoán, cluster genes và kiểm tra tính toàn vẹn của gen

(mẫu QT2) 59

Bảng 3.4 Tổng hợp kết quả chú giải chức năng gen (QT2) 60

Bảng 3.5 Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia

vesparium QT2 theo giới và ngành 65

Bảng 3.6 Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia

Bảng 3.9 Gen có hoạt tính sinh học mới (so với ở Việt Nam) 73

Bảng 3.10 So sánh hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch

thu hồi biểu hiện trong P pastoris SMD1168 và E coli

BL21(DE3) 106

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô 4

Hình 1.2 Sơ đồ đại diện cho hải miên asconoid 4

Hình 1.3 Vai trò của vi sinh vật với hải miên 8

Hình 1.4 Ba trạng thái liên kết chung củ VSV và hải miên 10

Hình 1.5 Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các cộng đồng VSV liên kết hải miên 11

Hình 1.6 Ba chất ức chế protease có sẵn trên thị trường 20

Hình 1.7 Một vài họ PPI quan trọng 23

Hình 1.8 Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitor) 26

Hình 1.9 Cơ chế ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II 27

Hình 1.10 Serpin ức chế protease 28

Hình 2.1 Cấu trúc vectơ pET-32a(+) 38

Hình 2.2 Cấu trúc vectơ pPIC9 39

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị 54

Hình 3.2 Điện di đồ trên gel agarose 1 % 56

Hình 3.3 Kết quả tinh sạch dữ liệu QT2 57

Hình 3.4 Phân bố độ dài contig sau lắp ráp 58

Hình 3.5 Phân bố độ dài gen 59

Hình 3.6 Phân loại chức năng gen trên cơ sở dữ liệu COG 61

Hình 3.7 Phân nhóm chức năng của enzyme trên cơ sở dữ liệu CAZy 62

Hình 3.8 Kết quả phân loại trên cơ sở dữ liệu KEGG 63

Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8 % 64

Hình 3.10 Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 theo giới và ngành 66

Hình 3.11 Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị theo chi 69

Hình 3.12 So sánh trình tự axít amin của protein PI-QT với các trình tự tương đồng trên cơ sở dữ liệu NCBI 76

Hình 3.13 Mối phát sinh quan hệ gen của protein PI-QT với các serpin

khác (B) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự đoán bằng SWISS-MODEL (C) Cấu trúc protein của PI-QT đã được dự đoán bằng (PS)2-v2 77

Hình 3.14 (A) –Gel agarose của vectơ cắt bằng EcoRI/NotI, (B) – Gel

agarose của plasmid tái tổ hợp ([pET-32a(+)/PI-QT]) được cắt

bằng enzyme EcoRI/ NotI 78

Hình 3.15 A- Kết quả điện di PAGE 12,6 % kiểm tra E coli

BL21(DE3)/[pET-32a(+)/PI-QT] biểu hiện ở 37 oC 80

Hình 3.16 Kiểm tra trạng thái của protein PI-QT biểu hiện 80

Hình 3.17 Protein PI-QT biểu hiện trong E coli dưới các nồng độ IPTG

khác nhau 81

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tạo protein PI-QT tan 83

Hình 3.19 (A)- Điện di SDS- PAGE 12,6 % kiểm tra khả năng tan của

protein ở OD600= 0,6 trước khi cảm ứng; (B)- Trạng thái protein PI-QT (% tan) và hàm lượng protein tạo ra khi OD600 trước cảm ứng khác nhau 84

Hình 3.20 Sử dụng đệm đẩy cột imidazole 100 mM, 250 mM, 300 mM,

500 mM 86

Hình 3.21 Kết quả Western blot và kết quả loại bỏ đuôi dung hợp

TRx-His-tag ra khỏi protein PI-QT bằng thrombin trên gel PAGE 12.6 % 88

SDS-Hình 3.22 Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với

Trypsin và Elastasetrên đĩa thạch 90

Hình 3.23 Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với

ɑ-Chymotrypsin trên đĩa thạch 90

Hình 3.24 Điện di đồ trên gel agarose 1 % sản phẩm cắt mở vòng vectơ

pPIC9 (a) và cắt kiểm tra plasmid [pPIC9/PI-QT] 91

Hình 3.25 Điện di đồ trên gel agarose 1% sản phẩm cắt kiểm tra plasmid

pPIC9/PI-QT và sản phẩm PCR bằng cặp mồi AOX1 92

Hình 3.26 Kết quả kiểm tra kiểu hình và kiểu gen nấm men mang gen

PI-QT 92

Hình 3.27 Đường cong sinh trưởng của các dòng P pastoris tái tổ hợp

theo thời gian 94

Hình 3.28 Điện di đồ protein PI-QT biểu hiện trong P pastoris SMD1168 [pPIC9/PI-QT] 95

Hình 3.29 Đồ thị tương quan giữa hàm lượng protein ngoại lai tạo ra với mật độ tế bào nấm men tái tổ hợp 95

Hình 3.30 Định tính khả năng ức chế protease của protein biểu hiện 96

Hình 3.31 Kết quả thử hoạt tính ức chế protease của dịch chiết thô

P pastoris SMD1168 không mang gen PI-QT 97

Hình 3.32 Điện di SDS-PAGE 12,6 % đồng trùng hợp với cơ chất casein 0.1 % và xử lý bằng enzyme trypsin 98

Hình 3.33 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo protein PI-QT (mg/L) trong nấm men P pastoris 99

Hình 3.34 Khảo sát nhiệt độ biểu hiện của P pastoris SMD 1168 [pPIC9/PI-QT] 100

Hình 3.35 Khảo sát pH trong quá trình biểu hiện P pastoris SMD 1168[pPIC9/PI-QT] 102

Hình 3.36 Nồng độ methanol cảm ứng trong biểu hiện P pastoris tái tổ hợp 103

Hình 3.37 Điện di SDS – PAGE 12,6 % protein PI-QT qua màng cut off 30 kDa và qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B 105

Hình 3.38 Hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch biểu hiện trong nấm men P pastoris SMD1168 105

Hình 3.39 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hợp chất PI-QT 106

Hình 3.40 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến hợp chất PI-QT 107

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ

PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia

vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG , VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2020

và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm đáng kể mức độ virus HIV trong máu

Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện các phân tử protein mới có hoạt tính ức chế đặc hiệu các protease đích khác nhau, liên quan đến các loại bệnh là một hướng nghiên cứu được quan tâm hiện nay Hải miên và các vi sinh vật liên kết với hải miên được xem là một nguồn để phát hiện và khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học mới phục vụ chế tạo thuốc, các peptide có hoạt tính ức chế protease là một trong số đó Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật liên kết hải miên thuộc loại không nuôi cấy được nên hạn chế khả năng khai thác chúng Nhờ kỹ thuật metagenomic, với sự hỗ trợ của thiết bị giải trình tự gen hiệu năng cao và công cụ tin sinh cho phép phát hiện các gen, cụm gen có chức năng mã hóa cho các PI, cho phép khai thác được các PI từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy được

Đến nay tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về hải miên, từ việc phân lập vi sinh vật trên hải miên, đến tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ nhóm

vi sinh vật này Tuy nhiên, vẫn còn chưa có nghiên cứu nào sử dụng công cụ metagenomics và công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới để phát hiện, sàng lọc các gen có hoạt tính sinh học, trong đó có hoạt tính ức chế protease và biểu hiện các gen

này trong hệ Escherichia coli và nấm men Pichia pastoris

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án với tên đề tài: “Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam”

Mục tiêu của đề tài luận án

Phát hiện và sàng lọc gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên thu nhận từ biển Miền Trung, Việt Nam

bằng phương pháp metagenomics Sau đó biểu hiện gen chọn lọc in vitro và xác

định hoạt tính

Nội dung nghiên cứu

1 Tách DNA của vi sinh vật liên kết với hải miên, xác định nồng độ DNA và độ tinh sạch, lựa chọn mẫu giải trình tự metagenomics

2 Phân tích dữ liệu metagenomics mẫu đã giải trình tự bằng các công cụ tin sinh học Đánh giá đa dạng sinh học của vi sinh vật liên kết với hải miên Từ CSDL metagenomics khai thác gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ức chế protease

3 Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease trong hệ biểu hiện

Escherichia coli và hệ biểu hiện nấm men Pichia pasroris

4 Đánh giá hoạt tính ức chế protease của protein tái tổ hợp

Những đóng góp mới của luận án

1 Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên của mẫu hải miên QT2 thu nhận tại vùng biển Quảng Trị (Miền Trung), Việt Nam Cơ sở dữ liệu thu được có ý nghĩa về mặt khoa học góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển Việt Nam và có tiềm năng khai thác nguồn gen trên để ứng dụng vào thực tiễn

2 Thu nhận được gen mới PI-QT mã hóa cho PIs và biểu hiện thành công ở E coli

và P pastoris Hoạt tính ức chế protease của protein biểu hiện đã được đánh giá

và kết quả thu được cho thấy protein PI-QT tái tổ hợp từ E coli có hoạt tính ức chế trypsin, ức chế ɑ-chymotrypsin và protein từ P pastoris thể hiện hoạt tính ức

chế trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên

1.1.1 Giới thiệu về hải miên

Hải miên là một ngành động vật đa bào nguyên thủy, có cấu trúc tế bào tách biệt và là nhóm động vật sống bám, tuy nhiên một số loài có khả năng vận động nhờ vào tế bào chất hay roi Hải miên có thể sống trong các loại môi trường khác nhau ở biển và trong tất cả các vùng khí hậu Từ các vùng cực và ôn đới, đến hệ sinh thái rạn san hô nhiệt đới và cận nhiệt đới Tính đến năm 2019, khoảng 9.125 loài hải miên nói chung được chấp nhận có trong danh sách của Cơ sở dữ liệu hải miên thế giới (Http://www.marinespecies.org) Vì vậy, các quần thể hải miên có sự khác biệt

về sự đa dạng, sự phong phú và mật độ Các loài hải miên được chia thành 4 lớp: Calcarea (hải miên đá vôi), Demospongia (demosponges), Hexactinellida (hải miên thủy tinh), và Homoscleromorpha Lớp lớn nhất là Demospongia, gồm khoảng 83,4

% tất cả các loài được biết Trong số các loài hải miên được biết đến, chỉ có khoảng

250 loài là sống trong nước ngọt (van Soest et al., 2012)

Hải miên có các hình dạng khác nhau, từ hình cầu, hình ống, hình bình hoặc

phân nhánh và kích thước cũng khác nhau, từ một vài milimet (hải miên Cliona celata), đến vài mét (hải miên Xestospongia muta) Phần lớn hải miên là động vật

ăn lọc, trừ các loài ăn thịt cư trú ở môi trường biển sâu nghèo dinh dưỡng (Lee et al., 2012) Hình dáng cơ thể chung của loài ăn lọc được chuyên môn hóa cho lọc

nước để lấy dinh dưỡng, hô hấp và bài tiết Phụ thuộc vào thiết kế của hệ thống lọc nước, hải miên được chia thành: (1) Asconoid, khi cơ thể hải miên có hình trụ rỗng,

bề mặt có các lỗ nhỏ; (2) Syconoid, khi bề mặt cơ thể hải miên có xen kẽ các túi chui vào trong và lồi ra ngoài, làm tăng tỉ lệ giữa diện tích và thể tích; hoặc (3) Leuconoid, khi cơ thể hải miên được tạo thành bởi các kênh dẫn nước bao gồm rất nhiều các khoang hình cầu nối với nhau bởi các ống giống như mao mạch (Hình 1.1

và 1.2) (Cavalcanti & Klautau., 2011; Webster & Thomas., 2016)

Hình 1.1 Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô

(Nguồn: Cavalcanti & Klautau., 2011)

(A): Asconoid; (B): Syconoid; (C): Leuconoid Mô liên kết: mesophyl (màu xám), lớp bề mặt (pinacoderm) và một lớp tế bào bên trong hình thành bởi các tế bào hình roi (choanoderm: màu đen)

Hình 1.2 Sơ đồ đại diện cho hải miên Asconoid

(Nguồn: Webster &Thomas., 2016)

Nước biển đi vào hải miên thông qua các lỗ nhỏ (ostia) vào lớp bề mặt (pinacoderm) Các tế bào roi choanocyte được sắp xếp thành vòng tròn lót hệ chuyển nước của hải miên và chịu trách nhiệm di chuyển nước qua hải miên cho đến khi thải ra qua các lỗ thoát nước (osculum) Vi sinh vật môi trường là các tế bào màu xanh, trong khi mật độ cộng đồng vi sinh vật liên kết có trong mô liên kết màu

đỏ

Cấu trúc cơ thể hải miên được giữ vững bởi mô liên kết và các loại tế bào khác nhau Các thành phần khung riêng biệt làm cho hải miên có cấu trúc toàn vẹn được cấu tạo từ các gai (spicules), canxi (calcareous) hoặc silic (siliceous), chitin hoặc sợi

collagen (collagenous spongin) (Hentschel et al., 2012)

Thành phần hóa học, sự khác biệt cấu trúc và kích thước gai là các đặc điểm hình thái quan trọng để phân loại hải miên Lớp Demospongia và Homoscleromorpha có sợi collagen hoặc các gai hoặc cả hai Lớp Homoscleromorpha cũng có đại diện không có gai nhưng có sợi collagen Lớp hải

miên đá vôi và hải miên thủy tinh có canxi hoặc silic, tương ứng (van Soest et al.,

2012)

Là loài ăn lọc, hải miên xử lý hàng trăm lít nước biển một ngày, vì vậy thức

ăn của chúng bao gồm VSV, sinh vật nhân chuẩn nhỏ, các hợp chất hữu cơ nhỏ

(de Goeij et al., 2013) Thức ăn được tế bào roi và lớp bề mặt của hải miên bắt giữ,

và chuyển đến các tế bào mô liên kết và tiêu hóa bởi tế bào khởi thủy (archaeocytes) Tiếp theo, các sản phẩm của thức ăn đã được tiêu hóa được phân bố đến các tế bào mô liên kết khác và cuối cùng các thứ không được tiêu hóa và sản phẩm bài tiết được trục xuất ra khỏi hải miên thông qua các kênh thở ra (exhalant)

hoặc mặt ngoài qua ngoại tế bào (exocytosis) (Maldonado et al., 2012)

Hải miên có sự đa dạng cao và là một thành phần quan trọng của quần thể sinh vật đáy biển, từ cửa sông, bờ biển đến biển sâu Nhóm này là một trong những nguồn các hợp chất hoạt tính sinh học từ biển nổi bật nhất, với khoảng 4851 hợp chất (năm 2014), đóng góp gần 30 % tổng số các hợp chất tự nhiên từ biển được phát hiện Trong 10 năm từ 2001 đến 2010, hơn 2400 các sản phẩm tự nhiên mới

được phát hiện từ 542 chi và 671 loài hải miên (Mehbub et al., 2014) Rất nhiều hợp

chất nhận được từ hải miên, gồm terpenoids, alkaloids, peptides, và polyketides

(Tung et al., 2009; Utkina & Denisenko., 2011; Kalinin et al., 2012) và chúng có

nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học, được sử dụng như các chất

kháng sinh, kháng ung thư, kháng virus, chống viêm và chống độc (Hirashima et al., 2010; Joseph & Sujatha., 2011; Li et al., 2013; Perdicaris et al., 2013) Do sự

tương đồng cao của một số hợp chất nhận được từ hải miên với các chất trao đổi thứ

VSV liên kết sản sinh Việc định vị các chất trao đổi thứ cấp trong các vi sinh vật

cộng sinh đã ủng hộ giả thiết này (Wilson et al., 2014)

1.1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên

Vi sinh vật liên kết hải miên được tìm thấy cả trong và ngoài tế bào hải miên, nằm trong mô liên kết hoặc trong lớp ngoài của hải miên Các vi khuẩn và cổ khuẩn gồm ngành Thaumarchaeota và các ngành vi khuẩn Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Proteobacteria (Alpha-, Beta-, Gamma-, và Delta-), Planctomycetes,

Verrucomicrobia, và Poribacteria (Hentschel et al., 2012) Từ nghiên cứu giải trình

tự thông lượng cao về quần xã VSV liên kết hải miên, số lượng ngành VSV trong

một hải miên tăng từ 23 ngành (Webster et al., 2010) lên đến 47 ngành (Reveillaud

et al., 2014) Theo số liệu mới nhất gần đây, hơn 60 ngành VSV đã tìm được từ các

mẫu hải miên biển theo phân loại của Silva và hơn 70 ngành theo phân loại của

Greengenes (Moitinho-Silva et al., 2017) Nhìn chung, VSV liên kết hải miên có

các loại tương tác khác nhau, có lợi hoặc có hại, từ việc là nguồn thức ăn, ký sinh,

gây bệnh, đến hỗ sinh và hội sinh (Hình 1.3) (Taylor et al., 2007; Lafi et al., 2009)

Vi khuẩn liên kết hải miên được chia ra thành các nhóm: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, cổ khuẩn oxi hóa ammonia Ba loại liên kết rộng rãi của vi khuẩn với hải miên gồm: (1) Lượng lớn các quần thể vi khuẩn đặc hiệu hải miên trong mô liên kết hải miên; (2) Các quần thể nhỏ vi khuẩn bên trong tế bào riêng biệt; (3) Các quần thể vi khuẩn không đặc hiệu giống với các quần thể trong môi

trường nước xung quanh (Mares et al., 2017)

VSV nhân chuẩn là một trong những thành phần quan trọng và đa dạng của các hệ sinh thái biển; tuy nhiên, chúng được đánh giá thấp so với các VSV khác Trong hải miên, chủ yếu là thấy nấm men Trái ngược với các cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên, các nghiên cứu về sự liên kết giữa nấm và hải miên vẫn còn

rất khiêm tốn (Rodríguez-Marconi et al., 2015; Naim et al., 2017) Các sinh vật

nhân chuẩn khác như "SAR" - một nhánh bao gồm Stramenopiles, Alveolates và

Rhizaria cũng đã được phát hiện trong hải miên (Burki el al., 2007; Webster et al.,

2004; Sipkema & Blanch., 2009) Tuy nhiên, cộng đồng các VSV nhân chuẩn

dường như không cộng sinh chặt chẽ với hải miên (Rodríguez-Marconi et al.,

2015)

Vai trò của vi sinh vật với hải miên

VSV liên kết hải miên có vai trò khác nhau đối với vật chủ (Hentschel et al., 2012; Taylor et al., 2007) Ví dụ, vật chủ hải miên có thể nhận được lợi ích từ VSV liên kết ở dạng chất trao đổi thứ cấp, sinh tổng hợp vitamin (Siegl et al., 2011), loại

bỏ chất thải trao đổi chất, ổn định khung hải miên hoặc ngay cả bảo vệ hải miên khỏi tia UV Các chất trao đổi thứ cấp của VSV có thể là những nhân tố quan trọng trong các cơ chế bảo vệ hóa học của hải miên chống lại các loại động vật ăn thịt hải miên, các nguồn bệnh hoặc động vật không cuống đáy cạnh tranh không gian (ví dụ san hô) (Pawlik., 2011)

Rất nhiều VSV liên kết hải miên tham gia vào các chu trình dinh dưỡng phức tạp giữa hải miên và môi trường Ví dụ, quá trình chuyển hóa quang tự dưỡng (photoautotrophic) và hóa tự dưỡng (chemoautotrophic) của cacbon vô cơ và hữu

cơ hòa tan như một phần của chu trình cacbon ở hải miên (Hentschel et al., 2012; Easson & Thacker., 2014; Maldonado et al., 2012) Một số VSV cộng sinh có thể

có chức năng quan trọng trong chu trình nitơ của hải miên, và tham gia vào quá trình chuyển hóa nitơ như cố định nitơ, nitrit hóa, oxy hóa yếm khí ammonia và

phản nitrit hóa (Maldonado et al., 2012; Fan et al., 2012) Rất nhiều loài hải miên nhiệt đới có vi khuẩn lam (cyanobacteria) liên kết (ví dụ: chi Synechococcus) (Bayer et al., 2014a) cố định nitơ thành ammonia cho hải miên Hải miên cũng

được lợi khi được cung cấp dinh dưỡng như phosphate hữu cơ hay glycerol Có đến

50 % nhu cầu năng lượng và 80 % quỹ cacbon của hải miên có thể được vi khuẩn

lam liên kết cung cấp (Taylor et al., 2007; Thoms & Schupp., 2007) Hải miên vùng lạnh, ôn đới và nhiệt đới (ví dụ: Phakellia ventilabrum, Geodia barretti, hoặc Inflatella pellicula), có các VSV liên kết như cổ khuẩn oxy hóa ammonia (ngành Thaumarchaeota với chi Nitrosopumilus hoặc Cenarchaeum), vi khuẩn oxy hóa

ammonia (ngành Planctomycetes, bộ Planctomycetales, lớp Betaproteobacteria với

chi Nitrosomonas), và vi khuẩn oxy hóa nitrite (ngành Nitrospirae, chi Nitrospira) (Radax et al., 2012)

Giảm nhiễm bệnh

(Prokaryotes)

chuẩn (Eukaryotes)

Vai trò

Vi khuẩn (Cyanobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria)

Hải miên

Tảo (algae)

Cố định nitơ, bảo vệ

Oxy hóa

ammonia

Tảo đơn bào

2 roi Dinoflagellate)

Tăng tốc độ sinh trưởng

Cỏ (Mangroves)

Hình 1.3.Vai trò của vi sinh vật với hải miên

(Nguồn: Lafi et al., 2009)

Sự phong phú, đa dạng và đặc hiệu của vi sinh vật liên kết hải miên

VSV liên kết hải miên thường cư trú ở vùng ngoại bào, nơi chúng tập trung xung quanh các tế bào roi, các vòng của các tế bào roi tạo thành hệ thống dẫn nước của hải miên (Hình 1.2) Dựa vào mật độ VSV liên kết, hải miên được chia thành loài có mật độ liên kết cao (high microbial abundance: HMA), có tới 109 tế bào/cm3

mô hải miên, và loài có mật độ VSV liên kết thấp (low microbial abundance: LMA) với 105-106 vi khuẩn/cm3 mô và vùng mô liên kết chỉ có rất ít VSV (Gloeckner et al., 2014)

Hải miên được biết liên kết với hơn 60 ngành VSV khác nhau (Webster et al., 2010; Schmitt et al., 2012; Reveillaud et al, 2014; Rodríguez-Marconiet al, 2015; Moitinho-Silva et al, 2017) Mức độ phong phú và đa dạng của các cộng

đồng liên kết khác nhau nhiều giữa các loài hải miên, từ một vài đơn vị phân loại

riêng biệt đến hàng trăm VSV cộng sinh khác nhau về mặt di truyền cho một mẫu

hải miên (Webster et al., 2010; Reveillaud et al, 2014; Lee et al., 2011) Những

khảo sát rộng rãi về phát sinh loài cho thấy những VSV liên kết hải miên chiếm ưu

thế nằm trong các đơn vị phân loại Gamma- và Alphaproteobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Nitrospirae, Cyanobacteria,Poribacteria và

Thaumarchaea (Hentschel et al., 2012)

Rất nhiều nghiên cứu cho thấy các cộng đồng VSV hải miên phần lớn đặc

hiệu vật chủ (Webster et al., 2010; Schmitt et al., 2012; Lee et al., 2011; Simister et al., 2012) và trong cùng loài, các cộng đồng VSV có xu hướng ổn định cao không

phụ thuộc vào địa sinh học và các điều kiện môi trường khác nhau (Webster &

Taylor., 2012; Erwin et al., 2012) Những cụm trình tự đặc hiệu hải miên này là các

nhánh đơn phát sinh (monophyletic clades), chứa ít nhất 3 trình tự có nguồn gốc từ

hải miên (Hentschel et al., 2002) Đáng chú ý là gần đây việc lập bản đồ phả hệ của

12 triệu trình tự 16S rRNA ngắn từ Dự án giải trình tự thông lượng cao của Tổng cục điều tra Quốc tế về VSV biển (International Census of Marine Microbes - ICoMM; Http://icomm.mbl.edu/) đối với 173 cụm trình tự đặc hiệu hải miên của

Simisterel al (2012) cho thấy, rất nhiều VSV đặc hiệu hải miên cũng có mặt trong các hệ sinh thái biển khác, nhưng với số lượng cực ít Webster et al (2010) sử dụng

giải trình tự thông lượng cao 16S rRNA để nghiên cứu đa dạng và sự phong phú của

quần xã VSV liên kết 3 loài hải miên (Ianthella basta, Ircinia ramosa và Rhopaloeides odorabile) từ biển Đông Bắc, Australia Kết quả nhận được cho thấy

đơn vị phân loại vi khuẩn có đa dạng ngành cao (n=23) trong 3 loài hải miên nghiên cứu Các trình tự nhận được rơi vào 33 cụm đặc hiệu hải miên, với hầu như một nửa

số cụm chỉ liên quan đến vật chủ Bằng cách ứng dụng 16S rRNA giải trình tự thông lượng cao cho 32 loài hải miên (˃ 90 mẫu vật) từ 8 địa điểm của vùng nhiệt

đới và ôn đới phân bố trên toàn cầu, Schmitt el al (2012) mô tả 3 trạng thái chung

của các cộng đồng VSV liên kết hải miên: (1) cộng đồng lõi nhỏ; (2) cộng đồng bất định và (3) nhóm lớn đặc hiệu hải miên (Hình 1.4)

Các cộng đồng VSV liên kết hải miên dường như tương đối ổn định và có thay đổi theo vật chủ hoặc đặc hiệu loài theo không gian, thời gian Những nghiên cứu luân chuyển loài của các cộng đồng VSV liên kết hải miên theo thời gian

(Hardoim & Costa., 2014), không gian (Reveillaud et al., 2014) cũng như các môi trường khác nhau (Cardenas et al., 2014) nhấn mạnh rằng các cấu trúc cộng đồng

VSV nói chung là đặc hiệu loài Ngược lại, sự khác biệt theo chiều dọc (độ sâu) và chiều ngang (địa sinh học) có vẻ chỉ có ảnh hưởng nhỏ lên các kiểu cộng đồng Nhưng ảnh hưởng của gradients môi trường tự nhiên cục bộ (ví dụ, độ sâu, mật độ dinh dưỡng, độ mặn hoặc gradients ánh sáng) hoặc tổ hợp các nhân tố lên quần xã VSV hải miên được nghiên cứu ít toàn diện hơn, chỉ có một vài nghiên cứu đặc biệt

tập trung vào các ảnh hưởng cụ thể này (Cardenas et al., 2014)

Hình 1.4 Ba trạng thái liên kết chung của VSV và hải miên

(Nguồn: Schmitt et al., 2012)

Quá trình thu nhận vi sinh vật của hải miên

Hải miên có thể sinh sản hữu tính (sản sinh chồi mầm) hoặc vô tính (bằng cách phân đoạn, mọc chồi), tất cả đều có thể truyền VSV cộng sinh hiệu quả từ hải miên bố mẹ cho thế hệ sau (Webster & Thomas., 2016) Việc truyền VSV từ thế hệ này sang thế hệ khác được gọi là “sự truyền dọc” và được cho là một cơ chế tiến hóa cổ đại để duy trì VSV cộng sinh trong hải miên HMA Kịch bản tiến hóa này được củng cố khi các cụm phát sinh loài VSV đặc hiệu hải miên được tìm thấy trong các loài hải miên có quan hệ họ hàng xa và cách xa về mặt địa lý Ngoài ra,

nhiều loài VSV đặc hiệu hải miên không tìm được trong nước biển (Hentschel et al., 2012; Simister et al., 2012)

Một phương thức khác để thu nhận vi sinh vật vào hải miên thông qua việc làm giàu đặc hiệu hoặc không đặc hiệu từ môi trường Phương thức này còn được gọi là “truyền ngang” Bằng cách “truyền ngang” quần xã VSV đặc hiệu hải miên được làm giàu một cách không đặc hiệu, ví dụ qua dinh dưỡng như thức ăn vi khuẩn

từ nước biển, hoặc ngẫu nhiên hấp thu qua vết thương vào biểu bì hải miên Về mặt

lý thuyết, làm giàu đặc hiệu VSV trong truyền ngang gồm một vài cơ chế: (1) hấp thụ chủ động VSV đặc hiệu thông qua việc nhận biết VSV cụ thể bởi hệ miễn dịch của hải miên; (2) làm giàu loại trừ (subtractive enrichment), là tích lũy VSV kháng

được sự thực bào (Taylor et al., 2007) Trong những trường hợp này, VSV môi

trường mà hải miên thu được cần phải cạnh tranh thắng các loài định cư tiềm năng

để tạo ra các cộng đồng liên kết hải miên ưu thế

Có khả năng nhất là cả 2 phương thức “truyền dọc” và “truyền ngang” đồng thời có trong hải miên Mỗi chiến lược đều có lợi ích và phí tổn nhất định Ví dụ, trong trường hợp “truyền dọc”, thế hệ con cháu chắc chắn nhận được VSV cộng sinh cần thiết cho vật chủ trực tiếp từ bố mẹ, nhưng cũng có thể làm giảm genome cộng sinh hoặc đánh mất khả năng trao đổi chất ở thế hệ tiếp theo, và điều này có thể có hại trong trường hợp hải miên bị phân tán đến môi trường không thuận lợi cho VSV liên kết Trong khi chọn lọc tự nhiên dường như có lợi cho vật chủ khi có được VSV cộng sinh từ môi trường tự nhiên, nhưng cũng đồng thời có hại bởi có

thể các nguồn bệnh có cơ hội nhiễm vào hải miên (Hentschel et al., 2012)

Hình 1.5 Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các cộng

đồng VSV liên kết hải miên

(Nguồn: Hentschel et al., 2012)

Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật liên kết hải miên

simplex (HSV) (Sagar et al., 2010)

Macrolactin A, phân lập từ vi khuẩn liên kết hải miên được xác định ức chế

mạnh virus Herpes simplex type I và type II với giá trị IC50 5,0 µg/mL và 8,3

µg/mL Từ hải miên biển Homophymia sp đã phân lập được chủng Pseudomonas

sp 1531-E7 sản sinh hợp chất kháng virus 2-undecyl-4-quinolone với nồng độ IC50

thử nghiệm in vitro chống HIV-1 là 10-3µg/mL Hợp chất sorbicillactone A được

phân lập từ nấm Penicillium chrysogenum liên kết với hải miên Ircinia fasciculata

và xác định cấu trúc bởi Bringmann et al (2003) Sorbicillactone A có hiệu quả bảo

vệ tế bào bị nhiễm HIV-1 của dòng tế bào người H9, và thử nghiệm in vitro cho

thấy hợp chất này làm giảm sự xuất hiện của HIV-1 protein trong tế bào H9 đến 70

% ở nồng độ 0,3 µg/mL (Bringmann et al., 2003) Chủng nấm Stachybotrys chartarum MXH-X73 liên kết hải miên sản sinh hợp chất stachybotrin D, có hoạt

tính kháng HIV-1 bằng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) hướng đích

Li et al (2014) đã nhận dạng 3 hợp chất kháng HIV-1 khác từ Stachybotrys chartarum: chartarutine B, G, và H, trong đó chartarutine B có IC50 cho HIV-1 thấp

nhất (1,81 µg/mL), tiếp theo là chartarutine G và H (2,05 µg/mL) (Sagar et al.,

2010)

Vi sinh vật liên kết hải miên cũng sản sinh các hợp chất kháng virus cúm

Zhao et al (2015) đã làm rõ 14 isoprenylated cyclohexanols được đặt tên là truncateols A-N từ nấm liên kết hải miên Truncatella angustata Truncateols C, E

và M thể hiện hoạt tính đối kháng H1N1, trong đó Truncateols M có tiềm năng nhất với nồng độ IC50 thấp hơn 6 lần so với đối chứng dương Oseltamivir

Một số ví dụ về VSV liên kết hải miên sản sinh hợp chất kháng virus được trình bày ở Phụ lục 1

Các hợp chất kháng khuẩn

Vi sinh vật phân lập từ hải miên biển thể hiện hoạt tính sinh học đối kháng phổ rộng các vi khuẩn gây bệnh (Phụ lục 2) Kháng sinh mới thiopeptide YM-

266183 và YM-266184 được phân lập từ Bacillus cereus QN03323 liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng vi khuẩn Gram (+) gây bệnh truyền nhiễm bệnh viện in vitro, trong đó có Staphylococcus aureus và Enterococcus faecium kháng

vancomycin với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 0,025 µg/mL Cả 2 hợp chất này

đều có khả năng ức chế Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) với MIC

là 0,39 µg/mL và 0,78 µg/mL, tương ứng Hợp chất kocurin được nhận dạng từ 3

loài Actinobacteria liên kết hải miên: Kocuria marina F-276,310; Kocuria palustris F-276,345, và Micrococcus yunnanensis F-256,446; là thành viên mới của họ

thiazolyl peptide, và là hợp chất đối kháng MRSA phân lập từ vi sinh vật liên kết

hải miên mạnh nhất cho đến nay (Martin et al., 2012; Pandey et al., 2014) Scheenemaan el al (2010) phân lập Streptomyces sp HB202 từ hải miên Haliclona simulans, dẫn đến việc phát hiện polyketide mayamycin Mayamycin thể hiện hoạt tính đối kháng S aureus, Staphylococcus epidermidis và MRSA với giá trị IC50 là

1,16 µg/mL; 0,14 µg/mL và 0,58 µg/mL, tương ứng ở thử nghiệm in vitro Những

báo cáo về các hợp chất phân lập từ vi sinh vật liên kết hải miên đối kháng vi khuẩn Gram (-) ít hơn so với đối kháng vi khuẩn Gram (+) Một ví dụ hợp chất ức chế vi

khuẩn Gram (-) Chlamydia trachomatis là naphthacene glycoside SF2446A2 phân lập từ Streptomyces sp RV15, trước đó nhận được từ hải miên Dysidea tupha Chlamydia trachomatis là vi khuẩn nội bào bắt buộc G (-) gây các bệnh truyền qua đường sinh dục và hiện không có phương pháp để diệt vi khuẩn này (Reimer et al.,

2015)

Pruksakorn et al.(2010) báo cáo 3 hợp chất kháng lao tiềm năng trichoderin

A, A1 và B từ nấm liên kết hải miên Trichoderma sp 05FI48, trong đó trichoderin

A là hợp chất mạnh nhất với giá trị MIC thấp nhất chống lại các chủng

Mycobacterium smegmatis, M bovis BCG, và M tuberculosis H37Rv Những

nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng hoạt tính sinh học của trichoderin A dựa trên khả năng ức chế tổng hợp adenosine triphosphate (ATP) của mycobacteria

Các hợp chất đối kháng nấm

Từ chủng Streptomyces sp liên kết hải miên Aplysina fistularis đã phân lập

được 2 hợp chất: saadamycin là một hợp chất mới và 1 hợp chất đã biết

5,7-dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin Thử nghiệm sinh học cho thấy cả 2 hợp

µg/mL và 15 µg/mL, tương ứng Ngoài ra, 2 hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính

sinh học chống lại một số nấm gây bệnh da như Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum, và Cryptococcus humicolus So với đối chứng dương (miconazole), giá trị MIC của saadamycin thấp hơn 3875 lần và của 5,7-dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin thấp hơn 200 lần

(Gendy & Bondkly., 2010) Hợp chất Lacton YM-202204 được phân lập từ chủng

nấm Phoma sp Q60596 liên kết hải miên có hiệu quả đối kháng C albicans (IC806,25 µg/mL), Cryptococcus neoformans (IC80 1,56 µg/mL), Saccharomyces cerevisiae (IC80 1,56 µg/mL) và Aspergillus fumigatus (IC80 12,5 µg/mL) (Nagai et al., 2002) YM-202204 có khả năng bao vây neo glycophosphatidylinositol (GPI

anchor), một cấu trúc quan trọng cho protein gắn vào trong các tế bào sinh vật nhân chuẩn (eukaryotes) và một trong những đích để phát triển thuốc đối kháng nấm

Hoạt tính chống lại protozoa (Antiprotozoan activity)

Manzamine A, đầu tiên được tách chiết từ hải miên Haliclona sp., và sau đó

từ một số loài hải miên khác Hợp chất này được chứng minh có hoạt tính kháng

khối u, kháng nấm, kháng khuẩn, chống sốt rét và kháng HIV (Eyese et al., 2011; Ranwan et al., 2012) Manzamine A sau đó được tách chiết từ Micromonospora sp M42 liên kết hải miên biển Indonesia Acanthostrongylophora ingens (Hill et al., 2005) Pimentel-Elardo et al (2010) nhận dạng 3 hợp chất cyclic depsipeptide

valinomycin, indolocarbazole alkaloid staurosporine và butenolide từ chủng

Streptomyces sp liên kết hải miên Valinomycin và staurosporine ức chế sinh trưởng của L major với giá trị IC50 0,12 µg/mL và 1,24 µg/mL, tương ứng; ức chế Trypanosoma brucei với IC50 0,0036 µg/mL và 0,0051 µg/mL, tương ứng và

butenolide có IC50 là 7,92 µg/mL

1.2 Sơ lược về metagenomics

Khái niệm về metagenomics

Metagenomics nổi lên như một vũ khí mạnh mẽ được sử dụng để nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bất kể chúng có thể nuôi cấy được hay không trong điều kiện phòng thí nghiệm và cũng cung cấp cơ hội để mô tả sự đa dạng vi sinh vật trong môi trường vì rất nhiều loài hiện chưa nuôi cấy được Metagenomics dựa vào việc tách DNA từ một cộng đồng và như vậy tất cả genome của vi sinh vật trong cộng

đồng đều được gộp lại Metagenomics cũng được mô tả như genomic cộng đồng và môi trường bao gồm phân tích genome của vi sinh vật bằng cách tách trực tiếp DNA và tạo dòng từ một tập hợp các vi sinh vật trong phần lớn môi trường trên trái đất như nước và đất Phương pháp metagenomics dựa trên tách nucleic acid trực tiếp từ mẫu môi trường được chứng minh là công cụ mạnh để so sánh và khám phá

hệ sinh thái (Nazir., 2016; Ghosh et al., 2019)

Cách tiếp cận metagenomics

Phương pháp metagenomics cho phép đánh giá genome vi sinh vật có trong môi trường Metagenomics bao gồm tách dòng trực tiếp DNA môi trường vào các thư viện dòng lớn để thuận tiện cho việc phân tích gen và các trình tự trong các thư viện này Kỹ thuật metagenomics bao gồm những bước cơ bản sau: (1) Thu nhận mẫu và tách chiết acid nucleic; (2) thiết lập thư viện metagenome hoặc giải trình tự DNA metagenome; (3) sàng lọc gen dựa vào ngân hàng gen hoặc phân lập gen dựa vào số liệu giải trình tự gen Việc phân lập gen từ metagenome được thực hiện tương tự như các nghiên cứu phân lập gen trong một hệ gen (genome) (Thi

Huyen Do et al., 2014)

Hiện nay sau khi tách chiết nucleic acid người ta ít tiến hành lập thư viện gen mà tiến hành giải trình tự Sau đó dựa trên số liệu giải trình tự kết hợp với các công cụ tin sinh để tìm kiếm, khai thác gen hay vùng gen mã hóa cho các protein

quan tâm trước khi đưa vào thực nghiệm (Nguyễn Minh Giang et al., 2015)

Một số mục tiêu của metagenomics

Mục tiêu của metagenomics là để tìm hiểu thành phần và hoạt động của tập đoàn vi sinh vật phức tạp trong các mẫu môi trường thông qua phân tích trình tự

DNA của chúng (George et al., 2010) Mặt khác, khi có số liệu về đa hệ gen, chúng

ta có thể thực hiện hàng loạt dự án phân lập gen tùy theo mục đích nghiên cứu Ví

dụ như phân lập những gen tham gia vào chuyển hóa các protein, vitamin, chất

béo…từ hệ vi sinh vật nghiên cứu (Nguyễn Minh Giang et al., 2015)

Một số mục tiêu cụ thể của metagenomics là: Xác định tính đa dạng phân loài sử dụng 16S rRNA, các mẫu gen đa dạng và cây phân loài của vi sinh vật

(Sharma et al., 2012) Số liệu đó được sử dụng để theo dõi và dự đoán các biến đổi

môi trường; xác định gen hay operon mã hóa cho các enzyme cần thiết, có đặc tính mới (như cellulases, chitinases, lipases, thuốc kháng sinh, các sản phẩm tự nhiên

khác…) Những enzyme này có thể được ứng dụng trong công nghiệp hoặc dược phẩm; xác định biến thể hoặc đa dạng trong gen cho các enzyme quan trọng và thiết

kế tối ưu các điều kiện xúc tác của enzyme; xác định các cơ chế điều hòa và truyền tín hiệu của các gen quan tâm; xác định vi khuẩn hoặc các trình tự plasmid, đánh giá ảnh hưởng của chúng đến cấu trúc và sự đa dạng của các cộng đồng vi sinh vật Xác định các sự kiện chuyển gen tiềm năng hay các gen/operon cho việc thu nhận dinh dưỡng, trung tâm trao đổi chất trung gian… Từ đó, cung cấp những hiểu biết

về tương tác giữa các sinh vật trong chuỗi và lưới thức ăn, hoặc khám phá nền tảng thành công của vi sinh vật trong môi trường của chúng; xác định con đường trao đổi chất để có thể thiết kế môi trường nuôi cấy tăng trưởng cho các loài vi sinh vật chưa

thể nuôi cấy được (Nguyễn Minh Giang et al., 2015)

Sử dụng công cụ tin sinh khai thác metagenome

Việc chuẩn bị mẫu metagenome để đọc trình tự rất quan trọng, nếu mẫu không đủ sạch sẽ gây nhiễu khi đưa vào máy đọc tự động có thể gây ra sai lệch trong kết quả Toàn bộ DNA tách chiết được từ mẫu môi trường đủ tiêu chuẩn sẽ được đưa vào máy đọc trình tự tự động Sau khi đọc, máy sẽ xác lập được số lượng lớn các trình tự đọc ngắn (short – reads) Công việc tiếp theo là sắp dãy (assembly) các short – reads này để thu được bộ gen hoàn chỉnh Tuy nhiên, trong quá trình xác lập trình tự DNA của các kĩ thuật có khả năng sinh lỗi cho từng nucleotide với tỉ lệ khoảng từ 1 % đến 2 % trên chiều dài của short - reads Các nucleotide lỗi phải được sửa chữa để phục vụ cho việc sắp dãy lại thành một bộ gen hoàn chỉnh Ở bước này, một số phần mềm như SOAPdenovo được sử dụng để lắp ráp lại bộ gen

từ các short - reads (hay “reads”) thu được trong quá trình giải trình tự gen Phần mềm này gồm có 6 module được dùng để 1) sửa chữa các lỗi đọc trình tự; sau đó 2)

xây dựng đồ thị de Bruijn để 3) lắp ghép các contig, rồi 4) kiểm tra lại kết quả lắp

ráp bằng cách so sánh các contig với các trình tự đọc được dùng để tạo ra nó; tiếp đến 5) tối ưu độ bao phủ và chiều dài các contig để 6) thu nhỏ các vùng gen không đọc được trình tự Bằng công cụ như SOAPaligner các trình tự sau đó được đem so sánh lại (map) với các contig của chính nó để tìm ra bao nhiêu trình tự được sử dụng để tạo contig PE (pair-end reads) là các trình tự mà cả hai đầu của nó đều tương đồng với contig và mối quan hệ hai đầu này là chính xác, cho

độ tin cậy cao Các trình tự mà chỉ có một đầu của nó tương đồng với contig hoặc mối quan hệ hai đầu không chính xác thì được gọi là SE (single-end reads) Sau khi có các contig từ metageneome, bước đầu tiên nên làm là kiểm tra chất

lượng giải trình tự, ví dụ bằng phần mềm FastQC (Qian Zhou et al., 2014); tiếp theo

loại bỏ những đoạn trình tự có chất lượng thấp và độ dài ngắn (Trimmomatics,…); lắp ráp các tập dữ liệu với độ sâu đọc không đồng đều (IBDA-UD (Iterative De Bruijn Graph De Novo Assembler), ….); Sau đó sử dụng các phần mềm dự đoán gen như: Prodigal, MetaGene Annotator (MGA), FragGeneScan, Glimmer-MG, GeneMark… để dự đoán tất cả các khung đọc mở (ORF – open reading frame) từ các contig Dựa trên các ORF đã được xác định, sẽ tiếp tục dự đoán bằng cách so sánh ORF với hàng loạt các dữ liệu khác nhau như: Dữ liệu NCBI NR, MetaHIT, Silva, GreenGene để phân tích độ đa dạng loài; dữ liệu KEGG, MetaCys để phân loại gen vào các con đường chuyển hóa khác nhau; dữ liệu CAZy, GO, KEGG, eggNOG, Pfam, Prk, COG, FIGfam để sắp xếp gen vào các nhóm chức năng Nếu nghiên cứu tập trung vào DNA và protein của metagenome thì công cụ BLASTall (Basic Local Alignment Search Tool: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blasti) được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học BLAST sử dụng thuật toán tìm kiếm cục bộ heuristic và do đó có thể phát hiện ra mối liên hệ giữa các trình tự có những sự tương đồng riêng biệt Có rất nhiều loại tìm kiếm khác nhau trên BLAST phục vụ cho những mục đích khác nhau: 1) BLASTp tìm kiếm tất cả các trình tự protein tương đồng với trình tự protein cần phân tích trong cơ sở dữ liệu protein; 2) BLASTn tìm kiếm tất cả các trình tự nucleotide tương đồng với trình tự DNA cần phân tích trong cơ sở dữ liệu DNA; 3) TBLASTn tìm trình tự protein tương đồng trong cơ sở dữ liệu DNA bằng cách dịch mỗi trình tự DNA ra tất cả 6 khung đọc mở; 4) BLASTx tìm trình tự nucleotide tương đồng trong cơ sở dữ liệu protein bằng cách dịch trình tự nucleotide cần phân tích sang tất cả 6 khung đọc mở Sau khi có được các khung đọc mở cần quan tâm, sử dụng công cụ tìm kiếm trình tự amino acid tương đồng trong BLASTp; 5) Công cụ Blastpby được sử dụng trong so sánh

các ORF với cơ sở dữ liệu NR để tiến hành phân loài Cấp độ phân loài của mỗi

ORF được xác định bằng thuật toán dựa trên cơ sở LCA (Least Common Ancestors) được sử dụng trong phần mềm MEGAN (MetaGenomic ANalyser) Thuật toán

LCA sẽ xếp trình tự vào nhóm phân loại mà cấp độ phân loại của nhóm phân loại

đó phản ánh được mức độ bảo thủ của trình tự gen Căn cứ vào các ORF đã được đối chiếu với chức năng và các con đường chuyển hóa để lựa chọn các gen hay nhóm quan tâm Trình tự các axit amin được dịch từ các ORF sẽ được sử dụng để

dự đoán cụ thể về cấu trúc và các đặc tính của protein (trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tác enzyme, khả năng chịu nhiệt, khả năng chịu kiềm…),… bằng phần mềm Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), Expasy (http://www.expasy.org)… Hoặc có thể xây dựng mô hình chuyển hóa các chất giữa các sinh vật trong môi trường bằng các công cụ Pathway Tools, COBRA, Model SEED ((Nguyễn Minh

Giang et al., 2015)

Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích quần xã vi sinh vật trong rất nhiều môi trường như đại dương, đất, dải san hô, xác cá voi, suối nước nóng và các quần xã vi sinh vật liên kết với nhiều cơ thể sống khác nhau như người, mối, rệp,

giun (Kennedy et al., 2011)

Ứng dụng của metagenomics

Metagenomics cung cấp một nguồn tài nguyên không giới hạn cho sự phát triển các gen mới, enzyme, các sản phẩm tự nhiên, các hợp chất hoạt tính sinh học

và các chế phẩm sinh học có thể ảnh hưởng đáng kể đến các ứng dụng công nghiệp

và công nghệ sinh học (Nazir., 2016)

Cellulases, lipases, xylanases, amylases, proteases, và rất nhiều enzyme có tầm quan trọng công nghiệp được sản xuất thông qua metagenomics (Nazir., 2016) Ngoài ra, một số nhà khoa học cũng cho rằng có thể khai thác các chất kháng sinh mới nhờ ứng dụng kỹ thuật metagenomics Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật biển như chất hoạt động bề mặt (Biosurfactants) là chất thay thế tiềm năng cho chất hoạt động bề mặt tổng hợp (Surfactants) trong một vài quá trình công nghiệp như bôi trơn, làm ướt, làm mềm, cố định thuốc nhuộm, làm nhũ tương, ổn định độ phân tán, tạo bọt, ngăn ngừa tạo bọt cũng như trong công nghiệp thực phẩm, y sinh và dược phẩm, sửa chữa sinh học các điểm bị ô nhiễm bởi các chất hữu cơ hoặc vô cơ (Nazir., 2016) Metagenomics được sử dụng để tạo thư viện DNA của các mẫu đất/nước bị ô nhiễm dầu, sau đó sàng lọc các dòng sinh chất hoạt động bề mặt

(Cynthia et al., 2013) Isabel et al (2014) báo cáo tiềm năng của phương pháp

metagenomics để nhận dạng và làm sáng tỏ các gen mới trong các môi trường ít được nghiên cứu và cho thấy triển vọng rộng lớn hơn vào quá trình phân hủy hydrocacbon trong các bể chứa dầu Gần đây các nhà nghiên cứu đã nhận dạng các gen và các con đường trao đổi chất của chúng liên quan đến phân hủy phenol và các hợp chất vòng thơm khác trong các mẫu bùn từ một hệ thống xử lý nước thải nhà máy lọc dầu, sử dụng phương pháp metagenomics để nắm bắt sự đa dạng chức năng

to lớn trong cộng đồng vi sinh vật

1.3 Chất ức chế protease (PIs)

1.3.1 Sơ lược protease

Protease là một trong những họ enzyme phổ biến và đa dạng nhất được biết đến và có mặt trong tất cả các sinh vật sống, bao gồm virus, vi khuẩn, cổ khuẩn, nấm, thực vật và động vật Protease đóng nhiều vai trò quan trọng trong các quá trình của tế bào, bao gồm đông máu, tiêu hóa thức ăn, tăng trưởng và di chuyển tế bào, sắp xếp mô, phát triển hình thái, viêm, tăng trưởng khối u và di căn, đông máu, kích hoạt zymogen, giải phóng hormone và các peptide có hoạt tính dược lý từ các protein tiền thân và vận chuyển các protein bài tiết qua màng (Sapna., 2013)

Về phân loại protease được chia nhỏ thành hai nhóm chính, tức là exopeptidase và endopeptidase, tùy thuộc vào vị trí tác dụng của chúng Nói chung, protease đặc trưng là endopeptidase hoặc exopeptidase Endopeptidase tách liên kết trong protein và thường rất đặc hiệu cho các chuỗi axit amin cụ thể Exopeptidase tách một axit amin duy nhất từ đầu cuối của protein và ít đặc hiệu hơn đối với axit amin đang bị phân cắt Exopeptidase là những loại tách ra từ C-terminator (carboxypeptidase), N-terminus (aminopeptidase) hoặc cả hai termini (dipeptidase) Protease cũng được phân loại theo loại xúc tác của chúng thành peptidase aspartic, cysteine, glutamic, serine và threonine, dựa trên dư lượng axit amin chức năng có tại vị trí hoạt động Serine protease tạo thành lớp phong phú nhất bao gồm khoảng 1/3 tổng số protease, được công nhận là yếu tố quan trọng trong việc kiểm soát nhiều con đường liên quan đến đông máu, tiêu sợi huyết, chuyển mô liên kết, cân bằng nội môi, thụ tinh và phản ứng viêm, tiếp theo là peptidase metallico-, cysteine,

aspartic và threonine (Ana et al., 2010; Sabotic & Kos., 2012)

Cơ chế phân giải protein: Protease cũng được đặc trưng bởi cơ chế hoạt động của chúng; đó là các axit amin có liên quan đến vị trí xúc tác của enzyme Vị trí xúc tác chứa các axit amin đóng vai trò trực tiếp trong quá trình thủy phân liên kết peptide Quá trình này đòi hỏi một nucleophile để bắt đầu phản ứng, có thể là chuỗi bên axit amin hoạt động hoặc phân tử nước Trong các giai đoạn sau của quá trình phân giải protein, hai phần của protein bị thủy phân được giải phóng và vị trí hoạt động của protease trở lại trạng thái ban đầu, sẵn sàng liên kết một chất nền khác để phân giải protein Các protease thường được nhóm thành bốn nhóm chính dựa trên

vị trí hoạt động của chúng: serine protease, cysteine protease (thiol), aspartic protease và metallicoprotease Serine protease và cysteine (thiol) có một axit amin trong vị trí hoạt động tấn công nucleophilic ban đầu, trong khi aspartic protease và metallicoprotease kích hoạt một phân tử nước để thực hiện tấn công nucleophilic ban đầu (Ritchie., 2019)

1.3.2 Chất ức chế protease và phân loại

Chất ức chế protease (PI) là phân tử ngăn chặn hoạt động của protease và thường hoạt động trên protease có cơ chế hoạt động tương tự Các chất ức chế protease (PIs) có thể ở dạng protein, peptide hoặc các phân tử nhỏ (Hình 1.6) Các chất ức chế protease trong tự nhiên thường là protein hoặc peptide

Hình 1.6 Ba chất ức chế protease có sẵn trên thị trường PMSF là một phân tử nhỏ;

E-64 là một phân tử giống như peptide; Aprotinin là một protein nhỏ

(Nguồn: Labome.com; Sigmaaldrich.com)

Phân loại chất ức chế protease

Các chất ức chế protease có thể được phân loại theo nguồn gốc (vi sinh vật, nấm, thực vật, động vật), theo cấu trúc của chúng (sơ cấp và ba chiều), hoặc theo protease mà chúng ức chế (rộng, đặc hiệu) và cơ chế phản ứng (cạnh tranh, không - cạnh tranh) PIs thường được phân loại theo nhóm protease mà chúng ức chế (thuốc

ức chế protease aspartic, cysteine hoặc serine) Ngày nay, các chất ức chế protease thường được phân loại thành hai nhóm chính (1) Các chất ức chế phân tử nhỏ và (2) Các chất ức chế protein (Sapna., 2013)

Chất ức chế phân tử nhỏ

Các chất ức chế phân tử nhỏ (SMIs) bao gồm các hợp chất tự nhiên như pepstatin, bestatin và amastatin, và một số chất ức chế tổng hợp được tạo ra trong phòng thí nghiệm Vì vậy, rất khó để cung cấp bất kỳ phân loại tự nhiên, không giống như các peptidase và chất ức chế protein và một loạt các định danh mới đã được mô tả Theo đó, mỗi SMI được gắn một mã định danh bao gồm một chữ J ban đầu theo sau là một số có năm chữ số Ví dụ, pepstatin là J00095 và ethylene diamine tetraacetic acid là J00149 (Rawlings & Barrett, 2011)

SMI là chất ức chế không phải là protein, bao gồm peptide và chất ức chế tổng hợp thường có nguồn gốc vi sinh vật và là peptide trọng lượng phân tử thấp Nhiều loại trong số chúng đã được tổng hợp trong phòng thí nghiệm; tuy nhiên, những loại xuất hiện tự nhiên đã được tách chiết từ vi khuẩn và nấm (Rawlings., 2010) Các chất ức chế phân tử nhỏ đã được chứng minh là hữu ích và được sử dụng là thuốc thử trong phòng thí nghiệm như retropepsin của virus HIV; thrombin, điều hòa cầm máu và chống đông máu; dipeptidyl-peptidase IV, có liên quan đến bệnh tiểu đường loại 2; γ-secretase, có liên quan đến bệnh Alzheimer; renin và angiotensin kiểm soát huyết áp… (Sapna., 2013)

Trong số các chất ức chế phân tử nhỏ có nguồn gốc vi khuẩn và nấm, peptidyl aldehydes như leupeptin và antipain, hexapeptide pepstatin và epoxysuccinyl peptide E-64 và các chất tương tự của chúng đã được nghiên cứu như là chất chống ung thư Chất ức chế đặc hiệu thiol-protease, E-64, ban đầu được

phân lập từ Aspergillus japonicus đã được nghiên cứu rộng rãi như một tác nhân

chống ung thư tiềm năng trong nuôi cấy tế bào và mô hình động vật Sau đó, các dẫn xuất của E-64 tiếp tục được ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh khác (Frlan & Gobec, 2006)

Một vài ví dụ về việc sử dụng các chất ức chế phân tử nhỏ của vi sinh vật như các tác nhân chống côn trùng gây hại cây trồng, ví dụ: Các chất ức chế

aminopeptidase của Actinomycetes amastatin và bestatin chống lại bọ bột đỏ (Tribolium castaneum) (Oppert et al., 2011), thuốc ức chế protease aspartic A từ Actinomycetes chống lại đậu đũa (Callosobulusus) Thuốc ức chế protease serine và cysteine leupeptin từ Actinomycetes chống lại giun bắp phương Tây (Diabrotica virgifera) và E-64, thuốc ức chế protease cysteine từ Aspergillus japonicus chống lại bọ cánh cứng Colorado hại khoai tây (Leptinotarsa decemlineata) (Sapna.,

2013)

Trong quá trình thu hồi protein tái tổ hợp, các chất ức chế phân tử nhỏ có thể được thêm vào môi trường nuôi cấy để ức chế hoạt động phân giải protein của sinh

vật chủ thường thuộc loại serine và aspartic (Sabotic et al., 2012) Một số vi khuẩn

tổng hợp peptide và dẫn xuất của peptide là chất ức chế peptidase hiệu quả, thường

là những chất ảnh hưởng đến peptidase từ các họ khác nhau Được biết đến nhiều nhất trong số này là leupeptin (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-D, L-argininaldehyd),

ban đầu được phân lập từ Streptomyces và ức chế nhiều loại serine, cysteine và

threonine trypsin, PACE4 calpain, clostripain và hoạt động giống như trypsin của

proteasome Các chất ức chế phân tử nhỏ khác được sản xuất bởi Actinomycetes bao

gồm bestatin và amastatin (chất ức chế aminopeptidase); tyrostatin, chất ức chế sedolisin của họ S53 (Sapna., 2013)

Chất ức chế protein (PPIs)

Các chất ức chế protein của protease có mặt khắp nơi và đã được phân lập từ nhiều loài thực vật, động vật và vi sinh vật Trước đây, PPIs được nhóm theo loại protease mà chúng ức chế Sau đó, chúng được phân loại là chất ức chế cysteine, serine, aspartic và metallicoprotease Ngoại trừ macroglobulin huyết tương, ức chế protease của tất cả các lớp, các chất ức chế protein riêng lẻ chỉ ức chế các protease thuộc một lớp cơ học duy nhất Trong số các chất ức chế này, nghiên cứu rộng rãi nhất là các chất ức chế protease serine Các chất ức chế protein của protease aspartic tương đối hiếm gặp và chỉ được tìm thấy ở một vài địa điểm chuyên biệt (Sapna.,

2013) Rawllings et al (2004) đã phân loại PPIs theo sự tương đồng trong trình tự

axit amin Phân loại này có 48 họ PI được nhóm lại trong 26 loại siêu họ (superfamilies) có liên quan trên cơ sở cấu trúc của chúng Một số họ tiêu biểu được tóm tắt trong Hình 1.7

Việc phân loại các chất ức chế peptidase protein liên tục được sửa đổi bởi cơ

sở dữ liệu MEROPS và hiện tại các chất ức chế được nhóm thành 71 họ dựa trên so sánh các trình tự protein bao gồm 17451 trình tự ức chế Những họ này có thể được nhóm lại thành 39 nhóm dựa trên sự so sánh về cấu trúc bậc ba Họ và nhóm của một số chất ức chế peptidase protein được mô tả trong Phụ lục 3 Mỗi nhóm, họ và chất ức chế peptidase đặc trưng hóa học được cung cấp một định danh duy nhất Một định danh họ bao gồm chữ cái “I” theo sau là một số và số nhận dạng nhóm hai chữ cái bắt đầu bằng chữ “I” hoặc chữ “J” (Rawlings., 2010)

Phân bố các họ giữa các sinh vật: Hơn 634 loài ức chế peptidase protein được phân phối trên khắp các sinh vật từ virus đến động vật Trong số 71 họ, có 27

họ có nguồn gốc vi sinh vật và nấm (Bảng 3.2, Phụ lục 3) Trong đó, 7 họchỉ có trong vi khuẩn (I10, I16, I36, I38, I57, I58, I69) và 5 họchỉ có trong nấm (I34, I48, I66, I79, I85) (Rawlings., 2010)

Hình 1.7 Một vài họ PPI quan trọng

(Nguồn: Shamsi et al., 2016)

Chất ức chế protease

Serpin Kunitz Cystatin Bowman

Birk

Metallocarboxyl peptide Aspartyl

Mol wt:

8 kDa;

Ức chế:

Trypsin, hymotrypsin, elastase

Mol wt:

4.2 kDa;

Ức chế:

Carboxy- -peptidase

Mol wt:

27 kDa;

Ức chế: Trypsin, chymotrypsin, cathepsin D

Siêu họ Serpin: là siêu họ lớn nhất và phổ biến nhất của PPIs Serpin có nguồn gốc thực vật đã được tách chiết từ hạt ngũ cốc (Habib & Khalid., 2007) Serpin có vai trò kiểm soát chính của các quá trình như đông máu và viêm, và trở

thành mục tiêu của nhiều nghiên cứu y học (Khunaizi et al., 2002) Một số loại

trong họ serpin ức chế mạnh trypsin và chymotrypsin, ngoài ra, chúng cũng ức chế thrombin, kallikrein, yếu tố VIIa và yếu tố Xa Vài loại serpin khác ức chế chymotrypsin, cathepsin G và có axit glutamic, lysine hoặc arginine tại vị trí P1

(Roberts et al., 2003)

Họ Kunitz: Các thành viên của họ này chủ yếu ức chế các protease serine,

nhưng cũng có thể ức chế các protease khác (Heibges el al., 2003) Các chất ức chế

Kunits thường có khối lượng phân tử 18 - 22 kDa; có hai cầu nối disulfide và một vị trí phản ứng (Habib & Khalid., 2007) Các thành viên của họ này bao gồm một chuỗi peptide nhỏ chứa từ 28 đến 30 axit amin có phân tử khối 3.0 - 3.5 kDa (Oliva

& Sampaio., 2008) Hiểu biết về cấu trúc của các chất ức chế họ Kunitz rất hữu ích

để nghiên cứu các cơ chế đằng sau tính đặc hiệu của chúng đối với các khối u, các yếu tố đông máu và viêm, và vùng chịu trách nhiệm cho hoạt động sinh học của nó (Oliva & Sampaio., 2009)

Siêu họ Cystatin: bao gồm 4 họ ức chế hoạt động của cysteine và thiol proteinase (Habib & Khalid., 2007) PI Thiol đóng một vai trò quan trọng trong kiểm soát tất cả các mô sống bởi chúng có khả năng ức chế cathepsin và nhiều đặc

tính sinh học khác (Qadeer et al., 2014)

Họ ức chế Bowman Birk (BBI): Họ này được đặt theo tên của nhà khoa học

đã phát hiện và mô tả chất ức chế đầu tiên của họ này từ đậu tương, (hai nhà khoa học D.E Bowman và Y Birk) Các chất ức chế thuộc họ này có trọng lượng phân

tử khoảng 8 kDa và có vị trí hoạt động đầu tiên thường đặc hiệu cho elastase,

trypsin và chymotrypsin (Qi et al., 2005) BBI đã được báo cáo là làm giảm sự tăng sinh của các tế bào ung thư vú MCF7 (Palavalli et al., 2012)

Họ ức chế peptidase metallicoparboxy: Chúng là những chất ức chế peptide nhỏ có trọng lượng phân tử khoảng 4.2 kDa Chúng ức chế cạnh tranh mạnh đối với phổ rộng của carboxypeptidase từ vi khuẩn và động vật, nhưng không thể ức chế

carboxypeptidase serine từ nấm men và thực vật Chúng được tìm thấy trong các mô của củ khoai tây trong quá trình phát triển, cùng với các chất ức chế khoai tây I và II

của serine PI (Shamshi et al., 2016)

Họ Aspartyl PI: Các thành viên của họ này đã được tìm thấy trong hoa

hướng dương, lúa mạch, thảo quả (Cynara cardunculus) và củ khoai tây Chất ức

chế cathepsin D, có trọng lượng phân tử khoảng 27 kDa và ức chế các protease serine, ví dụ như trypsin và chymotrypsin cùng với aspartyl protease cathepsin D, nhưng không ức chế pepsin, cathepsin E và rennin, tất cả đều là aspartyl protease Pepstatin, một chất ức chế mạnh mẽ protease aspartyl đã được chứng minh là ức chế

sự phân giải protein của enzyme amylase và lipase của bọ cánh cứng Colorado

(Lptinotarsa decemlineata) (Shamshi et al., 2016)

1.3.3 Cơ chế hoạt động của PIs

Chất ức chế protease có thể hoạt động theo nhiều cách khác nhau để ức chế hoạt động của protease Các chất ức chế này có thể được phân loại theo loại protease mà chúng ức chế và cơ chế mà chúng ức chế các enzyme đó Hiểu rõ cơ chế ức chế protease của PIs sẽ giúp cho quá trình phát triển các thuốc ức chế protease như một chiến lược điều trị

Cơ chế ức chế protease của PIs có thể được khái quát làm 2 phương thức là

ức chế thuận nghịch (Reversible inhibition) và ức chế bất thuận nghịch (Irreversible inhibitor) (Sapna , 2013; Đỗ Quý Hai., 2013)

Các chất ức chế thuận nghịch bao gồm các chất ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitors), ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I (Non-competitive inhibitor) và ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II (Uncompetitive inhibitor) (Mai Xuân Lương., 2005)

Ức chế cạnh tranh: Phần lớn các chất ức chế protease có tính cạnh tranh Trong trường hợp ức chế cạnh tranh là cơ chất và chất ức chế đều tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzyme, chất ức chế thay thế chỗ của cơ chất ở enzyme Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất ức chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất ức chế cao thì lại có tác dụng ức chế hoàn toàn (Hình 1.8a) Cơ chế ức chế này được nghiên cứu kỹ lưỡng ở họ serine protease

inhibitors Các chất ức chế canonical (khóa và chìa khóa) liên kết với các mục tiêu của chúng theo cách giống như cơ chất để tạo thành phức hợp gần như “Michaelis”,

một nguyên tắc được sử dụng bởi các chất ức chế protease serine (Sermilvan et al.,

2001) Những chất ức chế này bao gồm các chất ức chế họ Kazal, Kunitz và Bowman-Birk (Sapna., 2013) Một ví dụ về chất ức chế cạnh tranh là aprotinin, ức chế nhiều loại protease thuộc họ protease serine Các chất ức chế cạnh tranh thường

có cấu trúc tương tự như trạng thái chuyển tiếp của cơ chất tự nhiên Trạng thái chuyển tiếp của cơ chất là trạng thái trung gian của cấu trúc thường liên kết chặt chẽ nhất với enzyme Do đó, các hợp chất bắt chước cấu trúc này liên kết với enzyme có

độ bền cao hơn cơ chất (ở trạng thái ban đầu), và do đó phản ứng enzyme thông thường không thể tiến hành Một ví dụ về loại tương tự trạng thái chuyển tiếp này là LP-130 (Hình 1.8b), một chất ức chế protease HIV-1

Hình 1.8 Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitors)

(a): Mô tả cơ chế, trong đó S (cơ chất); I (chất ức chế); E (Enzyme)

(Nguồn: Đỗ Quý Hai., 2013)

(b): Cấu trúc tinh thể của protease HIV-1 (màu xanh lá cây) liên kết với LP-130, một chất ức chế trạng thái chuyển tiếp (1ODY) (màu đỏ) và dư lượng của aspartic

protease (màu vàng)

(Nguồn: Ritchie., 2019)

Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I (Non-competitive inhibitor): Các chất ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I liên kết với protease có ái lực tương tự, bất kể sự có mặt của cơ chất liên kết Các phân tử này ức chế hoạt động protease thông qua cơ

chế allosteric BBI, một chất ức chế trypsin từ đậu nành (Prasad et al., 2010) và