Sàng lọc và biểu hiện gen mã hoá protein ức chế protease củacủa vi sinh vật liên kết hải miên spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển miền trung, việt nam

Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia Bảng 3.9 Gen có hoạt tính sinh học mới so với ở Việt Nam...73 Bảng 3.10 So sánh hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ

PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia

vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN

Spheciospongia vesparium QT2 THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN

TRUNG, VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường

2 PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc

Hà Nội, 2020

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tớiPGS.TS.NCVCC Phạm Việt Cường, nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoahọc Miền Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam- Nhà Khoa họcmẫn cán, người thầy mẫu mực- người đã giúp tôi định hướng nội dung, giúp đỡ vềtinh thần, kiến thức chuyên môn, cơ sở vật chất và chỉ bảo tận tình giúp tôi vượt quarất nhiều khó khăn để hoàn thành Luận án trong suốt những năm qua.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kim Cúc,Chủ nhiệm đề tài ĐTĐLCN.17/14 “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật liên kếthải miên tại biển miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện và sàng lọc các chất hoạttính sinh học mới” đã định hướng cho luận án của tôi và quan tâm, giúp đỡ tôi trongsuốt thời gian thực hiện luận án

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã cửtôi đi học, tập thể Trung tâm sinh học Phân tử Nghĩa Đô, Ths.NCS Tôn Thất HữuĐạt, phòng quản lý tổng hợp Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung đã tạo điềukiện cho tôi làm việc, hoàn thành các thủ tục giấy tờ và hoàn thiện các nội dungtrong nghiên cứu này

Tôi trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Công nghệSinh học đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp đỡ tôi hoàn thành mọithủ tục cần thiết trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luônbên cạnh động viên, giúp đỡ, chia sẻ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập,nghiên cứu và hoàn thiện luận án của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

NCS Trần Thị Hồng

i

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với cáccộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một số kết quảlần đầu tiên được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành có uy tín với sự đồng

ý và cho phép của các đồng tác giả

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

NCS Trần Thị Hồng

ii

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên 3

1.1.1 Giới thiệu về hải miên 3

1.1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên 6

1.2 Sơ lược về metagenomics 14

1.3 Chất ức chế protease (PIs) 19

1.3.1 Sơ lược protease 19

1.3.2 Chất ức chế protease và phân loại 20

1.3.3 Cơ chế hoạt động của PIs 25

1.3.4 Ứng dụng của chất ức chế protease 28

1.3.5 Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sịnh vật liên kết với hải miên trong và ngoài nước 31

1.4. Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris 35

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu nghiên cứu 37

2.1.1 Vật liệu… 37

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu… 39

2.1.3 Hóa chất…. 39

2.1.4 Máy móc thiết bị 39

2.1.5 Dung dịch và môi trường sử dụng 40

2.2 Phương pháp nghiên cứu 42

2.2.1 Phương pháp tách DNA metagenome của VSV liên kết hải miên 43

iii

2.2.4 Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế

plasmid mang gen PIs 47

2.2.5 Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E coli (DE3) 48

2.2.6 Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris 49

2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease 50

2.2.8 Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs tái tổ hợp 52

2.2.9 Phân tích thống kê 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Thu thập mẫu hải miên 53

3.2 Kết quả tách chiết DNA metagenome 54

3.2.1 Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị 54

3.2.2 Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử 55

3.3 Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị, Việt Nam bằng tin sinh học 56

3.3.1 Lắp ráp reads của DNA metagenome 56

3.3.2 Kết quả dự đoán gen 58

3.3.3 Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen 60

3.3.4 Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị 64 3.3.5 Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ liệu (CSDL) metagenomics71 3.4. Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia coli 75 3.4.1 Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI-QT 76

iv

3.4.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT

ở trạng thái tan cao nhất 81

3.4.5 Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E coli và nhận diện bằng khối phổ 87

3.4.6 Thử hoạt tính ức chế của protein tái tổ hợp PI-QT với protease 89

3.5 Nghiên cứu biển hiện ức chế protease (PIs) trong hệ nấm men Pichia pastoris 91

3.5.1 Tạo plasmid pPIC9 mang gen PI-QT 91

3.5.2 Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT 92

3.5.3 Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P pastoris SMD1168 93

3.5.4 Kết quả thử hoạt tính ức chế của protein PI-QT biểu hiện trong nấm men 96

3.5.5 Kết quả phát hiện chất ức chế protease bằng điện di trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất casein 0,1 % 97

3.5.6 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện P pastoris SMD 1168 [pPIC9/PI-QT] 98

3.5.7 Tinh sạch protein PI-QT tái tổ hợp biểu hiện trong nấm men P pastoris qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharore 4B 104 3.5.8 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PI-QT 106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO 114

v

ACN Acetonitrile

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp, kb, kDa Base pair, Kilo base, Kilo dalton

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

HMA High microbial abundance

IAA 3-Indolebutyric acid

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

KH&CN Khoa học và Công nghệ

LMA Low microbial abundance

NCBI National Center for Biotechnology Information

P pastoris Pichia pastoris

PCR Polymerase Chain Reaction

PIs Protein inhibitors

vi

RNase Ribonuclease

SCUBA Self contained underwater breathing apparatus

SDS Sodium dodecyl sulphate

Bảng 1.2. Chất ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên……… 32

Bảng 2.1. Thành phần của bản gel polyacryamide 42

Bảng 3.1. Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển

Quảng trị 54

Bảng 3.2. Kết quả lắp ráp DNA metagenome của mẫu QT2 57

Bảng 3.3. Kết quả dự đoán, cluster genes và kiểm tra tính toàn vẹn của gen

(mẫu QT2) 59

Bảng 3.4. Tổng hợp kết quả chú giải chức năng gen (QT2) 60

Bảng 3.5. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia

vesparium QT2 theo giới và ngành 65

Bảng 3.6. Phân loại các reads 16S rRNA của hải miên Spheciospongia

Bảng 3.9 Gen có hoạt tính sinh học mới (so với ở Việt Nam) 73

Bảng 3.10 So sánh hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch

thu hồi biểu hiện trong P pastoris SMD1168 và E coli

BL21(DE3) 106

viii

Hình 1.1. Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô 4

Hình 1.2. Sơ đồ đại diện cho hải miên asconoid 4

Hình 1.3. Vai trò của vi sinh vật với hải miên 8

Hình 1.4. Ba trạng thái liên kết chung củ VSV và hải miên 10

Hình 1.5. Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các cộng đồng VSV liên kết hải miên 11

Hình 1.6. Ba chất ức chế protease có sẵn trên thị trường 20

Hình 1.7. Một vài họ PPI quan trọng 23

Hình 1.8. Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitor) 26

Hình 1.9. Cơ chế ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II 27

Hình 1.10. Serpin ức chế protease 28

Hình 2.1. Cấu trúc vectơ pET-32a(+) 38

Hình 2.2. Cấu trúc vectơ pPIC9 39

Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị 54

Hình 3.2. Điện di đồ trên gel agarose 1 % 56

Hình 3.3. Kết quả tinh sạch dữ liệu QT2 57

Hình 3.4. Phân bố độ dài contig sau lắp ráp 58

Hình 3.5. Phân bố độ dài gen 59

Hình 3.6. Phân loại chức năng gen trên cơ sở dữ liệu COG 61

Hình 3.7. Phân nhóm chức năng của enzyme trên cơ sở dữ liệu CAZy 62

Hình 3.8. Kết quả phân loại trên cơ sở dữ liệu KEGG 63

Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1,8 % 64

Hình 3.10. Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 theo giới và ngành 66

Hình 3.11. Phân loại vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 biển Quảng Trị theo chi 69

Hình 3.12. So sánh trình tự axít amin của protein PI-QT với các trình tự tương đồng trên cơ sở dữ liệu NCBI 76

Hình 3.13. Mối phát sinh quan hệ gen của protein PI-QT với các serpin

ix

đoán bằng (PS)2-v2 77

Hình 3.14. (A) –Gel agarose của vectơ cắt bằng EcoRI/NotI, (B) – Gel

agarose của plasmid tái tổ hợp ([pET-32a(+)/PI-QT]) được cắt

bằng enzyme EcoRI/ NotI 78

Hình 3.15. A- Kết quả điện di PAGE 12,6 % kiểm tra E coli

BL21(DE3)/[pET-32a(+)/PI-QT] biểu hiện ở 37 oC 80

Hình 3.16. Kiểm tra trạng thái của protein PI-QT biểu hiện 80

Hình 3.17. Protein PI-QT biểu hiện trong E coli dưới các nồng độ IPTG

khác nhau 81

Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tạo protein PI-QT tan 83

Hình 3.19. (A)- Điện di SDS- PAGE 12,6 % kiểm tra khả năng tan của

protein ở OD600= 0,6 trước khi cảm ứng; (B)- Trạng tháiprotein PI-QT (% tan) và hàm lượng protein tạo ra khi OD600trước cảm ứng khác nhau. 84

Hình 3.20. Sử dụng đệm đẩy cột imidazole 100 mM, 250 mM, 300 mM,

500 mM 86

Hình 3.21. Kết quả Western blot và kết quả loại bỏ đuôi dung hợp

TRx-His-tag ra khỏi protein PI-QT bằng thrombin trên gel PAGE 12.6 % 88

SDS-Hình 3.22. Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với

Trypsin và Elastase trên đĩa thạch 90

Hình 3.23. Thử nghiệm hoạt tính ức chế protein tái tổ hợp PI-QT đối với

ɑ-Chymotrypsin trên đĩa thạch 90

Hình 3.24. Điện di đồ trên gel agarose 1 % sản phẩm cắt mở vòng vectơ

pPIC9 (a) và cắt kiểm tra plasmid [pPIC9/PI-QT] 91

Hình 3.25. Điện di đồ trên gel agarose 1% sản phẩm cắt kiểm tra plasmid

pPIC9/PI-QT và sản phẩm PCR bằng cặp mồi AOX1 92

Hình 3.26. Kết quả kiểm tra kiểu hình và kiểu gen nấm men mang gen

PI-QT 92

x

Hình 3.28. Điện di đồ protein PI-QT biểu hiện trong P pastoris

SMD1168 [pPIC9/PI-QT] 95

Hình 3.29. Đồ thị tương quan giữa hàm lượng protein ngoại lai tạo ra với

mật độ tế bào nấm men tái tổ hợp 95

Hình 3.30. Định tính khả năng ức chế protease của protein biểu hiện 96

Hình 3.31. Kết quả thử hoạt tính ức chế protease của dịch chiết thô

P pastoris SMD1168 không mang gen PI-QT 97

Hình 3.32. Điện di SDS-PAGE 12,6 % đồng trùng hợp với cơ chất casein

0.1 % và xử lý bằng enzyme trypsin 98

Hình 3.33. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo protein

PI-QT (mg/L) trong nấm men P pastoris 99

Hình 3.34. Khảo sát nhiệt độ biểu hiện của P pastoris SMD 1168

Hình 3.37. Điện di SDS – PAGE 12,6 % protein PI-QT qua màng cut off

30 kDa và qua cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B 105

Hình 3.38. Hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT tinh sạch biểu

hiện trong nấm men P pastoris SMD1168 105

Hình 3.39. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hợp chất PI-QT 106

Hình 3.40. Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến hợp chất PI-QT 107

xi

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-TRẦN THỊ HỒNG

SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ

PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia

vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG , VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2020

và đã được chứng minh là có khả năng làm giảm đáng kể mức độ virus HIV trongmáu.

Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện các phân tử protein mới có hoạt tính ứcchế đặc hiệu các protease đích khác nhau, liên quan đến các loại bệnh là một hướngnghiên cứu được quan tâm hiện nay Hải miên và các vi sinh vật liên kết với hảimiên được xem là một nguồn để phát hiện và khai thác các hợp chất có hoạt tínhsinh học mới phục vụ chế tạo thuốc, các peptide có hoạt tính ức chế protease là mộttrong số đó Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật liên kết hải miên thuộc loại khôngnuôi cấy được nên hạn chế khả năng khai thác chúng Nhờ kỹ thuật metagenomic,với sự hỗ trợ của thiết bị giải trình tự gen hiệu năng cao và công cụ tin sinh chophép phát hiện các gen, cụm gen có chức năng mã hóa cho các PI, cho phép khaithác được các PI từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy được

Đến nay tại Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về hải miên, từ việc phânlập vi sinh vật trên hải miên, đến tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ nhóm

vi sinh vật này Tuy nhiên, vẫn còn chưa có nghiên cứu nào sử dụng công cụmetagenomics và công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới để phát hiện, sàng lọc cácgen có hoạt tính sinh học, trong đó có hoạt tính ức chế protease và biểu hiện các gen

này trong hệ Escherichia coli và nấm men Pichia pastoris.

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện luận án với tên đề tài: “Sàng lọc và biểu

hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển Miền Trung, Việt Nam”.

Mục tiêu của đề tài luận án

Phát hiện và sàng lọc gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ứcchế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên thu nhận từ biển Miền Trung, Việt Nam

bằng phương pháp metagenomics Sau đó biểu hiện gen chọn lọc in vitro và xác

định hoạt tính

Nội dung nghiên cứu

1 Tách DNA của vi sinh vật liên kết với hải miên, xác định nồng độ DNA và độ tinh sạch, lựa chọn mẫu giải trình tự metagenomics

2 Phân tích dữ liệu metagenomics mẫu đã giải trình tự bằng các công cụ tin sinhhọc Đánh giá đa dạng sinh học của vi sinh vật liên kết với hải miên Từ CSDLmetagenomics khai thác gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất có hoạt tính ứcchế protease

3 Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease trong hệ biểu hiện

Escherichia coli và hệ biểu hiện nấm men Pichia pasroris.

4 Đánh giá hoạt tính ức chế protease của protein tái tổ hợp

Những đóng góp mới của luận án

1 Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hảimiên của mẫu hải miên QT2 thu nhận tại vùng biển Quảng Trị (Miền Trung),Việt Nam Cơ sở dữ liệu thu được có ý nghĩa về mặt khoa học góp phần bảo tồnnguồn gen vi sinh vật biển Việt Nam và có tiềm năng khai thác nguồn gen trên đểứng dụng vào thực tiễn

2 Thu nhận được gen mới PI-QT mã hóa cho PIs và biểu hiện thành công ở E coli

và P pastoris Hoạt tính ức chế protease của protein biểu hiện đã được đánh giá

và kết quả thu được cho thấy protein PI-QT tái tổ hợp từ E coli có hoạt tính ức chế trypsin, ức chế ɑ-chymotrypsin và protein từ P pastoris thể hiện hoạt tính ức

chế trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên

1.1.1 Giới thiệu về hải miên

Hải miên là một ngành động vật đa bào nguyên thủy, có cấu trúc tế bào táchbiệt và là nhóm động vật sống bám, tuy nhiên một số loài có khả năng vận động nhờvào tế bào chất hay roi Hải miên có thể sống trong các loại môi trường khác nhau ởbiển và trong tất cả các vùng khí hậu Từ các vùng cực và ôn đới, đến hệ sinh tháirạn san hô nhiệt đới và cận nhiệt đới Tính đến năm 2019, khoảng 9.125 loài hảimiên nói chung được chấp nhận có trong danh sách của Cơ sở dữ liệu hải miên thếgiới (Http://www.marinespecies.org) Vì vậy, các quần thể hải miên có sự khác biệt

về sự đa dạng, sự phong phú và mật độ Các loài hải miên được chia thành 4 lớp:Calcarea (hải miên đá vôi), Demospongia (demosponges), Hexactinellida (hải miênthủy tinh), và Homoscleromorpha Lớp lớn nhất là Demospongia, gồm khoảng 83,4

% tất cả các loài được biết Trong số các loài hải miên được biết đến, chỉ có khoảng

250 loài là sống trong nước ngọt (van Soest et al., 2012).

Hải miên có các hình dạng khác nhau, từ hình cầu, hình ống, hình bình hoặc

phân nhánh và kích thước cũng khác nhau, từ một vài milimet (hải miên Cliona

celata), đến vài mét (hải miên Xestospongia muta) Phần lớn hải miên là động vật

ăn lọc, trừ các loài ăn thịt cư trú ở môi trường biển sâu nghèo dinh dưỡng (Lee et

al., 2012) Hình dáng cơ thể chung của loài ăn lọc được chuyên môn hóa cho lọc

nước để lấy dinh dưỡng, hô hấp và bài tiết Phụ thuộc vào thiết kế của hệ thống lọcnước, hải miên được chia thành: (1) Asconoid, khi cơ thể hải miên có hình trụ rỗng,

bề mặt có các lỗ nhỏ; (2) Syconoid, khi bề mặt cơ thể hải miên có xen kẽ các túichui vào trong và lồi ra ngoài, làm tăng tỉ lệ giữa diện tích và thể tích; hoặc (3)Leuconoid, khi cơ thể hải miên được tạo thành bởi các kênh dẫn nước bao gồm rấtnhiều các khoang hình cầu nối với nhau bởi các ống giống như mao mạch (Hình 1.1

và 1.2) (Cavalcanti & Klautau., 2011; Webster & Thomas., 2016)

Hình 1.1 Cấu trúc cơ thể hải miên và các mô.

(Nguồn: Cavalcanti & Klautau., 2011).

(A): Asconoid; (B): Syconoid; (C): Leuconoid Mô liên kết: mesophyl (màu xám),lớp bề mặt (pinacoderm) và một lớp tế bào bên trong hình thành bởi các tế bào hìnhroi (choanoderm: màu đen)

Hình 1.2 Sơ đồ đại diện cho hải miên Asconoid.

(Nguồn: Webster &Thomas., 2016).

Nước biển đi vào hải miên thông qua các lỗ nhỏ (ostia) vào lớp bề mặt(pinacoderm) Các tế bào roi choanocyte được sắp xếp thành vòng tròn lót hệchuyển nước của hải miên và chịu trách nhiệm di chuyển nước qua hải miên chođến khi thải ra qua các lỗ thoát nước (osculum) Vi sinh vật môi trường là các tế bàomàu xanh, trong khi mật độ cộng đồng vi sinh vật liên kết có trong mô liên kết màuđỏ

Cấu trúc cơ thể hải miên được giữ vững bởi mô liên kết và các loại tế bào khácnhau Các thành phần khung riêng biệt làm cho hải miên có cấu trúc toàn vẹn đượccấu tạo từ các gai (spicules), canxi (calcareous) hoặc silic (siliceous), chitin hoặc sợi

collagen (collagenous spongin) (Hentschel et al., 2012).

Thành phần hóa học, sự khác biệt cấu trúc và kích thước gai là các đặc điểmhình thái quan trọng để phân loại hải miên Lớp Demospongia vàHomoscleromorpha có sợi collagen hoặc các gai hoặc cả hai LớpHomoscleromorpha cũng có đại diện không có gai nhưng có sợi collagen Lớp hải

miên đá vôi và hải miên thủy tinh có canxi hoặc silic, tương ứng (van Soest et al.,

2012)

Là loài ăn lọc, hải miên xử lý hàng trăm lít nước biển một ngày, vì vậy thức

ăn của chúng bao gồm VSV, sinh vật nhân chuẩn nhỏ, các hợp chất hữu cơ nhỏ

(de Goeij et al., 2013) Thức ăn được tế bào roi và lớp bề mặt của hải miên bắt giữ,

và chuyển đến các tế bào mô liên kết và tiêu hóa bởi tế bào khởi thủy(archaeocytes) Tiếp theo, các sản phẩm của thức ăn đã được tiêu hóa được phân bốđến các tế bào mô liên kết khác và cuối cùng các thứ không được tiêu hóa và sảnphẩm bài tiết được trục xuất ra khỏi hải miên thông qua các kênh thở ra (exhalant)

hoặc mặt ngoài qua ngoại tế bào (exocytosis) (Maldonado et al., 2012).

Hải miên có sự đa dạng cao và là một thành phần quan trọng của quần thểsinh vật đáy biển, từ cửa sông, bờ biển đến biển sâu Nhóm này là một trong nhữngnguồn các hợp chất hoạt tính sinh học từ biển nổi bật nhất, với khoảng 4851 hợpchất (năm 2014), đóng góp gần 30 % tổng số các hợp chất tự nhiên từ biển đượcphát hiện Trong 10 năm từ 2001 đến 2010, hơn 2400 các sản phẩm tự nhiên mới

được phát hiện từ 542 chi và 671 loài hải miên (Mehbub et al., 2014) Rất nhiều hợp

chất nhận được từ hải miên, gồm terpenoids, alkaloids, peptides, và polyketides

(Tung et al., 2009; Utkina & Denisenko., 2011; Kalinin et al., 2012) và chúng có

nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học, được sử dụng như các chất

kháng sinh, kháng ung thư, kháng virus, chống viêm và chống độc (Hirashima et

al., 2010; Joseph & Sujatha., 2011; Li et al., 2013; Perdicaris et al., 2013) Do sự

tương đồng cao của một số hợp chất nhận được từ hải miên với các chất trao đổi thứcấp của VSV đã biết, người ta tin rằng ít nhất một số chất hoạt tính sinh học là do

VSV liên kết sản sinh Việc định vị các chất trao đổi thứ cấp trong các vi sinh vật

cộng sinh đã ủng hộ giả thiết này (Wilson et al., 2014).

1.1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên

Vi sinh vật liên kết hải miên được tìm thấy cả trong và ngoài tế bào hải miên,nằm trong mô liên kết hoặc trong lớp ngoài của hải miên Các vi khuẩn và cổ khuẩngồm ngành Thaumarchaeota và các ngành vi khuẩn Acidobacteria, Actinobacteria,Bacteroidetes, Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Gemmatimonadetes,Nitrospirae, Proteobacteria (Alpha-, Beta-, Gamma-, và Delta-), Planctomycetes,

Verrucomicrobia, và Poribacteria (Hentschel et al., 2012) Từ nghiên cứu giải trình

tự thông lượng cao về quần xã VSV liên kết hải miên, số lượng ngành VSV trong

một hải miên tăng từ 23 ngành (Webster et al., 2010) lên đến 47 ngành (Reveillaud

et al., 2014) Theo số liệu mới nhất gần đây, hơn 60 ngành VSV đã tìm được từ các

mẫu hải miên biển theo phân loại của Silva và hơn 70 ngành theo phân loại của

Greengenes (Moitinho-Silva et al., 2017) Nhìn chung, VSV liên kết hải miên có

các loại tương tác khác nhau, có lợi hoặc có hại, từ việc là nguồn thức ăn, ký sinh,

gây bệnh, đến hỗ sinh và hội sinh (Hình 1.3) (Taylor et al., 2007; Lafi et al., 2009).

Vi khuẩn liên kết hải miên được chia ra thành các nhóm: vi khuẩn quanghợp, vi khuẩn dị dưỡng, cổ khuẩn oxi hóa ammonia Ba loại liên kết rộng rãi của vikhuẩn với hải miên gồm: (1) Lượng lớn các quần thể vi khuẩn đặc hiệu hải miêntrong mô liên kết hải miên; (2) Các quần thể nhỏ vi khuẩn bên trong tế bào riêngbiệt; (3) Các quần thể vi khuẩn không đặc hiệu giống với các quần thể trong môi

trường nước xung quanh (Mares et al., 2017).

VSV nhân chuẩn là một trong những thành phần quan trọng và đa dạng củacác hệ sinh thái biển; tuy nhiên, chúng được đánh giá thấp so với các VSV khác.Trong hải miên, chủ yếu là thấy nấm men Trái ngược với các cộng đồng vi khuẩnliên kết với hải miên, các nghiên cứu về sự liên kết giữa nấm và hải miên vẫn còn

rất khiêm tốn (Rodríguez-Marconi et al., 2015; Naim et al., 2017) Các sinh vật

nhân chuẩn khác như "SAR" - một nhánh bao gồm Stramenopiles, Alveolates và

Rhizaria cũng đã được phát hiện trong hải miên (Burki el al., 2007; Webster et al.,

2004; Sipkema & Blanch., 2009) Tuy nhiên, cộng đồng các VSV nhân chuẩn

dường như không cộng sinh chặt chẽ với hải miên (Rodríguez-Marconi et al.,

2015)

Vai trò của vi sinh vật với hải miên

VSV liên kết hải miên có vai trò khác nhau đối với vật chủ (Hentschel et al., 2012; Taylor et al., 2007) Ví dụ, vật chủ hải miên có thể nhận được lợi ích từ VSV liên kết ở dạng chất trao đổi thứ cấp, sinh tổng hợp vitamin (Siegl et al., 2011), loại

bỏ chất thải trao đổi chất, ổn định khung hải miên hoặc ngay cả bảo vệ hải miênkhỏi tia UV Các chất trao đổi thứ cấp của VSV có thể là những nhân tố quan trọngtrong các cơ chế bảo vệ hóa học của hải miên chống lại các loại động vật ăn thịt hảimiên, các nguồn bệnh hoặc động vật không cuống đáy cạnh tranh không gian (ví dụsan hô) (Pawlik., 2011)

Rất nhiều VSV liên kết hải miên tham gia vào các chu trình dinh dưỡng phứctạp giữa hải miên và môi trường Ví dụ, quá trình chuyển hóa quang tự dưỡng(photoautotrophic) và hóa tự dưỡng (chemoautotrophic) của cacbon vô cơ và hữu cơ

hòa tan như một phần của chu trình cacbon ở hải miên (Hentschel et al., 2012; Easson & Thacker., 2014; Maldonado et al., 2012) Một số VSV cộng sinh có thể có

chức năng quan trọng trong chu trình nitơ của hải miên, và tham gia vào quá trìnhchuyển hóa nitơ như cố định nitơ, nitrit hóa, oxy hóa yếm khí ammonia và phản

nitrit hóa (Maldonado et al., 2012; Fan et al., 2012) Rất nhiều loài hải miên nhiệt đới có vi khuẩn lam (cyanobacteria) liên kết (ví dụ: chi Synechococcus) (Bayer et

al., 2014a) cố định nitơ thành ammonia cho hải miên Hải miên cũng được lợi khi

được cung cấp dinh dưỡng như phosphate hữu cơ hay glycerol Có đến

50 % nhu cầu năng lượng và 80 % quỹ cacbon của hải miên có thể được vi khuẩn

lam liên kết cung cấp (Taylor et al., 2007; Thoms & Schupp., 2007) Hải miên vùng lạnh, ôn đới và nhiệt đới (ví dụ: Phakellia ventilabrum, Geodia barretti, hoặc

Inflatella pellicula), có các VSV liên kết như cổ khuẩn oxy hóa ammonia (ngành

Thaumarchaeota với chi Nitrosopumilus hoặc Cenarchaeum), vi khuẩn oxy hóa

ammonia (ngành Planctomycetes, bộ Planctomycetales, lớp Betaproteobacteria với

chi Nitrosomonas), và vi khuẩn oxy hóa nitrite (ngành Nitrospirae, chi Nitrospira) (Radax et al., 2012).

VSV nhân sơ Liên kết VSV nhân

(Eukaryotes) Cố địnhKhử

Tảo đơn bào tốc độ

nhiễmbệnh

Hình 1.3.Vai trò của vi sinh vật với hải miên

(Nguồn: Lafi et al., 2009)

Sự phong phú, đa dạng và đặc hiệu của vi sinh vật liên kết hải miên

VSV liên kết hải miên thường cư trú ở vùng ngoại bào, nơi chúng tập trungxung quanh các tế bào roi, các vòng của các tế bào roi tạo thành hệ thống dẫn nướccủa hải miên (Hình 1.2) Dựa vào mật độ VSV liên kết, hải miên được chia thànhloài có mật độ liên kết cao (high microbial abundance: HMA), có tới 109 tế bào/cm3

mô hải miên, và loài có mật độ VSV liên kết thấp (low microbial abundance: LMA)với 105-106 vi khuẩn/cm3 mô và vùng mô liên kết chỉ có rất ít VSV (Gloeckner et

al., 2014).

Hải miên được biết liên kết với hơn 60 ngành VSV khác nhau (Webster et

al., 2010; Schmitt et al., 2012; Reveillaud et al, 2014; Rodríguez-Marconiet al,

2015; Moitinho-Silva et al, 2017) Mức độ phong phú và đa dạng của các cộng

đồng liên kết khác nhau nhiều giữa các loài hải miên, từ một vài đơn vị phân loại

riêng biệt đến hàng trăm VSV cộng sinh khác nhau về mặt di truyền cho một mẫu

hải miên (Webster et al., 2010; Reveillaud et al, 2014; Lee et al., 2011) Những

khảo sát rộng rãi về phát sinh loài cho thấy những VSV liên kết hải miên chiếm ưu

thế nằm trong các đơn vị phân loại Gamma- và Alphaproteobacteria,

Actinobacteria, Chloroflexi, Nitrospirae, Cyanobacteria,Poribacteria và Thaumarchaea (Hentschel et al., 2012).

Rất nhiều nghiên cứu cho thấy các cộng đồng VSV hải miên phần lớn đặc

hiệu vật chủ (Webster et al., 2010; Schmitt et al., 2012; Lee et al., 2011; Simister et

al., 2012) và trong cùng loài, các cộng đồng VSV có xu hướng ổn định cao không

phụ thuộc vào địa sinh học và các điều kiện môi trường khác nhau (Webster &

Taylor., 2012; Erwin et al., 2012) Những cụm trình tự đặc hiệu hải miên này là các

nhánh đơn phát sinh (monophyletic clades), chứa ít nhất 3 trình tự có nguồn gốc từ

hải miên (Hentschel et al., 2002) Đáng chú ý là gần đây việc lập bản đồ phả hệ của

12 triệu trình tự 16S rRNA ngắn từ Dự án giải trình tự thông lượng cao của Tổngcục điều tra Quốc tế về VSV biển (International Census of Marine Microbes -ICoMM; Http://icomm.mbl.edu/) đối với 173 cụm trình tự đặc hiệu hải miên của

Simisterel al (2012) cho thấy, rất nhiều VSV đặc hiệu hải miên cũng có mặt trong các hệ sinh thái biển khác, nhưng với số lượng cực ít Webster et al (2010) sử dụng

giải trình tự thông lượng cao 16S rRNA để nghiên cứu đa dạng và sự phong phú của

quần xã VSV liên kết 3 loài hải miên (Ianthella basta, Ircinia ramosa và

Rhopaloeides odorabile) từ biển Đông Bắc, Australia Kết quả nhận được cho thấy

đơn vị phân loại vi khuẩn có đa dạng ngành cao (n=23) trong 3 loài hải miên nghiêncứu Các trình tự nhận được rơi vào 33 cụm đặc hiệu hải miên, với hầu như một nửa

số cụm chỉ liên quan đến vật chủ Bằng cách ứng dụng 16S rRNA giải trình tựthông lượng cao cho 32 loài hải miên (˃ 90 mẫu vật) từ 8 địa điểm của vùng nhiệt

đới và ôn đới phân bố trên toàn cầu, Schmitt el al (2012) mô tả 3 trạng thái chung

của các cộng đồng VSV liên kết hải miên: (1) cộng đồng lõi nhỏ; (2) cộng đồng bấtđịnh và (3) nhóm lớn đặc hiệu hải miên (Hình 1.4)

Các cộng đồng VSV liên kết hải miên dường như tương đối ổn định và cóthay đổi theo vật chủ hoặc đặc hiệu loài theo không gian, thời gian Những nghiêncứu luân chuyển loài của các cộng đồng VSV liên kết hải miên theo thời gian

(Hardoim & Costa., 2014), không gian (Reveillaud et al., 2014) cũng như các môi trường khác nhau (Cardenas et al., 2014) nhấn mạnh rằng các cấu trúc cộng đồng

VSV nói chung là đặc hiệu loài Ngược lại, sự khác biệt theo chiều dọc (độ sâu) vàchiều ngang (địa sinh học) có vẻ chỉ có ảnh hưởng nhỏ lên các kiểu cộng đồng.Nhưng ảnh hưởng của gradients môi trường tự nhiên cục bộ (ví dụ, độ sâu, mật độdinh dưỡng, độ mặn hoặc gradients ánh sáng) hoặc tổ hợp các nhân tố lên quần xãVSV hải miên được nghiên cứu ít toàn diện hơn, chỉ có một vài nghiên cứu đặc biệt

tập trung vào các ảnh hưởng cụ thể này (Cardenas et al., 2014).

Hình 1.4 Ba trạng thái liên kết chung của VSV và hải miên

(Nguồn: Schmitt et al., 2012).

Quá trình thu nhận vi sinh vật của hải miên

Hải miên có thể sinh sản hữu tính (sản sinh chồi mầm) hoặc vô tính (bằngcách phân đoạn, mọc chồi), tất cả đều có thể truyền VSV cộng sinh hiệu quả từ hảimiên bố mẹ cho thế hệ sau (Webster & Thomas., 2016) Việc truyền VSV từ thế hệnày sang thế hệ khác được gọi là “sự truyền dọc” và được cho là một cơ chế tiếnhóa cổ đại để duy trì VSV cộng sinh trong hải miên HMA Kịch bản tiến hóa nàyđược củng cố khi các cụm phát sinh loài VSV đặc hiệu hải miên được tìm thấytrong các loài hải miên có quan hệ họ hàng xa và cách xa về mặt địa lý Ngoài ra,

nhiều loài VSV đặc hiệu hải miên không tìm được trong nước biển (Hentschel et al., 2012; Simister et al., 2012).

Một phương thức khác để thu nhận vi sinh vật vào hải miên thông qua việclàm giàu đặc hiệu hoặc không đặc hiệu từ môi trường Phương thức này còn đượcgọi là “truyền ngang” Bằng cách “truyền ngang” quần xã VSV đặc hiệu hải miênđược làm giàu một cách không đặc hiệu, ví dụ qua dinh dưỡng như thức ăn vi khuẩn

từ nước biển, hoặc ngẫu nhiên hấp thu qua vết thương vào biểu bì hải miên Về mặt

lý thuyết, làm giàu đặc hiệu VSV trong truyền ngang gồm một vài cơ chế: (1) hấpthụ chủ động VSV đặc hiệu thông qua việc nhận biết VSV cụ thể bởi hệ miễn dịchcủa hải miên; (2) làm giàu loại trừ (subtractive enrichment), là tích lũy VSV kháng

được sự thực bào (Taylor et al., 2007) Trong những trường hợp này, VSV môi

trường mà hải miên thu được cần phải cạnh tranh thắng các loài định cư tiềm năng

để tạo ra các cộng đồng liên kết hải miên ưu thế

Có khả năng nhất là cả 2 phương thức “truyền dọc” và “truyền ngang” đồngthời có trong hải miên Mỗi chiến lược đều có lợi ích và phí tổn nhất định Ví dụ,trong trường hợp “truyền dọc”, thế hệ con cháu chắc chắn nhận được VSV cộngsinh cần thiết cho vật chủ trực tiếp từ bố mẹ, nhưng cũng có thể làm giảm genomecộng sinh hoặc đánh mất khả năng trao đổi chất ở thế hệ tiếp theo, và điều này cóthể có hại trong trường hợp hải miên bị phân tán đến môi trường không thuận lợicho VSV liên kết Trong khi chọn lọc tự nhiên dường như có lợi cho vật chủ khi cóđược VSV cộng sinh từ môi trường tự nhiên, nhưng cũng đồng thời có hại bởi có

thể các nguồn bệnh có cơ hội nhiễm vào hải miên (Hentschel et al., 2012).

Hình 1.5 Ba cách truyền và thu nhận VSV để thiết lập và duy trì các cộng

đồng VSV liên kết hải miên

(Nguồn: Hentschel et al., 2012).

Các chất hoạt tính sinh học từ vi sinh vật liên kết hải miên

simplex (HSV) (Sagar et al., 2010).

Macrolactin A, phân lập từ vi khuẩn liên kết hải miên được xác định ức chế

mạnh virus Herpes simplex type I và type II với giá trị IC50 5,0 µg/mL và 8,3

µg/mL Từ hải miên biển Homophymia sp đã phân lập được chủng Pseudomonas

sp 1531-E7 sản sinh hợp chất kháng virus 2-undecyl-4-quinolone với nồng độ IC50

thử nghiệm in vitro chống HIV-1 là 10-3µg/mL Hợp chất sorbicillactone A được

phân lập từ nấm Penicillium chrysogenum liên kết với hải miên Ircinia fasciculata

và xác định cấu trúc bởi Bringmann et al (2003) Sorbicillactone A có hiệu quả bảo

vệ tế bào bị nhiễm HIV-1 của dòng tế bào người H9, và thử nghiệm in vitro cho

thấy hợp chất này làm giảm sự xuất hiện của HIV-1 protein trong tế bào H9 đến 70

% ở nồng độ 0,3 µg/mL (Bringmann et al., 2003) Chủng nấm Stachybotrys

chartarum MXH-X73 liên kết hải miên sản sinh hợp chất stachybotrin D, có hoạt

tính kháng HIV-1 bằng enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) hướng đích

Li et al (2014) đã nhận dạng 3 hợp chất kháng HIV-1 khác từ Stachybotrys

chartarum: chartarutine B, G, và H, trong đó chartarutine B có IC50 cho HIV-1 thấp

nhất (1,81 µg/mL), tiếp theo là chartarutine G và H (2,05 µg/mL) (Sagar et al.,

2010)

Vi sinh vật liên kết hải miên cũng sản sinh các hợp chất kháng virus cúm

Zhao et al (2015) đã làm rõ 14 isoprenylated cyclohexanols được đặt tên là truncateols A-N từ nấm liên kết hải miên Truncatella angustata Truncateols C, E

và M thể hiện hoạt tính đối kháng H1N1, trong đó Truncateols M có tiềm năng nhấtvới nồng độ IC50 thấp hơn 6 lần so với đối chứng dương Oseltamivir

Một số ví dụ về VSV liên kết hải miên sản sinh hợp chất kháng virus được trình bày ở Phụ lục 1

Các hợp chất kháng khuẩn

Vi sinh vật phân lập từ hải miên biển thể hiện hoạt tính sinh học đối khángphổ rộng các vi khuẩn gây bệnh (Phụ lục 2) Kháng sinh mới thiopeptide YM-

266183 và YM-266184 được phân lập từ Bacillus cereus QN03323 liên kết hải miên có hoạt tính đối kháng vi khuẩn Gram (+) gây bệnh truyền nhiễm bệnh viện in

vitro, trong đó có Staphylococcus aureus và Enterococcus faecium kháng

vancomycin với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 0,025 µg/mL Cả 2 hợp chất này

đều có khả năng ức chế Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) với MIC

là 0,39 µg/mL và 0,78 µg/mL, tương ứng Hợp chất kocurin được nhận dạng từ 3

loài Actinobacteria liên kết hải miên: Kocuria marina F-276,310; Kocuria palustris F-276,345, và Micrococcus yunnanensis F-256,446; là thành viên mới của họ

thiazolyl peptide, và là hợp chất đối kháng MRSA phân lập từ vi sinh vật liên kết

hải miên mạnh nhất cho đến nay (Martin et al., 2012; Pandey et al., 2014) Scheenemaan el al (2010) phân lập Streptomyces sp HB202 từ hải miên Haliclona

simulans, dẫn đến việc phát hiện polyketide mayamycin Mayamycin thể hiện hoạt

tính đối kháng S aureus, Staphylococcus epidermidis và MRSA với giá trị IC50 là

1,16 µg/mL; 0,14 µg/mL và 0,58 µg/mL, tương ứng ở thử nghiệm in vitro Những

báo cáo về các hợp chất phân lập từ vi sinh vật liên kết hải miên đối kháng vi khuẩnGram (-) ít hơn so với đối kháng vi khuẩn Gram (+) Một ví dụ hợp chất ức chế vi

khuẩn Gram (-) Chlamydia trachomatis là naphthacene glycoside SF2446A2 phân lập từ Streptomyces sp RV15, trước đó nhận được từ hải miên Dysidea tupha.

Chlamydia trachomatis là vi khuẩn nội bào bắt buộc G (-) gây các bệnh truyền qua

đường sinh dục và hiện không có phương pháp để diệt vi khuẩn này (Reimer et al.,

2015)

Pruksakorn et al.(2010) báo cáo 3 hợp chất kháng lao tiềm năng trichoderin

A, A1 và B từ nấm liên kết hải miên Trichoderma sp 05FI48, trong đó trichoderin

A là hợp chất mạnh nhất với giá trị MIC thấp nhất chống lại các chủng

Mycobacterium smegmatis, M bovis BCG, và M tuberculosis H37Rv Những

nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng hoạt tính sinh học của trichoderin A dựa trên khảnăng ức chế tổng hợp adenosine triphosphate (ATP) của mycobacteria

Các hợp chất đối kháng nấm

Từ chủng Streptomyces sp liên kết hải miên Aplysina fistularis đã phân lập

được 2 hợp chất: saadamycin là một hợp chất mới và 1 hợp chất đã biết

5,7-dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin Thử nghiệm sinh học cho thấy cả 2 hợp chất này đều thể hiện hoạt tính đối kháng Candida albicans rõ ràng với MIC 2,22

µg/mL và 15 µg/mL, tương ứng Ngoài ra, 2 hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính

sinh học chống lại một số nấm gây bệnh da như Epidermophyton floccosum,

Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum, và Cryptococcus humicolus So với đối chứng dương (miconazole), giá trị MIC của saadamycin thấp

hơn 3875 lần và của 5,7-dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin thấp hơn 200 lần

(Gendy & Bondkly., 2010) Hợp chất Lacton YM-202204 được phân lập từ chủng

nấm Phoma sp Q60596 liên kết hải miên có hiệu quả đối kháng C albicans (IC80

6,25 µg/mL), Cryptococcus neoformans (IC80 1,56 µg/mL), Saccharomyces

cerevisiae (IC80 1,56 µg/mL) và Aspergillus fumigatus (IC80 12,5 µg/mL) (Nagai et al., 2002) YM-202204 có khả năng bao vây neo glycophosphatidylinositol (GPI

anchor), một cấu trúc quan trọng cho protein gắn vào trong các tế bào sinh vật nhânchuẩn (eukaryotes) và một trong những đích để phát triển thuốc đối kháng nấm

Hoạt tính chống lại protozoa (Antiprotozoan activity)

Manzamine A, đầu tiên được tách chiết từ hải miên Haliclona sp., và sau đó

từ một số loài hải miên khác Hợp chất này được chứng minh có hoạt tính kháng

khối u, kháng nấm, kháng khuẩn, chống sốt rét và kháng HIV (Eyese et al., 2011; Ranwan et al., 2012) Manzamine A sau đó được tách chiết từ Micromonospora sp M42 liên kết hải miên biển Indonesia Acanthostrongylophora ingens (Hill et al., 2005) Pimentel-Elardo et al (2010) nhận dạng 3 hợp chất cyclic depsipeptide

valinomycin, indolocarbazole alkaloid staurosporine và butenolide từ chủng

Streptomyces sp liên kết hải miên Valinomycin và staurosporine ức chế sinh

trưởng của L major với giá trị IC50 0,12 µg/mL và 1,24 µg/mL, tương ứng; ức chế

Trypanosoma brucei với IC50 0,0036 µg/mL và 0,0051 µg/mL, tương ứng và

butenolide có IC50 là 7,92 µg/mL

1.2 Sơ lược về metagenomics

Khái niệm về metagenomics

Metagenomics nổi lên như một vũ khí mạnh mẽ được sử dụng để nghiên cứucộng đồng vi sinh vật bất kể chúng có thể nuôi cấy được hay không trong điều kiệnphòng thí nghiệm và cũng cung cấp cơ hội để mô tả sự đa dạng vi sinh vật trongmôi trường vì rất nhiều loài hiện chưa nuôi cấy được Metagenomics dựa vào việctách DNA từ một cộng đồng và như vậy tất cả genome của vi sinh vật trong cộng

đồng đều được gộp lại Metagenomics cũng được mô tả như genomic cộng đồng vàmôi trường bao gồm phân tích genome của vi sinh vật bằng cách tách trực tiếpDNA và tạo dòng từ một tập hợp các vi sinh vật trong phần lớn môi trường trên tráiđất như nước và đất Phương pháp metagenomics dựa trên tách nucleic acid trựctiếp từ mẫu môi trường được chứng minh là công cụ mạnh để so sánh và khám phá

hệ sinh thái (Nazir., 2016; Ghosh et al., 2019).

Cách tiếp cận metagenomics

Phương pháp metagenomics cho phép đánh giá genome vi sinh vật cótrong môi trường Metagenomics bao gồm tách dòng trực tiếp DNA môi trường vàocác thư viện dòng lớn để thuận tiện cho việc phân tích gen và các trình tự trong cácthư viện này Kỹ thuật metagenomics bao gồm những bước cơ bản sau: (1) Thunhận mẫu và tách chiết acid nucleic; (2) thiết lập thư viện metagenome hoặc giảitrình tự DNA metagenome; (3) sàng lọc gen dựa vào ngân hàng gen hoặc phân lậpgen dựa vào số liệu giải trình tự gen Việc phân lập gen từ metagenome được thựchiện tương tự như các nghiên cứu phân lập gen trong một hệ gen (genome) (Thi

Huyen Do et al., 2014).

Hiện nay sau khi tách chiết nucleic acid người ta ít tiến hành lập thư việngen mà tiến hành giải trình tự Sau đó dựa trên số liệu giải trình tự kết hợp với cáccông cụ tin sinh để tìm kiếm, khai thác gen hay vùng gen mã hóa cho các protein

quan tâm trước khi đưa vào thực nghiệm (Nguyễn Minh Giang et al., 2015)

Một số mục tiêu của metagenomics

Mục tiêu của metagenomics là để tìm hiểu thành phần và hoạt động củatập đoàn vi sinh vật phức tạp trong các mẫu môi trường thông qua phân tích trình tự

DNA của chúng (George et al., 2010) Mặt khác, khi có số liệu về đa hệ gen, chúng

ta có thể thực hiện hàng loạt dự án phân lập gen tùy theo mục đích nghiên cứu Ví

dụ như phân lập những gen tham gia vào chuyển hóa các protein, vitamin, chất

béo…từ hệ vi sinh vật nghiên cứu (Nguyễn Minh Giang et al., 2015).

Một số mục tiêu cụ thể của metagenomics là: Xác định tính đa dạng phânloài sử dụng 16S rRNA, các mẫu gen đa dạng và cây phân loài của vi sinh vật

(Sharma et al., 2012) Số liệu đó được sử dụng để theo dõi và dự đoán các biến đổi

môi trường; xác định gen hay operon mã hóa cho các enzyme cần thiết, có đặc tínhmới (như cellulases, chitinases, lipases, thuốc kháng sinh, các sản phẩm tự nhiên

khác…) Những enzyme này có thể được ứng dụng trong công nghiệp hoặc dượcphẩm; xác định biến thể hoặc đa dạng trong gen cho các enzyme quan trọng và thiết

kế tối ưu các điều kiện xúc tác của enzyme; xác định các cơ chế điều hòa và truyềntín hiệu của các gen quan tâm; xác định vi khuẩn hoặc các trình tự plasmid, đánh giáảnh hưởng của chúng đến cấu trúc và sự đa dạng của các cộng đồng vi sinh vật Xácđịnh các sự kiện chuyển gen tiềm năng hay các gen/operon cho việc thu nhận dinhdưỡng, trung tâm trao đổi chất trung gian… Từ đó, cung cấp những hiểu biết vềtương tác giữa các sinh vật trong chuỗi và lưới thức ăn, hoặc khám phá nền tảngthành công của vi sinh vật trong môi trường của chúng; xác định con đường trao đổichất để có thể thiết kế môi trường nuôi cấy tăng trưởng cho các loài vi sinh vật chưa

thể nuôi cấy được (Nguyễn Minh Giang et al., 2015).

Sử dụng công cụ tin sinh khai thác metagenome

Việc chuẩn bị mẫu metagenome để đọc trình tự rất quan trọng, nếu mẫukhông đủ sạch sẽ gây nhiễu khi đưa vào máy đọc tự động có thể gây ra sai lệchtrong kết quả Toàn bộ DNA tách chiết được từ mẫu môi trường đủ tiêu chuẩn sẽđược đưa vào máy đọc trình tự tự động Sau khi đọc, máy sẽ xác lập được số lượnglớn các trình tự đọc ngắn (short – reads) Công việc tiếp theo là sắp dãy (assembly)các short – reads này để thu được bộ gen hoàn chỉnh Tuy nhiên, trong quá trình xáclập trình tự DNA của các kĩ thuật có khả năng sinh lỗi cho từng nucleotide với tỉ lệkhoảng từ 1 % đến 2 % trên chiều dài của short - reads Các nucleotide lỗi phảiđược sửa chữa để phục vụ cho việc sắp dãy lại thành một bộ gen hoàn chỉnh Ởbước này, một số phần mềm như SOAPdenovo được sử dụng để lắp ráp lại bộ gen

từ các short - reads (hay “reads”) thu được trong quá trình giải trình tự gen Phầnmềm này gồm có 6 module được dùng để 1) sửa chữa các lỗi đọc trình tự; sau đó 2)

xây dựng đồ thị de Bruijn để 3) lắp ghép các contig, rồi 4) kiểm tra lại kết quả lắp

ráp bằng cách so sánh các contig với các trình tự đọc được dùng để tạo ra nó; tiếpđến 5) tối ưu độ bao phủ và chiều dài các contig để 6) thu nhỏ các vùng gen khôngđọc được trình tự Bằng công cụ như SOAPaligner các trình tự sau đó được đem sosánh lại (map) với các contig của chính nó để tìm ra bao nhiêu trình tự được sử dụng

để tạo contig PE (pair-end reads) là các trình tự mà cả hai đầu của nó đều tươngđồng với contig và mối quan hệ hai đầu này là chính xác, cho

độ tin cậy cao Các trình tự mà chỉ có một đầu của nó tương đồng với contig hoặcmối quan hệ hai đầu không chính xác thì được gọi là SE (single-end reads) Sau khi

có các contig từ metageneome, bước đầu tiên nên làm là kiểm tra chất lượng giải

trình tự, ví dụ bằng phần mềm FastQC (Qian Zhou et al., 2014); tiếp theo loại bỏ

những đoạn trình tự có chất lượng thấp và độ dài ngắn (Trimmomatics,…); lắp rápcác tập dữ liệu với độ sâu đọc không đồng đều (IBDA-UD (Iterative De BruijnGraph De Novo Assembler), ….); Sau đó sử dụng các phần mềm dự đoán

gen như: Prodigal, MetaGene Annotator (MGA), FragGeneScan, Glimmer-MG,GeneMark… để dự đoán tất cả các khung đọc mở (ORF – open reading frame) từcác contig Dựa trên các ORF đã được xác định, sẽ tiếp tục dự đoán bằng cách sosánh ORF với hàng loạt các dữ liệu khác nhau như: Dữ liệu NCBI NR, MetaHIT,Silva, GreenGene để phân tích độ đa dạng loài; dữ liệu KEGG, MetaCys để phânloại gen vào các con đường chuyển hóa khác nhau; dữ liệu CAZy, GO, KEGG,eggNOG, Pfam, Prk, COG, FIGfam để sắp xếp gen vào các nhóm chức năng Nếunghiên cứu tập trung vào DNA và protein của metagenome thì công cụ BLASTall(Basic Local Alignment Search Tool: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blasti) được sửdụng rộng rãi nhất trong tin sinh học BLAST sử dụng thuật toán tìm kiếm cục bộheuristic và do đó có thể phát hiện ra mối liên hệ giữa các trình tự có những sựtương đồng riêng biệt Có rất nhiều loại tìm kiếm khác nhau trên BLAST phục vụcho những mục đích khác nhau: 1) BLASTp tìm kiếm tất cả các trình tự proteintương đồng với trình tự protein cần phân tích trong cơ sở dữ liệu protein; 2)BLASTn tìm kiếm tất cả các trình tự nucleotide tương đồng với trình tự DNA cầnphân tích trong cơ sở dữ liệu DNA; 3) TBLASTn tìm trình tự protein tương đồngtrong cơ sở dữ liệu DNA bằng cách dịch mỗi trình tự DNA ra tất cả 6 khung đọcmở; 4) BLASTx tìm trình tự nucleotide tương đồng trong cơ sở dữ liệu protein bằngcách dịch trình tự nucleotide cần phân tích sang tất cả 6 khung đọc mở Sau khi cóđược các khung đọc mở cần quan tâm, sử dụng công cụ tìm kiếm trình tự aminoacid tương đồng trong BLASTp; 5) Công cụ Blastpby được sử dụng trong so sánhcác ORF với cơ sở dữ liệu NR để tiến hành phân loài Cấp độ phân loài của mỗiORF được xác định bằng thuật toán dựa trên cơ sở LCA (Least Common Ancestors)được sử dụng trong phần mềm MEGAN (MetaGenomic ANalyser) Thuật toán

LCA sẽ xếp trình tự vào nhóm phân loại mà cấp độ phân loại của nhóm phân loại đóphản ánh được mức độ bảo thủ của trình tự gen Căn cứ vào các ORF đã được đốichiếu với chức năng và các con đường chuyển hóa để lựa chọn các gen hay nhómquan tâm Trình tự các axit amin được dịch từ các ORF sẽ được sử dụng để dự đoán

cụ thể về cấu trúc và các đặc tính của protein (trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tácenzyme, khả năng chịu nhiệt, khả năng chịu kiềm…),… bằng phần mềm Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), Expasy (http://www.expasy.org)… Hoặc cóthể xây dựng mô hình chuyển hóa các chất giữa các sinh vật trong môi trường bằng

các công cụ Pathway Tools, COBRA, Model SEED ((Nguyễn Minh Giang et al.,

2015)

Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích quần xã vi sinh vật trong rấtnhiều môi trường như đại dương, đất, dải san hô, xác cá voi, suối nước nóng và cácquần xã vi sinh vật liên kết với nhiều cơ thể sống khác nhau như người, mối, rệp,

giun (Kennedy et al., 2011).

Ứng dụng của metagenomics

Metagenomics cung cấp một nguồn tài nguyên không giới hạn cho sự pháttriển các gen mới, enzyme, các sản phẩm tự nhiên, các hợp chất hoạt tính sinh học

và các chế phẩm sinh học có thể ảnh hưởng đáng kể đến các ứng dụng công nghiệp

và công nghệ sinh học (Nazir., 2016)

Cellulases, lipases, xylanases, amylases, proteases, và rất nhiều enzyme cótầm quan trọng công nghiệp được sản xuất thông qua metagenomics (Nazir., 2016).Ngoài ra, một số nhà khoa học cũng cho rằng có thể khai thác các chất kháng sinhmới nhờ ứng dụng kỹ thuật metagenomics Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vậtbiển như chất hoạt động bề mặt (Biosurfactants) là chất thay thế tiềm năng cho chấthoạt động bề mặt tổng hợp (Surfactants) trong một vài quá trình công nghiệp nhưbôi trơn, làm ướt, làm mềm, cố định thuốc nhuộm, làm nhũ tương, ổn định độ phântán, tạo bọt, ngăn ngừa tạo bọt cũng như trong công nghiệp thực phẩm, y sinh vàdược phẩm, sửa chữa sinh học các điểm bị ô nhiễm bởi các chất hữu cơ hoặc vô cơ(Nazir., 2016) Metagenomics được sử dụng để tạo thư viện DNA của các mẫuđất/nước bị ô nhiễm dầu, sau đó sàng lọc các dòng sinh chất hoạt động bề mặt

(Cynthia et al., 2013) Isabel et al (2014) báo cáo tiềm năng của phương pháp

metagenomics để nhận dạng và làm sáng tỏ các gen mới trong các môi trường ítđược nghiên cứu và cho thấy triển vọng rộng lớn hơn vào quá trình phân hủyhydrocacbon trong các bể chứa dầu Gần đây các nhà nghiên cứu đã nhận dạng cácgen và các con đường trao đổi chất của chúng liên quan đến phân hủy phenol và cáchợp chất vòng thơm khác trong các mẫu bùn từ một hệ thống xử lý nước thải nhàmáy lọc dầu, sử dụng phương pháp metagenomics để nắm bắt sự đa dạng chức năng

to lớn trong cộng đồng vi sinh vật

1.3 Chất ức chế protease (PIs)

1.3.1 Sơ lược protease

Protease là một trong những họ enzyme phổ biến và đa dạng nhất được biếtđến và có mặt trong tất cả các sinh vật sống, bao gồm virus, vi khuẩn, cổ khuẩn,nấm, thực vật và động vật Protease đóng nhiều vai trò quan trọng trong các quátrình của tế bào, bao gồm đông máu, tiêu hóa thức ăn, tăng trưởng và di chuyển tếbào, sắp xếp mô, phát triển hình thái, viêm, tăng trưởng khối u và di căn, đông máu,kích hoạt zymogen, giải phóng hormone và các peptide có hoạt tính dược lý từ cácprotein tiền thân và vận chuyển các protein bài tiết qua màng (Sapna., 2013)

Về phân loại protease được chia nhỏ thành hai nhóm chính, tức làexopeptidase và endopeptidase, tùy thuộc vào vị trí tác dụng của chúng Nói chung,protease đặc trưng là endopeptidase hoặc exopeptidase Endopeptidase tách liên kếttrong protein và thường rất đặc hiệu cho các chuỗi axit amin cụ thể Exopeptidasetách một axit amin duy nhất từ đầu cuối của protein và ít đặc hiệu hơn đối với axitamin đang bị phân cắt Exopeptidase là những loại tách ra từ C-terminator(carboxypeptidase), N-terminus (aminopeptidase) hoặc cả hai termini (dipeptidase).Protease cũng được phân loại theo loại xúc tác của chúng thành peptidase aspartic,cysteine, glutamic, serine và threonine, dựa trên dư lượng axit amin chức năng cótại vị trí hoạt động Serine protease tạo thành lớp phong phú nhất bao gồm khoảng1/3 tổng số protease, được công nhận là yếu tố quan trọng trong việc kiểm soátnhiều con đường liên quan đến đông máu, tiêu sợi huyết, chuyển mô liên kết, cânbằng nội môi, thụ tinh và phản ứng viêm, tiếp theo là peptidase metallico-, cysteine,

aspartic và threonine (Ana et al., 2010; Sabotic & Kos., 2012).

Cơ chế phân giải protein: Protease cũng được đặc trưng bởi cơ chế hoạt độngcủa chúng; đó là các axit amin có liên quan đến vị trí xúc tác của enzyme Vị trí xúctác chứa các axit amin đóng vai trò trực tiếp trong quá trình thủy phân liên kếtpeptide Quá trình này đòi hỏi một nucleophile để bắt đầu phản ứng, có thể là chuỗibên axit amin hoạt động hoặc phân tử nước Trong các giai đoạn sau của quá trìnhphân giải protein, hai phần của protein bị thủy phân được giải phóng và vị trí hoạtđộng của protease trở lại trạng thái ban đầu, sẵn sàng liên kết một chất nền khác đểphân giải protein Các protease thường được nhóm thành bốn nhóm chính dựa trên

vị trí hoạt động của chúng: serine protease, cysteine protease (thiol), asparticprotease và metallicoprotease Serine protease và cysteine (thiol) có một axit amintrong vị trí hoạt động tấn công nucleophilic ban đầu, trong khi aspartic protease vàmetallicoprotease kích hoạt một phân tử nước để thực hiện tấn công nucleophilicban đầu (Ritchie., 2019)

1.3.2 Chất ức chế protease và phân loại

Chất ức chế protease (PI) là phân tử ngăn chặn hoạt động của protease vàthường hoạt động trên protease có cơ chế hoạt động tương tự Các chất ức chếprotease (PIs) có thể ở dạng protein, peptide hoặc các phân tử nhỏ (Hình 1.6) Cácchất ức chế protease trong tự nhiên thường là protein hoặc peptide

Hình 1.6 Ba chất ức chế protease có sẵn trên thị trường PMSF là một phân tử nhỏ;

E-64 là một phân tử giống như peptide; Aprotinin là một protein nhỏ

(Nguồn: Labome.com; Sigmaaldrich.com)

Phân loại chất ức chế protease

Các chất ức chế protease có thể được phân loại theo nguồn gốc (vi sinh vật,nấm, thực vật, động vật), theo cấu trúc của chúng (sơ cấp và ba chiều), hoặc theoprotease mà chúng ức chế (rộng, đặc hiệu) và cơ chế phản ứng (cạnh tranh, không -cạnh tranh) PIs thường được phân loại theo nhóm protease mà chúng ức chế (thuốc

ức chế protease aspartic, cysteine hoặc serine) Ngày nay, các chất ức chế proteasethường được phân loại thành hai nhóm chính (1) Các chất ức chế phân tử nhỏ và (2)Các chất ức chế protein (Sapna., 2013)

Chất ức chế phân tử nhỏ

Các chất ức chế phân tử nhỏ (SMIs) bao gồm các hợp chất tự nhiên nhưpepstatin, bestatin và amastatin, và một số chất ức chế tổng hợp được tạo ra trongphòng thí nghiệm Vì vậy, rất khó để cung cấp bất kỳ phân loại tự nhiên, khônggiống như các peptidase và chất ức chế protein và một loạt các định danh mới đãđược mô tả Theo đó, mỗi SMI được gắn một mã định danh bao gồm một chữ J banđầu theo sau là một số có năm chữ số Ví dụ, pepstatin là J00095 và ethylenediamine tetraacetic acid là J00149 (Rawlings & Barrett, 2011)

SMI là chất ức chế không phải là protein, bao gồm peptide và chất ức chếtổng hợp thường có nguồn gốc vi sinh vật và là peptide trọng lượng phân tử thấp.Nhiều loại trong số chúng đã được tổng hợp trong phòng thí nghiệm; tuy nhiên,những loại xuất hiện tự nhiên đã được tách chiết từ vi khuẩn và nấm (Rawlings.,2010) Các chất ức chế phân tử nhỏ đã được chứng minh là hữu ích và được sử dụng

là thuốc thử trong phòng thí nghiệm như retropepsin của virus HIV; thrombin, điềuhòa cầm máu và chống đông máu; dipeptidyl-peptidase IV, có liên quan đến bệnhtiểu đường loại 2; γ-secretase, có liên quan đến bệnh Alzheimer; renin vàangiotensin kiểm soát huyết áp… (Sapna., 2013)

Trong số các chất ức chế phân tử nhỏ có nguồn gốc vi khuẩn và nấm,peptidyl aldehydes như leupeptin và antipain, hexapeptide pepstatin vàepoxysuccinyl peptide E-64 và các chất tương tự của chúng đã được nghiên cứu như

là chất chống ung thư Chất ức chế đặc hiệu thiol-protease, E-64, ban đầu được phân

lập từ Aspergillus japonicus đã được nghiên cứu rộng rãi như một tác nhân chống

ung thư tiềm năng trong nuôi cấy tế bào và mô hình động vật Sau đó, các dẫn xuấtcủa E-64 tiếp tục được ứng dụng trong điều trị ung thư và các bệnh khác (Frlan &Gobec, 2006)

Một vài ví dụ về việc sử dụng các chất ức chế phân tử nhỏ của vi sinh vậtnhư các tác nhân chống côn trùng gây hại cây trồng, ví dụ: Các chất ức chế

aminopeptidase của Actinomycetes amastatin và bestatin chống lại bọ bột đỏ (Tribolium castaneum) (Oppert et al., 2011), thuốc ức chế protease aspartic A từ

Actinomycetes chống lại đậu đũa (Callosobulusus) Thuốc ức chế protease serine và

cysteine leupeptin từ Actinomycetes chống lại giun bắp phương Tây (Diabrotica

virgifera) và E-64, thuốc ức chế protease cysteine từ Aspergillus japonicus chống

lại bọ cánh cứng Colorado hại khoai tây (Leptinotarsa decemlineata) (Sapna.,

2013)

Trong quá trình thu hồi protein tái tổ hợp, các chất ức chế phân tử nhỏ có thểđược thêm vào môi trường nuôi cấy để ức chế hoạt động phân giải protein của sinh

vật chủ thường thuộc loại serine và aspartic (Sabotic et al., 2012) Một số vi khuẩn

tổng hợp peptide và dẫn xuất của peptide là chất ức chế peptidase hiệu quả, thường

là những chất ảnh hưởng đến peptidase từ các họ khác nhau Được biết đến nhiềunhất trong số này là leupeptin (N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-D, L-argininaldehyd),

ban đầu được phân lập từ Streptomyces và ức chế nhiều loại serine, cysteine và

threonine trypsin, PACE4 calpain, clostripain và hoạt động giống như trypsin của

proteasome Các chất ức chế phân tử nhỏ khác được sản xuất bởi Actinomycetes bao

gồm bestatin và amastatin (chất ức chế aminopeptidase); tyrostatin, chất ức chếsedolisin của họ S53 (Sapna., 2013)

Chất ức chế protein (PPIs)

Các chất ức chế protein của protease có mặt khắp nơi và đã được phân lập từnhiều loài thực vật, động vật và vi sinh vật Trước đây, PPIs được nhóm theo loạiprotease mà chúng ức chế Sau đó, chúng được phân loại là chất ức chế cysteine,serine, aspartic và metallicoprotease Ngoại trừ macroglobulin huyết tương, ức chếprotease của tất cả các lớp, các chất ức chế protein riêng lẻ chỉ ức chế các proteasethuộc một lớp cơ học duy nhất Trong số các chất ức chế này, nghiên cứu rộng rãinhất là các chất ức chế protease serine Các chất ức chế protein của protease aspartictương đối hiếm gặp và chỉ được tìm thấy ở một vài địa điểm chuyên biệt (Sapna.,

2013) Rawllings et al (2004) đã phân loại PPIs theo sự tương đồng trong trình tự

axit amin Phân loại này có 48 họ PI được nhóm lại trong 26 loại siêu họ(superfamilies) có liên quan trên cơ sở cấu trúc của chúng Một số họ tiêu biểu đượctóm tắt trong Hình 1.7

Việc phân loại các chất ức chế peptidase protein liên tục được sửa đổi bởi cơ

sở dữ liệu MEROPS và hiện tại các chất ức chế được nhóm thành 71 họ dựa trên sosánh các trình tự protein bao gồm 17451 trình tự ức chế Những họ này có thể đượcnhóm lại thành 39 nhóm dựa trên sự so sánh về cấu trúc bậc ba Họ và nhóm củamột số chất ức chế peptidase protein được mô tả trong Phụ lục 3 Mỗi nhóm, họ vàchất ức chế peptidase đặc trưng hóa học được cung cấp một định danh duy nhất.Một định danh họ bao gồm chữ cái “I” theo sau là một số và số nhận dạng nhóm haichữ cái bắt đầu bằng chữ “I” hoặc chữ “J” (Rawlings., 2010)

Phân bố các họ giữa các sinh vật: Hơn 634 loài ức chế peptidase proteinđược phân phối trên khắp các sinh vật từ virus đến động vật Trong số 71 họ, có 27

họ có nguồn gốc vi sinh vật và nấm (Bảng 3.2, Phụ lục 3) Trong đó, 7 họchỉ cótrong vi khuẩn (I10, I16, I36, I38, I57, I58, I69) và 5 họchỉ có trong nấm (I34, I48,I66, I79, I85) (Rawlings., 2010)

Chất ức chế protease

Serpin Kunitz Cystatin Bowman

Birk

chymotrypsin chymotrypsin, hymotrypsin,

Metallocarboxyl Aspartylpeptide

Mol wt: Mol wt: 4.2 kDa; 27 kDa;

Ức chế: Ức chế: Carboxy- Trypsin, -peptidase chymotrypsin,

13.4-14.4 kDa 39-43 kDa 17- 19 kDa

Hình 1.7 Một vài họ PPI quan trọng

(Nguồn: Shamsi et al., 2016)

Siêu họ Serpin: là siêu họ lớn nhất và phổ biến nhất của PPIs Serpin cónguồn gốc thực vật đã được tách chiết từ hạt ngũ cốc (Habib & Khalid., 2007).Serpin có vai trò kiểm soát chính của các quá trình như đông máu và viêm, và trở

thành mục tiêu của nhiều nghiên cứu y học (Khunaizi et al., 2002) Một số loại

trong họ serpin ức chế mạnh trypsin và chymotrypsin, ngoài ra, chúng cũng ức chếthrombin, kallikrein, yếu tố VIIa và yếu tố Xa Vài loại serpin khác ức chếchymotrypsin, cathepsin G và có axit glutamic, lysine hoặc arginine tại vị trí P1

(Roberts et al., 2003).

Họ Kunitz: Các thành viên của họ này chủ yếu ức chế các protease serine,

nhưng cũng có thể ức chế các protease khác (Heibges el al., 2003) Các chất ức chế

Kunits thường có khối lượng phân tử 18 - 22 kDa; có hai cầu nối disulfide và một vịtrí phản ứng (Habib & Khalid., 2007) Các thành viên của họ này bao gồm mộtchuỗi peptide nhỏ chứa từ 28 đến 30 axit amin có phân tử khối 3.0 - 3.5 kDa (Oliva

& Sampaio., 2008) Hiểu biết về cấu trúc của các chất ức chế họ Kunitz rất hữu ích

để nghiên cứu các cơ chế đằng sau tính đặc hiệu của chúng đối với các khối u, cácyếu tố đông máu và viêm, và vùng chịu trách nhiệm cho hoạt động sinh học của nó(Oliva & Sampaio., 2009)

Siêu họ Cystatin: bao gồm 4 họ ức chế hoạt động của cysteine và thiolproteinase (Habib & Khalid., 2007) PI Thiol đóng một vai trò quan trọng trongkiểm soát tất cả các mô sống bởi chúng có khả năng ức chế cathepsin và nhiều đặc

tính sinh học khác (Qadeer et al., 2014).

Họ ức chế Bowman Birk (BBI): Họ này được đặt theo tên của nhà khoa học

đã phát hiện và mô tả chất ức chế đầu tiên của họ này từ đậu tương, (hai nhà khoahọc D.E Bowman và Y Birk) Các chất ức chế thuộc họ này có trọng lượng phân

tử khoảng 8 kDa và có vị trí hoạt động đầu tiên thường đặc hiệu cho elastase,

trypsin và chymotrypsin (Qi et al., 2005) BBI đã được báo cáo là làm giảm sự tăng sinh của các tế bào ung thư vú MCF7 (Palavalli et al., 2012).

Họ ức chế peptidase metallicoparboxy: Chúng là những chất ức chế peptidenhỏ có trọng lượng phân tử khoảng 4.2 kDa Chúng ức chế cạnh tranh mạnh đối vớiphổ rộng của carboxypeptidase từ vi khuẩn và động vật, nhưng không thể ức chế

carboxypeptidase serine từ nấm men và thực vật Chúng được tìm thấy trong các môcủa củ khoai tây trong quá trình phát triển, cùng với các chất ức chế khoai tây I và II

của serine PI (Shamshi et al., 2016).

Họ Aspartyl PI: Các thành viên của họ này đã được tìm thấy trong hoa hướng

dương, lúa mạch, thảo quả (Cynara cardunculus) và củ khoai tây Chất ức chế

cathepsin D, có trọng lượng phân tử khoảng 27 kDa và ức chế các protease serine,

ví dụ như trypsin và chymotrypsin cùng với aspartyl protease cathepsin D, nhưngkhông ức chế pepsin, cathepsin E và rennin, tất cả đều là aspartyl protease.Pepstatin, một chất ức chế mạnh mẽ protease aspartyl đã được chứng minh là ức chế

sự phân giải protein của enzyme amylase và lipase của bọ cánh cứng Colorado

(Lptinotarsa decemlineata) (Shamshi et al., 2016).

1.3.3 Cơ chế hoạt động của PIs

Chất ức chế protease có thể hoạt động theo nhiều cách khác nhau để ức chếhoạt động của protease Các chất ức chế này có thể được phân loại theo loạiprotease mà chúng ức chế và cơ chế mà chúng ức chế các enzyme đó Hiểu rõ cơchế ức chế protease của PIs sẽ giúp cho quá trình phát triển các thuốc ức chếprotease như một chiến lược điều trị

Cơ chế ức chế protease của PIs có thể được khái quát làm 2 phương thức là

ức chế thuận nghịch (Reversible inhibition) và ức chế bất thuận nghịch (Irreversibleinhibitor) (Sapna , 2013; Đỗ Quý Hai., 2013)

Các chất ức chế thuận nghịch bao gồm các chất ức chế cạnh tranh(Competitive inhibitors), ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I (Non-competitiveinhibitor) và ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II (Uncompetitive inhibitor) (MaiXuân Lương., 2005)

Ức chế cạnh tranh: Phần lớn các chất ức chế protease có tính cạnh tranh.Trong trường hợp ức chế cạnh tranh là cơ chất và chất ức chế đều tác dụng lên trungtâm hoạt động của enzyme, chất ức chế thay thế chỗ của cơ chất ở enzyme Khi cơchất dư thừa, nồng độ chất ức chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế,còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất ức chế cao thì lại có tác dụng ức chế hoàntoàn (Hình 1.8a) Cơ chế ức chế này được nghiên cứu kỹ lưỡng ở họ serine protease

inhibitors Các chất ức chế canonical (khóa và chìa khóa) liên kết với các mục tiêucủa chúng theo cách giống như cơ chất để tạo thành phức hợp gần như “Michaelis”,

một nguyên tắc được sử dụng bởi các chất ức chế protease serine (Sermilvan et al.,

2001) Những chất ức chế này bao gồm các chất ức chế họ Kazal, Kunitz vàBowman-Birk (Sapna., 2013) Một ví dụ về chất ức chế cạnh tranh là aprotinin, ứcchế nhiều loại protease thuộc họ protease serine Các chất ức chế cạnh tranh thường

có cấu trúc tương tự như trạng thái chuyển tiếp của cơ chất tự nhiên Trạng tháichuyển tiếp của cơ chất là trạng thái trung gian của cấu trúc thường liên kết chặt chẽnhất với enzyme Do đó, các hợp chất bắt chước cấu trúc này liên kết với enzyme có

độ bền cao hơn cơ chất (ở trạng thái ban đầu), và do đó phản ứng enzyme thôngthường không thể tiến hành Một ví dụ về loại tương tự trạng thái chuyển tiếp này làLP-130 (Hình 1.8b), một chất ức chế protease HIV-1

Hình 1.8 Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibitors)

(a): Mô tả cơ chế, trong đó S (cơ chất); I (chất ức chế); E (Enzyme)

(Nguồn: Đỗ Quý Hai., 2013)

(b): Cấu trúc tinh thể của protease HIV-1 (màu xanh lá cây) liên kết với LP-130,một chất ức chế trạng thái chuyển tiếp (1ODY) (màu đỏ) và dư lượng của aspartic

protease (màu vàng)

(Nguồn: Ritchie., 2019)

Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I (Non-competitive inhibitor): Các chất ứcchế không cạnh tranh kiểu thứ I liên kết với protease có ái lực tương tự, bất kể sự cómặt của cơ chất liên kết Các phân tử này ức chế hoạt động protease thông qua cơ

chế allosteric BBI, một chất ức chế trypsin từ đậu nành (Prasad et al., 2010) và