Nghiên cứu chế tạo một số bộ kit miễn dịch ứng dụng chẩn đoán sớm các chỉ thị kháng thể ( iga, igg ) và kháng nguyên bệnh nhiễm trùng, viêm gan virus và ung thư gan

N ộ i dung nghiên cứu - Thiết lập các quy trình tinh chế lectin và proteinA từ thực vật và các chủng vi khuẩn tuyển chọn Staphylococcus aureus có khả năng sinh tổng hợp proteinA cao đặc

LỜI CẢM ƠN

C húng tỏi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đ ạo Đ ại học Q u ố c g ia H à N ội, Ban Khoa học công nghệ và Ban Tài chính, Ban giám hiệu, P hòng tài vụ, Phòng K hoa học Công nghệ và Ban ch ủ nh iệm k hoa Sinh học củ a trường Đ ại học K hoa học Tự nhiên Hà Nội đ ã hỗ trợ và tạ o m ọi điều kiện thuận lợi ch o việc thực hiện đổ tài

C húng tôi cũ n g xin chân th àn h cảm ơn các c ơ q u an b ệnh viện: k h o a M iễn dịch, Hoá sinh và H uyết học bệnh viện T rung ương quân đội 108, bệnh viện Bạch M ai, viện Huyết học và truyền m áu T rung ương, viộn V ệ sinh D ịch tễ T ru n g ương Hà Nội và viện P aster thành phô' H ồ C h í M inh (G.s N guyễn Lê T ran g và K hoa M iễn

d ịch) đ ã cung cấ p các m ẫu bệnh phẩm c h ế phẩm A FP tinh sạch ch o việc nghiên cứu cùa đề tài

C húng tôi xin chân th àn h cảm ơn các T iến Sĩ M R ecouvre, B V era V iện Sinh học Phân tử Jacq u es M onod, Đ ại h ọ c Paris 7, và G s p A u co u tu rier củ a Đ ại học Paris 6 đã cung cấp m ột số h o á ch ất cộng h ợp m iễn dịch và tư vấn những điều quý

Cuối cùng, ch úng tôi xin ch ân thành cảm ơn Ban lãnh đ ạo , T rung tâm Sinh học Phân tử và Công nghệ T ế b ào (nay là T ru n g tâm N g h iên cứu K hoa học Sự sống)

và các cán bộ củ a bộ m ôn Sinh lý Thực vật và H oá sin h đ ã g iú p đ ỡ c h o công việc nghiên cứu tiến triển

Tập thể đề tài

ì

Đ ặ t v ấ n đ ề 1

Tong quan tài liệ u 3

1 Biểu hiện bệnh lý do các kháng nguyên liên quan đến một số bệnh nhiễm trùng và ung thư 3

1.1 Protein A của vi khuẩn Staphylococcus aureus và khả nãng gây b ện h 3

1.2 Kháng nguyên AFP, chỉ thị bệnh nhiễm trùng và ung thư ga n 4

2 Biếu hiộn bệnh lý của kháng thể 5

3 Các k ĩ thuật m iễn dịch trong chẩn đoán bệnh 7

4 Các lectin đặc hiệu liên kết kháng thể hoặc kháng nguyên bệnh 7

4.1 Đặc tính sinh học và miễn dịch của lectin họ đậu 8

4.2 Danh pháp của AFP liên kết với le ctin 10

4.3 M ộ t số đặc điểm lectin các loài mít được dùng cho y học- miễn d ịc h 11

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 13

I Nguyèn liệ u 13

1 Hạt m ít 13

2 Hạt đậu dao biển (Canavaliơ maritim a) 13

3 Hạt cam thảo dây (A brus precatorius) 14

4 Các chủng v i khuẩn cho nghiên cứu 14

I I Phương pháp nghiên c ứ u 15

C á c kết quá thu được.

1 Đã thiết lập được quy trình tinh sạch hai loại lectin từ hai loài m í t 17

2 Quy trình xét nghiệm IgAị huyết thanh bằng k ĩ thuật E L LA đã được thiết lậ p 19

3 Sử dụng lectin mít tạo bộ sinh phẩm miễn dịch xét nghiệm Ig A ị 21

4 Phàn tích nồng độ kháng thể Ig A ị trong huyết thanh của người khoẻ mạnh và người b ị bệnh ung thư máu và ung thư ga n 22

5 T inh chế kháng nguyên protein A từ hai chủng tụ cầu vàng {Staph, aureus)

để thiết lập bộ sinh phẩm xét nghiộm kháng thê bệnh lý IgG 24

5.1 Kết quả tinh chế Ig G 24

5.2.Tuyển chọn tụ cầu vàng sinh tổng hợp cao protein A 25

5.3 Sử dụng kháng thê ỉgG để thiết kế cột ái lực Sepharose 4B -IgG để tinh chế proteinA 25

5.4 Xây dựng đường chuẩn kháng nguyên protein A bằng kỹ thuật ELISA-Ig 26

5.5 Thiết lập sinh phẩm ELỈSA-ProteinA đê’ xét nghiộm kháng thể IgG bệnh lý 27

6 Thu thập mẫu đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) và tinh chế lectin 28

7 Tinh chế lectin từ cam thảo dây (Abrus precatorius) và tạo sinh phẩm ELISA

-A P -A -b io tin nhận biết kháng nguyên vi khuẩn than (Baccilus anthracis) 30

a Q uy trình tạo cộng hợp lectin - biotin .31

b Q uy trình gắn lectin cộng hợp tạo sinh phẩm E L IS A - A P A - b iotin 31

c Các kết quả xét nghiệm kháng nguyên vi khuẩn than (Bacillus ơnthracis) và

các v i khuẩn không đặc h iệ u 32

Kết lu ậ n 34Tài liệu tham khảo

TÓM T Ắ T Đ Ể T À I

1 Tên dề tài: Nghiên cứu chế lạo một só bộ k it m iẻn dịch ứng dụng chẩn đoán sơm các ch i th ị kháng thê (Ig A , IgCì) và kháng nguyên bệnh nhiẻm trù n g , viém gan siêu vi và ung thư gan.

Thanh Nguyền Thuý Quỳnh và các sinh viên

5 M ụ c tiêu và nội dung nghiên cứu

5.1.M ụ c tiêu

- Tinh chê và tuyển chọn các protein có hoạt tính sinh học (lecũn, proteinA) từ nguồn

tài nguyên thiên nhiên dể chế tạo một sô K IT m iễn dịch dùng chẩn đoán sớm các chỉ

thị kháng nsuyên và kháng thê cùa mội sò' bệnh nhiễm trùng va une thư

5.2 N ộ i dung nghiên cứu

- Thiết lập các quy trình tinh chế lectin và proteinA từ thực vật và các chủng vi khuẩn

tuyển chọn Staphylococcus aureus có khả năng sinh tổng hợp proteinA cao đặc hiệu

kháng the và kháng nguyên bệnh.

- Nghiên cứu quy trình cộng hợp miền dịch lectin và protein A để điều chê bộ sinh phẩm bắt giữ miễn dịch kháng thể và kháng nguyên bệnh.

- Nehiên cứu điều kiện sàn xuất K IT mien dịch E L IS A -L ectin và ELlSA-ProteinA.

- Nchiên cứu các điều kiện bào quán K ÍT miễn dịch.

6 K ế t quà th u được

- Đã hoàn thành nghiên cứu ba quy trình tinh chế lectin và thu được 3 loại chế phẩm lectin từ m ít từ đậu dao biển và hạt cam thảo dãy Các chế phẩm lectin có độ sạch cao đã được đánh giá bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE.

hợp proteinA cao và tìm chọn được điều kiện nuối cấy tối ưu cho 2 chùng.

- Đã tinh chế được proteinA từ hai chủng lụ cầu vàng, có độ sạch cao khôi lượng phán lử khoảng 42 kDa được kiểm tra lại hằna điện di SDS-PAGE.

- Sử dụng proteinA để thiết kê bộ sinh phẩm K IT ELISA-ProteinA để xél nghiệm kháng thể bệnh lý IgG.

- Đã tinh chế được IgG từ huvết thanh của người bình thường và sừ dụng IgG tạo bộ

sinh phẩm định lượng proteinA và nhận biết tụ cầu vàng gây bệnh

- Sừ dụng lectin cam thảo dây chế tạo sinh phẩm E L lS A -A P A -biotin nhận biết vi

khuẩn than

* Đã có 5 bài báo đăng trong tạp chí chuyên ngành hoặc báo cáo ở hội nghị khoa học

Quốc G ia.l Đỗ Ngọc Lién Hoàng cẩm Vân Trần Thị Nguyệt Lan, Nguyễn Hạnh Phúc (2005) Tinh sạch lectin từ cam ihảo dây (Abus precatoricus) dùng để phát hiện

một số chủng vi khuẩnt gâv bệnh truyền nhiễm bảng k ĩ thuật ELISA Procceedings những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống Nxb K H K T Hà Nội Trang

610-613

2 Nguyễn Hạnh Phúc, Đỏ Ngọc Liên (2005), Nshién cứu khả năng cộng hợp lectin

{Abus pvecatorius)- Biotin trong nhận xốt một số chủng gây bệnh Proceedings Hội

nghị quốc tế về cống nghệ sinh học hưởng 8.2 Trang53-56

3 Nguyễn Thị Thanh, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn T hị Thanh Hà (2005) bước đầu nehiên cứu khả nãng cộng hợp protein A từ các chùng v i khuẩn Staphylococcus aureus

kháng kháng sinh được phân lập tại Việt Nam Proceedings những vấn đề nghicn cứu

cơ bản trong khoa học sự sống Nxb K H K T Hà N ộ i trang 1373-1375.

4 T rần Phương L iê n , N g uyên Vãn H iến, N g u yễ n T h ị T huý Q uỳnh, Đ ỗ Ngọc Liê n (20 0 6 ) so sánh khả nâng bắt giữ khá n s thế I g A ị từ huyết thanh cùa

(A.masticata) tạp chí Dược học 345 (46): 16-18

5 Đỏ Naọc Liên, Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Duy Loát (2006)

Tinh sạch lectin đậu dao biển (Canavaìia maritimơ, Auble!) và ÚT12 dụng trong xét nghiệm khár nguyên chỉ thị bệnh Tạp chí khoa học, ĐHQG, Hà nội (đang in).

* Sừn phẩm cùa đé tời: 3 bộ K IT miễn dịch xét nahiệm và tinh chế IgA| và IgG

* Đã dào lạo được:

1 thạc sĩ bảo vệ tháng 12 năm 2005 (Nguyễn Thị Thanh)

- 4 cử nhân đã được tốt nghiệp theo đề tài này (2006)

- 2 nghiên cứu sinh là Trần Thị Phương Liên và Trần Thị Nguyệt Lan đang tiếp tụ

nahiên cứu theo hướng để tài này (2005-2008)

6 Tình hình kin h phí

Kinh phí được cấp: 60.000.000 (vSáu mươi triệu đổng)

Kinh phí đã sử dụng: 60.000.000 (Sáu mươi triệu đồng)

V iệc nghiên cứ u các ch ỉ thị bệnh nhiẻm trùng vi sinh vật, nhất là các bệnh ung thư gồm phát hiộn nhanh các kháng nguyên và kháng th ể đặc hiệu cho từng loại bệnh và ch o từ ng loại tá c nhân gây bệnh là những vấn đề đ ã được nghiên cứu rất nhiéu vào những năm cu ố i của thập kỷ 20 và hiện nay vẫn còn đang được tiếp tục tiến hành ở nhiều nước trcn th ế giới [1,7] Trên cơ sở khoa học nghiên cứu các chỉ

thị bệnh kh án g nguyên và kháng thể, cũng như cấu trúc bộ gcn di truyền của các tác nhân gây bệnh, đ ã c ó hàng loạt phương pháp khác nhau trong việc phát hiện nhanh và nhạy cá c chỉ thị bệnh như kỹ thuật xét nghiệm m iễn dịch (ELISA, R IA , DOT-BLOT, W estern BLOT )

Bên cạnh đ ó c á c cải tiến kỹ thuật xét nghiệm kháng nguyên và kháng thể có thể

sử dụng các chất có hoạt tính từ nguồn tài nguyên thiên nhiên (động thực vật và vi sinh vật) như en zym , lectin , glycoprotein để tạo ra các kỹ thuật EIA , ELLA , FELLA M ặc dù các kỹ thuật tương đối đơn giản, ít tốn kém nhưng vẫn có tính đặc hiệu cao và ch o kết q u ả nhanh, nhạy, chính xác [1,6]

N gày nay, các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện trình tự gen đặc trưng của các tác nhủn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR (phản ứng trùng hợp chuỗi D N A ), kỹ thuật tách dòng chọn lọc và tạo kháng thể tái tổ hợp cũng đ an g được phát triển cho kết q u ả chính xác cao Tuy nhiên, kỹ thuật sinh học phân tử đòi hỏi tốn kém hơn, trang thiết bị đ ắt tién và thời gian thực hiện lủu hơn các phương pháp xét nghiệm m iễn dịch

Hơn nữa kỹ th u ật x ét nghiệm m iễn dịch còn được cải biến dưới d ạng que nhúng, hoặc bộ cảm biến sinh học B iosensor có thể thực hiện ở các đ ịa điểm tại hiên trường bên ngoài phòng th í nghiệm hiện đại

Việt N am là m ộ t nước nhiệt đới, có nguồn tài nguyên độ n g thực vật và vi sinh vật rất phong phú, có th ể cung cấp rất nhiều chất hoạt tính sinh học (bioactive substance) như: ch ấ t kìm hãm sinh học (bio-inhibitors) lectin, kháng thể, kháng nguyên, enzym đặc trưng nhằm phát hiện đ ặc hiệu các ch ỉ thị gây bệnh truyền

chất hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên thiên nhiên nhằm nghicn cứu tạo ra các bộ sinh phẩm (K IT ) ch o đ é tài này.

TỔ N G QUAN TÀI LIỆU

I Biếu h i ệ n b ệ n h lý của các kháng ngu vén liên quan đến một sò bệnh nhiễm trùng và ung thư

T rong đe tài, vì k in h phí và th ờ i gian có hạn, chúng tô i ch ỉ tập trun g vào khía

cạnh hoá sinh m iẻn dịch củ a loại kháng nguyên liên quan đến bệnh nhiễm trùng

máu và viêm gan v iru t Đ ó là các kháng nguyên p ro te in A và AFP.

1.1 Protein A của vi khuán Staphylococcus aureus và khả nâng gây bệnh

P roteinA là m ột protein cấu tạo nên thành tế bào củ a vi khuẩn G ram dương

Staphylococcus aureus Trong những năm 1970, người ta đã nghiên cứu cấu trúc

và tác dụng gây độc củ a P roteinA đối với người bị bệnh nhiễm trùng tụ cẩu vàng

Staphylococcus aureus Đ ến năm 1983, người ta đã giải m ã m ột phần cấu trúc gen

proteinA ở chủng vi khuẩn này và đến 1992 G ouda và nhiều nhà nghiên cứu đã đưa ra m ô hình cấu trú c không g ia n đoạn trình tự acid am in (vùng B) củ a phân tử

có ái lực liên kết cao với vùng Fc củ a phân tử kháng th ể IgG củ a người và các động vật chủ (O lszew ski và cộ n g sự [17]) Đ iều quan trọng là proteinA khi liên kết với kháng thê IgG làm m ấ t khả n ăng kháng bệnh nhiễm trùng củ a vật chủ (N guyen, et al [14]) Theo c ơ c h ế gây bất hoạt kháng th ể ch ủ chốt của cơ thể vật chủ bị nhiễm tụ cầu vàng, hậu quả nhiễm khuẩn trở nên nghiêm trọng, nhất là trong bệnh nhiễm trùng m áu P roteinA đặc biệt liôn kết đặc hiệu cao với kháng thế IgG của người (IgG ị, IgG 2 và IgG4, nhưng tương tác yếu với các kháng thể

khác của người như Ig M , Ig A , Ig D và Ig G ,) Chính vì vậy, người ta đã sử dụng

proteinA củ a tụ cầu vàng Staphylococcus aureus đổ nghiên cứu biổu hiện của các

IgG bệnh lý củ a cá c bệnh n h ân ung th ư và các bệnh nhiễm trùng củ a người (nhiẽm trùng vi khuẩn và virus) T rong phân tử proteinA , người ta phân chia ra 5 dom ain A, B, c , D, E, trong đ ó dom ain D có th ể tương tác với vùng biến đổi Fab

của chuỗi nặng của Ig M trên m àng tế bào B làm kích thích g ia i đoạn trưởng thành

của tế bào B, góp phần vào q u á trìn h chọn lọc dòng bạch cầu (G raillc M et al[ 12j Dựa vào sự tương tá c bề m ặt c ủ a proteinA với vùng V H , củ a receptor B (kháng

thể bề mặt của tế bào B) ngư ời ta có thể nghiên cứu kích thích chọn lọ c dòng tế

nghiên cứu ứng d ụ n g kháng nguyên protein A cũng đã được đ ề cậ p tới nhiều công trình củ a th ế kỷ trước, trong đ ó đáng kể là sử dụng proteinA trong xét nghiệm miễn dịch ELISA đ ể phát hiện IgG cú a người và các kháng th ể đặc hiệu virus (M ađore, B aum garten [14]

1.2 Kháng nguyên A F P , chỉ thị bệnh nhiẻm trùng và ung thư gan

A F P (alpha-fetoprotein) được gọi là protein thai có bản chất là một glycoprotein bao gồm m ột chuỗi polypeptid có khôi lượng phân tử sấp xỉ 70kDa, trong đó chứa 2,5% là phần carbohydrat (các gốc đường oligosaccharide) Trong năm 1956, B ergstrand và C za đ ã phát hiện ra A FP ở huyết thanh phôi thai, sau đó

T atarinov (1964) đ à tìm thấy nó trong huyết thanh m áu của các b ệnh nhân bị ung thư gan tiên phát [20] Sự sinh tổng hợp A FP chủ yếu diễn ra ở gan và túi noãn hoàng của thai A F P được tiết vào huyết thanh và đ ạt tới cực đại về nồng đ ộ ở tuần thứ 13 của Ihai kì và sau đ ó giảm dần ngay ở huyết thanh củ a đứ a trẻ mới sinh ra

và ở người trưởng thành chỉ ở nồ n g độ rất th ấp là nhỏ hơn 8.5 ng/m l huyết thanh

C ác đặc điểm hoá lí và trình tự acid am in củ a A FP gần tương tự n h ư A lbum in huyết thanh

Những năm 9 0 c ủ a th ế kỉ trước, các nghiên cứu của T ak eta và công sự [18] đã phân biệt A FP sinh lý (A F P củ a thai kì) và A FP hênh lý (A F P chỉ thị cho bệnh viêm gan virut v à ung th ư g an ) nhờ vào sự khác biệt thành phần các gốc oligosacchariđ liên kết cộ n g hoá trị với phần protein củ a phủn tử AFP Trên cơ sở

đ ó , các tác giả này đ ã phát hiện sự phát hiện trong tương tác đặc hiệu giữa các

A FP sinh lý và b ện h lý với các phân tử lectin (cũng là m ột loại glycoprotein) sẵn

có trong thiên nhiôn từ cây c ỏ và sinh vật, đặc biệt là các cây họ đ ậu (Fabaceae)

V ề chức năng c ủ a AFP, đ ã có nhiều công trình nghiên cứu từ th ế kỉ trước và cho đến nay vẫn cò n nhiều điều mới mẻ đê nghiên cứu Người ta cho rằng, AFP

có nhiều chức n ăn g vận ch u y ển giống như horm on estrogen và cá c acid béo Tuy nhiên khía cạnh m iễn dịch h ọ c, A FP cũng được nghiên cứu về hiệu q u ả kìm hãm

m iễn dịch ở thời kì c ó thai c ủ a thai phụ Đ icu này rất có thể tác dụ n g của nó là giữ

4

thức ghcp dị gen tự nhiên ( A llo g r a ft) giữa hai mẹ con tro n g thai kì.

A FP c ó ý n g h ĩa lâm sàng quan trọng trong chẩn đ oán các bệnh nhiễm trùng, ung thư gan và bệnh di truyền bẩm sinh (thiếu hụt ống thần kinh, bệnh Down )-

Người ta có th ể định lượng sự tăng đột biến về nồng độ A FP ở các bệnh nhân ung th ư gan tiên phát, xơ gan c ổ chướng, viêm gan m ạn tính hoặc sự giảm đột biến củ a nồng đ ộ A FP trong thai kì gây ra d o đột biến di truyền ở thai nhi Không

những thế, các nhà khoa học còn phát hiện ra sự khác biệt về cấu trú c đột biến

phần protein (chuỗi polypeptid A FP) đặc biệt là phần cấu trúc đường củ a m ỗi loại

A FP bệnh lí (T aketa và cs) V iệc xác định biểu hiện A F P đ ể tìm ra sớm bệnh lí

ung thư biếu m ô gan có thể coi là biện pháp sàng lọc N ồ ng độ cao của A F P được

tìm thấy ở trên 90% các bệnh n hân ung thư tế bào biểu m ô gan tiên phát N ồng độ

A F P huyết thanh > 1000ng/m l và đ ô i kh i lớn hơn 10000ng/m l hoặc đạt tới

I.000.000ng/m l N ồng đ ộ A FP cao được tìm thấy ở bệnh nhân ung thư tế bào

m ầm Người ta nhận thấy có m ối quan hộ trực tiếp giữa mức đ ộ A FP huyết thanh

và các giai đoạn phát triền b ệnh ung thư biểu m ô tinh hoàn và ung thư biểu mô gan tiên phái N ồ n g đ ộ cao A FP trong m áu chi' xuất hiện ở bệnh nhân có khối u phát triển lớn và tiên lượng bộnh là xấu Mức độ A FP ca o cũng phát sinh ở bộnh nhân ung thư dạ d ày , ung th ư biểu m ô ruột kết, mật và tuỵ cũng như thấy rõ trong trường hợp di căn ung thư gan

V iệc x ác định nồng đ ộ A FP d ể phân biệt giữa các d ạng ung thư cần được phối hợp với chí thị k h áng nguyên biêủ m ô phôi (C arcinoem bryonic A ntigen CEA)

Theo Fateh-M oghadam và A tieber [10], A FP là m ột ch ỉ thị có đ ộ nhạy cao trong chẩn đoán b ệnh ung gan v à ung thư biểu mô

2 Biểu hiện bệnh lý của kháng thẻ

Ở người có 5 lớp k h áng thể, chúng là các globulin m iễn dịch (Im m unoglobulin, Ig) có bản chất là những phân tử glycoprolein nằm trong m ột h ọ lớn của các

g lo b u lin m iền d ịch K h ố i lư ợng phân tử của các Ig khá cao từ 150-170kD a và có

C ỡ n g thức tổng q u át củ a các Ig là H2L2 Kháng thể thuộc hệ m iễn dịch , tiến hoá caio ờ người có cấu trúc phân tử rất tinh vi cố chức năng rất hiệu q uả trong đáp ứng

miiễn dịch chống lại các tác nhan gây bệnh như các vi sinh vật truyền nhiễm cũng nhiư trong các đ áp ứng các bệnh ung thư và nhiễm trùng khác củ a người

Điêu đáng chú ý là các nghiôn cứu về thành phần và số lượng của các chuỗi đưrờng liên kết với các chuỗi n ặng và các chuỗi nhẹ củ a các kháng thể củng cho biéết những đ ặc điếm bệnh lí củ a cá c Ig của bệnh (K obala [13]) Trong các Ig, IgG, IgĩM , IgA có nồ n g đ ộ huyết thanh rất cao từ 2 đến 12g/l h uyết thanh Đ iều đó cũing nói lên vai trò b ảo vệ m iễn dịch của các kháng thể này đối với cơ thể người

Sự thay đổi về số lượng và ch ất lượng củ a các kháng th ể cũng đ ã được nghiên

cứm trong nhiều bệnh n hiễm trùn g, bệnh ung thư và các bệnh tự m iẻn

(Aiutoirr.mune d iseases) và m ột s ố bệnh di truyền C ác Ig củ a bệnh ung thư tuỷ

(bệình u tú y ) là d o sự tăng sin h đơn dòng của tế bào B khôn g chỉ biểu hiện khả

nãing tăng sinh khối lượng củ a IgG (tăng nồng độ IgG ) m à cò n làm thay đổi cấu trúcc cùa chuỗi đường trong ph ân tử IgG Người ta đã phân tích thấy rằng tất cả các

ỉg ( 3 của bệnh nhân u tuỷ đều chứ a hai chuỗi đường o ligosaccharide liên kết với các; gốc ^\sp trong phan tử IgG Tuy nhiên đ ã phát hiện ra 5 dạn g phân tử IgG của bệm h u luỷ có chứa m ột lượng lớn các chuỗi đường Trong bộnh u tuỷ, số lượng tãnjg lên bất thường củ a các chuỗi nhẹ tự do (chuỗi nhẹ protein Bence-Jone) và số lưựmg cốc chuỗi đường cũng được phát hiện khác biệt bất thường ở m ảnh protein

này/ (Ohcura và các cộng sự [1 6 ]

TTươnị; tự như trên , sự thay đổi về số lượng củ a các kháng th ể IgA (Ig A |, IgA 2) cũm g đã được phát hiện ở nhiều bệnh nhiễm trùng và ung th ư (A ucouturier và cộnig s ự [3]) Biểu hiện bất thường của chuỗi nặng a củ a IgAị đơn dòng là khả nãnig glyx)syl hoá rất cao (gắn nhiều gốc đường vào phân tử) Sự thay đổi cấu trúc đườm g c«a các IgA và IgG đ ã làm biến đổi đặc tính hoá ái lực liên k ết với m ột số

h ợ p châì cộ n g hợp đường (g lycoconjugates) có trong cơ th ể sống đ ã tạo ra hiện tượm g bệnh lí nghiêm trọng n h ư đóng cặn A m yloid, gủy tổn thương thân nghiêm trọm g Hm nữa các kháng th ể b ất thường đó cũ n g thay đổi ái lực hoá học đối với

6

và phàn biệt các kh án g the bệnh lí với các kháng thể bình ihường.

3 Các kĩ thuật miẻn dịch trong chẩn đoán bệnh

Dựa vào nguyên lý liê n kết đặc hiệu giữa kháng nguyôn và kháng thể, người ta

c ó thế thiết k ế được c á c phương pháp xác định hoặc kháng thể hoặc kháng nguyên bệnh tức là những dấu hiệu chỉ thị bệnh (M arker)

T ro n g m ột bệnh tru yề n nhiễm do các vi khuẩn tụ cầu vàng (Staphylococcus

a ureus) gây bệnh n h iễ m trùn g máu, nhiễm trùn g bỏng, ngư ời ta có thể sử dụn g bộ

sinh phẩm chứa k h án g thể IgG để phát hiện và bắt g iữ đ ặc hiệu k h áng nguyên proteinA của chí riêng loại vi khuẩn này M ột số lectin khác n h ư lectin đậu tương

G lycin e m ax, le ctin ốc sên (H e lix p o m a tia ) phát hiện đặc hiệu riê n g đ ố i v ớ i kháng

nguyên bề m ặt củ a vi khuẩn gây bệnh than (Bacillus anthracis) (D oyler và

C ác bộ sinh phẩm m iẽn dịch được thiết k ế có thể sử dụn g trong cá c xét nghiệm

m iễn dịch chí thị bệnh nhiễm khuẩn, nhiễn virut như nhiẻm khuẩn gây đ ộ c Ihực phẩm , nhiễm các loại v iru t bệnh nguy hiểm như (H IV , virut viêm gan virut, cúm

A, H 5N | ) hoặc xét n g h iêm kháng thể hoặc kháng nguyên chỉ thị bệnh ung thư

4 C ác ỉectin đặc hiệu liên kết kháng thể hoặc kháng nguyên bệnh.Lectin theo G oldstein (1980) định nghĩa là những protein hoặc glycoprotein có khả nãng ngưng kết c á c tế bào hổng cầu củ a động vật và tương tác đặc hiệu với các loại đường cũng n h ư các hợp chất cộng hợp với đường (glycoconjugates)

m ạnh m ẽ từ những n ăm 50 củ a th ế kỷ XX và ngày nay khả náng ứng dụng sinh

h ọc y học, m iẽn d ịc h h ọ c của lectin ngày càng phát triển

Các lectin đ ã đư ợc phát hiộn ớ hầu như tất cả các cơ th ể độ n g vật, thực vật và vi sinh vật, thậm trí có m ạt ở các bào quan quan trọng củ a người như: m àng tế bào,

m àng nhãn và n h iều c ơ quan nội tạng quan trọng khác như tim , ó c, phổi, gan Tuy vậy, chức năng sin h học củ a các lectin cho đến nay, m ằc dù đ ã biết rõ khá nhiều, nhưng cũng cò n nhiều vấn đ ề đang tranh cãi M ặc dù vậy, các ứng dụng

củ a lectin vẫn phát triể n và đang đưa đến nhiều lợi ích trong nghiên cứu sinh học,

y học, trong đ ó có n g h ic n cứu ung thư học

C ác lectin được ứng dụng nhiều trong y học và sinh học trước tiên là lectin từ nguồn gốc cây họ đ ậu (Fabaceae), tiếp theo đ ó là các cây họ dâu tàm (Moraceae), họ thầu dầu hay họ ba mảnh vỏ (Euphorbiaceae, Tricoccea), có khả

năng tương tá c đặc hiộu với các tế bào hồng cầu thuộc các nhóm m áu A, B, o của người, khá n ăng phản ứng đặc hiệu với các k h áng th ể và k h áng nguyên có bản chất glycoprotein, k h ả năng kích thích phân bào đặc hiệu và kìm hãm gây độc đặc hiệu với bào quan rib o x o m (RIP)

4.1 Đậc tính sinh học và miễn dịch của lectin họ đậu

Trong số các lectin từ hạl của các cây họ đ ậu , C oncanavalia A là lectin được tách và tinh c h ế từ câ y đ ậu Canavalia ensiformis, thường gọi tắt là C onA đ ã được nghiên cứu cấu trú c h o á học sâu sắc nhất và khả năng ứng dụn g y h ọ c của nó cho đến nay vẫn đ ang đư ợc khai thác m ạnh mẽ nhất Vì thế, các c h ế phẩm lectin này

đ ã được tinh c h ế ở m ức đ ộ sạch rất cao và được thương mại hoá trên th ế giới với giá trị cao C hẳng h ạn lg c h ế phẩm ConA củ a hãng SIGM A , có đ ộ sạch đồng nhất ttrong điện di SDS-PAG E, d ạng đỏng khô đã được bán với giá 190 USD (sách

C atalogue thương m ại, hãng SIG M A 2000)

Bén cạnh đó, các lectin từ các cây thuộc chi Pltaseolus, đặc biệt là từ đậu thận

đ ỏ (Phaseolus vulgaris) thường được gọi là PHA (Ph\tohaemaggỉutinin),nghĩa là chất gáy ngưng kết h ồ n g cầu c ó nguồn gốc thực vật, đ ã được tinh c h ế từ vài chục

(m itogen) điển hình T u y vậy, chính trong hạt của cây đ ậu này, tuỳ th eo nguồn

g ố c giống trồng (C ultivar), nghĩa là sự phân loại ớ mức dưới loài, lectin củ a chúng

c ó the the hiện ở 5 lo ại izo le c tin khác nhau, với tỷ lộ khác nhau g iô n g như kiểu cấu trúc cùa izo zym lactatdehydrogenase (R u d ig e r et al, 1985) M ộ t trong 5 loại

Iz o le c tin đó là P H A -E 4 có khả năng liên kết chọn lọ c, đặc hiệu v ớ i kháng nguyên

A F P của kh ố i u tro n g bệnh ưng thư biểu m ô tế bào gan Dựa vào tín h chất liên kết

đặc hiệu cao này, T ak eta và cộng sự [18] đã nhiều năm n ghiên cứu về ái lực liên kết miễn dịch đặc hiệu giữa nhiều dạng A FP của m ột số dạng ung th ư ở người, ung thư biểu m ô tế b ào g an , ung thư noãn hoàng và A F P vốn sẩn có củ a bào thai

củ a sản phụ bình thường C ùng với các tác giả trên, nhiều nhà khoa học cũng đã chứng minh được tín h k h ác biệt tinh vi trong cấu trú c đường củ a nhiều loại phân

tử A FP có nguồn g ố c khác n hau có ảnh hưởng đến ái lực liên kết củ a chúng đối với các loại lectin khác n hau [15] N hờ những phát m inh trên, T aketa và Cộng sự [18] đ ã đưa ra m ột k h ái niệm về dấu hiộu chỉ điểm ung th ư A FP-Lectin nghĩa là dấu hiện A FP ái lực với lectin phân hiột với A FP không có ái lực với lectin

Các kết quả ngh iên cứu về A F P cho biết: A F P d i chuyển nhanh ở vùng a khi

điộn di trẽn giấy và trên tấm thạch agar-agar; ngay bên cạn h phân tử album in huyết thanh Đ iểm đ ẳn g điện cử A FP là 4,5-5,2 Hộ số tắt đặc trưng củ a dung địch

A FP ỉ % với chiều d ày lc m ở bước sóng 278nm là E ‘™ = 5,3; thời gian bán huỷ 5

ngày

A F P trong huyết thanh của phụ nữ có thai tăng lên nhanh chóng vào tháng thứ

2 và 3 (từ tuần thứ 12-14) và đ ạt cực đại trong các tháng tiếp theo Đ ặc biệt là dây rốn của trẻ sơ sinh, hàm lượng A FP có th ể đạt tới 10.000m g/m l- 100.000ing/ml và sẽ g iảm ngay lập tức sau khi sinh 10 tháng

A FP được tổng hợp ở nhu m ô củ a gan HCC và ở gan bào thai khá g iống nhau về cấu trúc hoá học, cũ n g n h ư đặc tính phản ứng miễn dịch

Nồng độ A FP có th ể thay đổi trong các trường hợp bệnh lí khác củ a gan, như các bệnh viêm gan m ạn tính, cấ p tính do virut HBV, H CV H àm lượng A FP lớn

nhân viêm gan cấ p tín h , viêm gan m ãn tính, xư gan và ch iếm tỷ lệ tương ứng là 31% , 15%, và 11% H àm lượng A FP huyết thanh củ a b ệnh viêm gan m ãn tính

(C h ro n ic hcpa tities) rất hiếm k h i vượt quá 500 ng/m l T u y nhiên, trong y văn đã có

lú c nêu trường hợp cá b iệ t đạt tớ i l0()()-3000n g/m l, thậm t r í có k h i là 7.190ng/m l

(T aketa và cộng sự [19]), nhưng văn khổng thấy xuất hiện ung thư gan ở bệnh nhân này A FP huyết th an h củ a b ệnh nhân viêm gan thường tăng từ từ hoặc c ó thể

tăng nhanh đổng th ờ i với m ột số enzym transaminase, chẳng hạn, G lutam ate

o x alo acetate T ran sam in ase và G lutam ate pyruvate transam inase củ a huyết thanh (ký hiệu tương ứng là SGOT, SGPT) Sự xuất hiện A FP tăng đ ộ t ngột trong bệnh

viêm gan cấp thường liê n quan đến sự tổn thương các tế bào gan dẫn đến huỷ hoại

các tế bào gan, được phản ánh rất rõ bằng sự tăng lên m ạnh m ẽ trong các bệnh ung thư gan thứ phát và ung th ư ngoài gan Đối với ung th ư dạ dày, ung thư tu ỵ và ung thư gan th ứ phát, tỷ lệ A F P dương tính tương ứng với các bệnh đ ã nêu là 18%,

23% và 8,6% Ở bện h ung thư túi noãn hoàng của người (hum an yolk sac

T um our), người ta cũ n g tìm thấy sự tăng lên nồng đ ộ A FP huyết thanh Tất cả những phân tích ở trên đều ch o thấy, không thể dựa vào sự tăng về nồng đ ộ A FP

để phân biệt các bệnh l í khác nhau ở người, đặc biệt là khôn g thể phân b iệ t giữa

ung thư biéu m ô tế b ào gan với các bộnh viêm gan và cá c bệnh ung thư khác Vì

lẽ đổ, căn cứ vào ái lự c liê n kết hoá học giữa các dạng A F P bệnh l í có thổ tạo ra phức hệ A F P -le c tin đặc hiộu riê n g do cấu trú c đường trên các kiể u phân tử àP của các bệnh riê n g biệt.

4.2 Danh pháp của A F P liên kết với lectin

Do có nhiều lectin được ứng dụn g trong điện di, vì vậy hệ thống danh pháp (cách gọi tên) củ a A F P liôn kết với lectin được viết dưới nhiều dạng khác nhau, tuỳ thuộc vào cách đặt tên và cách gọi tên củ a từng tác giả (Taketa và cộng sự)

Tuy nhiên, T aketa K và cộ n g sự [19]đã đưa ra hệ thống d anh pháp hợp lý và đầy đủ nhất Hộ th ố n g danh pháp này có thê được sử dụn g ch o tất cả cá c loại lectin, và không phụ th u ộ c vào số lượng của các dài A F P th eo lectin Có th ể tóm tắl như sau:

10

tiên của dải hao giờ c ũ n g là số 1 Hậu tố tiếp nối với A FP là lectin được viết bằng

ch ữ số in hoa và lấy ch ữ đầu tiên Ví dụ: khi điện di A FP với concavalinA (C onA ), kết quá cu ố i cù n g sẽ phân tách được 2 dải: AFP-C1 và A FP-C 2, Irong đỏ:

c là chữ đ áu củ a co ncavalinA

Tuy nhiên, trong m ộ t số trường hợp có một số dải Irung gian V í dụ: dải trung gian giữa A FP-L2 và A F P -L3 thì đưực diễn tả bằng A FP-L2-3 Sau đây là các dải (band) củ a A FP ái lực với các loại lectin đ ã được phân loại theo h ệ thống danh pháp Taketa K và cộ n g sự

C ác dải (b an d ) cùa A FP với lectin Lectin dùng tro n g điện di

AFP-P1 A FP-P2, A F P -P 3 , A FP-P4, AFP-P5 E-PH A

AFP- D l, A FP- D2, A FP - D3, A FP- D4, AFP- D5 DSA

A FP -A A I, A FP -A A 2, A FP-A A3, A FP-A A4 A A L

4.3 Một sỏ dặc điếm lectin các loài mít được dùng cho y học- miễn dịchTrong hai th ập kỷ 80 và 90 củ a th ế kỷ trước nhiều công trình k h o a học nghiên cứu về lectin các loài m ít thuộc chi mít (A rtocarpus) được thực hiện theo hai hướng cư bản: n g h iên cứu cấu trú c phủn tử và nghiên cứu đặc tính m iễn dịch của lectin

Từ năm 1988 sau khi phát hiện những giá trị to lớn củ a lectin từ có liên quan đến khả nũng kìm h ãm sự tương tác giữa HIV và tế bào T-C D 4 tro n g hội chứng AIDS, nhiều công trìn h n ghiên cứu về lectin m ít đ ã được công bố: H agiw ara

1988, Pincau v à cộ n g sự (1 989), A ueouturier và cộng sự (1990), B rugier và cộng

sự (1990), N icolas và cộ n g sự (1993, 1995, 1996) C ác công trình k hoa học này

lectin m ít có nguồn g ố c lừ O iâ u Phi và Nam Mỹ (B razin), và V iệt N am [3]

Theo th ứ lự thời g ian , những vản đề về cấu trúc phân tử lectin các loài m ít chi

A rtocarpus đã dần d ần được sáng tỏ và được đôn g đảo các nhà khoa học thừa nhận

N hững nghicn cứu v ề đặc tín h cấu trúc phân tử m iễn dịch học củ a lectin m ít của Viột N am , có nguồn g ố c Đ ông N am châu A (Jarette, 1959) chỉ mới bắt đ ầu từ những năm 1991-1992 Khi đ ó , Đỗ N gọc Liên và các tác g iả người Pháp [9] đã tiến hành tách tinh chế, so sánh trình tự sắp xếp đầu tận cùng N củ a cá c lectin từ 3 loài m ít củ a V iệt N am là mít m ật (A heterophyilus), m ít tố n ữ (A champeden) và

chay A tonkisnesis) được trồng tại m ién bắc V iệt Nam K ết quả nghiên cứu cho

thấy giông như các tá c g iả củ a Canada Young N M và cộng sự [1991] phân tích trên lcctin củ a m ít B razin, lectin mít củ a V iệt N am cũng bao gồm hai chuỗi polypcptid là chuỗi a gồ m 133 acid am in và chuỗi p gồm 20-21 acid am in Tuy

nhiên trình tự sắp x ếp c á c ac id am in trong chuỗi polypeptid củ a chuỗi a c ó một sô' sai khác từ 5 đ ến 7 gốc ac id am in và ở chuỗi p có đ ến 4 gốc acid am in sai khác nhau Trong năm 1994, Đ ồ N gọc Liên và cộng sự cũng đ ã tiếp tục phân tích trình tự dầu N củ a hai ch u ỗ i polypeptid a và p ở 2 loài m ít dại củ a V iệt N am là A

m asticata, A asperulus T iếp th eo đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu các lcctin này đối với các dò n g k h án g thể đư n dồng và đa dòng IgA , IgD K ết quả ch o thấy các lectin của m ột số loài m ít V iệt Nam có khả nãng liên kết đ ặc hiệu chủ yếu với IgAị Rõ ràng là n hờ những nghiên cứu cơ bản sâu sắc, các ứng dụng y h ọ c và

m iễn dịch củ a lectin m ít đ ã đ ạt được những kết q u ả có ý nghĩa khoa học và thực tiẻn cao và đ ã có nhữ n g công trình nghiên cứu ứng dụn g y học [2,6]

12

Hình 1 Quà mít dai (A heíerophylìus Lamk) H ình 2 Q uả m ít tô nữ (A champeden)

M ít (lai (Artocarpus heterophyllus Lamk ) thuộc bộ gai (Urticaies), họ dâu tầin

(Moraceae), chi Aríocarpus.Là loại cây ăn q u ả nhiệt đới , mít dai được trổng ở nhiẻu tỉnh m ién Bác nước ta M ít d ai là loại cây lâu năm , thân gỗ, hoa m ọc thành

cụ m trôn cành Q u ả phức nhiều m ú i, mỗi m úi ứng với m ột hoa Hạt lớn hai lá

m ẩm chứa nhiều chất d ự trừ Q uả ch ín vào cuối tháng 6, đầu tháng 7 dương lịch

2 Hạt đặu dao biển (Canavalia maritima)

H ạt đẠu d ao biến thu tại khu vực chân núi N gũ H ành Sơn thuộc Q uảng N am -

Đà Nãng do T S Nguyễn Đăng Khôi định tên

3 H ạ t cam th à o dây (A b ru s preca to riu s)

C am thảo dây hay còn gọi là

3-4m

Cam thảo dây thường sô n g ờ vùng nhiệt đới, trong các vùng rìm g thưa ở cả trung

d u và đổng bằng, ở nư ớc ta c ó th ể thấy cây này ở Thừa Thiên H u ế đến Ninh Thuận C ây được trổng làm thuốc và làm cảnh

Cam thảo dây có thê d ù n g làm thuốc, dùn g để chữa ho, giải cảm , trị hoàng đ àn do viêm gan virus, đ ánh trống ngực, sát trùng, tiêu viêm, làm mụn nhọt ch ó n g vỡ, chữa rắn cắn làm th u ố c tẩy, thuốc g ây nôn

4 Chủng vi khuẩn cho nghiên cứu

C ác chủng Staphylococcus aureus được cung cấp bởi phòng K háng sinh đ ồ 1

củ a V iện V ệ sinh D ịch tề Trung ương Vi khuẩn được lấy từ các ống thạch m ểm

ch uyển sang canh th an g thường nuôi cấy qua đêm trong tủ ấm 37°c Sau đ ó chúng

dược chuyển qua m ôi trường thạch ngh iên g nuôi cấy qua đêm trong tủ ấm 37°c,

hạt cườm thào, Dây chi chi, Dây cườm cườm, tên k hoa học

là Abrus precatorius L-, thuộc

họ đậu Fabaceae

Hình thái và đặc điểm nhận dạng: là cây bụi, thân leo cuốn, hoa cánh bướm giống m àu hoà hổng, tập trung trên m ột cànhHình 4 Ánh cây và h ạt cam th ảo dáy hoa dài Bụi cây có thể ca o đến

trường T ry p to casein soya broth nuôi cấy trong 72 giờ ờ nhiệt độ 3 7 °c đê thu sinh

khối (T ro n g trường h ợ p các ch ủng bị nhiễm tạp thì phài dùng m ôi trường

C hapm an đ ể phíìn lộp Staphylococcus aureus ).

anthracis và các chủng s flexneri

X P155, S flexneri XP154, s.flexneri

XP156, Corynebacterium diptherỉae, Streptococcus spp., tì cereus được khoa

vi khuẩn viện vộ sinh dịch tễ cung cấp

H ìn h 5 T ụ c ầ u v àn g

- H ổng cau cu a Viẹn nuyet nọc va iru y ề n m áu TW C ác nhổm m áu A, B, o được

ch ống đ ô n g bằng K ,-E D T A , sau đ ó rửa, ly tâm 1200 v ò n g /p h ú t; 3 lần bàng dung

dịch m uối sinh lý N aC l 0,9% ; pha loãng hồng cẩu thành du n g dịch 2% đ ể sử dụng

trong th í nghiệm xác đ ịn h hoạt tín h ngưng kết và tương tác đặc hiệu đường cù a

lectin

1 X ác đ ịn h hoạt đ ộ lectin theo A lex an d re Kort [ 1 ]

2 Tinh c h ế các lectin từ dịch chiết các loại đệm thích http (PBS, TBS có C a2\

M n2' nhờ k ết tủa với (N H 4)SQ4 70% ) tiếp theo sắc k í trên cộ t trao đổi ion CM-

cellulose, D E A E -cellu lo se, Sephadex G 5 0 như đà được m ô tà [ 1 ]

3 Tinh c h ế protein A n h ờ cột ái lực Sepharose 4B -IgG tự điéu chế

4 Tinh c h ế IgG n hờ cộ t sấc k í ái lực Sepharose 4B- proteinA (H ãng SIG M A )

5 Đ iện di trên SDS-PAG E như đã được m ô tả [ 1 ]

6 Sử dụn g cá c phương pháp xét nghiệm m iẻn dịch EL ISA -lectin; ELISA -lectin-

biotin đã được m ô tả.ị.1 ]

8 C ác hoá chất sử d ụ n g là tinh khiết dùng cho phân tích được m ua củ a các hãng Ihương mại Sigm a, Prolabo, M erck.

Li tâm 8000 v/p trong 15 phút, thu tủa,

h o à tan tủ a bằng lượng tối thiểu đệm PBS pH 7.4

K iểm tra đ ô tinh Sử dụn g làm kháng

H ìn h 6 Sơ đổ tin h chè lectin mít (m ít d ai và mít tỏ nừ) (Bằng sác kí tra o đổi ion q u a cột CM -Cellulose)

Mức đ ộ tinh sạch củ a cá c c h ế phẩm lectin sau khi được tinh c h ế bằng quy trình

ở trên đã được kiểm tra bằng k ĩ thuật điện di c h ế phẩm lectin trên gen SĐS-PAGE

q

Cột 2 le ctin mít d ai sau tinh ch ế

C ột 3 le ctin m ít tố nữ sau tinh ch ế

Cội 4 le ctin m ít ch ay sau tinh ch ế

Kết quả tin h c h ế lectin theo quy trình này thu được m ỗi loại lectin chứa hai băng có k h ố i lượng phân tử sấp xi 14 và 17kDa n h ư đ ã được công b ố trong các công trình trư ớ c đây [2] Tuy nhiên điều khác biệt trong phương pháp này là

ch úng tôi đ ã s ử d ụ n g m ột quy trình mới chỉ cần m ột cộ t sắc k í trao dổi ion CM- cellulose và tiến h ành thí nghiệm trong điều kiện pH lựa chọn tối ưu nhất cho nên thu được c h ế phẩm vừa có độ tinh sạch và hiệu suất cao

Bảng l:Q u á trìn h tin h ch ế lectin mít d ai bàng cột CM -celluIose từ lOg bột h ạt

tổng (mg) Hoạt độ tổng (H AA xlO 1)

Hoạt độ riông (HAAxlO tym g Pr

Độ sạch tăng

Thu hổi hoạt độ,

% Chế phẩm thỏ tủa

Các giai đoạn Protein

tổng (mg) Hoạt độ tổng (HAAxlO ')

Hoạt độ riêng (H AA xl0')/m g Pr

Độ sạch tăng

Thu hổi hoạt độ,

Hình 8: Đồ thị phân tích sác kí lectin mít qua cột CM-celluIose

2 Quy trình xét nghiệm Ig A ị huyết thanh bằng k ĩ thuật E L L A đã được thiết lập:

Kĩ thuật ELLA (Enzym e-L inked-L ectinosorbent-A ssay) là m ột kỹ thuật mới có

độ nhạy cao, nó được cải tiến dựa trên kỹ thuật ELISA (E nzym e-Linked-

Im m unorbent-A ssay) sử dụn g nghiên cứu m iễn dịch lectin đ ể chẩn đ oán bệnh của người và độn g vật Kỹ Ihuật này cho phép định lượng m ột kháng th ể hoặc kháng nguyôn có mặt trong m ẫu nghiên cứu huyết thanh sinh vật bằng cách sử dụng kháng thể đặc hiệu h o ặc k h áng nguyên đ ặc hiệu gắn cộ n g hợp với m ột enzym e

2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 0 22

Phân đoạn

kháng ihổ hoặc kháng ng u y ên nghiên cứu.

2 Phu hán (Blocking): Cho 250 ị.il đệm blocking vào mồi giếng rồi để ở nhiệt

độ phòng từ 16-18h hoặc để ở nhiệt độ 3 7°c trong 1 -2 h Sau đó rửa bản như trên và làm khô

3 Gắn kháng thể: Pha loãng huyết thanh người k hoẻ ở nồng độ th ích hợp trong đệm blocking C ho 100 huyết thanh đ ã pha loãng (H u y ết thanh được pha loãng 100 lần bằng đ ệm citrat-phosphate pH 5,5 trước khi sử dụng) vào mỗi giếng trừ giếng đ ố i chứ ng, sau đó đ ế ở nhiệt độ phòng từ 16-18h hoặc để ở 37°c

trong lh Rứa hán từ 5-7 lần bằng đ ệm PBS pH 7.4 chứa 0 05% T w een 20, vỗ cho thật khỏ

4 Gắn kháng thê’ cộng hợp: C ho vào mỗi giếng 100 |.il kháng thể cộng hợp

PO kháng IgA người (pha loãng 1/20 000 trong đệm blocking), ủ ở 37° c trong 2h sau đó rửa từ 5-7 lần bằng đệm PBS - Tw een 0.05% , rồi làm khô

5 Thêm c ơ chất: C ho vào m ỗi giếng 100 ^1 cơ ch ất, sau đ ó đ ể phản ứng xảy ra trong tối trong 3 0 phút

6 Ngừng phản ứng: C ho 50 Ịil H2S 0 4 4 N vào m ối giếng rồi đọc k ết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 4 9 2 / 620

Xây dưng đ ồ thị chuẩn Ig A ,: Từ c h ế phẩm IgA , đ ã tinh sạch pha với đệm blocking thành các d u n g dịch c ó nồ n g độ lần lượt là 0.05; 0.1; 0.15; 0.2; 0.25; 0.3;0.35; 0.4 mg/ml rồi xây dựng đ ổ thị chuẩn (hình 5) b ầng phương p háp ELISA trcn máy đọc EL1SA 5 50 củ a hãng BIOR AD

20

3 Sứ dụng lectin mít tạo bộ sinh phẩm miễn dịch xét nghiệm IgAi

Sử dụ n g cá c c h ế phẩm lectin m it được tinh sạch, ch ú n g tôi n ghiên cứu quy

trình gắn bản, thời gian g ắn bản và b ảo quản sinh phẩm trong các điều kiện khác nhau Kết q u ả thu được như sau:

a Điều kiện gắn bản và thời gian gắn.

C húng tôi g ắn bản trong những điều kiện sau:

- G ắn bản lectin ở 3 7 ° c tro n g 2-7-3 giờ

- G ắn bản lectin ở 4 2 ° c trong 2 -T- 3 giờ

- G ắn bản lectin ở nhiột đ ộ phòng (2 2 ° c 4- 25°C) trong 2 -ỉ- 3 giờ

- G ắn bản lectin q u a đêm (khoảng 16 tiếng -r 18 tiếng) ở nhiột độ phòng(220O 2 5 0C)

Tất cả các bước còn lại thực hiộn g iống nhau với các điều kiộn bản gắn sao cho:

- H àm lượng lectin gắn bản: 10 ng/giếng

- H uyết thanh như nhau pha loãng 100 lần

- K háng h u y ết th an h pha loãng 20.000 lần

Trong quá trìn h xét nghiệm kháng th ể IgA , ch úng tôi thấy điều kiện gắn bản tối ưu là: gắn bản lectin qua đêm (khoảng 16 tiếng -r 18 tiếng) ở nhiệt độ phòng (2 2 ° c -T- 25°C) T uy nhiên trong khoảng thời gian ngắn ĩa hoàn toàn có thể

sử dụng việc gắn bản ở 3 7 ° c trong khoáng 2 -r 3 giờ vì kết q u ả hấp phụ quang học đạt 0.148 (đối với lectin m ít dai) bằng 98,67% so với điều kiện tối ưu, củ a lectin mít tố nữ là 0.135 ( bằng 98,54% )

C húng tôi tiến hành g ắ n bản lectin trên 96 giếng nhựa (8x12), từ hán qua đêm ỡ nhiệt độ ihường với h àm lượng lectin gắn bản như đã thãm dò là 10

|ig/giếng Sau đó, rứa sạch b án giếng bằng PBS - Tw een 0,05% , vỗ khỏ Blocking tất cá các giếng Rửa sạch, vỗ khỏ Báo quản bán gán lectin ở 4°c.

Sứ dụn g bản lectin gắn sẵn làm thí nghiệm trong cá c khoảng thời gian khác nhau: sau 2 ngày, 4 ngày, 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 1 th án g , cá c điều kiện thí nghiệm là như nhau C húng tôi thu được kết quả sau:

Bàng 3 Độ háp phụ q u an g học của IgAị sau các thời gian bảo q u ản ở 4 °c

của b ản g ắn lectin mít dai và mít tò nữ

4 Phàn tích nồng độ kháng thê IgAj trong huyết thanh của người khoẻ mạnh

và ngưòi bị bênh ung thư máu và ung thư gan

C húng tòi đ ã tiến hành phân tích cá c m ẫu huyết thanh với số lượng từ 10-15 mẫu

từ người k hoe bình thường và người bị bệnh Sử dụng bộ sinh phẩm ELISA -lectin mít được đ iề u c h ế từ hai loại m ít: m ít dai và m ít tố nữ đ ể xét nghiệm theo k ĩ thuật ELLA như q u y trình đ ã m ỏ tả ở phần 2 K ết q u ã thu được thể hiện ở biểu đồ so sánh ữ hình 10

22

Hình 10: Khả năng bắt giừ miễn dịch IgA, của các lectin mít bằng kĩ thuật

E L IS A

N H Ậ N X É T

C ó thể dùng lectin m ít đ ã tinh sạch đê dùng làm k h áng nguyên gắn bản trong

kỹ thuật ELLA để xác đ ịn h hàm lượng IgA, trong huyết thanh người bình thường

và trong huyết thanh người bệnh ung thư gan nguyên phát và ung thư m áu và nghiôn cứu m ột số đ iề u kiện tạo b ộ sinh phẩm m iến dịch xét nghiệm IgAị Kết quả ch o ihấy hàm lượng IgA ị trong huyết thanh

+ Đ ối với người b ìn h thường là 3,58 m g/m l (đối với lectin mít dai) và

3 ,44(đối với lectin m ít tố nữ)

+ Đ ỏi với người bị ung Ihư m áu là 10,93 m g/m l (đối với lectin m ít dai) và 10,72 m g/m l (đối với lectin m ít tố nữ)

+ Đ ối với người bị bộnh ung th ư gan là 11,43 (đối với lectin m ít dai ) và 10,59 (đối với lectin m ít tố nữ)

- N ghiên cứu ch o th ấy điều kiện gắn bản tối ưu là G ắn bản q u a đêm (16-18 giờ) ở nhiệt đ ộ phòng (22-25°C)

- Thời gian sử d ụ n g bản g ắn tốt nhất trong m ột tuần tính từ khi gắn bản (điều kiện b ảo q uản là 4°C) đạt kết q u ả 95,39% so với bản gắn được dùn g ngay (đối với lectin m ít d ai) và đ ạt 97,1% (đối với lectin mít tố nữ)

5 Tinh chế kháng nguyên proteinA từ hai chủng tụ cầu vàng (S aureus)

đê thiết lập bộ sinh phám xét nghiệm kháng thể bệnh lý IgG

Như trong phần tổ n g q uan đã trình bày sự tương tác giữa kháng nguyên

p roteinA với kh án g th ể IgG củ a người có tính đặc hiệu ái lực cao Vì vây một chiến lược đề ra đẽ’ th iết lập bộ sinh phẩm ELISA -ProteinA trong xét nghiệm kháng th ê IgG phái đ ư ợc tiến hành th eo các bước sau:

* Tinh c h ế IgG từ huyết thanh người bình thường và bệnh lý bằng cột Protein A- Sepharose 4B (thương phẩm SIGMA)

* Sử dụng IgG đ ã tinh sạch từ huyết thanh người bình thường và bệnh lý xáy dựng đồ thị ch u ẩn , tuyển chọn các chủng tụ cầu vàng (S aureus) có khả năng

sinh tổng hợp cao k h án g nguyên proteinA và nuôi cấy các ch ủng tụ cầu vàng tổng hợp proteinA h o ạt lực ca o đ ã được chọn lọc đ ể tinh c h ế k h áng nguyên protein A

* Sử dụng k h áng th ể IgG đ ể thiết k ế cột ái lực Sepharose 4B-IgG dùn g cho việc tinh c h ế proteinA từ đó c h ế tạo bộ sinh phẩm ELISA -ProteinA xét nghiệm IgG bộnh lí

Protcn A ca o nhất, tuy vậy hiộu suất thu hổi củ a 2 cột trao đổi ion cũng tương đối

ca o tr 24-30%

Đi tinh sạch củ a IgG được kiểm tra bằng điện SDS-PAGE Kết q u ả được thế hiện 1 hình 11

1 2 3 4 5

Hình 11 Ảnh điện di IgG đ ã tin h sạch bằng SDS-PAGE

Hàn* 1 5: phân đoạn tin h c h ế bằng cột DEA E-Sephadex A50

H ànị'2: Fh;\n đoạn tinh c h ế b ằng DEAE cellulose DE52

Hàng3: Fhùn doạn tinh c h ế bằng cột Sepharose 4B-ProtcinA

Hàng4: Protein chuẩn

5.2 u y ờ ĩ ch ọ n tụ cầu v à n g sinh tô n g hợp cao P roteinA

Đ ã lia chọn được 2 ch ủng Q Y 17 và YB07 có khả n ăng sinh tổng h ợp cao nhất protenA nội bào và ngoại b ào , trong số 71 chủng phãn lập từ các bệnh nhân nhiễn tr ù ig hỏng d o học viện Q uân Y 103 cung cấp

H ìn h 12: Đ ồ th ị tr ìn h bày s ự tin h c h ế p ro tein A từ d ịch p h á m à n g (S

a u r e u s Q Y17) q u a cột S e p h a ro se 4 B - IgG

K iểm tra đ ộ tin h sạch c ủ a p ro te in A b ằ n g k ĩ th u ậ t S D S -P A G E

H ình 13: Ánh điện di ché phẩm p ro tein A sau khi tin h chê bằng cột S epharose 4B

với các vi khuẩn khác m à cò n sử dụng kỹ thuật này đè tuyển chọn các chủng tụ cầu vàng có khả năng sinh tổng hợp proteinA cao nhất.

Hàm lương protein A (microgram/IOOmicrolit)

H ình 14 Đó th ị ch u ẩn proteinA cho xét nghiệin ELISA -IgG

5 5 C h è tạo sin h p h ẩ m E L IS A -P ro te in A đ ể x é t n g h iệ m k h á n g t h ể ỉg G

b ệnh lý

C ác điều kiện c h ế tạo E L ISA -P roteinA đã lựa chọn

- Phá m àng và thành tế bào vi khuẩn s aureus QY 17 bằng ure 2M

- Tinh ch ế ProteinA củ a tụ cầu vàng bằng cột ái lực Sepharose 4B-IgG

- Sử dụng proteinA đã tinh c h ế và sơ c h ế từ thành tế bào vi khuẩn quét gắn bản nhựa m icrotiter (SIG M A ) d ù n g ch o bộ sinh phẩm ELISA - ProteinA

Hình 15 Kết quả xét nghiệm Ig(ỉ bệnh lý bằng kỹ thuật ELISA-ProteinA khi

sử dung các chẽ phẩm Protein A tinh chế ở điéu kiện khác nhau

6 Thu thập mẫu đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) và tinh chê lectin

Sau khi xác định tên k h o a học củ a đậu dao biển thu ở ven biển vùng núi Q uảng

N am Đ à N ẵng, ch ú n g tôi đ ã lựa chọn các điều kiện đ ể tinh c h ế lectin từ hạt đậu này theo q uy trìn h ở hình 16

Bột hạt đậu dao biển

Chiết xuất lectin Chiết xuất 3 lần bằng dung dịch đệm TBS0.02M pH 7.4 có M n và Ca2; 3mM Khuấ>

từ m ỗi lần 10 phút Ly tâm 9000 vòng/phút/20 phút/4°'C

D ịch chiết thô (D)

N ạp cột sephadex G -75

C onM gắn vào cột G-75

Rửa cột b ằng dun g địch TBS pH 7.4 có M n 2+ và

bệnh lý A FP củ a cá c bệnh viêm gan virut và ung thư gan C ác kếl q u ả nghicn cứu tinh ch ế bước đ ầu đ ã cho thấy việc tinh ch ế lectin này rất khó k hãn vì khả năng rất nhạy cảm với pH và với cá c ion kim loại củ a lectin này có nhiều đặc điểm khác so với cá c lectin cù n g ch i Canavalia đã được nghiên cứu trước đây Đ ộ tinh sạch của

c h ế phẩm lectin đ ậu d ao biển được kiểm tra, đ ánh giá bằng kỹ th u ật điện di SDS- PAG E (hình 17)

Hình 17 Ảnh điện di chê phẩm ConM đâ tinh sạch

1:Protein ch u ẩ n (P hosphorylase b 94.7kD a; BSA 66,2 kD a; O valbum in 45 kDa, C arb o n ic anh y d rase 31 kDa, Soybean T rypsin in h ib ito r 2 4 kDa, Lysozym e 14,4 kD a)

2:ConM có SDS, không sử lý 2- m ercaptoethanol

3:ConM có SDS và sử lý 2- m ercaptoethanol

4 :Dịch lectin th ô đậu dao biển

Lectin ConM đ an g được nghiên cứu các điéu kiện bắt giữ kh áng nguyên A FP và kháng thế bệnh lý IgG

7 Tinh chế lectin từ cam tháo dây (Ábrus precatorius-APA) và tạo sinh phám E L IS A -A P A -b io tin nhận biết kháng nguvên vi khuẩn than

HĐR(HAA/mgprotein)

Thu hồi hoạt độ (%)

Độ sạch tăng (lán)

Phân đoạn tủa

C hế phẩm tinh sạch lectin đ ã được kiểm tra đánh g iá bằng kỹ thuật SDS-PAGE

H ình 18 Ả nh đ iệ n di ch ế phẩm APA đ ã tinh sạch bằng SDS-PAGE

1 Protein chuẩn; 2 D ịch chiết thô; 3 Lectin APA đ ã tinh sạch không sử lý 2-

m ecaptom etanol; 4 Lectin APA đã tinh sạch có sử lý 2-m ecaptom etanol

30

giai đ o ạ n sau:

1 Sử dụng NHS-LC biotin (SIGM A ) (1 mg/ml đệm bicarbonat pH 8,5 hoặc sử dụng c h ế phẩm d ạng bột 0,4m g cho 20m g protein lectin cộng hợp)

2 Protein cộng hợp: lectin 20m g/m l đệm bicarbonal pH 8,5 có ion Ca2+( lm M )

3 Trộn hoá chất biotin và protein lectin trong nước đá với thời gian 2 giờ sau

đ ó đưa về nhiệt đ ộ phòng 1 giờ

4 T hẩm tích tiếp th eo trong đệm phosphat 0,1 M pH 7, 24 g iờ để loại biotin dư thừa

5 Ly tâm 8 0 0 0vòng/phút/l5phút và thu dịch trong của ch ế phẩm đã cộng hợp

6 Bảo quản dịch trong của chất cộng hợp ở 4°c trong giấy bạc, tránh ánh sáng

b Q uy trìn h g ắ n ỉectin c ộ n g h ợp tạo sinh p h ẩ m E L IS A - A P A - biotin

1 Gắn lectin vào bản ( lOƠỊil/giếng) ủ qua đôm ở nhiệt độ phòng Rửa sạch hằng đệm PBS-Tween, vỗ khô

2 Phủ bản bằng dun g dịch Blocking: 250 nl/giếng ủ ở 3 7 °c/lg iờ Rửa sạch bằng độm PBS-Tween, vỗ khô

3 Gắn vi khuẩn: ủ ở 3 7 ° c trong 1 giờ Rửa sạch bằng đệm PBS-Tween

4 Gắn cộ n g hợp: nhỏ 100 Ịil lectin- biotin ủ ở 3 7 °c/lg iờ Rửa bàng đệm PBS- Tvveen

5 Gắn streptavidin-PO vào cộng hợp lectin-biotin: nhỏ 100 n l streptavidin nồng độ pha loãng 1:10000, ủ ở 37 °c/lg iờ Rứa bàng đệm PBS-Tween

trong tối 30 phút.

7 Ngừng phản ứng bằng HUS04 4N và so màu ớ bước sóng 492nm trên máy đọc ELISA

c C ác k ết q u á x ét n g h iệ m k h á n g n g u y ê n vi k h u ẩ n th a n (Bacillus anthracis)

và c á c vi k h u ẩn k h ô n g đ ặ c h iệ u (T ụ c ầ u v àn g Staphylococcus aureus, liên cầu khuẩn Streptococcus pneum oniae, vi k h u ẩn b ện h lỵ (Shigella fle x n eri s sonnei XP/Ị4 1 5 6, vi k h u ẩ n Corynebacterium diphterriae, và B cereưs).

Vi khuẩn than và các loại vi khuẩn khác của viện V ệ sinh D ịch tễ TW cung cấp, được nuôi cấy trong những m ôi trường thích hợp Sau đó thu sinh khối để làm xét nghiệm Dung dịch chứa tế b àio vi khuẩn được pha loãng trong đệm PBS sao cho số lượng vi khuẩn bằng 5.106/m l, và được tiến hành phản ứng theo k ĩ thuật ELISA lectin-biotin để xác định sự có mặt củ a các loại kháng nguyên vi khuẩn trên bề mặt của chúng Kết quả xét nghiệm ELISA -A PA -biotin đối với các kháng nguyên vi khuẩn được trình bày ở bảng và được trình bày ở hình 19

B ảng 6: S ự liên k ế t giữa le ctin c a m th ả o d â y (A PA ) với vi k h u ẩ n g ảy bệnh

Hình 19: Ảnh chụp kết quả nhận biết sự có mật của kháng nguyên vi khuẩn than và các loại vi khuẩn khác bàng K IT ELISA-APA-Biotin1,2,3: Phán ứng ELISA -A PA -B iotin dương tính với B.anthracis, m àu phản ứng rất

đậm

4: Phán ứng ELISA -A PA -B iotin với B anthracỉs (4 giếng đầu tính từ dưới lên) và

so sánh với với B cereus (4 giếng sau) Thấy rõ phản ứng với B.cereus m ờ nhạt

kém đặc hiệu hơn nhiều so với phản ứng của B.anthracis.

6: Phán ứng ELISA -A PA -B iotin với B.anthracis có độ pha loãng giảm dần 1/2".

7,8: Phan ứng ELISA -A PA -B iotin với các vi khuẩn k h ác như Shigella fle x n eri s

sonnei XPI54 l56, vi khuẩn Corynebacteriitm diphterriae, thấy rõ APA trong xét

nghiệm không phản ứng với các vi khuẩn không đặc hiệu