Ứng dụng kỹ thuật phân tích bạch cầu trong tinh dịch và mối liên quan giữa bạch cầu với một số chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHAN VĂN HƯỞNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU TRONG TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ Ở

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHAN VĂN HƯỞNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU TRONG TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ

Ở NAM GIỚI VÔ SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHAN VĂN HƯỞNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BẠCH CẦU TRONG TINH DỊCH VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA BẠCH CẦU VỚI MỘT SỐ CHỈ SỐ TINH DỊCH ĐỒ

Ở NAM GIỚI VÔ SINH

Chuyên ngành : Y sinh học Di truyền

Mã số : 60720102

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS.BS Đoàn Thị Kim Phượng

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS BS Đoàn Thị KimPhượng, phó trưởng Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y HàNội đồng thời là phó giám đốc Trung tâm Tư vấn Di truyền, bệnh viện Đạihọc Y Hà Nội, người đã dành cho tôi sự quan tâm, trực tiếp chỉ bảo tận tình từnhững bước đầu trong quá trình nghiên cứu đến khi hoàn thiện khóa luận, cô

đã đặt những viên gạch đầu tiên làm nền móng cho con đường nghiên cứukhoa học của tôi

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS BS Lương Thị Lan Anh,phụ trách Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, PGS BS Trần Đức Phấn, TS.Nguyễn Thị Trang, TS Vũ Thị Huyền, PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan Bộ môn

Y Sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, TS Nguyễn Hoài Bắc Bộmôn Ngoại trường Đại học Y Hà Nội đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ hếtlòng trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn:

Toàn thể Thầy Cô, các anh chị kỹ thuật viên, các anh chị Bác sĩ nội trú

Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội đã luôn gần gũi,động viên, giúp đỡ tôi và cho tôi những lời khuyên quý báu

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Phòng đào tạo sau đạihọc Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trìnhhọc tập, hoàn thành luận văn này

Xin bày tỏ lòng kính yêu sâu sắc đến bố mẹ và những người thân tronggia đình, bạn bè, đã luôn ở bên hỗ trợ, cổ vũ và động viên tôi hoàn thành luậnvăn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2019

Bác sỹ nội trú Phan Văn Hưởng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Phan Văn Hưởng, học viên bác sĩ nội trú khóa 42, chuyên ngành

Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn

của TS Đoàn Thị Kim Phượng.

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,trung thực và khách quan, đã được sự xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơinghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2019

Tác giả

Phan Văn Hưởng

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BC Bạch cầuCASA Computer – Aided Semen AnalysisDFI DNA Fragmentation Index

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assayITT Ít tinh trùng (Oligospermia)

KCTT Không có tinh trùng (Azospermia)KHV Kính hiển vi

NST Nhiễm sắc thểPMN Polymorphonuclear leukocytesRIA Radioimmunoassay

VCL Curvilinear velocity

VSL Straight-line velocityTDĐ Tinh dịch đồ

WHO World Health Organization

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở nước ta, tỷ lệ vô sinh nói chung và tỷ lệ nam giới vô sinh nói riêngngày càng gia tăng Đặc biệt, vô sinh ở nam giới đang nhận được sự quan tâmnhiều hơn trong những năm gần đây Để chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ởnam giới, thì tinh dịch đồ là một trong những xét nghiệm cơ bản nhất đánh giáchức năng sinh sản của nam giới trong độ tuổi sinh sản, là xét nghiệm đầu taychứa đựng nhiều chỉ số quan trọng trước khi người bác sĩ đưa ra một chỉ địnhtiếp theo đối với những trường hợp có bất thường trong kết quả tinh dịch đồ[1], [2] Trong tinh dịch người, ngoài tinh trùng trưởng thành còn có các loại

tế bào như tế bào bong, tinh trùng non, bạch cầu Các tế bào này được gọichung là các “tế bào khác”, hay “tế bào tròn” để phân biệt với các tinh trùngtrưởng thành Số lượng tế bào khác trong tinh dịch bình thường cho phép dưới

1 triệu/mL [3] Khi các tế bào này tăng quá mức cho phép, dù là bạch cầu haytinh trùng non đều là một trong các nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới Một

số nghiên cứu đã chỉ ra rằng bạch cầu trên 1 triệu/mL liên quan tới các bệnhđường sinh dục như: nhiễm trùng đường sinh dục tiết niệu, tắc ống dẫn tinh,giãn tĩnh mạch thừng tinh, giảm chức năng tuyến sinh dục phụ Bạch cầu tăngcao còn liên quan đến giảm số lượng và chất lượng của tinh trùng do bạch cầu

có thể sản xuất ra các sản phẩm chuyển hóa như ROS (reactive oxygenspecies) [4], khi số lượng bạch cầu trên 1 triệu/mL làm tăng nồng độ ROS lênđáng kể Các sản phẩm này làm tăng stress oxy hóa gây tổn thương tế bào tinhtrùng, đặc biệt là DNA và màng tế bào [5], [6], [7], [8]; tăng nguy cơ vô sinh,sảy thai, đẻ non và các bệnh lý di truyền [9], [10] Việc phân biệt các tế bàokhác nhiều quá mức trong tinh dịch là tế bào sinh tinh non hay bạch cầu cóvai trò quan trọng trong chẩn đoán và quyết định điều trị [11], [12] Hơn nữa,Việt Nam là một nước nhiệt đới, tỷ lệ viêm nhiễm nói chung và viêm nhiễm

đường sinh dục tiết niệu nói riêng vẫn còn nhiều, đồng thời tỷ lệ vô sinh ngàycàng gia tăng, đặc biệt là nhóm vô sinh nam chưa rõ nguyên nhân trong đó cónguyên nhân từ tăng bạch cầu trong tinh dịch Tuy nhiên, với các phươngpháp nhuộm thông thường như Giemsa không phân biệt được bạch cầu với tếbào non hay tế bào bong Nhận thấy sự cần thiết và tính khả thi của vấn đềtrên, góp phần chẩn đoán chính xác hơn một số tình trạng viêm nhiễm đườngsinh dục nam, hỗ trợ chức năng sinh sản nam giới, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật phân tích bạch cầu trong tinh dịch và mối

liên quan giữa bạch cầu với một số chỉ số tinh dịch đồ ở nam giới vô sinh”

Đề tài có 2 mục tiêu sau:

1 Phát hiện được bạch cầu trong tinh dịch bằng phương pháp nhuộm peroxidase.

2 Nhận xét mối liên quan giữa số lượng bạch cầu với độ pH, số lượng,

độ di động và hình thái tinh trùng ở nam giới vô sinh.

1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình vô sinh và vô sinh nam

1.1.1. Khái niệm vô sinh nam

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vô sinh (infertility) được định nghĩa

là tình trạng một cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ, khi chung sống cùngnhau trên một năm, có quan hệ tình dục thường xuyên, không sử dụng bất kỳbiện pháp tránh thai nào, mà không thể có con [13]

Vô sinh được phân thành 2 loại:

• Vô sinh nguyên phát (vô sinh I) là trường hợp cặp vợ chồng chưa bao giờ cóthai, mặc dù sống với nhau trên một năm và không dùng biện pháp tránh thainào

• Vô sinh thứ phát (vô sinh II) là trường hợp cặp vợ chồng đã từng có con hoặc

đã có thai, nhưng sau đó không thể có thai lại mặc dù đang sống với nhau trênmột năm và không dùng biện pháp tránh thai nào

Vô sinh nam (male infertility) là trường hợp vô sinh mà nguyên nhânđược xác định do người nam (chồng hoặc đối tác) Tại các cơ sở y tế, xétnghiệm TDĐ từ lâu đã trở thành một xét nghiệm cơ bản và đầu tay trong chẩnđoán vô sinh nam Từ năm 1978, WHO đã tiến hành biên soạn tài liệu hướngdẫn đánh giá TDĐ và các chỉ số liên quan đến tinh trùng Năm 1999, tài liệunày xuất bản phiên bản lần thứ IV [13] Mới đây, năm 2010, phiên bản V rađời đưa ra những chỉnh sửa về tiêu chuẩn đánh giá các chỉ số trong TDĐ [1].Theo tiêu chuẩn WHO 2010, số ngày kiêng quan hệ trước khi làm xét nghiệmTDĐ là từ 2 – 7 ngày Nếu kết quả phân tích tinh dịch bình thường thì chỉ cầnlàm 1 lần, trường hợp kết quả xét nghiệm bất thường thì cần làm ít nhất 2 lần.Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích TDĐ theo tiêu chuẩn WHO 2010

(bảng 1.1) Tuy nhiên, tỷ lệ hình thái bình thường chúng tôi dựa trên tiêuchuẩn của WHO 2000 (≥15%) do các tiêu chuẩn đánh giá và phương phápnhuộm hình thái khác nhau.

Bảng 1.1: TDĐ theo tiêu chuẩn WHO 2010 [1]

Chú thích: PR: Tiến tới (Progessive).

1.1.2. Tình hình vô sinh và vô sinh nam trên thế giới

Vấn đề vô sinh và vô sinh nam đã được thế giới quan tâm và nghiên cứunhiều Theo WHO (1985), trong các trường hợp vô sinh có khoảng 80% xácđịnh được nguyên nhân và 20% không rõ nguyên nhân Đến năm 1991, WHOước tính trên thế giới có khoảng 12 – 15% cặp vợ chồng vô sinh [14]

Tại Mỹ, theo một nghiên cứu của Hội Y học sinh sản Hoa Kỳ, có khoảng6,1 triệu người Mỹ bị vô sinh, một phần ba trong số này có nguyên nhân do

nữ giới, một phần ba có nguyên nhân từ nam giới và còn lại có nguyên nhân

từ cả hai phía hoặc không rõ nguyên nhân [15]

Tại châu Âu, thống kê năm 1988 – 1989 ở Pháp, tỉ lệ vô sinh nam chiếmđến 13,5%; trong đó nguyên nhân do nam chiếm khoảng 20% [16] TheoIrvine D S (2002) thì vô sinh là một vấn đề phổ biến trên thế giới, chiếm 14– 17% ở các cặp vợ chồng, trong đó nguyên nhân do nam giới khó xác định[16] Còn Krauz và cộng sự lại cho rằng nguyên nhân gây vô sinh nam lênđến 50%, trong số này lại có 40 – 50% trường hợp bất thường về cả số lượng

và chất lượng tinh trùng [17]

Ở các nước châu Á, theo Aribarg A vô sinh tại Thái Lan chiếm 12% cáccặp vợ chồng vô sinh trong lứa tuổi sinh đẻ [18]

Nhằm mục đích nghiên cứu tỉ lệ vô sinh nguyên phát và thứ phát, năm

2000, Larsen và cộng sự tiến hành nghiên cứu tình hình vô sinh ở 10 trong số

28 quốc gia châu Phi, đã công bố có 3% các cặp vợ chồng vô sinh nguyênphát trong lứa tuổi sinh đẻ trong khi tỉ lệ vô sinh thứ phát còn cao hơn nhiều[19] Năm 2011, Lee J.Y khi nghiên cứu trên các cặp vợ chồng vô sinh đã chỉ

ra tỉ lệ vô sinh nguyên phát là 78% và vô sinh thứ phát là 22% [20]

Như vậy, tỷ lệ vô sinh trên thế giới thay đổi từ 10 – 20%, tỷ lệ này có xuhướng ngày càng tăng, trong đó nguyên nhân vô sinh do nam và nữ có tỉ lệtương đương và tỷ lệ vô sinh không rõ nguyên nhân còn nhiều

1.1.3. Tình hình vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam

Ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về vô sinh cho thấy tỷ lệ vôsinh có xu hướng tăng Theo điều tra dân số năm 1980, tỷ lệ này chỉ ở mức7% – 10%, đến năm 1982, tỷ lệ vô sinh chung ở Việt Nam đã lên đến 13%,trong đó vô sinh nữ chiếm 54%, vô sinh nam chiếm 36%, vô sinh không rõnguyên nhân chiếm 10% [21]

Theo Phan Văn Quyền (2000) tỷ lệ vô sinh là 10% – 15% [21] Cònnghiên cứu của Ngô Gia Hy (2000) cho rằng trong số các cặp vợ chồng bị vôsinh thì nguyên nhân do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cảhai vợ chồng là 10% [22]

Theo Trần Thị Trung Chiến và cộng sự (2002) đã công bố tỷ lệ vô sinhchiếm 5%, trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [23]

Theo Trần Thị Phương Mai (2001), vô sinh nguyên nhân do nữ giớithường chiếm khoảng 30% – 40% các trường hợp Vô sinh nam giới chiếmkhoảng 30% các trường hợp [24] Khoảng 20% các trường hợp tìm thấy

nguyên nhân vô sinh ở cả hai vợ chồng Bên cạnh đó, có khoảng 20% các cặp

vợ chồng không tìm thấy nguyên nhân gây vô sinh [25]

1.2. Các nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam

1.2.1 Nguyên nhân ảnh hưởng đến số lượng tinh trùng

Azoospermia – không có tinh trùng (KCTT) là tình trạng không pháthiện được tinh trùng nào trên tiêu bản với kính hiển vi độ phóng đại cao cũngnhư sau ly tâm tinh dịch Theo WHO (2010), oligospermia – ít tinh trùng(ITT) là tình trạng tinh dịch có mật độ tinh trùng ít hơn 15 triệu tinh trùng/mL[16]

Tiêu chuẩn tinh dịch đồ WHO 2010: [1]

- Nhẹ: Mật độ 10 triệu – 15 triệu tinh trùng/mL

- Vừa: Mật độ 5 triệu – 10 triệu tinh trùng/mL

- Nặng: Mật độ < 5 triệu tinh trùng/mL [26]

Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Quý (2002) trên những bệnh nhân nam

vô sinh theo tiêu chuẩn WHO (1999) về tinh dịch đồ cho thấy tỉ lệ KCTT là10,10% [27]

Theo Lê Hoàng Anh (2012) khảo sát tinh dịch đồ theo tiêu chuẩnWHO 2010 cho thấy tỉ lệ những người bệnh nhân nam vô sinh KCTT là 6%[28] Có rất nhiều nguyên nhân gây ra KCTT hoặc ITT bao gồm các nguyênnhân di truyền và không do di truyền.

Các yếu tố gây rối loạn nội tiết hay ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh,cương dương, phóng tinh đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh

• Bệnh tật:

Các bệnh ảnh hưởng vùng dưới đồi, vùng tuyến yên như phẫu thuậtvùng tuyến yên, tia xạ, nhồi máu (đột quỵ tuyến yên), bệnh tự miễn, chấnthương sọ não, dị dạng như hội chứng hố yên rỗng, thiểu sản tuyến yên, vàcác nhiễm khuẩn hệ thần kinh: apxe, viêm màng não, viêm não, lao

Giãn tĩnh mạch thừng tinh (Varicocele): Là hiện tượng dòng máu tĩnhmạch thừng tinh bị nghẽn tắc làm tăng nhiệt độ gây giảm số lượng và giảmchất lượng tinh trùng

Lỗ đái lệch thấp (Hypospadias) là một rối loạn trong đó niệu đạo sẽ mở

ra ở vị trí mặt dưới của dương vật hoặc ở gốc dương vật, tầng sinh môn chứkhông phải đầu dương vật, khiến tinh trùng xuất ra khó đi vào lỗ cổ tử cung

Nhiễm trùng: một số bệnh nhiễm trùng như quai bị có thể gây viêm teotinh hoàn, sốt trên 38,5oC có thể ức chế quá trình sinh tinh trong thời gian 6tháng (WHO, 1987) [29]

Viêm tuyến tiền liệt, viêm ống dẫn tinh, viêm niệu đạo, viêm bao quyđầu, viêm mào tinh hoàn, phẫu thuật, chấn thương có thể gây ra sẹo ngănchặn quá trình xuất tinh

Sử dụng một số thuốc điều trị bệnh nội khoa như: nội tiết tố (corticoid, androgens), cimetidin, sulphasalazine, spironolactone, nitrofurantoin,

niridazone, colchichine… đều trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh.

Các nguyên nhân khác: một số bệnh toàn thân ảnh hưởng đến nội tiếtnhư bệnh ác tính, tim mạch, đái tháo đường, suy gan, suy thận… tiếp xúc vớihoá chất hay bức xạ, hút thuốc lá, nghiện các chất như: ma tuý, rượu…,kháng thể kháng tinh trùng, chấn thương tinh hoàn, thoát vị bẹn, tinh hoàn lạcchỗ…

• Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ tế bào

Một số bất thường di truyền nói chung và bất thường NST nói riênggây suy giảm quá trình sinh tinh, hậu quả là làm suy giảm khả năng sinh sảncủa nam giới Theo các tài liệu công bố trên thế giới, ở các bệnh nhân nam vôsinh, tỉ lệ bất thường NST thường cao gấp 6 lần và bất thường NST giới tínhcao gấp 15 lần so với cộng đồng [30]

Bất thường NST giới tính thường gặp

Hội chứng Klinefelter: Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng các trường

hợp bất thường NST giới tính như hội chứng Klinefelter (47,XXY) hay rốiloạn cấu trúc NST giới tính có thể gây tình trạng KCTT [31] Theo TrầnQuán Anh (2002), hội chứng Klinefelter (47,XXY) chiếm 1% các thể vô sinh,

13 – 20% các trường hợp KCTT [32]

Hội chứng nam 47,XYY có tỉ lệ 1/1000 trẻ sơ sinh nam Ở nhữngngười mắc hội chứng này, cơ thể không có biểu hiện hình thái gì đặc biệt,thường cao lớn, nội tiết không thay đổi khác thường, nhiều trường hợp tínhtình hung hăng, thiếu tự chủ Tuy nhiên, những người nam 47,XYY có thểbiểu hiện sinh dục kém phát triển, tinh hoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp

Hội chứng nam 46,XX (male 46,XX): Hội chứng nam 46,XX thường

là kết quả của sự trao đổi chéo không cân giữa nhánh ngắn của NST X và

NST Y, dẫn đến sự chuyển vị vật liệu di truyền của NST Y sang NST X, trong

đó có chứa gen xác định giới tính nam (SRY) Do gen SRY vẫn tồn tại nênkiểu hình vẫn là nam, tuy nhiên không có sự hiện diện của toàn bộ vùng đặchiệu nam trên NST Y (MSY: Male specific region Y) Do đó, nam 46,XXchắc chắn không có sự sinh tinh nên một khi làm karyotyp xác định là nam46,XX thì việc phẫu thuật tìm tinh trùng trong tinh hoàn để hỗ trợ sinh sản là

vô ích [33]

Bất thường NST thường

Bên cạnh những bất thường về NST giới tính, những bất thường củaNST thường cũng có thể gây nên tình trạng vô sinh Bất thường NST thườngchiếm tỉ lệ 1 – 2% các trường hợp vô sinh nam Cơ chế do sự mất cân bằngtrong bộ NST gây trở ngại cho việc bắt cặp NST trong quá trình giảm phân,

do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh Thường gặp các dạng đột biến sốlượng NST như hội chứng Down và các loại đột biến cấu trúc NST như mấtđoạn, chuyển đoạn tương hỗ, đảo đoạn quanh tâm và ngoài tâm [34]

Hội chứng Prader Willi: là một rối loạn di truyền hiếm gặp do đột biếnmất đoạn nhánh dài gần tâm NST số 15 vùng băng q12 với biểu hiện béo phì,thiểu năng trí tuệ và suy sinh dục, những người này thường vô sinh

Các rối loạn di truyền khác gây thiếu GnRH hoặc gonadotropin:Những rối loạn nguyên phát của sự chế tiết và điều hòa của hai hormon sinhdục LH và FSH từ tuyến yên do đột biến các gen thụ thể LH nằm trên nhánhdài của NST số 9 (9q) và FSH nằm trên nhánh ngắn NST số 2 (2p21)

• Rối loạn vật chất di truyền ở mức độ phân tử

Với sự phát triển không ngừng của các kỹ thuật di truyền, một số tácgiả đã chỉ rõ được một số gen liên quan đến quá trình sinh sản, các gen nàynằm ở đoạn xa nhánh dài NST Y (Yq11.23), nhóm gen này được gọi là DAZ(delected in azoospermia) Khi phân tích DNA của những người nam vô sinh

thấy có 8% trường hợp có mất đoạn ở nơi có các gen DAZ, những người bìnhthường về tinh dịch không có các bất thường này [35].

Các nhà khoa học đã phát hiện mối liên quan chặt chẽ giữa KCTThoặc ITT với sự mất đoạn nhỏ xảy ra trên nhánh dài NST Y (Yq) là vùngAZF (azoospermic factor) Bốn vùng AZF lần lượt là AZFa, AZFb, AZFd,AZFc [36 ]

Xơ nang (Cystic Fibrosis) là một bệnh do đột biến gen CFTR trên

NST số 7 Nam giới bị bệnh này thường không có ống dẫn tinh hoặc ốngdẫn tinh bị tắc dẫn đến KCTT trong tinh dịch mặc dù tinh hoàn vẫn sảnxuất được tinh trùng

Hội chứng Kallmann: gen LAL – 1 nằm trên nhánh ngắn NST X bị đột

biến dẫn đến sự thiếu hụt LH, FSH, gây giảm sản xuất tinh trùng, suy chứcnăng tuyến sinh dục, giảm sự sinh tinh tại tinh hoàn Những bệnh nhân nàybiểu hiện mất khứu giác và suy sinh dục do suy hạ đồi

Hội chứng kháng Androgen: gen AR (gen thụ thể của androgen) nằm

trên nhánh dài của NST X bị đột biến dẫn đến mất một phần hoặc hoàn toànthụ thể androgen Người đột biến kháng androgen hoàn toàn có kiểu hình nữ,

bộ NST 46,XY, tinh hoàn nằm trong ổ bụng hay trong ống bẹn sâu, không có

tử cung, buồng trứng, âm đạo, hoặc âm đạo cụt, vô sinh

1.2.2 Nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng và tinh dịch

Bên cạnh số lượng, chất lượng tinh trùng cũng như tinh dịch ảnhhưởng đáng kể đến khả năng sinh sản ở nam giới Một tỉ lệ không nhỏ namgiới có mật độ tinh trùng bình thường, vẫn gặp khó khăn trong việc có con

Plasma tinh có thành phần rất phức tạp, gồm nhiều hợp chất hữu cơ và

vô cơ như: nước, muối, fructose, kẽm, acid citric và một số chất khác [37]

Sự mất cân bằng hay thiếu hụt các thành phần trong plasma tinh cũng ảnhhưởng đến chất lượng tinh trùng và độ di động của tinh trùng mặc dù sốlượng tinh trùng vẫn bình thường.

Hình thái tinh trùng: Nguyễn Xuân Bái (2002) tiến hành nghiên cứutinh dịch của 1000 cặp vợ chồng vô sinh tại bộ môn Mô Phôi, trường Đại học

Y Hà Nội Kết quả cho thấy tỉ lệ có tinh dịch đồ bất thường chiếm 60% Bấtthường về độ di động tinh trùng chiếm tỉ lệ cao nhất 28,7%, tiếp đến là mật

độ tinh trùng 25,4%, hình thái tinh trùng 19,6% [38]

Chức năng tinh trùng: đứt gãy DNA tinh trùng gây ra một tỉ lệ khôngnhỏ các trường hợp vô sinh Chỉ số để đánh giá mức độ đứt gãy của DNAtinh trùng - DNA Fragmentation Index (DFI) càng lớn thì mức độ đứt gãyDNA càng cao Nam giới vô sinh có tinh dịch đồ bất thường có tỉ lệ đứt gãyDNA tinh trùng cao hơn nam giới vô sinh có tinh dịch đồ bình thường Tỉ lệnam giới có tinh dịch đồ bình thường có DFI ở mức > 30% vẫn chiếm tỉ lệcao (41%) [39]

Stress oxy hóa là một trong những tác nhân quan trọng tác động lên sựhình thành và phát triển của tinh trùng, gây nên ảnh hưởng cả về hình thái lẫnchức năng của tinh trùng Giống như nhiều loại tế bào sống hiếu khí khác,tinh trùng liên tục tiếp xúc với môi trường cân bằng liên quan đến oxy Oxycần để tế bào tồn tại và gốc tự do có oxy ở nồng độ sinh lí là rất cần thiết đểduy trì chức năng bình thường của tế bào Ngược lại, nếu các sản phẩm phụcủa oxy như ROS tăng cao lại là nguy cơ gây ảnh hưởng đến chức năng và sựtồn tại của tế bào

1.3.Sự hình thành và biệt hóa tinh trùng

1.3.1 Đại cương về quá trình hình thành tinh trùng ở người

Tinh trùng là tế bào giao tử đực ở người mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội(n=23), là loại tế bào có mức độ biệt hóa cao để thực hiện chức năng sinh sản.Quá trình sinh tinh phụ thuộc đầu tiên vào sự phát triển của tinh hoànthời kì bào thai (bắt đầu vào khoảng tuần 4-6) Ở giai đoạn này, các tế bàomầm sinh dục nguyên thủy ở gờ sinh dục bắt đầu tăng sinh, một số sẽ bị thoáihóa, số còn lại sẽ biệt hóa thành tiền tinh nguyên bào và ngưng lại ở giai đoạnnày Đến khoảng từ lúc sinh đến 6 tháng tuổi, các tiền tinh nguyên bào bắt đầubiệt hóa thành tinh nguyên bào và tăng sinh Đến lúc dậy thì, các tinh nguyênbào bắt đầu giảm phân để tạo thành tinh bào

Tinh trùng được sinh ra tại các ống sinh tinh trong tinh hoàn sau đó dichuyển vào mào tinh để hoàn thành sự trưởng thành cuối cùng trước khi đượcxuất tinh Nếu không có hiện tượng phóng tinh thì các tinh trùng sẽ chết, thoáihóa và được hấp thụ bởi tế bào biểu mô của mào tinh hoàn Vào thời điểmphóng tinh thì các tinh trùng di chuyển dọc theo ống dẫn tinh, sau đó đượctrộn lẫn với dịch của tuyến tiền liệt, túi tinh, tuyến hành niệu đạo và cuối cùngđược tống xuất ra ngoài theo đường niệu đạo

Quá trình hình thành tinh trùng bắt đầu từ lúc dậy thì và tiếp diễn liên tụccho đến lúc chết Quá trình sinh tinh là một quá trình rất hiệu quả (mỗi ngày

có thể có 150 triệu tinh trùng được tạo ra ở mỗi tinh hoàn) trong khi đó quátrình thụ tinh là một quá trình không hiệu quả vì chỉ có một tinh trùng thụ tinhcho trứng để tạo hợp tử Do đó, nếu quá trình sinh tinh giảm sút hoặc có sựtác động của các yếu tố vật lý, hóa học, sinh học trong hay ngoài cơ thể thì sốlượng và chất lượng sẽ không đảm bảo làm cho quá trình thụ tinh bị ảnhhưởng dẫn tới thiểu năng sinh sản [20], [22], [16], [40], [41] Thậm chí, chấtlượng tinh trung kém còn làm tăng khả năng sinh con dị tật, tăng nguy cơ tửvong trẻ em ở những gia đình có bố có chất lượng tinh dịch kém [42]

1.3.2 Quá trình sinh tinh tại tinh hoàn

Quá trình hình thành tinh trùng tại tinh hoàn thực chất là quá trình pháttriển và phân bào của các tinh nguyên bào (2n) chưa biệt hóa và không có khảnăng thụ tinh thành các tinh trùng (1n) có độ biệt hóa cao và khả năng thụ tinhkhi gặp trứng Đây là quá trình diễn ra liên tục tại các ống sinh tinh trong tinhhoàn của nam giới từ lúc dậy thì cho đến lúc chết

Mỗi tinh nguyên bào đều phải trải qua 3 giai đoạn để trở thành tinh trùng:

♦ Giai đoạn tinh nguyên bào: đây là giai đoạn các tinh nguyên bào phânbào nguyên nhiễm để tạo thành các loại tinh nguyên bào và tinh bào I để cungcấp cho quá trình sinh tinh

♦ Giai đoạn tinh bào: đây là giai đoạn các tinh bào phân chia giảmnhiễm 2 lần để tạo 4 tinh tử đơn bội

♦ Giai đoạn tinh tử: đây là giai đoạn các tinh tử biến đổi các bộ phậnnhư đuôi, nhân, bộ Golgi, ti thể để biệt hóa thành tinh trùng trưởng thành

có chức năng

Các giai đoạn này diễn ra đồng thời và liên tục trong các ống sinh tinhcủa tinh hoàn, bắt đầu từ khi các tế bào mầm nguyên thủy biệt hóa thành cáctinh nguyên bào nhưng quá trình này ngừng lại cho đến tuổi dậy thì mới tiếptục Ở tuổi dậy thì, mỗi ngày mỗi tinh hoàn có thể sản xuất từ 50-150 triệutinh trùng [43], [44] Quá trình này diễn ra liên tục trong suốt cuộc đời củangười nam giới nhưng cũng bắt đầu giảm từ tuổi 40

♦ Giai đoạn tinh nguyên bào

Ở giai đoạn này, các tinh nguyên bào nằm ở phần đáy của biểu mô sinh tinhphân bào liên tục để tạo ra nhiều thế hệ tế bào để cung cấp cho quá trình sinhtinh Tuy nhiên, cũng có một số tinh nguyên bào có chu kỳ rất dài, rất ít phânchia, đóng vai trò dự trữ, cung cấp cho quá trình sinh tinh khi có sự thiếu hụt

Ở người có 3 loại tinh nguyên bào dựa vào hình dạng:

• Loại A đậm màu: đóng vai trò dự trữ, phân chia để tạo tinh nguyênbào loại A nhạt màu khi có sự thiếu hụt.

• Loại A nhạt màu: phân bào liên tục để tạo thành tinh nguyên bào loại B

• Loại B: phân chia để tạo thành tinh bào I

Sự phân bào liên tục của các tinh nguyên bào đảm bảo cho quá trình sinhtinh ở nam giới được diễn ra liên tục trong suốt cuộc đời

♦ Giai đoạn tinh bào

Ở giai đoạn này, các tinh bào I thực hiện quá trình giảm phân để tạo racác tinh tử Giảm phân là quá trình đảm bảo cho sự chuyển tiếp từ tế bàolưỡng bội (2n) thành đơn bội (n) trong quá trình sinh tinh Trong quá trìnhgiảm phân có 2 hiện tượng quan trọng liên quan đến chất liệu di truyền, đó là

số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa và sự tái tổ hợp vật liệu di truyềngiữa các chromatid

Phân bào giảm nhiễm được chia làm 2 giai đoạn:

• Giảm phân lần 1: từ tinh bào I sẽ tạo ra 2 tinh bào II, giai đoạn nàykéo dài vài ngày

• Giảm phân lần 2: từ tinh bào II sẽ tạo ra 2 tinh tử, giai đoạn nàythường bắt đầu một thời gian ngắn sau khi giảm phân I kết thúc vàdiễn ra rất nhanh trong vòng vài giờ Do vậy, đời sống tinh bào IIthường ngắn hơn tinh bào I [11], [43]

Như vậy sau quá trình phân bào giảm nhiễm từ một tinh bào I sẽ tạo ra 4tinh tử tương đương với số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa

♦ Giai đoạn tinh tử

Sự biệt hóa tinh tử để tạo thành tinh trùng diễn ra ngay sau khi quá trìnhgiảm phân kết thúc và cũng là giai đoạn cuối của quá trình sinh tinh Sự biệthóa này gồm:

• Bất hoạt toàn bộ bộ gen để đảm bảo sự hoạt động hoàn toàn sau khi thụ tinhvới trứng

• Nhiễm sắc thể được nén gọn để thu nhỏ kích thước của nhân, từ đó thu nhỏkích thước đầu tinh trùng tạo điều kiện cho quá trình di chuyển: trong quátrình này, protein histon trong chromatid sẽ được thay thế bằng proteinprotamin, protein này giúp sắp xếp lại các chuỗi DNA làm cho kích thước củanhân sẽ được thu nhỏ và nằm ngay dưới màng tinh trùng Sau khi thụ tinh,protamin sẽ được thay thế bằng histon ở trong tế bào trứng.

• Hình thành các cấu trúc giúp cho sự vận động của tinh trùng như đuôi và sựloại bớt bào tương Hiện tượng loại bớt bào tương diễn ra ở tinh trùng trưởngthành, các túi bào tương sẽ được loại ra ngoài từ phần cổ của tinh trùng Khitinh trùng được phóng thích vào ống sinh tinh thì các túi bào tương vẫn còntồn tại, tại mào tinh các túi bào tương sẽ trượt dần từ cổ xuống đuôi và rangoài

• Biệt hóa cấu trúc để tinh trùng nhận biết được trứng và có khả năng thụ tinhvới trứng

Kết thúc quá trình này, tinh trùng sẽ được hình thành với hình dạng vàcấu trúc ở mức độ biệt hóa cao để đảm bảo chức năng giao tử đực ở người.Toàn bộ quá trình hình thành tinh trùng từ tinh nguyên bào đến tinh trùngmất khoảng 70 ngày, ngoài ra để tinh trùng đảm bảo được chức năng củamình thì phải trải qua quá trình trưởng thành cuối cùng tại mào tinh khoảng10-24 ngày [11], [44]

Hình 1.1: Quá trình sản sinh tinh trùng

(Nguồn: Yhoctructuyen)

1.3.3 Sự thuần thục của tinh trùng tại mào tinh hoàn

Trong quá trình di chuyển tại mào tinh hoàn thì tinh trùng hoàn thànhquá trình chuyển hóa cuối cùng về hình thái, sinh hóa, chuyển hóa và sinh lý:

♦ Hình thái: mất đi các túi bào tương thừa, hình thái và kích thước củacực đầu ổn định

♦ Sinh hóa: cấu trúc glycoprotein ở màng tinh trùng thay đổi để dễ dàngnhận diện trứng và thực hiện các phản ứng với trứng khi gặp trứng

♦ Chuyển hóa: tinh trùng tăng chuyển hóa và tăng vận động Ở đầu màotinh hoàn tinh trùng di động yếu, không đồng bộ và không định hướng nhưng

ở cuối mào tinh, tinh trùng đã có khả năng di động nhanh và định hướng tốt

1.4 Các loại tế bào trong tinh dịch

1.4.1 Tế bào sinh tinh

 Tinh trùng trưởng thành (chiếm >90% trong tinh dịch đồ bình thường [1],[11])

♦ Nguồn gốc: tinh trùng được tạo ra từ các tế bào sinh tinh, nằm trong cácống sinh tinh thuộc hai tinh hoàn

♦ Đặc điểm: một tinh trùng được coi là bình thường về hình thái khi đầu,

cổ, đoạn trung gian và đuôi tinh trùng phải nằm trong giới hạn bình thường(WHO 1999) [13]

• Đầu: hình bầu dục hoặc hơi dẹt (khi nhìn mặt bên); dài 4-5 µm, rộng 2 µm.Khu vực chứa nhân nằm ở đoạn sau phình to, bắt màu đậm trên tiêu bảnnhuộm màu Phía trước đầu là túi cực đầu bắt màu nhạt, chiếm 40-70% diệntích vùng đầu Đầu tinh trùng có thể có không bào tuy nhiên chỉ coi tinh trùngbình thường khi không bào ≤ 20% vùng đầu

• Cổ: là đoạn ngắn, hẹp, gắn thẳng với trục đầu

• Đoạn trung gian: tiếp nối với đoạn cổ, khoảng 1 µm, có bao ti thể Cổ và đoạntrung gian được định ranh giới với đuôi bởi vòng Zensen, đây là nơi màngbào tương dày lên Chiều dài cổ và đoạn trung gian gấp 1,5 lần chiều dài đầu

• Đuôi: gồm 2 đoạn là đoạn chính và đoạn cuối Đoạn chính dài khoảng 45 µm,thẳng, thon, nhỏ hơn phần cổ, không cuộn Đuôi có một dây trục nằm ở trungtâm, vây quanh bởi một bao sợi xơ và bọc ngoài bởi màng tế bào Ở đoạn cuối,đuôi vuốt nhỏ lại chỉ còn dây trục ở giữa và bọc ngoài bởi màng tế bào.

Tinh trùng có thể có bào tương, thường nằm ở phần cổ và đoạn trunggian, cũng có khi ở phần đuôi Diện tích không bào thường < 1/3 diện tíchđầu Tinh trùng bình thường có chiều dài từ 50-60 µm

Hình 1.2: Cấu tạo tinh trùng trưởng thành (Nguồn: Pearson education 2006)

 Các tế bào dòng tinh khác

♦ Tinh nguyên bào: là tế bào đầu dòng tinh, kích thước nhỏ (9-15 µm),nằm sát màng đáy biểu mô tinh, ở ngăn ngoài của biểu mô tinh

♦ Tinh bào 1: là tế bào lớn, đường kính khoảng 25 µm, cách màng đáybởi một hàng tinh nguyên bào, có bộ nhiễm sắc thể 2n Tinh bào 1 có nhânhình cầu, các bào quan khác khá phong phú.

♦ Tinh bào 2: có kích thước nhỏ, gồm 2 loại: một loại mang nhiễm sắcthể X và một loại mang nhiễm sắc thể Y Trên tiêu bản mô học của tinh hoànhầu như không tìm thấy tinh bào 2 bởi tinh bào 2 ngay sau hình thành đã bướcvào lần phân chia thứ 2 của quá trình giảm phân để tạo tiền tinh trùng

♦ Tiền tinh trùng (tinh tử): nằm gần lòng ống sinh tinh, có hình hơi dài,nhân sáng, bào tương có các bào quan: bộ Golgi, ti thể Tiền tinh trùng quamột quá trình biệt hóa phức tạp để tạo thành tinh trùng (quá trình này gồm 4giai đoạn, xảy ra khi các tiền tinh trùng đang được vùi trong các khoảng trống

ở mặt tự do phía lòng ống sinh tinh của các tế bào Sertoli)

Các tế bào dòng tinh này hiếm khi xuất hiện trong tinh dịch đã xuất tinhtrừ một số trường hợp bất thường

1.4.2 Tế bào không phải là tinh trùng (tế bào tròn - round cell - nonsperm cell)

 Bạch cầu

- Nguồn gốc: huy động từ máu ngoại vi đến hoặc từ các mô lân cận

- Đặc điểm: có 5 loại tế bào bạch cầu: bạch cầu ưa kiềm, ưa acid, trungtính, mono và bạch cầu (BC) lympho kích thước đa dạng từ 5-20 µm.bạch cầu có hình tròn hoặc bầu dục dễ nhầm với tinh tử khi quan sát bằngmắt thường

• BC đa nhân trung tính (Neutrophil): kích thước 10-14µm, nhân chia nhiềumúi nối với nhau bằng sợi mảnh, bắt màu trung tính Nó tăng trong nhiễmtrùng cấp tính, giai đoạn bình phục trong mất máu nhiều; giảm khi nhiễmvirus và nhiễm độc kim loại Pb, As,…

• BC đa nhân ưa acid (Eosinophil): 12-15 µm nhân chia nhiều múi nối vơi nhaurất rõ (hình mắt kính) bắt màu acid, các hạt to bắt màu da cam Nó tăng trongcác bệnh nhiễm ký sinh trùng đường ruột, hen suyễn; giảm khi dùng nhiềuACTH, Cortisol.

• BC đa nhân ưa kiềm (Basophil): 8-10 µm nhân chia thành nhiều múi nối vớinhau bằng các mảnh nhỏ, hạt rất nhỏ, khó thấy, bắt màu kiềm cho màu xanhnhạt Nó tăng lên trong các bệnh viêm mãn tính, các bệnh BC dòng tủy, đáiđường, nhược năng tuyến giáp

• BC mono (monocytes): 8-22 µm, nhân to hình hạt đậu, bào tương màu xanhnhạt Nó có khả năng xuyên mạch đi vào mô liên kết, tập trung nhiều ở các ổviêm Nó có chức năng đại thực bào, chuyển hóa protein, glucid, lipid

• BC lympho (lymphocytes): gồm lympho cầu bé (8-12 µm) và lympho cầu lớn(15-18 µm), nhân hình gần tròn chiếm hầu hết tế bào, nguyên sinh chất màuxanh nhạt

Hình 1.3: Hình dạng các loại BC trưởng thành

(Nguồn: Lab tests online AACC)

 Tế bào mầm chưa trưởng thành (immature germ cells)

- Nguồn gốc: tế bào mầm sinh dục được sinh ra từ các tế bào biểu mô sinhtinh của ống sinh tinh Đa phần là các tinh tử tròn và tinh bào, hiếm khi làtinh nguyên bào Chúng phải trải qua các giai đoạn phát triển khác nhautrước khi đi đến mào tinh hoàn thiện chuẩn bị đầy đủ nhất về cấu tạo vàchức năng tìm và thụ tinh với trứng Vì một nguyên nhân nào đó, các tếbào mầm chưa trưởng thành được phóng thích sớm trước khi nó có đủ khảnăng thụ tinh với trứng, sẽ xuất hiện trong mẫu tinh dịch, có thể quan sátđược dưới kính hiển vi điện tử

- Đặc điểm: tinh tử và tinh bào có thể phân biệt được với bạch cầu trongphiến đồ phết nhuộm tinh dịch bằng kỹ thuật Papanicolaou [12] Việc xácđịnh có thể dựa trên màu thuốc nhuộm, kích thước nhân và hình dạng, sựthiếu peroxidase nội bào và không có kháng nguyên bạch cầu đặc hiệu.Tinh tử nhiều nhân có thể nhầm lẫn về mặt hình dạng với bạch cầu hạtnhưng bắt màu hồng nhạt, trái với màu hơi xanh của bạch cầu hạt [12].Tinh tử tròn có thể được xác định bằng các thuốc nhuộm chuyên biệt chovùng cực đầu đang phát triển [45] lectin hay các kháng thể đặc hiệu [46],[47] Kích thước nhân cũng có thể giúp cho việc xác định: tinh nguyênbào (rất hiếm khi thấy trong tinh dịch) có nhân xấp xỉ 8µm, tinh bào cónhân xấp xỉ 10µm, và tinh tử có nhân xấp xỉ 5µm Những kích thước nàychỉ là tương đối vì sự thoái hóa và giai đoạn phân chia có thể ảnh hưởnglên kích thước của nhân.

 Tế bào biểu mô

- Nguồn gốc: là các tế bào biểu mô vảy của các ống bài tiết và các tếbào biểu mô từ các túi tinh

- Đặc điểm: tế bào biểu mô vảy từ biểu mô bề ngoài của ống bài tiết cóliên quan đến sự xuất hiện của vi khuẩn và viêm Tế bào biểu mô từcác túi tinh chứa sắc tố màu vàng trong tế bào chất của chúng, cũngđược thấy sau khi nhuộm bằng kỹ thuật Papanicolaou, có thể đượctìm thấy với số lượng lớn tong viêm túi tinh mạc, đôi khi kết hợp vớicác hạt sắc tố trong huyết tương tinh dịch

1.5 Các phương pháp phát hiện bạch cầu trong tinh dịch

Có 2 phương pháp giúp phát hiện các tế bào khác (tế bào không phải tinhtrùng - non sperm cells) đang được sử dụng là phương pháp nhuộm tế bào học

và phương pháp xét nghiệm miễn dịch [48]

Trong đó phương pháp nhuộm tế bào phát hiện hoạt tính enzym từ cácquần thể bạch cầu được khuyến cáo cho việc phát hiện bạch cầu trong tinh dịch[49], [50].

1.5.1 Phương pháp nhuộm esterase (leukocyte esterase)

 Nguyên lý: phát hiện hoạt động của enzym ngoại bào của bạchcầu dựa trên sự phân cắt của nhóm indoxyl ester bởi enzym esterase củ

a bạch cầu tạo ra màu xanh chàm (Cytur test, Boehringer Mannheium, Germany)

 Ưu điểm: dễ thực hiện, nhanh và không quá tốn kém

 Nhược điểm: kết quả không tương thích với các phương pháp nhuộm

BC trong tinh dịch khác như phương pháp nhuộm peroxidase Ngàynay không được khuyến cáo dùng để phát hiện BC trong tinh dịch

1.5.2 Phương pháp nhuộm elastase (Granulocyte elastate)

 Nguyên lý:

- Với phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay):elastase được tiết ra từ các BC hạt lưu hành trong các dịch cơ thể,thường bị ràng buộc với chất ức chế alpha1-antitrypsin Ốngpolystyren phủ kháng thể với elastase của BC hạt được ủ tiếp với mẫutinh tương tinh dịch và kháng thể thỏ có chứa phosphotase kiềm vớichất ức chế alpha1-antitrypsin [51]

Hoạt tính phosphatase kiềm liên kết sau đó được xác định bằngquang phổ quang học bằng cách sử dụng p-nitrophenylphosphataselàm chất nền

- Với phương pháp RIA: (Radioimmunoassay, phương pháp miễn dịchđánh dấu phóng xạ): mẫu tinh tương tinh dịch được ủ với một sốlượng nhất định elastase và kháng thể kháng elastase Tỷ lệ giữa

phóng xạ tự do và phóng xạ gắnthể hiện nồng độ elastase trong tinh tương tinh dịch.

 Ưu điểm: đánh giá khách quan hoạt động chức năng của bạch cầu [52], [53]

 Nhược điểm: chỉ đánh giá được những BC tiết elastase, khó thực hiện

và đắt

1.5.3 Phương pháp nhuộm peroxidase (Myelo-peroxidase)

 Nguyên lý: trong bạch cầu hạt có hệ thống enzym peroxidase nội bào,với sự hiện diện của H2O2, chất nền là benzidine hoặc o-toluidine sẽ tạothành phức hợp màu nâu đậm có thể quan sát được dưới kính hiển vi

 Ưu điểm: nhanh chóng, dễ thực hiện và giá thành rẻ [54] Nhuộm đượccác tế bào BC hạt đa nhân, là loại BC chủ yếu trong tinh dịch [55].Phương pháp này đủ ý nghĩa trong thực hành lâm sàng

 Nhược điểm:

• Chỉ những bạch cầu có chứa peroxidase mới được phát hiện

• Không phân biệt được BC lympho và mono

• Chất khí được tạo thành bởi peroxidase và nhiệt của đèn kính hiển vi tạo thành các bọt nước cản trở việc đọc kết quả

• Benzidine có thể gây ung thư (vì vậy, người ta thường dùng

Bạch cầu trong tinh dịch cũng là tác nhân tạo ROS quan trọng Sự xuấthiện của bạch cầu trong tinh dịch, mặc dù rất ít, cũng có thể làm suy giảmchức năng tinh trùng Có nhiều kỹ thuật định lượng ROS trong tinh dịch đãđược nghiên cứu [57] Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay làphương pháp phát quang hóa học (Chemiluminescence), sử dụng đầu dòluminol Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp nên thườngđược dùng trong nghiên cứu hơn là thực tiễn lâm sàng.

1.5.5 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch BC bằng kháng thể đơn dòng

Đây là phương pháp nhuộm đặc hiệu nhất, có thể phân biệt được BC hạt,lympho và đại thực bào

Nguyên tắc của phương pháp này là tất cả các loại BC người đều cómột loại kháng thể đặc hiệu (CD45), có thể được phát hiện bởi kháng thể đơndòng phù hợp Bằng cách thay đổi bản chất của kháng thể nguyên thủy, kỹthuật này có thể phát hiện nhiều loại BC khác nhau như đại thực bào, đơn bào,bạch cầu trung tính, tế bào B hay tế bào T Đây được xem là tiêu chuẩn vàngphát hiện các loại BC trong tinh dịch, tuy nhiên, nhuộm hóa miễn dịch tế bàođắt tiền hơn và tốn nhiều thời gian hơn so với phương pháp đánh giá hoạtđộng enzym peroxidase của các BC hạt

1.6 Các nghiên cứu trong nước và thế giới về bạch cầu trong tinh dịch

Trên thế giới từ lâu đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp pháthiện bạch cầu trong tinh dịch, tác động của bạch cầu trong tinh dịch đến cácchỉ số tinh dịch đồ, ảnh hưởng của bạch cầu đến khả năng sinh sản nam giới

và phương pháp điều trị khi số lượng bạch cầu tăng cao Tuy nhiên, ở ViệtNam vẫn chưa có báo cáo nào về vấn đề này

1.6.1 Các nghiên cứu về xác định bạch cầu trong tinh dịch

Bạch cầu, chủ yếu là BC hạt, thường có mặt trong hầu hết các mẫuxuất tinh ở người [11], [58] Theo một nghiên cứu của Johanisson và cộng sựnăm 2000 chỉ ra rằng: có thể phân biệt được BC với các tinh tử và tinh bàotrong phiến đồ phết được nhuộm theo kỹ thuật Papanicolaou Sự khác biệtdựa trên những sự khác nhau về màu nhuộm, kích thước và hình dạng nhân[12] Các BC hạt dễ nhầm về mặt hình thái học với các tinh tử nhiều nhânnhưng lại bắt màu xanh nhạt, ngược lại với màu hơi hồng của tinh tử [12].Kích thước nhân cũng có thể giúp nhận biết: nhân BC đơn nhân cho thấy có sựkhác biệt lớn về kích thước, từ khoảng 7µm đối với các tế bào bạch huyết đếnhơn 15 µm đối với các đại thực bào Tuy nhiên, các kích thước này chỉ để thamkhảo vì sự thoái hóa và phân chia ảnh hưởng đến kích thước nhân Nghiên cứunày của Johanisson đã góp phần phân biệt được bạch cầu với các tinh tử, tuynhiên quá trình nhuộm gồm rất nhiều bước đòi hỏi sự tỷ mỉ và độ chính xác caomới có thể phân biệt rõ bạch cầu với tinh bào và tinh tử Vì vậy, kết quả thườngkhông đánh giá một cách chính xác, khách quan như mong đợi

Theo Wolff năm 1995, Johanisson và cộng sự năm 2000: do bạch cầu hạt

có chứa peroxid là dạng BC chiếm ưu thế trong tinh dịch, xét nghiệm thườngquy hoạt tính của enzym peroxidase có thể thực hiện như một kỹ thuật tầmsoát bước đầu [12], [50] Với nghiên cứu này, chúng ta có thể phân biệt rõbạch cầu hạt với các “tế bào tròn” khác trong tinh dịch, hóa chất thông dụng,

dễ tìm, không quá tốn kém và dễ thực hiện Phương pháp nhuộm peroxidasenày có ý nghĩa cao trong thực hành lâm sàng Nguyên lý: trong bạch cầu hạt

có hệ thống enzym peroxidase nội bào, với sự hiện diện của H2O2, chất nền làbenzidine hoặc o-toluidine sẽ tạo thành phức hợp màu nâu đậm có thểquan sát được dưới kính hiển vi Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, rẻ,

dễ thực hiện, có thể nhuộm được bạch cầu hạt là loại bạch cầu chiếm ưu thếtrong tinh dịch [59] Phương pháp có đủ ý nghĩa trong thực hành lâm sàng.Tuy nhiên cũng có một số nhược điểm như: chỉ những BC có chứa peroxidasemới được phát hiện, không phân biệt được BC lympho và mono.

Theo nghiên cứu của Homyk và cộng sự năm 1990, Eggert-Kruse vàcộng sự năm 1992: các BC hạt còn có thể được phân biệt với BC thôngthường và các kháng thể kháng tinh trùng bằng các xét nghiệm hóa miễn dịch

tế bào [46], [47] Các BC hạt đã phóng thích hạt và những loại BC khác nhưlympho bào, đại thực bào không chứa enzym peroxidase nội bào nên khôngthể phát hiện được nhờ vào xét nghiệm o-toluidine, nhưng có thể phát hiệnbởi các phương pháp hóa miễn dịch Stế bào Nguyên tắc của phương phápnày là tất cả các loại BC người đều có một loại kháng thể đặc hiệu (CD45), cóthể được phát hiện bởi kháng thể đơn dòng phù hợp Bằng cách thay đổi bảnchất của kháng thể nguyên thủy, kỹ thuật này có thể phát hiện nhiều loại BCkhác nhau như đại thực bào, đơn bào, bạch cầu trung tính, tế bào B hay tế bào

T Đây được xem là tiêu chuẩn vàng phát hiện các loại BC trong tinh dịch, tuynhiên, nhuộm hóa miễn dịch tế bào đắt tiền hơn và tốn nhiều thời gian hơn sovới phương pháp đánh giá hoạt động enzym peroxidase của các BC hạt

1.6.2 Các nghiên cứu về mối liên quan giữa số lượng bạch cầu trong tinh dịch với một số chỉ số tinh dịch đồ

Nghiên cứu của Jakob E Lackner và cộng sự năm 2010 về mối liên quangiữa BC và chất lượng tinh trùng phụ thuộc vào nồng độ BC trong tinh dịch[60] Đây là một nghiên cứu lâm sàng hồi cứu tại trung tâm nam học của mộtbệnh viện trường đại học Các mẫu tinh dịch từ nam giới vô sinh được phântích hình thái tinh trùng và độ di động theo nồng độ bạch cầu trong tinh dịch(loại A: >0 đến <0,25 ×106 /mL; loại B: > 0,25 đến <0,5×106/mL, loại C: >0,5

đến <0,75×106/mL, loại D: > 0,75 đến <1,0×106/mL, loại E: >1,0×106/mL).Kết quả cho thấy tỷ lệ tinh trùng với hình thái bình thường tăng đáng kể từloại A (14%) đến loại D (19%) nhưng giảm đáng kể xuống mức 14% ở loại Etương tự như loại A Mức độ di động trong nhóm di động tiến tới cũng tăng từloại A (12%, 20%) đến loại D (18,0%, 28,5%) và giảm đáng kể ở loại E (11%,20,5%) về mức tương tự như loại A Độ biến dạng tinh trùng và độ di động tạichỗ hoặc không di động tăng dần trong tất cả các loại Nghiên cứu đưa ra kếtluận rằng tỷ lệ tinh trùng với hình thái bình thường và tính di động tiến tới caohơn ở các mẫu tinh dịch với nồng độ bạch cầu từ 0 đến 1×106/mL so với cácmẫu có nồng độ bạch cầu >1×106/mL Mặc dù mối liên quan giữa các bạchcầu và các tham số tinh dịch phức tạp, và có thể liên quan đến nhiều yếu tốkhác nhau, các kết quả này chỉ ra rằng bạch cầu có thể có tác động tích cựctrên một số tham số tinh dịch [50], có thể phụ thuộc nồng độ và ngưỡng chonồng độ bạch cầu có thể gây hại cho tinh trùng tương ứng với mức độ hiện tạicủa WHO >1×106/mL [13].

Nghiên cứu của Alaa Moubasher và cộng sự năm 2018 về tác động củatăng bạch cầu lên các thông số vận động của tinh trùng, DNA và tính toàn vẹncủa nhiễm sắc thể [61] Các mẫu tinh dịch từ nam giới vô sinh được phân tíchmật độ và độ di động của tinh trùng, tính toàn vẹn DNA và nhiễm sắc thể theo

số lượng bạch cầu trong tinh dịch (bệnh nhân nam vô sinh có nồng độ bạchcầu trong tinh dịch ≥ 1 triệu/mL được đặt vào nhóm A-leukocytospermia,những bệnh nhân khác có nồng độ bạch cầu trong tinh dịch dưới 1 triệu/mLđược đặt trong nhóm B-nonleukocytospermia) Kết quả cho thấy không có sựkhác biệt đáng kể về thống kê giữa nhóm A và nhóm B đối với số lượng tinhtrùng và hình thái tinh trùng Số lượng tinh trùng nhóm A là (81,90 ±87,26)triệu/lần xuất tinh so với nhóm B là (72,63 ±85,00) triệu/lần xuất tinh, hìnhthái tinh trùng bình thường nhóm A là (13,44 ±9,19) % so với nhóm B là

(15,00 ±6,99) %, p> 0,05) Tuy nhiên lại có sự khác biệt về tỷ lệ tinh trùng diđộng tiến tới và tổng số tinh trùng di động Tỷ lệ tinh trùng di động tiến tớicủa nhóm A là (22,04 ±8,67)% thấp hơn đáng kể so với nhóm B là (39,08

±11,41) (p<0,001) và tổng số tinh trùng di động nhóm A là (26,80 ±11,03)%cũng thấp hơn đáng kể so với nhóm B là (45,44 ±13,16)% (p<0,001)

Nhóm A có các thông số vận động tinh trùng được đánh giá trên máyCASA thấp hơn đáng kể Trong đó, tốc độ di động trung bình VSL của nhóm A

là (24,12 ±5,28) µm/s thấp hơn đáng kể so với tốc độ di động trung bình VSLcủa nhóm B là (38,08 ±5,74) µm/s (p<0,001) Mức độ đứt gãy DNA tinh trùng ởnhóm A là 43.60 ±13.43 cao hơn so với 30.20 ±5.10 ở nhóm B có ý nghĩa thống

kê (p<0,001) Ngoài ra, các mối tương quan nghịch đáng kể đã được tìm thấygiữa số lượng bạch cầu dương tính vơi peroxidase và các thông số vận động củatinh trùng được đánh giá bởi CASA, bao gồm mức độ di động tiến tới của tinhtrùng (r = -0,580, p <0,001), VCL (r = -0,590, p <0,01), VSL (r = -0,526, p

<0,01) Cũng có mối tương quan thuận đáng kể giữa số lượng bạch cầu của tinhdịch và tỷ lệ DFI của tinh trùng (r = 0,767, p <0,001) Nghiên cứu kết luận rằng

có sự gia tăng đáng kể về tình trạng suy giảm chất lượng tinh dịch ở nhóm A sovới nhóm B thông qua khảo sát các thông số tinh dịch trên 2 nhóm có và không

có số lượng bạch cầu cao trong tinh dịch, chủ yếu là do nhiễm trùng các tuyếnsinh dục phụ, rối loạn chức năng tuyến sinh dục

Theo Jae Hung Jung và cộng sự (2016) cho thấy tỷ lệ BC tăng caotrong tinh dịch do viêm nhiễm đường sinh dục – tiết niệu dẫn tới tỷ lệ vô sinhcao 15% [62], [63] Kết quả sau khi điều trị kháng sinh cho những trường hợpnày đã cải thiện các chỉ số tinh dịch đồ một cách hiệu quả ví dụ như: tăng mật

độ tinh trùng, tăng tốc độ di động và giảm bất thường hình thái Điều này chothấy tỷ lệ bạch cầu cao trong tinh dịch là một trong những yếu tố gây ảnhhưởng tới số lượng và chất lượng tinh trùng và là nguyên nhân gián tiếp tăng

tỷ lệ vô sinh ở nam giới [64], [65], [66] Việc xét nghiệm đánh giá số lượngbạch cầu trong tinh dịch trong việc hỗ trợ điều trị vô sinh nam giới đang ngàymột gia tăng hiện nay là vấn đề cấp bách và thiết thực [64], [67], [68].

1.6.3. Các nghiên cứu về điều trị bạch cầu cao trong tinh dịch

Đã có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về điều trị bạch cầu tăng cao trongtinh dịch và hiệu quả của việc điều trị lên việc cải thiện chất lượng tinh trùng,

tỷ lệ có thai Một số nghiên cứu nổi bật như:

Branigan và Muller năm 1994 [69] dùng doxycycline 100mg x 2lần/ngày trong 7 ngày, sau đó 100mg/ngày trong 21 ngày hoặc chỉ xuất tinhthường xuyên hoặc kết hợp cả 2 phương pháp giúp làm giảm số lượng bạchcầu, duy trì 2-3 tháng ở nhóm kết hợp, tuy nhiên chưa có báo cáo về tác độnglên chất lượng tinh trùng và tỷ lệ có thai

Lackner và cộng sự năm 2006 [70] sử dụng valdecoxib 20mg/ngàytrong 14 ngày giúp tăng số lượng tinh trùng và giảm nồng độ bạch cầu

Vicari và cộng sự năm 2000 [71] sử dụng ofloxacin 200mg x 2 lần/ngàytrong 14 ngày/tháng, nghỉ 14 ngày, trong 3 tháng hoặc doxycycline100mg/ngày trong 14 ngày/tháng, dừng 14 ngày, trong 3 tháng giúp cải thiện

số lượng tinh trùng và tỷ lệ di động tiến tới, cải thiện đáng kể tỷ lệ có thai ởnhóm được điều trị

Oliva và Multigner năm 2006 [72] sử dụng ketotifen 1mg x 2 lần/ngàytrong 12 tuần giúp cải thiện tốc độ di động và tỷ lệ hình thái bình thường,giảm đáng kể nồng độ bạch cầu trong 4 tuần

Gambera và cộng sự năm 2007 [73] sử dụng rofecoxib 25mg/ngày trong

30 ngày giúp cải thiện tốc độ di động và tỷ lệ hình thái bình thường, giảmđáng kể mật độ bạch cầu sau 30 ngày và tăng tỷ lệ có thai 15,8%

Jung và cộng sự năm 2016 [64] sử dụng kháng sinh phổ rộng và cácchất chống oxy hóa để loại bỏ nhiễm trùng và giảm các gốc tự do oxy phảnứng được sản xuất bên trong ty thể của tế bào do viêm

Tuy nhiên, cho đến nay, việc điều trị viêm nhiễm sinh dục-tiết niệu có sốlượng bạch cầu cao trong tinh dịch vẫn còn nhiều tranh cãi