Phát triển phương pháp đánh giá tương tác với protein thụ thể không dùng chất phóng xạ phục vụ chiến lược sàng lọc các hợp chất cơ hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu việt nam

Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến các cán bộ của Phòng Sinh học thụ thể và Phát triển thuốc thuộc PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein; Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Bộ Y tế đã ủ

HỌC TỪNGUỔN DƯỢC LIỆU VIỆT NAM

5 C N H oàng H ả i Y ế n , Trường Đ ạ i học K h o a học T ự n hiên , Đ H Q G H N

6 H V C H N g u yễ n A n h Lư ơ n g , Trường Đ ạ i học K h o a học T ự nhiên , Đ H Q G H N

L Ờ I C Ả M Ơ N

Đề tài được hoàn thành với sự tài trợ của Bộ Khoa học - Công nghệ và Đại học

Q uốc gia Hà N ội, thuộc diện Đề tài thường xuyên giao cho PTNTĐ Công nghệ Enzym và Prơtein, mã số: KLEPT.09.05 Nhàn dịp này, tập thể cán bộ thực hiện đề tài xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới sự ủng hộ và giúp đỡ của Bộ Khoa học - Công nghệ và của Đại học Q uốc gia Hà N ội Trong quá trình thực hiện đề tài, các cán bộ của các Vụ và Ban chức nâng thuộc Bộ Khoa học - Công nghệ và của Đại học Q uốc gia Hà N ội đã luôn tạo

m ọi điều kiện thuận lợi để chúng tôi có thể hoàn thành những công việc được giao.

Chúng tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến lãnh đạo Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, các Phòng ban chức năng của nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học, Ban giám đốc PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein đã luôn tạo điều kiện và ủng hộ để đề tài được triển khai thuận lợi.

Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến các cán bộ của Phòng Sinh học thụ thể và Phát triển thuốc thuộc PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein; Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu (Bộ Y tế) đã ủng hộ và hợp tác với chúng tôi về chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài này.

T h a y m ặ t n h ó m n g h iê n cứ u

P G S T S Đ in h Đ o à n L o n g

T Ó M T Ắ T

Đ Ể T À I N G H I Ê N C Ứ U K H O A H Ọ C

Tên Đề tài: “PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TƯƠNG TÁC VÓI PROTEIN THỤ THÊ KHÔNG DÙNG CHẤT PHÓNG XẠ PHỤC vụ CHIÊN Lược SÀNG LỌC CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ NGUỒN Dược LIỆU VIỆT NAM”

Cơ quan chủ quản: Bộ Khoa học và Công nghệ

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện với các mục tiêu chính như sau: (1) Thu thập được các mẫu sinh phẩm từ

động vật thí nghiệm để từ đó làm giàu các protein thụ thể đặc thù phục vụ cho các phép thử sinh học, (2) Xây dựng được quy trình đánh giá tương tác giữa các phối tử (ligand, chất gắn thụ thể đặc hiệu) với các protein thụ thể đặc thù có vai ữò dược lý quan trọng theo nguyên tắc không dùng các đồng vị phóng xạ, (3) Bước đầu đánh giá tương tác giữa một số “thuốc thử” (hợp chất, dịch chiết, phân đoạn) thu được từ các bài thuốc y học cổ truyền trong nước với các protein thụ thể qua phương pháp đã được thiết lập; từng bước xây dựng mô hình sử dụng các protein thụ thể đích phục vụ chiến lược sàng lọc nhanh và nghiên cứu dược lý của các hợp chất

và sản phẩm có hoạt tính sinh học tiém nãng bắt nguồn từ tài nguyên dược liệu Việt Nam

- Các nội dụng nghiên cứu cùa đề tài gồm có: (1) Thu thập các mẫu sinh phẩm từ động vật thí

nghiộm để từ đó làm giàu được các protein thụ thể đặc thù phục vụ cho các phép thử sinh học; (2) Xây dựng quy trình đánh giá tương tác giữa các phối tử với các protein thụ thể đặc thù có vai trò dược lý quan trọng không dùng các đồng vị phóng xạ, đảm bảo các kết quả phân tích tương đương với các phương pháp hiên đang được sử dụng rộng rãi dùng các chất gắn được đánh dấu đồng vị phóng xạ; (3) Thu thập một số bài thuốc y học cổ truyền ờ Viột Nam có công dụng tương ứng với các giá trị dược học đã biết của các protein thụ thể được lựa chọn trong nghiên cứu; (4) Bước đầu tiến hành phân tích và xác định được các thành phần (dịch chiết, phân đoạn, hợp chất) có hoạt tính sinh học từ một sô' dược liệu cổ ưuyền Việt Nam qua mô hình đánh giá tương tác với các protein thụ thể có vai trò dược lý quan trọng

Kết quả khoa học: (1) Đã xây dựng và hoàn thiện được các quy trình làm giàu protein thụ thể

angiotensin II (All) từ mô gan và các thụ thể toll-Iike các loại 2, 3, 4 (TLR2-4) và dectin-1 từ đại thực bào có nguồn gốc tùy xương (BMDM) ờ chuột nhắt dòng Swiss phục vụ cho các phép thử sinh học; (2) đã xây dựng được các quy trình đánh giá tương tác giữa các phối tử (ligand) đặc hiệu với các thụ thể All, TLR2-4 và dectin-1 không dùng đồng vị phóng xạ bằng cách sử dụng các phép đo liên kết thụ thể (receptor binding assays) dựa trên nguyên lý ELISA cạnh tranh (với thụ thể All) và phép đo chức năng thụ thể (receptor functional assay) thông qua theo dõi sự xuất hiện cùa sản phẩm ưuyển tin đối với các thụ thể TLR2-4 và dectin-1; (3) Dựa trên kinh nghiệm vể y

học cổ truyền, thu thập được một sô' cây thuốc Việt Nam, gồm cò mân trâu (Eleusine indica L., Graerth), hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.), hòe (Sophora japonica L.) và Tầm gửi (Taxillus

philippensis Cham.&Schlecht., Ban.) làm "thuốc thử" cho các thí nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học có tiềm nãng tác động lên các thụ thể All (đối với cả 4 loài cây), TLR2-4 và dectin-1 (đối với

cỏ mần trầu); (4) Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học dịch chiết thô (methanol) của 4 loài cây thuổc lên thụ thể All bằng phương pháp liên kết cạnh tranh với phối tử đặc hiệu, và của cỏ mần trẩu lèn các thụ thể TLR2-4 và dectin-1 bằng phép đo biểu hiện chức năng của thụ thể

Cơ quan chủ trì đề tài: PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein (KLEPT), Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

PGS.TS Đinh Đoàn Long

TS Trịnh Tất Cường, TS Phạm Thanh Huyền, ThS Trần Thị Thùy Anh, CN Hoàng Hải Yến, HVCH Nguyễn Anh Lương

Các kết luận chính thu được từ đề tài gổm có :

1) Đã xây dựng được phép đo liên kết thụ thể - phới tử trên mô hình thụ thê angiotensin II (All) sử dụng phối tử đánh dấu fluorescein (F-AT II) theo nguyên lý ELISA cạnh tranh để thay thế cho phép đo dùng đổng vị phóng xạ nhằm đánh giá khả năng tương tác liên kết giữa dịch chiết dược liệu và thụ thể

2) Trên mô hình phép đo liên kết thụ thể All theo nguyên lý ELISA cạnh tranh, dịch chiết

methanol cò mần trầu (Eleusine indica Geartn.) và hạ khô thảo (Prunella vulgaris L.) biểu

hiện khả nãng chẹn thụ thể tương đối mạnh với các giá trị IC50 được xác định quanh 1,0 ng/ml Điều này cho thấy thụ thể angiotensin II có thể là đích tác động chính của các thành phần có trong địch chiết của hai loài cây dược liệu này Khả năng chẹn thụ thể angiotensin II của các

dịch chiết hòe (Sophora japonica L.) và tầm gửi (TaxiHus philippensis Cham & Schl.) tương

đổi yếu với ICịQ khoảng 37 |!g/ml (với hòe), và 419 ng/ml (với tầm gửi) Điều này cho thấy thụ thể All có lẽ không là đích tác động chính cùa các dược liệu này

3) Đã thiết lập được phép đo tương tác giữa dịch chiết dược liệu và thụ thể liên quan đến đáp ứng viêm bằng phép thử chức năng trên các thụ thể thuộc họ toll-like (TLR-2,-3,-4) và dectin-1 có

ở đại thực bào nguồn gốc tủy xương (BMDM) được nuôi cấy invitro trên cơ sờ theo dõi quá trình sinh sản phẩm của đáp ứng viêm (các cytokine) được kích ứng bời các phối tử đặc hiệu

4) Khi BMDM được kích ứng bằng P-glucan, dịch chiết methanol cỏ mần trầu (Eleusine indica

Geartn.) làm giảm rõ rệt các cytokine tiển viêm TNF-a, IL-6 và IL-12p40 Điều này chứng tỏ tác động kháng viêm của dịch chiết cỏ mần trầu có thể liên quan đến thụ thể dectin-1 và cây thuốc này đáng được quan tâm về khả năng kháng viêm quá mẫn gây ra bởi nấm Khi BMDM được kích úng bởi các phối tử lipoprotein vi khuẩn (BLP), axit polyinosinic:polycytidylic (poly I:Q

và lipopolysaccharide (LPS), dịch chiết cỏ mần ừầu không làm giảm các cytokine tiển viêm và kháng viêm Điều này chúng tỏ nhiều khả năng các thụ thể TLR2 -4 không phải đích tác động trục tiếp liên quan đến tính kháng viêm của cò mần trầu

Kết quả nghiên cứu của đề tài đồng thời khẳng định các mô hình đánh giá tương tác với các protein thụ thể không sử dụng chất phóng xạ phục vụ định hướng phát hiộn và phát triển thuốc từ tài nguyên dược liệu Việt Nam

- Kết quả ứng dụng: Hoàn thiộn 03 quy trình công nghệ: 01 quy trình xử lý mẫu và làm giàu

protein thụ thể, 01 qui trình đánh giá tương tác giữa phối tử đặc hiệu với protein thụ thể không dùng đổng vị phóng xạ; 01 qui ưình sàng iọc các sản phẩm có hoạt tính sinh học tiẻm năng từ dược liệu Việt Nam qua hoạt tính ức chế cạnh tranh giũa phối tử đặc hiệu với protein thụ thể

- Kết quả đào tạo: Đào tạo được 02 Thạc sỹ Sinh học (HVCH Nguyễn cẩm Dương, tốt nghiệp năm 2010; HVCH Nguyễn Anh Lương, tốt nghiộp năm 2011); Đào tạo được 05 c ử nhân (SV Nguyễn Anh Lương, K50 Sinh học, tốt nghiệp năm 2009; s v Phạm Thị Hồng Nhung, K10 CN'fN Sinh học, tốt nghiệp năm 2010; sv Đặng Ngọc Hoa, K51 Sinh học, tốt nghiôp năm 2011;

s v Trần Hoang Mai, K52B CNSH, tốt nghiệp năm 2012; sv Nguyễn Thị Quyên, K12 CNTN

Sinh học, tốt nghiệp năm 2012)

- Kết quả công bố: Đã công bô' 03 bài báo: 01 bài báo toàn văn tiếng Anh tại Hội nghị Khoa học

Quổc tế (Indochina Pharma VII, Bangkok, Thái Lan, 14-16 / 12 / 2011), 02 bài báo tiếng Anh trôn Tạp chí Khoa học (ĐHQGHN), 01 bài báo tiếng Việt trên Tạp chí Dược liệu (Bộ Y tế)

P T N T Đ C ông nghệ C hủ nhiệm đề tài

E nzym và Protein (K L E PT)

PG S.T S Đ inh Đ oàn Long

T R Ư Ờ N G Đ ẠI H Ọ C K H O A HỌC T ự N H IÊ N

S U M M A R Y

S C I E N T I F I C R E S E A R C H P R O J E C T

P ro je c t title: “ D e v e lo p m e n t o f n o n -ra d io a c tiv e re c e p to r assay s to w a rd s h ig h -th ro u g h p u t

screening of bioactive compounds derived from Vietnamese medicinal materials”

Code: KLEPT.09.05

Managing institution: Ministry of Science and Technology

Implementing institution: Key Laboratory for Enzvme and Protein Technology (KLEPT) Hanoi University of Science

Key implementer: Dinh Doan Long (PhD)

Participating investigators: Trinh Tat Cuong (PhD), Pham Thanh Huyen (PhD), Tran Thi Thuy Anh

(MSc), Hoang Hai Yen (BSc), Nguyen Anh Luong (MSc student)Duration: 36 months (since May 2009 through May 2012)

Grant budget: 400.000.000 V N D

Objectives and maj or activities

Objectives: (1) Selection of suitable tissue samples from experimental animals from which receptors

of interest for bioassays can be enriched, (2) Development of protocols for non-radioactive ligand- receptor binding assays, (3) Preliminary assessment of using non-radioactive ligand-receptor binding assays for determination of the interaction between the Vietnamese medicinal plant extracts with their potential targeted receptors

Major activities: (1) Collection of tissue samples from mice (Swiss strain) for isolation and/or

enrichment of the receptor of interest, including angiotensin II receptor, toll-1 ike-2,-3,-4 receptors and dectin-1 receptors; (2) Studies on optimization of protocols for non-radioactive receptor binding and functional assays so as to be comparable to the conventional methods; (3) Collection of medicinal plants whose modes of action might be involved in the receptors of interest from different localities in

Vietnam, including “co man trau” (Eleusine indica L., Graerth), “ha kho thao” (Prunella vulgaris L.),

“hoe” (Sophora japonica L.) and “tam gui” (Taxillus philippensis Cham.&Schlecht., Ban.) (4)

Preliminary studies on interaction between receptors of interest with Vietnamese herbal products based on nonradioactive receptor binding and functional assays

Results

- Scientific results: Research data resulted in the following major conclusion

1) A nonradioactive assay for angiontensin II (All) receptor binding studies based on principles

o f competitive ELISA comparable to the conventional radioligand binding method for the purpose of assessment of the receptor - medicinal plant extract interaction were successfully established, optimized and validated

2) Competitive ELISA-based receptor binding studies with methanolic extracts of different

accessions of various Vietnamese medicinal plants revealed that E indica and p vulgaris

exhibited relatively potent binding inhibition on All receptor Thus, this receptor subtype might be involved in the mode of action of these two medicinal plants Whereas, the weak and

hardlv inhibition of the extracts obtained from s japonica and T philippensis suggest the All

receptors are probably not involved in the pharmacological actions of them

3) A nonradioactive assay for toll-like receptors, including TLR2-4, and dectin-1 receptor based

on principles of receptor functional assays by using cultured bone-marrow derived macrophages (BMDMs) for the purpose of the receptor - medicinal plant extract interaction were successfully established and validated

4) Competitive receptor functional studies with methanolic extracts of different accessions of

Vietnamese medicinal plant E indica revealed that the extracts of this plant inhibited potently

the production of inflammatory cytokines, including TNF-a, IL-6 and IL-12p40, through the

V

dectin-1 pathway, whereas they hardy exerted any effects on the other investigated toll-like pathways Thus, dectin-1 receptors might be one of the major targets for the anti-inflammatory activity well-known for this medicinal plant Whereas, toll-like receptors, including TLR2-4,

are probably not direct targets of E indica extracts.

- Applied results' 03 standard operating procedures (SOP1-3): SOP1 - procedure for tissue specific

membrane preparation for receptor binding assay, SOP2 - procedure for nonradioligand receptor binding assay, SOP3 - procedure for assessment of interaction between receptors with medicinal plant extracts

- Training results' 02 Masters of Science in Biology (Ms Nguyen Cam Duong, 2010; and Mr Nguyen Arth Luong, 2011), 05 Bachelors in Biology (three graduates from the Honor Program for Bachelor of Science in Biology, i.e Ms Pham Thi Hong Nhung - 2010, Ms Nguyen Thi Quyen -

2012; three graduates from the Regular Program for Bachelor of Science in Biology, including Mr

Nguyen Anh Luong - 2009, Ms Dang Ngoc Hoa - 2011, Ms Tran Hoang Mai - 2012).

- Publications 03 papers One full paper in English published in the Proceedings of the 7Ih Indochina

Conference of Pharmaceutical Science (held in December 2011 in Bangkok, Thailand), 02 papers in English published in the VNU Journal of Science (in 2011), 01 paper in Vietnamese published in the Vietnam’s Journal of Medicinal Material Research (in 2010)

Key implementer

Dinh Doan Long

M ự c L Ụ C

Trang

Clnương 1 TỔ N G Q U A N T À I L IỆ U 3

1.1 Lược sừ phát triển của dược lý học và vai trò của các thụ thể trong nghiên cứu phát hiện và phát triển thuốc * 3

1.2 Chiến lược sàng lọc các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học dựa trên phân tích tương tác thuốc - thụ thể (drug - receptor interaction) 6

1.3 vể các phương pháp nghiên cứu tương tác thuốc - thụ th ể 8

1.3.1 Lý thuyết động học tương tác thụ thể - phối t ử 8

1.3.2 Các phương pháp phân tích tương tác thụ thể - phối t ừ 11

1.3.2.1 Các phép thừ liên kết thụ thể - phối từ dùng đồng vị phóng x ạ 12

1.3.2.2 Sơ lược về các phép thử liên kết thụ thể - phối tử không dùng đổng vị phóng xạ 13 1.3.2.3 Sử dụng phối tử đánh dấu huỳnh quang fluorescein trong các phép thử tương tác thụ thể - phối t ử 14

1.4 úng dụng các phưcmg pháp phân tích tương tác thụ thể - phối từ trong sàng lọc dược chất từ dược liệu thực v ậ t 16

1.5 Sơ lược vể các thụ thể được lựa chọn ưong nghiên c ứ u 17

1.5.1 Thụ thể angiotensin II (A ll) 17

1.5.2 Về các thụ thể nhận diện mầm bệnh trong đáp ứng viêm nhóm Toll-like (TLR) và Dectin-1 7 19

1.5.2.1 Vế các thụ thể Toll-like (TLR) 19

1.5.2.2 V ể thụ thể D e c tin -1 22

1.6 Sơ lược vể các loài cây thuốc được nghiên cứ u 23

1.6.1 Cỏ mần trầu (Eleusine indica L., Graerth.) 23

1.6.2 Hạ khô thảo (Prunella vulgaris L ) 24

1.6.3 Hòe (Sophora japonica L ) 25

1.6.4 Tầm gửi Ợaxillus philippensis (Scham.&SchIecht.)Ban) 25

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 26

2.1 Các thí nghiệm thiết lập phép thử liên kết thụ thể angiotensin II (All) theo nguyên lý Elisa cạnh tranh và thử nghiêm với dược liệu Việt N am 26

2.1.1 Vật liệu sinh h ọ c 26

2.1.2 Hóa chất và thiết b ị 27

2.1.3 Phương pháp nghiên c ứ u 27

2.1.3.1 Chuẩn bị dịch chiết methanol dược liệ u 27

2.1.3.2 Thu thụ thể m àng 28

2.1.3.3 Đánh giá khả nãng liên kết thụ thể của phối tử đặc h iệu 28

2.1.3.4 Phương pháp ELISA 29

2.1.3.5 Đánh giá khả năng cạnh tranh liên kết với thụ thể cùa dịch chiết dược liệu với phối từ đặc hiệu (ELISA cạnh tranh) 29

2.1.3.6 Phương pháp xử lý số liệ u 30

2.2 Đánh giá khả năng kháng viêm cùa cỏ mần trầu (Eleusine indica L., Gaertn) thông qua phép thử chức năng cùa một số thụ thể thuộc họ Toll-like và Dectin-1 30

2.2.1 Vật liệu sinh h ọ c 31

2.2.2 Hóa chất và thiết b ị 31

M ĩ ờ đ ã u 1

vii

2.2.2.1 Hóa c h ấ t 3]

2.2.2.2 Chuẩn bị hóa c h ấ t 32

2.2.2.3 Dụng cụ và thiết b ị 32

2.2.3 Phương pháp nghiên c ứ u 32

2.2.3.1 Thử độc tính dịch chiết cỏ mần trầu trên dòng đại thực bào nuôi c ấ y 32

2.2.3.2 Đánh giá khả năng tiết các cytokine cùa đại thực bào được kích thích bằng các phối tử đặc h iệ u 33

2.2.3.3 Phương pháp xử lý số liệ u 34

Clnucmg 3 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u VẢ THẢO LUẬN 35

3.1 Các thí nghiêm thiết lập phép thử liên kết thụ thể angiotensin II (All) theo nguyên lý Elisa cạnh tranh và thừ nghiêm với dược liệu Viột N am 35

3.1.1 Tối ưu điểu kiện ELISA 35

3.1.2 Xác định ảnh hường cùa nồng độ màng và thời gian ù 37

3.1.3 Thí nghiệm xác định Kd của phối tử đặc hiệu F-ATII (thí nghiêm bão hòa thụ th ể ) 39

3.1.4 Phản ứng cạnh ưanh với F-ATII cùa một sô' phối tử đã biết (thí nghiêm đối chứng dương) 41 3.1.5 Đánh giá khả nàng tương tác thụ thể angiotensin II của một sớ dịch chiết dược liệu Việt Nam bằng phương pháp ELISA cạnh tranh 43

3.1.5.1 Hoạt tính cạnh tranh của các dịch chiết cỏ mần trầ u 43

3.1.5.2 Hoạt tính cạnh tranh của các dịch chiết hạ khô th ảo 44

3.1.5.3 Hoạt tính cạnh tranh của các dịch chiết hòe và tầm gửi 44

3.1.6 Thảo lu ậ n 46

3.2 ỉ)ánh giá khả năng kháng viêm của cỏ mấn trầu (Eleusine indica L., Gaertn) thông qua phép thử chức năng của một số thụ thể thuộc họ Toll-Like và Dectin-1 50

3.2.1 Ảnh hường cùa dịch chiết methanol cỏ mẩn trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) tới khả năng sống cùa đại thực b à o 50

3.2.2 Đánh giá khả năng tiết các cytokine của đại thực bào nuôi cấy được kích thích bằng các phối từ đặc hiộu thụ thể 51

3.2.3 Ảnh hưởng cùa dịch chiết cò mần trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến khả nãng tiết các cytokine sau khi các thụ thể được hoạt hóa bời các phối tử đạc h iệ u 53

3.2.3.1 Tác động đến thụ thể TLR -2 53

3.2.3.2 Tác động đến thụ thể TLR -3 54

3.2.3.3 Tác động đến thụ thể TLR -4 55

3.2.3.4 Tác động đến thụ thể dectin-1 56

3.2.4 Thảo lu ậ n 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

Kết l u ậ n 61

Kiến n g h ị 62

Tài liệu tham khảo 63

Phụ lụ c 68

Phụ lục ỉ Các quy trình kỹ thuật (SOP)

Phụ lục 2 Bàn sao các công trình công bố liên quan đến đề tài

Phụ lục 3 Bản sao minh chứng các sản phẩm đào tạo của đề tài

Phụ lục 4 Bàng đối chiếu sản phẩm đã đạt được cùa đề tài với Thuyết minh để tài

Phu lục 5 Bàn sao minh chứng vể thanh, quyết toán đề tài

Phụ lục 6 Bàn sao biên bản họp hội đổng nghiệm thu cấp cơ sờ

phụ lục 7 'ITiuyẽt minh đề tài được phẽ duyệt

BẢNG CÁ C K Ý H IỆ U VÀ T Ừ V IẾ T T Ắ T

Từ viết tết Nghĩa tiếng Việt _ Nghĩa tiếng Anh _

HPLC Sắc ký lỏng cao áp / Sắc ký hiệu năng cao High pressure liquid chromatography

FRET Truyén năng lượng cộng huớng huỳnh quang Fluorescence resonance energy transfer

ELISA Phép thử hấp thụ miễn dịch gắn kết enzym Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

RP-HPLC Sắc ký lỏng cao áp đảo pha Reverse-phase high pressure liquid chromatographyTRF Huỳnh quang phân giải thời gian Time-resolved fluorescence

PDGF-R Thụ thể yếu tố tăng sinh nguổn gốc tiểu cáu Platelet derived growth factor receptor

F-ATII Angiotensin II gắn fluorescein Fluorescein-labeled angiotensin II

F-ESA Albumin huyết thành bò gắn fluorescein Fluorescein-labeled bovine serum albumine

NMDA Axit /V-methyl-D-aspartic /V-methyl-D-aspartate

GP3R Thụ thể kết cặp G-protein G-protein coupled receptor

ACE Enzym chuyển hóa angiotensin Angiotensin converting enzyme

AR3 Thuốc chẹn thụ thể angiotensin II Angiotensin II receptor blocker

PRR Thụ thể nhận biết mẩm bệnh Pathogen-associated/ pattern recognition receptor

PoM:C Axit polyinosinic: polycytidylic Polyinosinic:polycytidylic acid

TNF Yếu tố hoại tửu Tumor necrosis factor

FD/ Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hòa Kỳ Food and Drug Administration

HTS Sàng lọc hiệu năng cao High-throughput screening

Số vị trí liên kết tối đa Maximum binding sites

K, Hằng số ức chế Inhibitory constant

ICM Nồng độ ức chế 50% 50% inhibitory concentration

BMfM Đai thực bào nguồn gốc tủy xương Bone marrow derived macrophage _

ix

T rang

Bảng 2 Các thụ thê’ trong nghiên cứu và các phối tử đặc hiệu tương ứng với con đường truyển tin của chúng 23

Bảng 3 Các mảu dược liệu được thu thập và sử dụng trong nghiên cứ u 27

Bảng 4 Giá trị Kd của phối tử angiotensin II (A TII) liên kết vào thụ thể angiotensin II (A ll) thu được từ các nghiôn cứu khác n h a u 36

Bảng 5 Các giá trị K, cùa AT II và losartan liên kết cạnh tranh trẻn thụ thể angiotensin II thu được từ các nghiẽn cứu khác nhau 38

Bảng 6 Các giá trị IQo và K, cùa các dịch chiết dược liệu được sử dụng trong nghiên cứ u 42

Bảng 7 Sự tiết các cytokine cùa đại thực bào (BMDM) chuột nuôi cấy invitro được kích thích bởi các phối tử đâc hiẽu với các thụ thể toll-like (TLR-2,-3, -4) và Dectin-1 51

DAN H M Ụ C CÁC H ÌN H Hình 1 Mô hình minh họa về sự khác biệt giữa các chế phẩm thuốc tân dược và các thuốc có nguồn gốc tự nhiên chưa tiêu chuẩn h ó a 6

Hình 2 Mô hình giản lược vể nguyên lý phân tích tương tác “ thuốc-thụ thể” trong sàng lọc thuốc mới từ dược liệu 7 Hình 3 Mô hình sàng lọc thuốc từ dược liêu sử dụng protein Ihụ th ể 7

Hình 4 Thí nghiệm bão hòa thụ th ể 10

Hình 5 Nguyên lý cùa phép đo liên kết thụ thể - phối tử 13

Hình 6 Nguyên lý cùa phản ứng ELISA cạnh tranh 15

Hình 7 Tóm tắt các con đường truyển tin qua thụ thể A T , 18

Hình 8 (^ u ưúc, sự phân bô'và phối tử cùa các thụ thể toll-like (T L R ) 20

Hình 9 Quá trình truyển tin của các thụ thể TLR-2, -3, và - 4 21

Hình 10 Quá ưình truyền tin của thụ thể dectin-1 22

Hình 11 C3Ỏ mần ưẩu - Eleusine indica (L.) Graerth 23

Hình 12 Hạ khô thảo - P ru n ella vulgaris L 24

ỉ lình 13 Hòe - Sophora ja p o n ic a L 25

Hình 14 Táin gừi - Taxillus philippensis (Cham.&Schlecht.) Ban 25

Hình 15 Ảnh hưởng của nồng độ kháng nguyên F-BSA và kháng thể kháng fluorescein đến khả nâng xác định tín hiệu O D ^, qua phép thử E L IS A 31

Hình 16 Ảnh hường cùa nổng độ F-ATII đến sự hình thành màu cùa sản phẩm phản ứng ELISA cạnh tranh 32

Hình 17 Ảnh hường của nổng độ màng đến phép đo ELISA cạnh tranh 34

Hình 18 Ảnh hường cùa thời gian ù đến khả nấng liên kết thụ thể cùa F -A T II 34

Hình 19 Thí nghiêm bão hòa thụ thé giữa phối tử F-ATU và thụ thé angiotensin II ( A ll) 36

Hình 20 Sự cạnh tranh angiotensin n (hình trái) và losartan (hình phải) với phối tử F-AT n trong liên kết với thụ thể angiotensin II (A ll) 37

Hình 21 úc chế liên kết F -A T II với thụ thể angiotensin II bời dịch chiết cỏ mấn trầu (E leusine indica Gaertn.) 39

Hình 22 ú t chế liên kết F-A T II với thụ thể angiotensin II bời dịch chiết hạ khô thảo (Prunella vulgaris) 40

Hình 23 ú t chế liên kết F -A T II với thụ thể angiotensin II bời dịch chiết hòe (Sophora japonica) 41

Hình 24 úc chế liên kết F -A T II với thụ thể angiotensin II bởi dịch chiết tầm gửi cTaxillus philippensis) 41

Hình 25 Ành hường cùa dịch chiết methanol cỏ mần trầu (Eleusine indica) tới khả nâng sổng của các đại thực bào có nguồn gốc tùy xương (BMDM) nuỏi cấy invitro 50

Hình 26 Sự tiết các cytokine của đại thực bào nguổn gốc tùy xương (BMDM) chuột nuôi cấy invitro được kích thích bời các phối tử đặc hiệu các thụ thể toll-like (TLR-2,-3, -4) và Dectin-1 52

Hình 27 Ảnh hưởng của dịch chiết methanol cỏ mần trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến sự tiết các cytokine cùa đại thực bào nguồn gốc tủy xương (BMDM) qua con đường hoạt hóa thụ thể toll-like 2 (TLR-2) 54

Hình 28 Ành hường của dịch chiết methanol cỏ mần trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến sự tiết các cytokine cùa đại thực bào nguổn gốc tùy xương (BMDM) qua con đường hoạt hóa thụ thể toll-like 3 (TLR-3) 55

Hình 29 Ành hường cùa dịch chiết methanol cỏ mán trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến sự tiết các cytokine cùa đại thực bào nguổn gốc tùy xương (BMDM) qua con đường hoạt hóa thụ thể toll-like 4 (TLR-4) 56 Hình ;0 Ảnh hưcmg cùa dịch chiết methanol cỏ mán trầu (Eleusine indica (L.) Gaerth) đến sự tiết các cytokine

D A N H M Ụ C C Á C B Ả N G

MỞ ĐẦU

Là m ộ t q u ố c g ia c ó m ột n gu ồn tài n g u y ên đ ộ n g , thực vật p h on g phú và

đa d ạ n g , từ bao đời nay, c ộ n g đ ô n g các dân tộ c V iệ t nam c ó nhiều kinh

n g h iệm tron g v iệ c sử dụng các loài câ y c o n sẵn c ó trong tự nhiên để trị bệnh

và b ôi b ổ sứ c k h o ẻ T h eo điều tra củ a V iệ n D ư ợ c L iệu (B ộ Y tế), nước ta có gân 4 0 0 0 loài th ự c vật, 2 2 loài tảo, trên 4 0 0 loài đ ộ n g vật và hơn 70 loại

k h o á n g v ậ t đ ư ợ c dù n g làm thuốc trong y h ọ c c ổ truyền H iện nay, v iệ c tiêu chu ẩn h o á các sản phẩm dư ợ c c ó n gu ồn g ố c tự n h iên (g ọ i ch u n g là “dư ợc liệu ” tro n g b áo c á o này) đan g là m ột đ òi h ỏi cấp bách trong quá trình hiện đại hoá, c ô n g n g h iệp h oá ngàn h dư ợc k ết hợp g iữ a đ ô n g y v à tây y ở nư ớc ta

tử th u ôc b iể u h iện tác đ ộ n g lên c ơ thể là qua sự tư ơ n g tác của chú n g vớ i các protein đ íc h này Đ â y cũ n g là nền tản g c ơ bản để ch ú n g ta g iả i thích v ề nhiều quá trình sin h lý v à d ư ợ c lý ờ cấp phân tử v à tế bào T h eo p h ư ơ n g châm đó, các n g h iê n cứ u tư ơ n g tác “th uốc - thụ th ể” (d ru g-recep tor) h ay “thụ th ể-ph ối tử” (r e c e p to r -lig a n d ) đã trờ thành nền tảng c ơ bản c h o cá c n gh iên cứu tìm hiêu c ơ c h ế tác đ ộ n g của th uổc và phát triển th u ốc m ớ i Đ e đánh g iá tư ơng tác

th u ố c - thụ thể, c á c phép đ o liên kết thụ the (recep tor b in d in g a ssa y s) đã được phát triển v à ứ ng d ụ ng trong các n g h iên cứ u phát h iện v à đánh g iá thuốc

T h eo c á ch truyền th ố n g , trong nh ữ ng ph ép đ o này, cá c n ồ n g đ ộ xác định của

th u ổc v à thụ thể đ ư ợ c ủ vớ i nhau, sau đó các phân tử th u ốc k h ôn g liên kết với thụ th ể (p h ân tử th uốc tự d o ) đư ợc tách kh ỏi p hứ c hệ các phân tử thuốc liên kết thụ th ể b ằn g các ph ư ơ n g pháp vật lý, rồi tiến hành địn h lư ợ n g phần thuốc liên k êt v ớ i thụ thể Phần lớn các p h ư ơ n g pháp địn h lư ợ n g thuốc liên kết thụ thể kin h đ iển đ ều d ù n g th u ốc (p hối tử) đánh dấu p h ó n g xạ M ặc dù v iệ c dùng phối tử đán h dấu p h ó n g x ạ c ó ưu đ iểm rất nhạy v à c h o p h ép định lư ợng trực tiếp, s o n g p h ư ơ n g pháp này cũ n g b ộ c lộ n h iều hạn chế: c ó n gu y c ơ phơi

n h iễm p h ó n g x ạ v à ảnh hư ởn g đến sứ c k h ỏ e củ a n gư ờ i n g h iên cứu, c ộ n g đ ồn g

và m ô i trư ờ n g x u n g quanh; cần chi phí ca o c h o thiết kế v à x â y dư n g ph òng thí

n g h iệm nh ằm đảm bảo an toàn p h ó n g xạ; chi phí n g h iên cứu cao khi triển khai ở q u y m ô lớn.

T ro n g bối cản h đó, v iệc ứng d ụ ng m ột số p h ư ơ n g pháp n gh iên cứu protein nh ằm cải tiến và phát triển các p h ư ơ n g pháp m ớ i ch o phép đánh giá

1

tư ơ n g tác “th u ô c - thụ th ê” hay “thụ thê - ph ôi tử” m à k h ô n g cân d ù ng các

đ ô n g vị p h ó n g x ạ sẽ g iú p hạ giá thành n g h iên cứ u, đ ồ n g thời có thể m ở rộn g

cá c n g h iên cứ u th eo h ư ớ n g này ở n h iều p h ò n g thí n g h iệm k h ôn g đư ợ c trang

bị v ề an toàn p h ó n g xạ, đ iều cò n th iếu ở hầu hết cá c p h ò n g thí n gh iệm th u ộ c lĩn h v ự c sin h h ọ c dư ợ c phẩm ờ V iệ t N am Đ â y là lý d o ch ú n g tôi tiến hành đề

tài “P h á t tr iể n p h ư ơ n g p h á p đ á n h g iả tư ơ n g tá c v ớ i p r o te i n t h ụ t h ể k h ô n g

d ù n g c h ấ t p h ó n ụ x ạ p h ụ c v ụ c h iế n lư ợ c s à n g lọ c c á c h ợ p c h ấ t c ó h o ạ i tín h

s in h h ọ c t ừ n g u ồ n d ư ợ c liệ u V iệt N a m ”.

M ụ c tiê u c ủ a đề tài là phát triển đ ư ợ c m ột số p h ư ơ n g pháp trên c ơ s ở các

kỹ thuật p ro tein c h o ph ép đánh g iá sự tư ơ n g tác g iữ a d ịch c h iết dược liệ u V iệ t

N a m v ớ i m ộ t so p rotein thụ thể đ ích c ó v a i trò d ư ợ c lý quan trọng n h ư n g

k h ô n g d ù n g c á c p h ối tử (th u ố c) đánh dấu p h ó n g xạ.

Đ ể đạt đ ư ợ c m ụ c tiêu đó, đề tài đã đ ư ợ c triển khai v ớ i các n ội d u n g

n g h iên cứ u ch ín h như sau:

1) T h u thập cá c m ẫu sin h phẩm từ đ ộ n g vật thí n g h iệm để từ đ ó làm

g ià u cá c protein thụ thể đư ợc quan tâm n g h iên cứ u phục vụ c h o v iệ c

th iết lập c á c p h ép đo tư ơ n g tác “th u ố c - thụ th ể”

2 ) X â y d ự n g quy trình đánh g iá tư ơ n g tác g iữ a “th u ố c ” (h oặc p h ố i tử)

v ớ i cá c p rotein thụ thể k h ô n g d ù n g đ ồ n g v ị p h ó n g xạ , đảm b ảo cá c

k ế t quả ph ân tích tư ơ ng đương.

3 ) T h u thập m ột số cây dư ợc liệ u V iệ t N a m c ó c ô n g dụ ng tư ơ n g ứ n g

v ớ i c á c g iá trị dư ợc h ọc đã b iết củ a cá c protein thụ thể được lựa c h ọ n tro n g n g h iên cứu.

4 ) B ư ớ c đầu phân tích và xác định khả n ăn g tư ơ n g tác của dịch c h iế t

d ư ợ c liệu đ ư ợ c lựa chọn v ớ i cá c protein thụ thể đ ư ợ c quan tâm b ằn g

c á c q u y trình đánh giá tư ơ n g tác “th u ố c - thụ th ể ” th iết lập đư ợc.

c ô truyên n ô i tiế n g th ế g iớ i g ồ m : nền y h ọ c c ổ truyền T rung Q uốc và các

n ư ớ c P h ư ơ n g Đ ô n g v ớ i lý th u y ết v ề “âm d ư ơ n g n g ũ hành” ; nền y h ọ c cổ tru yền A n Đ ộ v ớ i tên g ọ i “k iế n thức c u ộ c s ố n g ” (A y u v e d a ) đư ợ c hình thành

k h o ả n g 6 0 0 0 năm trư ớc c ô n g n gu yên ; và n ền y h ọ c c ổ truyền Châu  u vớ i triết lý c ơ bản là y h ọ c G a len T ron g lịch sử , cá c n ền y h ọ c c ổ truyền c ó đặc

đ iêm c h u n g là ch ủ y ế u dựa trên cá c loại th uốc c ó n g u ồ n g ố c từ cây cỏ (E m st,

1 9 9 9 ).

Q u a th ờ i g ia n , c á c n ền y h ọ c c ổ truyền P h ư ơ n g Đ ô n g đã có nh ữ ng cải tiên v à phát triển, n h ư n g v ề c ơ bản triết lý ít thay đ ổ i C ò n ờ P h ư ơ n g tây (C h â u  u ), triết lý y h ọ c G a len đã đ ư ợ c th ay th ế b ằn g y h ọ c hiện đại với

n g u y ê n lý c ơ bản là sự h iể u b iết v ề c ơ ch ế hoạt đ ộ n g củ a th u ốc v à căn n g u y ên

g â y c á c b ện h lý C ác thàn h tựu quan trọng nhất củ a y h ọ c P h ư ơ n g tây h iện đại

có thê kể đến là các lĩn h v ự c y học chẩn đoán, xá c định căn nguyên các bệnh

truyền n h iễm , b ện h h ọ c n ộ i tiết v à c ô n g n g h iệp h o á d ư ợ c (V o g e l và cs, 2 0 0 2 ).

T ro n g khi cá c lĩn h v ự c y h ọ c chẩn đoán , x á c định căn n g u y ên g â y các bệnh lý kh ác nhau đã phát triển th eo thời g ian cù n g v ớ i n h ữ n g hiểu biết ngày

c à n g sâ u v à rộn g hơ n c ủ a c o n n g ư ờ i v ề các n g u y ê n nhân h oặc tác nhân g â y bện h , c h ẳ n g hạn v iệ c x á c định n g u ồ n g ố c củ a n h iều bện h truyền nh iễm gắn liền v ớ i sự phát m in h v à phát triển của kính h iển v i N e n c ô n g n g h iệp hoá

dư ợ c là m ộ t lĩnh v ự c quan trọ n g n h ư n g ra đời sau n ày v à phát triển chủ yếu trong v ò n g 100 năm g ầ n đây C ó th ể co i v iệ c x á c địn h đ ư ợ c các hợp chất có hoạt tín h sin h h ọ c c ó n g u ồ n g ố c từ các loài câ y c ỏ (b an đầu phần lớn là các

a lk a lo it) đ ư ợ c c h iế t x u ấ t thành c ô n g v à o đầu thế k ỷ 20 là đ iểm khởi đầu ch o

c ô n g n g h iệ p h ó a d ư ợ c, tro n g đó c ó thể x e m m orph in v à pap averin e ch iết xuất

từ c â y P a p a ver som niferum n h ư n h ữ ng v í dụ điển hìn h T ừ hai hợp chất c ơ bàn n à y , c o n n g ư ờ i sa u đ ó đã phát triển v à tổ n g hợ p đư ợ c thêm nh iều hợp

c h ấ t g iả m đau A tro p in từ c â y A tro p a belladonna v à dẫn xuất đư ợc sử dụ ng làm th u ố c c h ổ n g CO that C o c a in e từ cây Ery’throxylon coca đư ợc dùng để sản

x u ấ t c á c hợp chất g â y tê cụ c b ộ Q u in in e v à q u in id in e từ cây Cinchona

ju c c in u b ra d ù n g chữ a số t rét v à đ iều hoà nhịp tim E phed rin e từ cây Ephedra LSÌnica d ù n g đ ể tổ n g hợ p các chất k ích th ích hoặc ức ch ế thần kinh g ia o cảm

t h e o c ơ ch ế ứ c ch ế thụ thể p (P -b lo c k e r ), cá c hợp chat xan th in e kiểu co ffein e;

th e o b r o m in e và th e o p h y llin e từ các cây Coffea arabica, Theobroma cacao,

3

C am ellia sin en sis, đư ợc dùng để tổn g hợp n ên các d ư ợ c chất chữa bệnh tim , inạch như p e n to x y p h illin e ; các hợp chất resep in e và ajm aline từ câ y

Rauwolfia serpentina đư ợc dù ng làm thuốc ch ừ a ca o h u y ết áp và loạn nh ịp tim; p h y so stig m in e từ cây Physostigm a venenosum chữ a ch ứ n g thần kinh phân liệt; các hợ p chat g ly c o sid e từ các cây D ig ita lis lanata và D igitalis purpurea để sản xuất ra các hợp chất g ly c o s id e bán tổ n g hợp chữa b ện h tim

m ạch; cá c h ợ p chất anthraquinone từ các câ y Senna augustifolia h oặc

Rhamnus fra n g u la h oặc Rheum officiate và dẫn xu ất đ ư ợ c sử dụng n h ư các thuốc nhuận tràng (V o g e l và c s, 2 0 0 2 ).

N ử a c u ố i củ a thế kỷ thứ 19 đư ợc đánh dấu b ằn g các n g h iên cứ u d ư ợ c lý đâu tiên nhằm làm sá n g tỏ c ơ ch ế tác d ụ n g của cá c th u ốc đã biết trên cá c m ô hình đ ộ n g vật thí n g h iệm (trích từ K atzu n g, 2 0 0 7 ) T h e o n h ữ ng m ô hìn h này, các dịch ch iết h ay cá c hợp chất từ dư ợ c liệu đư ợ c thử n g h iệm trên cá c m ô hình c ơ quan tách rời, rồi trên đ ộ n g vật thí n g h iệm (m ô hình in v iv o ), m à ch ủ

y ê u là ở ch u ột v à m ộ t sổ đ ộ n g vật khác P h ư ơ n g pháp n g h iên cứ u dư ợc lý m à

n gày nay đã trở thành “kinh đ iển ” này thực tế đã trờ thành m ột p h ư ơ n g pháp

h iệu quả để phát h iện ra nh iều dư ợc phẩm m ớ i trong su ố t thế kỷ 20 vừ a qua (V o g e l v à c s, 2 0 0 2 ).

T u y v ậ y , c á c p h ư ơ n g pháp n g h iên cứ u d ư ợ c lý trên các m ô hình in v iv o

c ó hạn c h ế là th ư ờ n g cần th ời gian dài, lư ợ n g m ẫu (g ồ m cả hợp ch ất thử

n g h iệm v à đ ộ n g vật thí n g h iệm ) lớn C h ẳ n g hạn, lư ợ n g h oá chất m ớ i đ ư ợ c quan tâm n g h iên cứ u th ư ờn g đòi hỏi tối th iểu là 5 gram H ơ n nữa, các p h ư ơ n g pháp in v iv o k h ô n g cu n g cấp đư ợc các th ô n g tin v ề c ơ c h ế phân tử củ a th u ốc liên quan đến cá c h iệu quả chữ a bệnh đ ư ợ c quan sát th ấy C ó thể lấy v í dụ v ề điều này trong trường hợp su lfon ylu rea H ợ p chất này đ ã đ ư ợ c sử d ụ n g thành

c ô n g trong đ iều trị hàn g triệu bệnh nhân tiểu đ ư ờ n g trong hàn g ch ụ c năm trước khi c ơ ch ế dư ợ c lý phân tử của n ó đ ư ợ c b iết rõ là g â y tăng g iả i p h ó n g

in su lin củ a tế bào p tuyến tụy (B a ed er và c s, 1969).

T ron g các năm 1970 - 1 9 8 0 , các p h ư ơ n g pháp n g h iên cứ u đánh g iá hoạt tính sin h h ọ c trên các m ụ c tiêu dư ợc lý phân tử là cá c thụ the (recep tor) bắt đầu đư ợ c thực hiện T hực tế, các ph ép thử sinh h ọ c tư ơ n g tác vớ i các thụ thê

dư ợ c lý là m ột b ư ớ c n g o ặ t về m ặt c ô n g n g h ệ trong v iệ c phát h iện và phát triển các hợp chất d ư ợ c phẩm c ó tiềm n ăn g m ớ i, đặc b iệt là c u n g cấp các th ô n g tin

v ề m ố i quan h ệ g iữ a hoạt tính sinh h ọ c v à cấu trúc h o á h ọ c của các hợp chât

C ô n g n g h ệ thụ thể đã ch o phép các nhà n g h iên cứ u đánh g iá , phân tích m ột

lư ợ n g n h ỏ m ột hợp chất h oặc dịch ch iế t m ới (ch ỉ cần vài m iligram ) v ê khả năng tư ơ n g tác trực tiếp của ch ú n g vớ i cá c m ục tiêu d ư ợ c lý phân tử (V o g e l

và cs, 20 0 2).

G ần đ ây, v ớ i sự phát triển m ang tính cách m ạn g củ a c ô n g nghệ A D N tái

tổ hợp, n gày cà n g có nhiều phân tử là m ụ c tiêu tác đ ộ n g của thuốc (n h ư các

thụ thể và e n z y m dư ợ c lý ) đư ợc phát hiện, phân lập, nhân d ò n g và b iểu hiện

ph ụ c vụ ch o cá c n g h iên cứu v ề dư ợc lý phân tử Đ â y là lĩn h vự c n gh iên cứ u

v ê tác dụ ng củ a cá c phân tử thuốc đến c ơ thể qua n h ữ ng h iểu biết về hóa sin h , sin h lý, bệnh h ọ c , sinh h ọ c phân tử và h óa hữu c ơ để thấy rõ tác dụ n g củ a

th u ốc ờ m ức đ ộ phân tử Q ua dư ợc lý phân tử, ch ú n g ta c ó thể hiểu sâu sắc v ề

c ơ ch ế tác d ụ n g củ a th uốc, định h ư ớ n g phát h iện v à phát triển thuốc m ớ i, đ ề

x u ất nh ữ ng h ư ớ n g sử d ụ n g th uốc an toàn, h iệu quả tron g đ iều trị h oặc ngăn

n g ừ a nh ữ ng tác d ụ n g c ó hại c ó thể c ó của th u ốc N ộ i d u n g chủ yếu củ a d ư ợ c

lý phân tử là làm rõ c ơ thế tác d ụ ng của th uốc ờ m ứ c d ư ớ i tế bào, mà tron g đ ó

cá c protein thụ th ể là đ ích tác đ ộ n g chính củ a phần lớn các th uốc đang đ ư ợ c lưu hành rộng rãi (L undstrom , 2 0 0 6 ; O v erin g to n v à cs, 2 0 0 6 ).

T ron g các n g h iên cứu tư ơ ng tác th u ốc - thụ thể, p h ư ơ n g pháp gắn p h ó n g

xạ v à o các p h ối tử đặc hiệu (rad ioligan d ) đã là m ột c ô n g cụ quan trọng nhằm tìm ra các chất ch ủ vận (a g o n ist) v à các chất đối vận (a n ta g o n ist) đối v ớ i cá c thụ thể m ới đ ư ợ c phát h iện cũ n g nh ư các thụ thể d ư ợ c lý đã biết Đ ế n năm

2000, các n g h iên cứ u dùng các ph ối tử đặc h iệu đánh dấu p h ó n g xạ trong cá c

n g h iê n cứu v ề sin h h ọ c thụ thể đã c ó n h iều đ ó n g g ó p c h o v iệ c phát h iện v à đánh g iá các d ư ợ c chất c ó các g iá trị sử d ụ n g khác nhau, như: trên h ệ tim ,

m ạ ch và thay đ ổ i các thành phần m áu, trên hệ tiết n iệu , h ô hấp, thần kin h, thân kin h g ia o cảm ; h oạt tính liê n quan đ ến khả n ăn g h ọ c v à gh i nhớ, cá c h oạt tính g iả m đau, k h án g v iêm , hạ sốt; cá c hoạt tính m iễn dịch; cá c hoạt tính trên

đ ư ờ n g tiêu hoá, đ iều trị bệnh tiểu đ ư ờ n g, b é o phì .( V o g e l v à cs, 2 0 0 2 )

T ất n hiên ch ú n g ta phải thừa nhận rằng, k h ô n g phải m ọ i d ư ợ c phẩm m ớ i

đ ư ợ c phát h iện tới nay đ ều bằn g cá c n g h iên cứ u dư ợ c lý trong p h ò n g thí

n g h iệm ; thay v à o đ ó , m ột số d ư ợ c phẩm đã đ ư ợ c phát h iệ n tình c ờ trong đ iều trị h o ặ c thử n g h iệm lâm sà n g , v í dụ nh ư tác d ụ n g lợi n iệu của su lfa n ila m id e

và a c e ta z o la m id e th eo c ơ ch ế ức ch ế en zy m ca rb o n ic anhydrase (S ch w a rtz,

194 9 ; M aren, 1 9 6 7 ), hoạt tính hạ đ ư ờ n g h u y ết củ a cá c h ọp chất k iểu

su lfo n y lu rea v ố n ban đầu đư ợc sử d ụ n g nh ư cá c chất k h án g sinh (Franke và

F u ch s, 1955; A c h e lis v à H ard ebeck , 1 9 5 5 ), tác d ụ n g an thần củ a

p h en o th ia zin e (C o u rv o isier, 1 9 5 6 ), hoạt tính c h ố n g trầm cảm của iso n ia z id (K lin e , 1 9 5 8 ) v à của im ipram ine (K u h n, 1 9 5 8 ), tác d ụ n g c h ổ n g co giật củ a

N a -v a lp ro a te, h o ặ c của sild en a fil v ố n ban đầu chì đ ư ợ c d ù n g để điều trị v iê m

h ọ n g (E nn a, 2 0 0 0 ).

N g à y nay, v ớ i sự phát triển của d ư ợ c lý phân tử, c ù n g v ớ i sự hỗ trợ củ a

c ô n g n g h ệ A D N v à protein tái tổ hợp, n g à y cà n g c ó n h iều m ục tiêu phân tử của th u ố c là các en zy m và thụ thể d ư ợ c lý c ó bản chat protein được phân lập, nhân d ò n g , biểu hiện và tinh sạch H oạt tính sinh h ọc của các hợp chất m ớ i c ó

n g u ồ n g ố c tổn g hợp hoặc tự nhiên c ó thê đ ư ợ c đánh g iá qua tư ơng tác trực tiếp v ớ i các phân tử đích này hoặc gián tiếp qua sự b iểu h iện chứ c năng của

5

ch ủ n g C ác n g h iê n cứ u d ư ợ c lý phân tử khi áp d ụ n g trên cá c sản phẩm dược liệ u có thê đ ồ n g th ờ i g iú p làm sá n g tỏ các vấn đề sau:

- G iả i th ích v à làm rõ c ơ ch ế tác đ ộn g của thuốc.

- X á c định c á c m ụ c tiêu tác d ụ ng của thuốc.

- X á c định c á c h ợ p chất c ó h oạt tính sin h h ọ c th eo cá c c ơ ch ế riêng biệt.

R õ ràng, c á c th ô n g tin trên đây là cần thiết c h o quá trình phát triển, tiêu

chuân hoá và h iệ n đại hoá các sản phẩm dược liệ u , đồng thời định hướng cho

cá c n g h iên cứ u v ề th u ố c ở cá c g ia i đoạn sau củ a quá trình phát triển thuốc (n g h iê n cứ u d ư ợ c lý trên đ ộ n g vật thí n g h iệm , n g h iên cứ u lâm sàng, n gh iên

ở cấp đ ộ tế b ào h o ặ c c ơ thể (ở đ ộ n g vật thí n g h iệm v à lâm sàn g trên người;

x em m in h h ọa ở H ìn h 3 ) T ron g th ự c tế, các ph ép thử sinh h ọc tư ơng tác với các p rotein thụ th ể đã là m ột b ư ớ c n g o ặ t v ề m ặt c ô n g n g h ệ trong v iệ c phát

h iện , phát triển v à tổ n g hợp cá c hợ p chất c ó hoạt tính sin h h ọc tiềm năng m ớ i, đặc b iệt là c u n g cấp cá c th ô n g tin v ề m ối quan hệ “cấu trúc hoá h ọc - hoạt tính sin h h ọ c ” c ủ a cá c d ư ợ c chất và các đ ích tác đ ộ n g của chún g Các phép đo

huoc tân dược nhiên chưa tiêu chuẩn hóa

Hình 1 Mô hình minh họa vé sự khác biệt giữa các chế phám thuốc tân dưực và các thuốc có nguón góc tự nhién chưa tiẻu chuẩn huá AVií như các sán phẩm lún dược thường chi chứa vác hỢỊ) duit có hoạt lírtlì sinh học xác (lịnh (hìnlt màu đen) đuực sàn xuất theo các ngu\ẻn lác lổng hợp hoặc bún lóng hợj>, llii các cliẻ phẩm có nguón gốc tụ nhiên ihuìmg ủ dạn Ị! ltd chúi, nglũa lù bẽn cạnh các chđt có hoạt rinh sinli học có thi có các hợp chất độc thinh gạch chém, hoặc khống có tác dụng sinh hục (hình chấm).

Các mục tiêu phân ử tác động của thuốc (vf dụ các thụ thể/enzym duợc lý) [

THỬ NGHIỆM TRONG CÁC NGHIÊN CÚU TIỀN ŨM SÀNG VÀ LAM sảng NHẰM XẢC ĐỊNH HIỆU QUẢ ĐIỀU TR|

Hình 2 Mô hình giản lược về nguyên lý phân tích tương tác

D ịc h c h i ế t

t ổ n g c ộ n g

-Các phản đoạn, hoặc hợp chất riẻng rẽ

P h â n đ o ạ n

C h iế t tá c h

Hệ thống sàng lọc

dượcchít

in-vitro

Hlnh 3 Mô hình sàng lọc thuốc từ dược liệu sử dụng các protein thụ thể

S ự phát triên của công nghệ thụ thê đã dân đên sự ra đời của lĩn h v ự c sàng lọc hiệu năng cao các hợp chât có hoạt tính sinh học (hig h throughput

(H a rv e y , 2 0 0 8 ) C á c phương pháp sàng lọc nhanh hiện nay không những cho phép đánh g iá hoạt tính sinh học của các hợp chất m ới m à còn cho biết các số liệu về dược động học và chuyển hóa của các dược chất có tiềm năng m ới (W a tt v à cs, 2 0 0 0 ; W h ite , 2 0 0 0 ) C ùng v ớ i sự tự động hoá quá trình sàng lọc, một số hệ thống sàng lọc hiện nay cho phép sàng lọc hàng nghìn chất một ngày trên một đ ích phân tử riêng biệt (Lu n d stro m , 2 0 0 6 ; Zan d e r, 2011) M ặc

dù v ậ y , sự phát hiện v à phát triển các thuốc m ới dường n hư ngày càng trở nên khó khăn hơn C ó nhiều nguyên nhân giải thích cho hiện tượng này, nhưng một nguyên nhân băt nguồn từ thực tế hiện nay là y học đã có thuốc tương đối tôt cho nhiều bệnh phổ biến; việ c đầu tư phát hiện v à phát triển một thuốc

mới c ó tác đ ộ n g cù n g đích v à h iệu quả hơn th u ốc đã biết sẽ n gày cà n g h iếm hơn V í dụ nh ư trong cả năm 2 0 0 6 , chi c ó 21 th u ốc m ớ i đ ư ợ c F D A th ông qua Tuy v ậ y , đ iề u đ á n g lưu ý là trong số 1184 th uốc m ớ i đ ư ợ c phát triển trong giai đ oạn 1981 - 2 0 0 7 , vẫn c ó đến 6% là cá c sản p hẩm c ó n gu ồn g ố c tự

nhiên, 2 8 % là các dẫn xuất của các sản phẩm tự nhiên v à 2 4 % là các sản phâm tổng hợp được phát triển từ các mô h ìn h của sản phẩm tự nhiên (N e w m a n v à C ra g g , 2 0 0 7 ) Đ iều này chứng tỏ dược liệu tự nhiên vẫn là nguồn tài nguyên có tiềm năng lớn cho sự phát hiện v à phát triển thuốc m ới

T ro n g bối cảnh đó, chúng tôi tin rằng tài nguyên dược liệu V iệ t Nam có nhiều tiềm năng trong các nghiên cứu sàng lọc và phát hiện thuốc mới theo

m ô h ìn h thử tư ơ n g tác “th u ố c - thụ th ể”

1.3 v ề c á c p h ư ơ n g p h á p n g h iê n c ứ u t ư ơ n g tá c t h u ố c - t h ụ th ể

1 3 1 L ý t h u y ế t đ ộ n g h ọ c t ư ơ n g tá c t h ụ t h ể - p h ố i t ử

N hiều quá trìn h sinh học thiết yếu cho hoạt động v à sự tồn tại của tế bào

và c ơ thể đ ư ợ c đ iề u hòa bời h orm on e, cá c chất dẫn truyền thần kinh, cy to k in e

và c á c phân tử truyền tin khác S ự truyền tin n ày th eo c á ch phổ b iến hơn cả

bắt đẩu từ sự tương tác của các phân tử tín hiệu tự nhiên (horm one, chất dẫn

truyền thần kin h, c y to k in e , ) v ớ i các thụ thể trên m à n g tế bào hoặc trong tế

b ào ch ất h o ặ c nhân tế bào C ác phân tử tín h iệu th ư ờ n g c ó cấu hình khớp với

một v ị trí đặc hiệu trên thụ thể v à đính kết vào đó (g ọ i là v ị trí liên kết thụ thể) giống như sự tương tác g iữ a một cơ chất v ớ i một v ị trí x ú c tác của enzym tương ứng theo k iể u “ ch ìa khóa tra vào 0 kh ó a” Phân tử tín hiệu biểu hiện

hoạt đ ộ n g g iô n g như m ột p h ố i t ử (ligan d ); thuật n g ữ này đư ợc dùng đê chỉ

một phân tử liên kết đặc hiệu v ớ i một phân tử kh ác, thường có k ích thước lớn hơn nó K h i liê n kết vào thụ thể, phối tử thường trực tiếp làm protein thụ thể thay đổi hình dạng của nó Đ ổ i v ớ i nhiều loại protein thụ thê ( v í dụ nhóm thụ thể kết cặp G -p ro tein, G P C R ) , sự thay đổi hình dạng như v ậ y sẽ trực tiếp hoạt hóa thụ thể, giúp nó có thể tương tác v ớ i những phân tử khác trong tế bào

V ớ i một số loại thụ thể khác ( v í dụ nhóm thụ the tyro sin e k in a se ), hiệu ứng

tức thì của v iệ c phối tử liên kết vào thụ thể là tạo nên sự tập hợp của hai hay

n h iều phân tử thụ thể; điều n à y dẫn đến ch u ỗ i cá c sự k iện khác ở cấp đ ộ phân

tử (chuỗi truyền tin ) diễn ra trong tế bào dẫn đến đáp ứng sinh lý của tế bào

T h e o m ột cách phổ b iế n , v iệ c liên kết củ a thụ thể g iố n g với sự liên kết của m ột y êu tố đ iều hòa dị lập thể v à o en zy m , g â y n ên sự thay đổi hình dạng,

dẫn đến làm tăng hoặc giảm hoạt tính enzym V ớ i quá trình truyền tin, việ c

liên kêt của phối tử vào thụ thể làm thay đ ổi khả n ăn g truyền tin của thụ thể

Phần lớn các thụ thê truyền tin là các protein liên kết m àng sinh chất C ác

ph ối tử của ch ú n g thư ờng là cá c chất tan trong n ư ớ c v à c ó k ích thước đủ lớn

đến m ức không thể “ tự do” qua m àng sinh chất T u y v ậ y , cũng có một nhóm

các thụ thể c ó trong tế bào ch ất hoặc trong nhân ( V o g e l và c s, 2 0 0 2 ).

Tro n g các mô hình thử nghiệm in vitro , thụ thể có thể được dùng để sàng lọc các thành phần hóa học m ới hoặc để định tính và định lượng các thuốc tác

đ ộ n g lên nó C ác thụ thể tron g các phân tích tư ơ n g tác th u ố c - thụ thể c ó thể

thu được từ các động vật thí nghiệm hoặc gần đ ây có thể được tạo ra bằng công nghệ A D N tái tổ hợp (Lu n d stro m , 2 0 0 6 ) T ro n g phép thử tương tác thụ

thể - p h ối tử, m ộ t p h ố i tử đ ư ợ c đánh dấu v à th u ốc th ử sẽ cạnh tranh liên kết

nếu thụ thể đó là đ ích tác động của thuốc thử Ở trạng thái cân bàng, các phối

tử không liên kết thụ thể (phối tử tự do) được phân tách kh ỏ i phối tử liên kết

thụ thể (lú c n ày ở d ạn g phức “phối tử - thụ th ể”) Sau đ ó , cá c phối tử liên kết

và/hoặc phổi tử tự do (không liên kết vớ i thụ thể) sẽ được định lượng Theo dãy nồng độ tăng dần của thuốc thử (trong trường hợp nó có ái tính vớ i thụ thể), lượng phối tử đánh dấu liên kết vớ i thụ thể sẽ giảm đi do sự cạnh tranh

liên k ết v ớ i thụ thể củ a thuốc thử.

V ì mật độ thụ thể trong mỗi mô của một loài nhất định được xem là ổn định (đại diện bằng B max, tương đương vớ i tổng số v ị trí liê n k ế t), nên sự liên kết của một phổi tử đặc hiệu vào thụ thể của nó là một quá trình có thể bão hòa Đ iều này có nghĩa là k h i nồng độ cùa phối tử đặc hiệu tăng dần, lượng

phối tử liê n kết thụ th ể (phứ c hợp “ph ối tử - thụ th ể ” ) lú c đầu tăng nhanh cho đến khi đạt cận m ứ c tối đa ( B max) thì trở nên ổ n định (x e m H ìn h 4) T h eo

đ ộ n g h ọ c tư ơ n g tác p h ối tử - thụ thể, dựa v à o đ ư ờ n g c o n g bão hòa c ó thể xác

định được B max cũng như ái lự c giữa phổi tử v à thụ thể (đ ại diện bằng hằng số

phân ly Kd, là n ồ n g độ phổi tử m à ờ trạng thái cân b ằn g, 50% vị trí liên kêt của thụ thể đư ợc phối tử đính kết) T ron g thực n g h iệm , m ột cặp phối tử - thụ thể c ó g iá trị Kd (th ư ờ n g đư ợc biểu diễn qua đơn v ị p M /n M ) càn g lớn thì ái

lực càng thấp và ngược lại N h ư v ậ y , đối vớ i phổi tử nếu có thể định lượng

9

đ ư ợ c số liên kết thụ thể trong dãy

T ro n g dãy n ồ n g độ tăng dần của thuốc thử D , n ếu D tư ơ n g tác vớ i R thì

lư ợ n g p h ứ c hệ L R s ẽ g iả m đi N ồ n g đ ộ của D m à ở đ ó chỉ c ó 50% v ị trí liên kết thụ thể đ ư ợ c bắt g iữ bởi phối tử đư ợ c g ọ i là g iá trị IC 50 G iá trị này tư ơ ng quan n g h ịch v ớ i ái lự c của thuốc thử D với thụ thể Á i lự c củ a thuốc thử đối

vớ i m ộ t thụ thể (đại d iện bằng h ằn g số ức ch ế Kị) c ó th ể x á c địn h được từ g iá trị IC50 trong m ối tư ơ n g quan v ớ i ái lực của ph ối tử đặc h iệu v à thụ thể (đại diện b ằn g hàng sổ phân ly K d) qua ph ư ơ ng trình C h e n g -P r u so ff (C h en g và

và thụ thể)

1 3.2 C á c p h ư ơ n g p h á p p h â n tíc h tư ơ n g tá c t h ụ t h ể - p h ổ i t ử

C ác ph ép tử tư ơ n g tác thụ thể - ph ối tử (recep tor-ligan d b in d in g /

in teraction a s sa y s ) g iữ vai trò quan trọng trong cá c n g h iên cứu sinh h ọc và

g iờ đ ây đã trở thành m ột phần quan trọng trong cá c n g h iên cứu dư ợc phẩm

h iện đại T ù y th eo m ô hình thử n g h iệm đơn thuần dựa trên phân tử protein thụ thê hay tê bào n g u y ên v ẹ n m an g thụ thê, các phép thử tư ơ n g tác thụ th ê - phối

tử (h aỵ thụ thê - th u ô c) đư ợ c ch ia làm hai cá ch tiêp cận chính: 1) các p h ép thử liên kêt thụ th ê (recep to r b in d in g a ssa y s) hay cò n g ọ i là các p h ép thử dựa v à o thụ the (recep to r-b a sed a ssa y s); và 2) cá c p hép thử ch ứ c năng thụ thể (recep tor fu n ctio n a l a ssa y s) hay cò n g ọ i là cá c ph ép thử dựa trên tế b ào (c e ll-

b a sed a ssa y s) Ư u đ iểm của các phép thử liên kết thụ thể là khả năng đánh g iá

tư ơ n g tác trực tiếp của m ột ph ối tử (ligand; h ay m ộ t d ư ợ c chất) với m ột thụ

th ê nhất định v à x á c địn h đư ợc cá c th ôn g số đ ộ n g h ọ c tư ơ n g tác g iữ a ch ú n g (c h ẳ n g hạn n h ư m ật đ ộ thụ thể - B max, ái lực tư ơ n g tác - Kd) T u y vậ y , nh ư ợc

đ iêm của c á ch tiế p cận n ày là k h ô n g x á c định đ ư ợ c liệ u n h ữ ng tư ơng tác đó

c ó g â y ra đáp ứ n g tế bào h ay không; n ói cách k h ác, p h ép thử k h ôn g c h o phép

ch ỉ ra m ột p h ổ i tử tác đ ộ n g th eo k iểu chủ vận (a g o n ist, g â y đáp ứ ng tế b ào)

h ay th eo k iểu đ ố i vận (antagon ist; liê n kết v ó i thụ thể n h ư n g k h ôn g g â y đáp

ứ n g tế bào, v ì v ậ y ức c h ế chất chủ v ậ n /ch ẹn thụ th ể) T ron g khi đó, cá c ph ép thử ch ứ c n ăn g tế bào là sự b ổ su n g c h o các p h ép thử liê n kết thụ thể M ặc dù

c á c p h ép thử th e o cá ch tiếp cận thứ hai k h ô n g g iú p x á c địn h được cá c th ô n g

s ố đ ộ n g h ọc tư ơ n g tác g iữ a m ột p h ối tử và thụ thể nhất định, như ng thay v à o

đ ó ch ú n g ch o p h ép xác định đư ợc sau khi phối tử liên k ết v ớ i thụ thể, phứ c hệ

ph ối từ - thụ th ể c ó g â y đáp ứ ng tế bào hay k h ô n g (v í dụ: sự tăng sin h tế b ào hay tăn g tiết c á c chất truyền tin thứ h ai, như C a2+, IP3, cá c c y to k in e ) N h ư

v ậ y , tron g n g h iê n cứ u tư ơ n g tác th uốc - thụ thể các p h ép thử liê n kết thụ thể -

ph ối tử và b iểu h iện ch ứ c năn g thụ th ể có g iá trị b ổ su n g c h o nhau (D e J on g

v à c s, 2 0 0 5 ).

v ề p h ư ơ n g d iện kỹ thuật, các p h ư ơ n g pháp đánh g iá tư ơ n g tác thụ thể -

ph ối tử cần đ ịn h lư ợ n g đư ợ c lư ợ n g ph ổi tử liên kết v ớ i thụ th ể ở các n ồ n g độ khác nhau củ a p h ố i tử v à thụ thể; tron g khí đ ó, cá c p h ép thử chứ c n ă n g thụ thể th ư ờn g y ê u cầu x á c định đ ư ợ c sự xu ất h iện sản p hẩm củ a quá trình truyên tin sau khi p h ổ i tử đư ợc ủ vớ i tế bào số n g m an g c á c thụ thể được quan tâm

n g h iên cứu ( V o lg e l và c s, 2 0 0 2 ).

N h ằ m m ụ c đ ích định lư ợ ng đ ư ợ c phối tử liên kết thụ thê, trong các

p h ư ơ n g pháp đánh g iá tư ơ n g tác thụ thể - ph ối tử kinh đ iển , các ph ối tử

th ư ờ n g đư ợc đánh dấu p h ó n g xạ (ch ẳ n g hạn bàng 3H , 125I, ) Ư u đ iểm củ a

n h ữ n g p h ư ơ n g pháp này là tốc đ ộ nhanh, độ nhạy c a o , d ễ thực h iện và khả năn g lặp lại c a o T u y v ậ y , nhược đ iểm của nh ữ ng p h ư ơ n g pháp sử d ụ n g phôi

11

tử đánh dấu p h ó n g x ạ là n gu y c ơ an toàn sứ c k h ỏe v ớ i n gư ờ i n gh iên cứu và

m ô i trường, y ê u cầu đặc biệt v ề p h òn g thí n g h iệm , hệ th ố n g x ử lý rác thải

p h ó n g x ạ v à g iá thành rất cao khi thực hiện ở quy m ô lớn Đ â y là lý do các

p h ư ơ n g pháp đánh g iá tư ơ n g tác th uốc - thụ thể k h ô n g sử dụ ng phối tử đánh dâu p h ó n g x ạ đ ư ợ c quan tâm n g h iên cứu phát triển trong n h ữ ng năm gần đây

C ác ph ép thử k h ô n g d ù n g đ ồ n g vị p h ón g x ạ đến n ay đ ư ợ c phát triển chủ yếu dựa trên các p h ư ơ n g pháp quang h ọ c th eo n g u y ên lý phân cự c huỳnh quang -

FP (flu o r e s c e n c e p o la riza tio n ), truyền năng lư ợ n g c ộ n g h ư ở n g huỳnh quang -

F R E T (flu o r e s c e n c e reso n a n ce en ergy transfer) v à c ộ n g h ư ở n g p lasm on bề

m ặt - S P R (su rfa ce p la sm o n reson an ce), h o ặ c dựa trên m ột số p h ư ơ n g pháp

kh ác nh ư đ ếm tế b ào qua d ò n g chảy (flo w cy to m etry ) h ay sắ c ký kết hợp khối

p h ô địn h lư ợ n g (q u an titative H P L C /M S ) T ron g phạm v i báo cáo này, chúng tôi ch ỉ đ ề cập tóm tắt v ề m ột sổ p hư ơng pháp đánh g iá tư ơ n g tác thụ thể - phổi

tử d ù n g ph ối tử đánh dấu huỳnh quang v ố n c ó ưu đ iểm rẻ tiền hơn so với các

ph ư ơ n g pháp d ù n g đ ồ n g v ị p h ó n g xạ, tư ơ n g đối d ễ thự c h iện , k h ôn g yêu cầu

ca o v ê trang th iết bị p h ò n g thí n g h iệm (ch ỉ cần m áy đ ọ c E L IS A bên cạnh các

th iết bị n g h iên cứ u th ô n g thường); v à v ì v ậ y , đây là c á ch tiếp cận đư ợc chúng tôi lựa ch ọ n c h o đ ề tài này C ác n g u y ên lý v ề c ô n g n g h ệ phát h iện và định

lư ợ n g đ ư ợ c nêu tro n g phần tổ n g quan này chủ y ế u đ ề cập đến các phép đo liên k êt thụ th ể, s o n g c ũ n g c ó thể áp dụ ng c h o các p h ép đ o ch ứ c năng thụ thể.

1.3.2.1 C ác p h é p thử liên kết thụ thể - p h ổ i tử dừng đ ồn g vị phón g xạ

C ác p h ép th ử liên kết thụ thể - phối tử p hổ b iến đ ến n ay đều d ù ng phối

tử đánh dấu p h ó n g x ạ liên kết v ớ i thụ thể m àn g tế bào P h ép thử th eo n gu yên

lý n à y đ ư ợ c phát triển lần đầu tiên bởi L e fk o w itz v à c ộ n g sự (1 9 7 0 ) N g u y ê n

lý củ a p h ư ơ n g pháp dựa trên tư ơng tác cạnh tranh g iữ a m ộ t ph ối tử đánh dấu

và m ộ t “th uốc thử ” c ó cù n g v ị trí liên kết thụ thể N g u y ê n lý của các phép thử

th eo k iể u đẩy p h ối tử đ ư ợ c m inh họa trên H ìn h 5.

V iệ c ch ọ n m ộ t p h ối tử đánh dấu p h ó n g xạ phù hợ p cần đáp ứ n g m ột sổ tiêu ch í: i) p h ố i tử đánh dấu phải c ó tính ch ọ n lọ c v à c ó ái lực ca o v ớ i thụ thể

tư ơ n g ứ n g, ii) c ó tính đặc h iệu ca o v à thuần k h iết v ề h ó a p h ó n g xạ , và iii) phổi tử đánh dấu phải bền v ề m ặt hóa h ọ c và k h ô n g bị b iến tính bởi en zym

Ư u đ iểm lớn nhất của phép thử liên kết thụ thể - p h ối tử dùng phổi tử đánh dấu p h ó n g x ạ là độ nhạy ca o , tính đặc h iệu ca o v à ph ép phân tích nhanh Phép thử chì cần m ộ t chất đánh dấu duy nhất là p h ối tử và ph ối tử đánh dấu này k h ô n g làm thay đ ổi ái tính của thụ thể Sự sẵn c ó củ a n h iều phổi tử đánh dấu p h ó n g xạ trên thị trường ngày cà n g trở nên p hổ b iến g iú p v iệ c thiêt lập phép thử đư ợc dễ dàng Đ en nay có thể nói: n go ạ i trừ các thụ thể cô độc (orphan receptor; là nh ữ ng thụ thể ch ư a x á c định đ ư ợ c ph ối tử đặc hiệu),

p h ư ơ n g pháp đánh tư ơ n g tác thụ thể - phối tử sử d ụ n g p h ổ i tử đánh dâu phóng

xạ đ ã đư ợc th iết lập c h o hầu hết m ọi thụ thể c ứ m ỗi khi x á c định được phối tử đặc h iệu cửa n ó ( V o g e l và c s, 2002).

H ỉnh 5 N g u y ê n lý c ủ a p h é p đ o liê n k ế t th ụ th ể - p h ố i tử Thụ th ể (R) đ ư ợ c ủ với phối tử đ ặ c h iệu đ ánh dấu (L) và th u ốc th ử (D), s a u đ ó phần phổi tử không liên kết thụ

th ể (d ạ n g tự do) đ ư ợ c tá c h bỏ khỏi phần liên kết với thụ th ể h o ặ c b ằn g c á c p h ư ơ n g

p h áp lọc, rửa, thẩm tá ch h ay ly tâm; phần phối tử liên kết thụ th ể s a u đỏ đ ư ợ c định

lư ợ n g n h ờ c á c phối tử n à y đ ư ợ c đ ánh d ấu (h o ặ c với đ ồ n g vị p h ó n g xạ, n h ư 3H, h o ặ c với g ố c phát huỳnh q u a n g , n h ư flu o rescein ).

T u y v ậ y , d o n h ữ n g hạn ch ế rõ rệt cùa cá c p h ép đ o d ù n g p h ối tử đánh dấu

p h ó n g x ạ (n h ư n êu ở m ụ c 1 3 2 ), đã có m ột số n ỗ lự c ph át triển các p hép thử liên k ết thụ thể k h ô n g d ù n g p h ối tử đánh dấu p h ó n g x ạ (d e J o n g và cs, 2 0 0 5 ).

1.3.2.2 S ơ lược v ề các ph ép thử liên kết thụ th ể - p h ổ i tử không dùng đồng

vị p h ó n g xạ

Phần lớ n cá c p h ép thử này vẫn cần m ột k iểu đánh dấu c h o phép đ o được

sự liê n kết g iữ a ph ối tử v à thụ thể Đ iề u c ố t y ế u là cá ch đánh dấu kh ôn g làm

th ay đ ổi ái tính tư ơ n g tác g iữ a p h ối tử v à thụ thể T ron g trường hợp ph ối tử

đ ư ợ c đánh dấu, p h ép th ử cần đư ợc ch ứ n g m in h k h ô n g làm th ay đổi các thuộc tín h liên kết (n h ư tính đ ặc hiệu thụ thể, ái lực liên k ết) củ a p h ối tử so v ớ i phối

t ử tư ơ n g tự đánh dấu p h ó n g x ạ (T ak eu ch i và c s, 1 9 9 5 ).

M ột tron g các p h ép thử tư ơ n g tác ph ổi tử - thụ thể k h ô n g dùng đ ồ n g vị

p h ó n g xạ đầu tiên d ù n g ph ối tử đánh dấu huỳnh qu an g đ ư ợ c phát triển ch o thụ chể đ ích là b e n z o d ia z e p in dùng ph ối tử d ia zep a m đánh dấu flu o rescein ('M cC abe v à cs, 1 9 9 0 ) Sau đ ó , hai n h óm n g h iên cứ u củ a T a k eu ch i (T ak euch i

v à c s , 1 9 9 2 ) và J a n ssen (Jan ssen và c s, 2 0 0 1 ) đã ph át triển p h ư ơ n g pháp phát

h iệ n lư ợ n g ph ối tử đánh dấu huỳnh quang liê n kết thụ thể bằng p h ư ơ n g pháp

s ắ c ký lỏ n g ca o áp đảo p ha (R P -H P L C ) kết hợp v ớ i bộ phát h iện huỳnh quang ( flu o re sce n c e d etecto r) P hư ơng pháp củ a T ak eu ch i c h o p h ép định lư ợ ng phôi

t ử tự do (k h ô n g liên k ết thụ th ể) trực tiếp sau ly tâm , n h ư n g đòi hỏi lư ợ ng thụ

th e v à phối tử đủ lớn đ ể p h ư ơ n g pháp H PLC c ó thể định lư ợ n g được Ph ư ơng

p h á p của Jassen sau đ ó được cải tiến bằn g cá ch phân tách phổi tử tự do ra

13

khỏi phối tử liên kết thụ thể, rồi thu hồi lại ph ổi tử liên kết thụ thể bằng cách

g â y b iến tinh thụ th ể v à địn h lư ợ n g phối tử liên kết thụ thể bằng ph ư ơ n g pháp

R P -H P L C P h ư ơ n g pháp định lư ợ n g phối tử liê n kết này của Jassen được đánh g iá ưa v iệ t hơ n p h ư ơ n g pháp định lư ợ n g ph ối tử tự d o n h ờ độ nhạy và tính đặc hiệu ca o hơn, đ ồ n g thời kh ôn g cần lư ợ n g lớn thụ thể và phổi tử đánh dâu M ộ t cải tiến kh ác sau đ ó đư ợc nh óm T ak eu ch i (1 9 9 5 ) phát triển dựa trên

n g u y ên lý hu ỳn h qu ang phân giải thời g ian - T R F (tim e-reso lv ed flu o r e sc e n c e ) T h eo p h ư ơ n g pháp này, ph ối tử củ a thụ thể b en zo d ia zep in (d ia ze p a m ) đ ư ợ c đánh dấu b ằn g 3Eu Sau khi ly tâm , d ịch nổi đư ợ c chu yển

sa n g đ ĩa 96 g iế n g rồi bổ su n g chất tăng cư ờ n g phát q u an g trước khi đo tín

h iệu qu ang b ằn g m áy đ ọ c E L IS A

M ộ t số p h ư ơ n g pháp đánh g iá tư ơng tác v ớ i p rotein thụ thể kh ông dùng

đ ô n g v ị p h ó n g x ạ dựa trên n g u y ên tắc “đánh dấu b an g e n z y m ” T ron g các

p h ư ơ n g pháp này, hoặc ph ối tử đư ợc kết cặp v ớ i m ộ t en z y m (H a m er và

S a m u el, 1 9 8 9 ) h oặc ph ứ c hệ phối tử - thụ thể đ ư ợ c địn h lư ợ n g gián tiếp qua hoạt tính e n z y m (G arrett và cs, 1999; M a h o n ey v à c s, 1999; S eifert và cs,

1 9 9 9 ) V í dụ nh ư trong n p h iên cứ u củ a M a h o n ey v à c s (1 9 9 9 ) trên thụ thể y ếu

tố tăn g sin h c ó n g u ồ n g ô c tiểu cầu (P D G F -R ), p h ố i tử đ ư ợ c đánh dấu bằng

b io tin rồi đ ư ợ c ủ v ớ i thụ thể đã đư ợc gắn sẵn trên đ ĩa 9 6 g iế n g L ư ợ n g phối tử gắn biotin liê n k ết thụ thể sau đ ó đư ợc định lư ợ n g b ằn g v iệ c bổ su n g horserad ish p e r o x id a se (H R P ) đư ợc gắn v ớ i neutravid in L ư ợ n g neutravidin-

H R P dư thừa đư ợ c rửa trôi qua m áy thu tế bào rồi sau đ ó định lư ợ n g phối tử liên k ết b ằn g b ổ su n g c ơ chất c h o phản ứ ng e n z y m H R P.

1.3.2.3 Sử dụng p h ố i tử đánh dấu huỳnh quang flu o rescein trong các ph ép

thử thương tác thụ thể - p h ổ i tử

F lu o r esce in (3 9 ,6 9 -d ih y d ro sp ir o [iso b e n z o fu ra n - 1 (3 H ),9 9 -[9 H ]x a n th e n ]- 3- N a ) là m ột chất hữu c ơ tổ n g hợp c ó tính lự c hu ỳn h qu ang ca o v ớ i bước

só n g kích th ích cự c đại trong v ù n g 4 8 0 - 5 0 0 nm v à phát x ạ cự c đại v ù n g 5 2 0

- 5 3 0 nm C hất hu ỳnh quan g này h iện đ ư ợ c dù ng p h ổ b iến làm phân tử đánh dấu tro n g các n g h iên cứu tư ơ n g tác sin h h ọc của cá c đại phân tử N ó có thê

đư ợ c gắn v à o cá c phân tử protein (v í dụ như k h án g thể ) để n g h iên cứu v ề cấu trúc, sự phân b ố và b iểu h iện ch ứ c năng của cá c p rotein trong tế bào và c ơ thể, h o ặ c cũ n g c ó thể đ ư ợ c gắn v à o các n u cleo tit để tạo m ẫu d ò trong lai các axit n u c le ic (N o g a và cs, 2 0 0 2 ) N g o à i ra, flu o re sce in c ũ n g đ ư ợ c dùng n gày càn g rộng rãi trong chẩn đ oán y h ọ c (K w a n v à cs, 2 0 0 6 ).

T ron g các ph ép đo liên kết thụ thể - phối tử, flu o r e sc e in cũ n g là phân tử đánh dấu gần đây đ ư ợ c sử dụ ng phổ biến để thay thế các phối tử đánh dâu

p h ó n g xạ N h ờ tính lực hu ỳnh quang m ạnh, flu o rescein c ó thể giú p phát hiện

v à địn h lư ợ n g cá c loại phối tử khác nhau như các c y to k in e , cá c dư ợc chât, các

yếu tố tăng trư ở n g hay các h orm on e trong các m ẫu sin h h ọ c N hữ n g phép đo này dựa trên n g u y ê n lý tư ơ ng tác g iữ a cá c phối tử (h o ặ c kh áng n g u y ên ) với các thụ thê (h o ặ c k h án g th ể) D o tính đặc hiệu và ái lự c c a o của tư ơng tác thụ thê - ph ối tử (h o ặ c kh áng n g u y ên - khán g th ể), các p h ép thử này c ó thể định

lư ợ n g đ ư ợ c cá c p h ố i tử đ ến lư ợ n g p ico m o la r ( 1 0 '12M ) P h ư ơ n g pháp đánh giá

tư ơ n g tác thụ th ể - p h ối tử sử d ụ ng flo u rescein đơn g iả n nhất đến nay đã đư ợc phát triên dựa trên n g u y ên lý E L IS A cạnh tranh (O n ed a và Inou ye, 2 0 0 4 )

N g u y ê n lý củ a p h ư ơ n g pháp này đ ư ợ c m inh h ọa trên H ì n h 6.

Có kháng nguyên

cạnh tran h

h -A

Không có kháng nguyên cạnh tranh

<8> ỂẾ

Kháng nguyên phủ đĩa (Kháng nguyên “bắl giữ”) Kháng nguyên cạnh tranh (Kháng nguyên cần đo)

Phủ đĩa vói kháng nguyên th ứ n h ấ t(k h á n g nguyên “ bắt giữ”)

iJ Ĩ L j Ế y

ù kháng thể gán enzym phát hiện (E), có hoặc không có kháng nguyên cạnh tran h (kháng nguyên

T ron g p h ư ơ n g pháp E L IS A cạnh tranh, ban đầu m ộ t khán g n g u y ên thứ nhât (c ò n g ọ i là k h á n g n g u y ên “bắt g iữ ” ) đư ợ c gắn (p h ủ ) lên bề mặt đĩa thử (đĩa E L IS A ) Sau đ ó , kh áng th ể đư ợ c gắn v ớ i m ột e n z y m “phát h iện ” (như horserad d ish p e r o x id a se, H R P ) đ ư ợ c bổ su n g v à o h ồn hợp ủ khi c ó hoặc

k h ô n g c ó m ột k h á n g n g u y ên thứ hai (k h án g n g u y ên “p h ân tíc h ”) C ác kháng

n g u y ên hoặc k h á n g th ể dư thừa ở dạn g k h ôn g liên kết (tự d o ) sau bư ớc ủ sẽ

đ ư ợ c loại bỏ h o ặ c bằn g ph ư ơ n g pháp rửa trôi, ly tâm h o ặ c lọ c qua m áy thu tế bào T ron g b ư ớ c tiếp th eo, c ơ chất của phản ứng tạo m àu đư ợc xúc tác bời

15

en z y m “phát h iệ n ” sẽ đ ư ợ c bổ su n g để phản ứng tạo m àu d iễn ra H oạt tính

củ a en zy m (x á c đ ịn h đ ư ợ c qua chỉ s ố O D thư đ ư ợ c từ phản ứ ng en zy m c ó thể

đo đ ư ợ c bằn g m áy đ ọ c E L IS A ) tư ơ n g quan n g h ịch v ớ i lư ợ n g kháng n g u y ên

“phân tích ” T h eo n g u y ên lý đó, ph ư ơ n g pháp E L IS A cạn h tranh c ó thể d ù ng

đê định lư ợ n g p h ối tử nếu phối tử đư ợc sử d ụ ng nh ư k h án g n g u y ên “phân tíc h ” (k h á n g n g u y ên cạnh tranh) trong ph ép thử E L IS A cạnh tranh T ron g thực tế các p h ép đ o liên kết thụ thể - ph ối tử sử d ụ ng flu o r e sc e in làm phân tử đánh dấu, k h án g n g u y ên “phân tíc h ” ch ính là p h ối tử được đánh dấu flu o re sce in v à k h án g thê đ ư ợ c sử d ụ n g là k h án g thể k h án g flu o rescein

T ron g phạm v i đề tài n g h iên cứ u này, nhằm x â y d ự n g p h ư ơ n g pháp đánh giá tư ơng tác vớ i protein thụ thể kh ông dùng phối tử đánh dấu ph óng xạ phục vụ chiến lược sàn g lọ c các hợp chất c ó hoạt tính sinh học từ dư ợc liệu V iệt N am ,

ch ú n g tôi đã thử n g h iệm cá c phép thử thụ thể - ph ối tử th eo hai cách tiếp cận:

- T h eo cá ch tiếp cận thứ nhất (p h ép đ o liê n kết th u ốc - thụ thể), m ô hìn h

đư ợc thử n g h iệm là thụ the a n g io ten in II ( A ll, thu từ m à n g tế bào gan ch u ộ t

d ò n g S w is s ) dựa trên n g u y ên lý E L IS A cạnh tranh T ro n g m ô hình này,

a n g io ten sin II đán h dấu flu o re sce in (F -A T II) là k h án g n g u y ên cần đ o cò n

B S A đánh dấu flu o re sce in (F -B S A ) đ ư ợ c d ù n g làm k h án g n g u y ên bắt giữ ;

kh áng thể gắn e n z y m phát hiện (H R P ) là k h án g thể k h án g flu o rescein D o thụ the A l l đ ư ợ c biết là đ ích tác đ ộ n g củ a n hiều th u ốc c ó tác d ụ n g hạ h u yết áp v à

hỗ trợ tim , m ạch , cá c “th u ốc thử” đ ư ợ c lựa c h ọ n là d ịc h c h iế t thô (m eth a n o l) cùa 4 loài câ y th u ố c, g ồ m c ỏ mần trầu (Eleusine indica L , G raerth.), hạ kh ô thảo (Prunella vulgaris L.), h ò e (Sophora ja p o n ic a L ) v à tầm gử i ( Taxillus philippen sis (C h a m & S c h le c h t.) B a n ) v ố n đư ợ c ghi nhận trong y h ọ c c ô truyền c ó k h u yn h h ư ớ n g sử d ụ ng c h o n h ữ ng ch ứ n g b ệnh tư ơ n g tự N h ó m cá c nội d u n g n g h iên cứ u th eo cá ch tiếp cận thứ nhất đư ợ c trình b ày ở C hư ơ n g 2.

- T h e o cá ch tiếp cận thứ hai (p h ép đo ch ứ c năn g thụ th ể), m ô hình đ ư ợ c thử n g h iệm là cá c thụ thể to ll-lik e 2, 3 và 4 (T L R -2 , -3 , -4 ) và dectin-1 th eo

n g u y ên tắc phát h iệ n sự xuất h iện sản phẩm củ a quá trình truyền tin (c y to k in e ) sau khi c ó sự tư ơ ng tác g iữ a "thuổc thử" v à thụ thể V ì các thụ th ể này đư ợ c b iết c ó v a i trò trong đ iều h òa các đáp ứ n g v iê m , nên “th u ốc th ử ”

đư ợc thử n g h iệm là d ịch ch iết tổ n g c ộ n g (m eth a n o l) củ a cỏ m ần trâu

(Eleusine indica L , G raerth.) đư ợ c gh i nhận c ó khả n ăn g kháng v iêm trong

m ột n g h iên cứ u trên đ ộ n g vật thí n g h iệm trước đây (D e M e lo và c s, 2 0 0 5 )

N h ó m nội du ng n gh iên cứu theo cách tiếp cận này được trình bày ở C h ư ơng 3.

1.4 ứ n g d ụ n g c á c p h ư ơ n g p h á p p h â n tíc h t ư ơ n g t á c t h ụ th ể - p h ố i t ử

t r o n g s à n g lọ c d ư ợ c c h ấ t t ừ d ư ợ c liệ u t h ự c v ậ t

V iệ c ứ ng d ụ n g các ph ư ơ n g pháp phân tích tư ơ n g tác thụ thể - p h ối tử trong sàng lọc d ư ợ c chất từ nguồn d ư ợ c liệu tự nhiên đ ư ợ c bat đầu quan tâm

kh oảng 2 0 năm trở lại đây N h ư n g d ư ờ n g như n h ữ n g n g h iên cứ u này ch o đến nay m ới ch ủ y ê u đ ư ợ c thực hiện ở m ột số n ư ớ c c ó nền c ô n g n gh iệp dược từ thảo m ộ c phát triên (n h ư M ỹ, A nh , Đ ứ c, T h ụ y Sĩ, Pháp, Á o , ) và chưa có

nh iêu kêt quả đ ư ợ c c ô n g bố (g iố n g v ớ i n h iều dự án sà n g lọ c dược phẩm khác) T u y v ậ y , m ộ t sô c ô n g bô th eo h ư ớ n g n ày đã g ó p phân chỉ rõ thành phân c ó hoạt tín h sin h h ọ c ở m ột sô loài c â y d ư ợ c liệu v à cá c thụ thê đích nhiều khả n ăn g th am g ia điều hòa tác đ ộ n g d ư ợ c lý củ a cá c sản phẩm dư ợc liệu này (L u n d stro m , 2 0 0 6 ) B ả n g 1 nêu v í dụ v ề m ộ t số hợp chất và sản phâm d ư ợ c liệu đã đ ư ợ c xác định qua các phép thử thụ thể - p h ố i tử trong các ngh iên cứ u sà n g lọ c.

B ả n g 1 M ột s ố h ợ p c h ấ t v à s ả n p h ẩ m d ư ợ c liệ u đ ư ợ c x á c đ ịn h q u a c á c p h é p p h â n tíc h t ư ơ n g t á c th ụ t h ể - p h ố i t ử

T ên c â y t h u ô c H ợ p c h ấ ư S ả n p h ẩ m T hu t h ể đ íc h T ài liê u th a m k h ả o

Bacopa monnieri Dịch chiết methanol GABAa, GABAb Misra (1 9 9 8 )

Sharma và cs (2010)

Piper methysticum Kavain; nhóm

k a vap yron e

GABAa, dopamine D2

Vitex agnus-castus Vitexin, C asticin d o p a m in e D2 Meier và cs (2000)

N h ìn ch u n g đ ây là m ột h ư ớ n g ứ n g d ụ n g m ớ i v à c ó n h iều tiềm năng vì các n g u ồ n d ư ợ c liệu c ó thể đưa v à o sà n g lọ c là p h o n g phú v à n gày cà n g có

n h iều p rotein thụ thể m ớ i đ ư ợ c xác địn h, nhân d ò n g v à b iểu h iện thành c ô n g

v ớ i sự trợ g iú p c ủ a cá c c ô n g n gh ệ A D N v à protein tái tổ hợp.

1.5 S ơ lư ợ c v ề c á c t h ụ t h ể đ ư ợ c lự a c h ọ n t r o n g n g h iê n c ứ u• • • • • o o

1.5.1 Thụ th ể angioten sin I I (A ll)

T hụ thể a n g io te n sin II ( A l l ) là trung gian tác đ ộ n g củ a hệ renin -

a n g io ten sin - a ld o stero n e, đ ón g vai trò quan trọng trong đ iều hòa cân băng

m áu, cá c chất đ iện g iả i và h u yết áp C ó bốn phân typ thụ the A l l đã biêt (kí hiệu từ A T i đến A T 4) đều là các thụ thể kết cặp G -p rotein (G P C R ), trong đó phàn typ A T | là quan trọng nhất do tính p hổ b iến của n ó , tiếp đến là A T 2 Sự

h oạt hóa A T | thúc đẩy m ột s ố c o n đ ư ờ n g truyền tin (x e m H ìn h 7) c u ố i cù n g

dân đèn sự c o m ạch , đáp ứ ng v iêm , tăn g sinh tế bào, T u y v ậ y , sự hoạt hóa

bât th ư ờng củ a ch ú n g c ó thể là c ơ ch ế bệnh sinh m ột số bệnh lý khác nhau

liên quan đến h u y ết áp, x ơ vữ a đ ộ n g m ạch, c h ứ n g đ ô n g m áu, phì đại tâm thất

(C u m o w và c s, 1992; H o e v à S aaved a, 2 0 0 2 ) ít p h ổ b iến hơn A T ị, A T2 chủ

y ê u được biểu h iện trong g ia i đ oạn bào thai Ở n g ư ờ i trưởng thành, A T2

d ư ờ n g như chỉ đ ư ợ c b iểu h iện ở m ứ c tối th iểu V ai írò củ a A T2 v ớ i hệ tim

m ạ ch chưa biết đ ầy đủ, n h ư ng co n đ ư ờ n g truyền tin củ a n ó d ư ờ n g nh ư đ ộc lập

v ớ i A T ị (G unther, 1 9 8 4 ).

C ác thuốc đ iều h ò a h u yết áp p h ổ biến h iện n ay ch ủ y ế u tác đ ộ n g qua h ệ

ren in - a n g io ten sin - ald o stero n e v à ch ia làm 2 n h óm chính : 1) n h ó m thuổc

ức c h ê en zvm c h u y ể n h óa a n g io ten sin (A C E ), v í dụ như captop ril, en alap ril,

lisin o p ril và ram ipril; và 2) nhóm th uốc ức ch ế (c h ẹ n ) liê n kết củ a p h ối tử

a n g io ten sin II v à o thụ thể củ a nó, v í dụ như losartan, irbesartan, candesartan

v à c á c chất đối vận k h ô n g c ó bản chất peptit kh ác (K a tzu n g , 2 0 0 7 ).

AT,r

Co mạch, viêm, Tăng sơ vữa Đáp ứng viêm và Co mạch Tăng sinh và phân bào gây đông ináu, động mạch phân bào

tăng sinh

H ỉnh 7 T óm tắt c á c c o n đ ư ờ n g tr u y ề n tin q u a th ụ t h ể ATY A P-1: Protein h oạt h ỏ a 1;

AT1r: Thụ th ể All (phân typ 1); DAG: D iacylglycerol; IP3 : 1,4,5-in o sito ltrip h o sp h ate; JAK:

J a n u s kinase; MAP: protein h oạt h ỏa phân bảo; NADH: N ico tin a m id e-a d en in e

d in u cleotid e; NADPH: N ico tin a m id e-a d en in e d in u cleo tid e p h o sp h a te; N F - k B: y ếu tố nhân

k B; NO: Nitric oxide; OxLDL: C á c lipoprotein m ật độ thấp bị oxi h ỏ a (O xidized low -d en sity

lipoprotein); ROS: c á c g ố c oxi phàn ứng; STAT: yểu tổ truyền tin và h oạt h óa phiên mã;

PKC: Protein k in a se C; PLC: P h o s p h o lip a s e C; PTK: P h o sp h o ty r o sin e k in ase.

C ác th uốc ứ c c h ế A C E ngăn bư ớc ch u y ển hóa a n g io ten sin I (A T I) thành

a n g io te n sin II (A T II) là p h ối tử tác đ ộ n g trực tiếp lên thụ thể A ll T rong khi

đó, c á c th u ốc c h ẹ n thụ thể A l l (v iế t tắt là A R B ) cạnh tranh liên kết với ATII tại thụ thể của n ó N e u như các th u ốc ức ch ế A C E đ ư ợ c tìm thấy có các tác

d ụ ng phụ liên quan đến hoạt tính g iảm của A C E như tăn g kali huyết, giảm tiết

a ld o stero n e, g â y hạ đ ư ờ n g h u y ết d o chất ức ch ế A C E th ư ờ n g mẫn cảm với

in su lin , g â y th iêu m áu do tư ơ n g tác và làm g iảm hoạt tính củ a erythropoietin, thì c á c th u ốc c h ẹ n thụ the A l l k h ôn g c ó các tác d ụ n g phụ này (K atzu ng,

2 0 0 7 ) C ác th u ố c n h óm A R B đẩy A T II ra kh ỏi thụ thể A T ! và ức chế tác đ ộn g của A T II dẫn đ ế n h ạ h u yết áp, đ ồ n g thời khi n ồ n g đ ộ A T II tăng cao sẽ tác

đ ộn g lên thụ the A T2, c ũ n g g â y tác đ ộ n g hạ h u yết áp th eo c o n đư ờng thụ thể này D o ở n g o à i c o n đ ư ờ n g A C E , A T I c ò n c ó thể đ ư ợ c ch u y ển hóa thành ATII b ở i e n z y m c h y m a se v à m ột so en zy m ch u y ển h ó a k h ác, nên thuốc ch ẹn thụ th ê A l l th ư ờ n g b iểu h iện ứ c c h ế tác đ ộ n g của A T II triệt để hơn so với nhóm th u ố c ức c h ế A C E (G u o v à c s, 2 0 0 1 ; K atzu n g, 2 0 0 7 ).

1 5 2 v ề cá c t h ụ t h ể n h ậ n d iệ n m ầ m b ệ n h tr o n g đ á p ứ n g v iê m n h ó m

T o ll- lik e ( T L R ) v à D e c tin - 1

Đ á p ứ ng m iễ n d ịch ở đ ộ n g vật c ó x ư ơ n g số n g c ó th ể ch ia làm hai hệ

th ống chính: m ộ t hệ th ố n g c ó vai trò bảo v ệ v ò n g n g o à i (m iễ n dịch bẩm sinh;

innate im m unity) v à m ột hệ th ố n g đặc hiệu v à ghi n h ớ m ầm bệnh (m iễn dịch thích ứ n g; a d a p tive immunity). M ộ t cấu phần quan trọng của hệ m iễn dịch bẩm sin h là cá c thụ thể nhận biết m ẩm bệnh P R R (p a th o g en -a sso cia ted / pattern r e c o g n itio n receptor) đư ợ c biểu hiện ở cá c tế b ào bạch cầu Đ ây là các thụ th ể sau khi liê n k ết v ớ i c á c p h ối tử m ầm b ện h sẽ g â y đáp ứ ng tế bào và định h ư ớ n g cá c đáp ứ ng m iễn d ịch (Jan ew ay v à M ed z h ito v , 2 0 0 2 ) C ác thụ thể T L R là lớp thụ thể P R R đầu tiên đ ư ợ c tìm thấy và ch ú n g đ ư ợ c xác định có vai trò q u an trọ n g tron g khởi đầu các đáp ứ ng v iêm c h ố n g lại nh iều loại m ầm bệnh k h ác nhau M ộ t lớp thụ thể PR R thứ hai m ớ i đ ư ợ c phát hiện gần đây được g ọ i là các thụ the lectin loại c - C L R (C -ty p e lectin receptor) B an đầu

ch ú n g đ ư ợ c phát h iện chủ y ế u liên quan đến đáp ứ ng v iê m c h ố n g nấm, nhưng gần đ â y c ũ n g đ ư ợ c tìm thấy c ó vai trò trong đáp ứ ng m iễn d ịch với các m âm bệnh k h ác như v i khuẩn, virut và g iu n tròn (K errigan v à B row n , 2 0 1 0 )

D e c t i n - 1 là thụ th ể C L R đầu tiên đư ợ c tìm thấy và n g h iên cứ u kỳ nhất tới nay.

1.5.2.1 v ề các thụ thể Toll-like (TLR)

Ỏ đ ộ n g vật c ó vú , h ọ thụ thể T o ll-lik e đư ợc tìm thấy v ớ i ít nhất 13 loại (R o a c h và c s, 2 0 0 5 ) v ề cấu trúc (x e m H ìn h 8), các T L R g ồ m 3 m iền đặc trưng: i) m iền n g o ạ i bào giàu lơ x in xác định đặc trưng c h o m ỗi loại T LR và phối tử m ầm b ện h đặc hiệu của ch ú n g, ii) m iền x u y ê n m à n g , và iii) m iên nội bào g ồ m k h o ả n g 160 axit am in c ó cấu trúc g io n g thụ thê tê bào chât IL -1R

19

Zymosan Peptidoglycan Lipoprotein

Lipopolysaccharit (LPS), Taxol Protein dung hợp (F) của virut hợp bầo hô hấp Fibronectin, HSP60, HSP70, Hyaluronan

ARN mạch đơn Imiquimod

Poly l:C ARN virut sợi đôi

TIR3

CpG ADN

H ìn h 8 C ấ u tr ú c , s ự p h â n b ố v à p h ố i t ử c ủ a c á c th ụ t h ể T o ll-lik e (TLR) C á c thụ

th ể TLR m à n g tế b à o g ồ m T LR -1,-2 ,-4 ,-5 ,-6 C á c thụ th ể TLR nội b à o (e n d o s o m e ) gồ m

TLR-3,-7,-8,-9 C á c thụ thể TLR đư ợ c chọn cho nghiên cứu này gồm TLR2 (phối tử:

Z y m o sa n ), TLR4 (phối tử: L PS) và TLR3 (phối tử: P oly l:C) (theo Krishnan, 2007).

nên đ ư ợ c g ọ i là m iền tư ơ n g đ ồ n g T oll/IL -1 (v iế t tắt là T IR ) S ự phân b ố chi tiết củ a c á c T L R ch ư a b iết đầy đủ, so n g đến nay m ột n h óm (g ồ m T L R -1 ,- 2 ,-

4 ,-5 v à -6) đ ư ợ c tìm th ấy x u y ê n m à n g sinh chất (n h ư vậ y , đây là cá c thụ thể

m àn g tế b ào); tro n g khi đó, m ột n h óm thứ hai (g ồ m T L R -3 ,-7 ,-8 v à -9 ) đư ợ c tìm thấy x u y ê n m à n g e n d o so m e (n ên đ ư ợ c c o i là các thụ th ể tế bào chất).

K hi p h ối tử m ầm b ệnh (c á c thành phần củ a v i sin h vật như

p e p tid o g ly c a n - P E G , lip o p o ly sa cc h a r id e - L P S , A R N ) liê n kết v à o cá c thụ thê T L R , ch ú n g h oạt hóa các co n đ ư ờ n g truyền tin, dẫn đ ến hoạt h ó a nhân tố nhân k B tro n g b à o tư ơ ng (N F - k B ) N F - k B sau khi đ ư ợ c h oạt h óa s ẽ di ch u y ển vào nhân, liên k ết v à o prom oter v à thúc đẩy p h iên m ã cá c g e n m ã c h o các

c y to k in e tiền v iê m (trợ v iê m ) như T N F -a , IF N -y, IL-1Ị3, IL -2 , IL -6, I L - 1 2 hoặc cá c c y to k in e kh áng v iê m như IL -4 , IL -5, IL -1 0 , T G F -P H ì n h 9 m ô tả

m ột s ố c o n đ ư ờ n g truyền tin qua cá c thụ thể T L R m àn g tế b ào (T L R -2 và -4 )

v à T L R tế bào chat (T L R -3 ).

T ron g đáp ủ n g v iê m , các c y to k in e tiền v iê m c ó tác d ụ n g thúc đẩy các đáp ứ ng v iê m nh ằm tiêu diệt cá c v i sinh vật m ầm bệnh , n h ư n g ch ú n g cũ n g có thể g â v ra cá c tổn th ư ơn g nội m ạc bởi v iệ c g iả i p h ó n g các chất trung gian như

T L R 1/6 T L R 2 TLR 4 TLR3

Hỉnh 9 Quá trinh truyền tin của các thụ thể TLR-2, -3 và -4 Theo đó, những con đường này được chia lảm 2 loại: phụ thuộc vào MyD88 hoặc không phụ thuộc vào MyD88 Theo con đuòng phụ thuộc vào MỵD88 (TLR-2 và -4), MyD88 sau khi liên kết vào miền TIR của TLR sẽ phosphoryl hỏa IRAK4 dẫn đen phosphoryl hóa IRAKI IRAK1 phosphoryl hỏa TRAF6 dẫn đến ubiquitin hóa phức TAK Sự hoạt hóa các con đường p38, JNK và IKK dẫn đến các đáp ứng viêm và kháng virut thông qua sự tiết các cytokines Theo con đuửng không phụ thuộc MyD88 (ĨLR-2 và TLR-3), protein được hoạt hóa lả TRIF (yếu tố thúc đẩy sản sinh inteferon - IFN) Các kí hiệu trên hình: ISRE - yếu tố đáp ứng kích thích iinteferon, kB - vị tri liên kết của NF-kB, p - phosphoryl hóa, Ub - ubiquitin hóa (theo Kríshnan, 2007).

đ ê t h ử n g h iệ m k h ả n ă n g tư ơ n g tá c v ớ i d ư ợ c liệ u s ẵ n c ó ở V i ệ t N a m là c ỏ m ầ n

trâu (E leu sin e ỉn d ica L , Graerth) v ố n đã đ ư ợ c c ô n g b ố c ó hoạt tính kháng

Vi khuẩn Gram (+), Nấm, Vi nấm

TRIF

Toll like 3

(TLR-3)

Axit polyinosinic-polycytidylic (Poll l:C)

Retrovirut (virut ARN sợi đôi)

TRIF

Toll like 4

(TLR-4)

Lipopolysaccharide (LPS)

Vi khuẩn Gram (-) MyD88-TIRAP,

TRIF-TRAM

1.6 S ơ lư ợc về các loài cây thuốc được nghiên cứu

B ổ n lo à i c â y t h u ố c ở V iệ t N a m đ ư ợ c lự a c h ọ n c h o t h ử n g h iệ m đ á n h g iá

tư ơ n g tá c v ớ i th ụ th ể A l l d ự a tr ê n k in h n g h iệ m c ù a y h ọ c c ổ tr u y ề n , g ồ m c ỏ

m ầ n tr ầ u (E leu sin e indica L ) , h ạ k h ô th ả o (Prunella vulgaris Ly), h ò e

(Sophora ja p o n ic a L ) v à tầ m g ử i ( Taxillus ph ilippen sis B a n ) T h e o đ ó , d ư ợ c liệ u t ừ c á c lo à i c â y th u ố c n à y đ ư ợ c d ù n g tr o n g m ộ t s ố b à i th u ố c đ iề u h ò a

h u y ế t á p , m à t h ụ th ể A l l c ó th ể là m ộ t đ íc h tá c đ ộ n g c h ín h R iê n g d ịc h c h i ế t

c ỏ m ầ n t r ầ u c ò n đ ư ợ c c h ọ n đ ể đ á n h g iá tá c đ ộ n g đ ế n c h ứ c n ă n g m ộ t s ố th ụ

th ể đ á p ứ n g v iê m th e o m ô h ìn h p h â n tử tr ê n c ơ s ở m ộ t n g h iê n c ứ u tr ư ớ c đ â y

c h o th ấ y d ư ợ c l i ệ u n à y c ó h o ạ t tí n h k h á n g v iê m t r ê n m ô h ìn h đ ộ n g v ậ t th í

n g h iệ m D ư ớ i đ â y là m ộ t s ố th ô n g tin b ổ s u n g v ề đ ổ i tư ợ n g n g h iê n c ứ u

1.6.1 Cỏ m ần trầu (Eleusíne indica L , G raerth.)

Hình 12 Hạ khô thảo - Prunella vulgaris L

C á c c h â t ta n tr o n g th u ô c s ă c c ó tá c d ụ n g h ạ h u y ê t á p lâ u d à i tr ê n b ệ n h n h â n v à

là m h ế t tr i ệ u c h ứ n g c a o h u y ế t á p ( Đ ỗ H u y B íc h v à c s , 2 0 0 4 )

H ò e ( H ì n h 1 3 ) c ò n c ó m ộ t s ố tê n g ọ i đ ịa p h ư ơ n g k h á c là h ò e h o a , h ò e m ễ , lài lu ồ n g , th u ộ c h ọ Đ ậ u ( F a b a c e a e ) C â y n h ỡ , t h ư ờ n g x a n h , c a o 5 - 1 0 m T h â n

tr ầ u (Eleusine indica L , G r a e r th ) , h ạ k h ô th ả o (Prunella vulgaris L.), h ò e

{Sophora ja p o n ic a L ) v à tầ m g ử i ( Taxillus philipperĩsis ( C h a m & S c h l e c h t )

B a n )

2.1.1 Vât liêu sinh hoc• • •

C h u ộ t n h ắ t t r ắ n g c h ủ n g S w is s , k h ố i lư ợ n g 3 0 - 4 0 g đ ư ợ c m u a từ v iệ n V ệ

s in h d ịc h tễ t r u n g ư ơ n g ( N I H E )

M ầ u th ự c v ậ t d o K h o a tà i n g u y ê n D ư ợ c liệ u ( V iệ n D ư ợ c L iệ u ) c u n g c ấ p ,

v ớ i d a n h m ụ c đ ị a đ iể m th u m ẫ u , b ộ p h ậ n d ù n g là m d ư ợ c liệ u v à k ý h iệ u tiê u

b ả n h iệ n đ ư ợ c lư u tạ i B ả o tà n g D ư ợ c L iệ u n ê u tr ê n B ả n g 3

B ả n g 3 C á c m ẫ u d ư ợ c liệ u đ ư ợ c t h u t h ậ p v à s ử d ụ n g t r o n g n g h i ê n c ứ u

Tên loài (họ) Tèn thường gọi Bộ phận lẩy Địa điểm lấy mẫu Ký hiệu tiêu bản

Eleusine indica

Gaerth (Poaceae)

2.1.3 P hư ơng p h á p nghiên cứu

2.1.3.1 Chuẩn bị dịch chiết m ethanol dược liệu

M ỗ i lo à i c â y t h u ố c đ ư ợ c lấ y ở 3 đ ịa đ iể m p h â n b ố n g ẫ u n h iê n (B ảng 3)

C á c m ẫ u d ư ợ c liệ u đ ư ợ c s ấ y k h ô ở n h iệ t đ ộ d ư ớ i 4 5 ° c , r ồ i d ù n g k é o c ắ t c à n h ( la u s ạ c h b à n g c ồ n 7 0 % ) c ắ t th à n h c á c m ả n h n h ỏ ( k h o ả n g 0 ,3 - 0 ,5 c m ), rồ i

2 1.3.2 Thu thụ th ể m àng

Q u y tr ì n h th u th ụ th ể m à n g g ồ m c á c b ư ớ c c h ín h s a u đ â y :

n g u y ê n v ẹ n r ồ i c h u y ể n lê n đ á tơ i c ắ t lư ợ c b ỏ n h ữ n g p h ầ n m ô k h á c (c ơ , g â n )

- Đ ẩy p h ổ i tử đánh dấu huỳnh quang bằng p h ổ i tử không đánh dấu: ử

- Phủ đ ĩa ELI SA với kháng nguyên thứ nhất: p i p e t 1 0 0 |il d u n g d ịc h F -

B S A tr a c á c m ỗ i g iế n g c ủ a đ ĩa đ ọ c E L I S A ; b ọ c k ín đ ĩ a b ằ n g g iấ y n h ô m ; ủ q u a

2.1.3.5 Đánh g iá khả năng cạnh tranh liên kết với thụ th ể của dịch chiết

dư ợc liệu với p h ổ i tử đặc hiệu (ELISA cạnh tranh)

h à m lư ợ n g p r o te i n tổ n g s ố là 10 m g /m l v ớ i th ể tíc h tố i th i ể u là 5 0 0 |il

2 9