Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng iPSC

Tế bào gốc phôi có thể được nuôi cấy vô thời hạn trong khi vẫn duy trì khả năng tạo ra bất kỳ loại tế bào nào trong cơ thể, và do đó cung cấp một công cụ mạnh mẽ để mô hình hóa bệnh ở n

NGUYỄN THÙY LINH

Tên đề tài:

BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG

CẢM ỨNG (iPSC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

THÁI NGUYÊN, 2019

NGUYỄN THÙY LINH

Tên đề tài:

BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG

CẢM ỨNG (iPSC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy

Chuyên ngành: CNSH - CNTP

Khóa học: 2015 – 2019

Giảng viên hướng dẫn: 1 TS Nguyễn Xuân Hưng

THÁI NGUYÊN, 2019

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Hưng –

Phó viện trưởng kiêm Trưởng phòng Nghiên cứu khoa học Viện Nghiên cứu Tế bào

gốc và công nghệ gen Vinmec và PGS.TS Dương Văn Cường – giảng viên Khoa

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ths Trần Thị Tuyết Trinh –

kỹ thuật viên Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Viện nghiên cứu Tế bào gốc và

Công nghệ gen TS Nguyễn Hồng Thanh, TS Đào Thị Mai Lan… đã hỗ trợ nhiệt

tình cho tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô, cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua

Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thùy Linh

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng 10

Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa 11

Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 21

Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 23

Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm 24

Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry 28

Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O 29

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR 35

Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 35

Bảng 3.8: Trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm 37

Bảng 3.9 Thành phần phản ứng Real time PCR 37

Bảng 4.1: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid mini 39

Bảng 4.2: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid maxi 40

Bảng 4.3: Kết quả đo OD sau mỗi lần tách RNA 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc 4

Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng 5

Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mô hình bệnh và khám phá thuốc 9

Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4 12

Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2 13

Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4 14

Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC 15

Hình 2.8: Cấu trúc miền protein của LIN28 16

Hình 2.9: Cấu trúc miền protein của GLIS1 17

Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC 18

Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình 20

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài 25

Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình 28

Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA 36

Hình 3.4: Chu trình nhiệt cài đặt cho máy Real-time PCR 37

Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA plasmid mini 39

Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA plasmid maxi 40

Hình 4.3: Tế bào CD34+ sau khi rã đông 41

Hình 4.4: Tế bào CD34+ sau 6 ngày nuôi tăng sinh 42

Hình 4.5: Tế bào CD34+ sau 2 ngày nuôi tăng sinh 43

Hình 4.6: Tế bào CD34+ sau 5 ngày nuôi tăng sinh 43

Hình 4.7 Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào nuôi tăng sinh 45

Hình 4.8: Tế bào sau 1 ngày xung điện 47

Hình 4.9: Quần thể tế bào sau 2 ngày chuyển gen (A), sau 3 ngày chuyển gen (B) và sau 7 ngày chuyển gen (C) 48

Hình 4.10: Tế bào sau 1 ngày xung điện 49 Hình 4.11: Quần thể tế bào sau 4 ngày chuyển gen (A), sau 5 ngày chuyển gen (B),

sau 8 ngày chuyển gen (C) 49 Hình 4.12: (A)Biểu hiện của các gen SOX2-KLF4 và LMYC- LIN28 (B) Cấu trúc

vector pCEB-hSK-O và pCEB-hUL-G 51

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

E coli Escherichia coli

hiPSC Human induced pluripotent stem cell

iPSC Induced pluripotent stem cell

mESC Mouse embryonic stem cell

PBMC Peripheral blood mononuclear cell

qRT-PCR Quantitative polymerase chain reaction

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT v

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 4

2.1.1 Tế bào gốc 4

2.1.2 Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng 4

2.1.3 Phân loại tế bào gốc 5

2.2 Các nhân tố tái lập trình 12

2.2.1 OCT4 12

2.2.2 SOX2 13

2.2.3 KLF4 14

2.2.4 MYC 15

2.2.5 LIN28 16

2.2.6 GLIS1 17

2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC 18

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 21

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2 Địa điểm và thời gian 21

3.2 Nội dung nghiên cứu 21

3.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1 Vật liệu 21

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 25

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

4.1 Kết quả nhân plasmid lần 1 39

4.2 Kết quả nhân plasmid lần 2 40

4.3 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 1 41

4.4 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2 43

4.5 Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 1 46

4.6 Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 2 48

4.7 Kết quả kiểm tra biểu hiện gen 50

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cell - ESC) là những tế bào vạn năng, có khả năng tự làm mới và có nguồn gốc từ khối tế bào bên trong (inner cell mass – ICM) của phôi nang đang phát triển [44] Tế bào gốc phôi có thể được nuôi cấy vô thời hạn trong khi vẫn duy trì khả năng tạo ra bất kỳ loại tế bào nào trong cơ thể, và

do đó cung cấp một công cụ mạnh mẽ để mô hình hóa bệnh ở người [8] tuy nhiên tế bào gốc phôi vướng phải nhiều tranh cãi về đạo đức khi sử dụng trực tiếp nguồn phôi người [3]

Việc Yamanaka khám phá ra rằng các tế bào trưởng thành nguyên vẹn có thể được tái lập trình để trở thành các tế bào gốc vạn năng ngay lập tức được coi là một bước đột phá lớn Các tế bào gốc vạn năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell - iPSC) là đại diện thay thế cho nguồn tế bào gốc phôi, không gây tranh cãi về đạo đức và mang đầy đủ các đặc tính của một tế bào gốc phôi Một lợi thế quan trọng của iPSC là khả năng tương thích miễn dịch khi sử dụng liệu pháp tế bào tự thân [30] Tế bào gốc vạn năng cảm ứng có thể được tạo ra từ nhiều loại tế bào sinh dưỡng khác nhau và có sự tương đồng cao với tế bào gốc phôi Với các nguồn tế bào sinh dưỡng dễ tiếp cận, iPSC từ người không chỉ loại bỏ các vấn đề về đạo đức vướng phải khi sử dụng ESC mà còn cho phép tạo ra nguồn tế bào gốc vạn năng đơn giản hơn, cũng như biệt hóa thành nhiều loại tế bào chuyên biệt cho từng bệnh nhân Tương tự như ESC, iPSC của người có khả năng tăng sinh mạnh mẽ trong ống nghiệm trong khi vẫn giữ được tiềm năng phát triển và biệt hóa thành mọi tế bào trong cơ thể Do đó, các tế bào này có thể cung cấp một số lượng không giới hạn nguồn tế bào biệt hóa dành riêng cho bệnh nhân để tạo mô hình nghiên cứu bệnh, xét nghiệm độc tính, sàng lọc thuốc và sử dụng cho các liệu pháp cấy ghép Việc tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng bằng cách đưa các yếu tố tái lập trình vào tế bào sinh dưỡng là một phương pháp đầy hứa hẹn cho liệu pháp tế bào trong y học tái tạo

Các dòng iPSC từ người đã bắt đầu được phát triển, quan tâm và nghiên cứu nhiều trên thế giới, tuy nhiên chủ yếu vẫn là các dòng được phát triển từ tế bào sinh dưỡng có hệ gen của người da trắng, tính đến nay chưa có dòng iPSC của người Việt Nam Hệ gene của người Việt Nam khác với các nước trên thế giới do vị trí địa

lý, khí hậu, phong tục tập quán, chính vì thế chúng tôi tiến hành tạo các dòng iPSC phù hợp với hệ gene của người Việt Nam, làm công cụ hữu ích để nghiên cứu cơ chế bệnh, khám phá và sàng lọc độc tính các loại thuốc mới và đặc biệt là trở thành một nguồn tế bào vô hạn sử dụng cho cấy ghép và y học tái tạo Mặc dù tiến bộ nhanh chóng, nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam vẫn đang giới hạn trong việc sử dụng tế bào gốc đa năng với khả năng biệt hoá thành một số hữu hạn dòng tế bào, các nghiên cứu về iPSC mới chỉ bắt đầu ở chuột từ năm 2016

Từ các cơ sở khoa học nêu trên, tôi lựa chọn đề tài: “Biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)”

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Biểu hiện thành công hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu của người

- Điện biến nạp hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, GLIS1 vào quần thể tế bào gốc tạo máu của người

- Kiểm tra biểu hiện gen của các yếu tố tái lập trình trong tế bào gốc tạo máu sau khi điện biến nạp

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Là tiền đề để tạo thành công dòng tế bào gốc vạn năng cảm ứng đầu tiên từ

tế bào có hệ gen của người Việt Nam, đánh dấu một bước phát triển quan trọng trong lĩnh vực này tại Việt Nam

- Tạo dòng iPSC đầu tiên của người Việt Nam để cung cấp một khối lượng lớn tế bào làm mô hình cho nghiên cứu biệt hóa, nghiên cứu sàng lọc thuốc

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Chuyển gen thành công là bước đầu quan trọng và cần thiết trong quy trình tạo dòng tế bào gốc vạn năng cảm ứng

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tế bào gốc

Tế bào gốc là một loại tế bào đặc biệt trong cơ thể Hai đặc điểm đặc trưng của tế bào này là khả năng nhân đôi vô hạn và khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào sinh dưỡng khác [43] Nhờ thế chúng có khả năng tái tạo, sửa chữa và thay thế các tế bào chết, tổn thương trong cơ thể Tên gọi tế bào gốc được hình thành cũng vì khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau khiến người ta liên tưởng đến hình ảnh gốc cây phân nhánh, mỗi nhánh hình thành cành, lá, quả

Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc 2.1.2 Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng

- Năm 1962, John B Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành của ếch có lưu mọi thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình [3]

- Năm 1981, Martin Evans và Martin Kaufman, Gail Martin phân lập được tế bào gốc phôi từ phôi của chuột [3]

- Năm 1997, Sir Ian Wilmut và cộng sự đã chuyển nhân vào tế bào sinh dưỡng để lập trình lại tế bào nhằm nhân bản cừu Dolly, loại động vật có vú đầu tiên được tạo bằng nhân bản tế bào sinh dưỡng [3]

- Năm 1998, James Thomson phân lập được tế bào gốc phôi người [3]

- Năm 2001, Tada và cộng sự đã dung hợp tế bào sinh dưỡng với tế bào gốc phôi để tạo ra các tế bào có khả năng biểu hiện gen liên quan đến các tế bào đa năng cho thấy ESC có chứa một số yếu tố có thể lập trình lại các tế bào sinh dưỡng [3]

- Năm 2006, các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ đã tạo ra tế bào gốc phôi hoàn toàn mới từ tế bào trưởng thành Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này được tạo ra nhờ chuyển bốn gen kích hoạt tái lập trình để tạo ra tế bào có đặc tính giống tế bào gốc thu nhận ở phôi [3]

Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng

2.1.3 Phân loại tế bào gốc

Có thể phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa hoặc phân loại theo nguồn gốc [48] Theo tiềm năng biệt hóa (differentiation potency) đa dạng của tế bào, các nhà nghiên cứu đã chia tế bào gốc thành 4 loại khác nhau [8]: tế bào gốc toàn năng (Totipotent), tế bào gốc vạn năng (Pluripotent), tế bào gốc đa năng (Multipotent) và tế bào gốc đơn năng (Unipotent)

a Tế bào gốc toàn năng

Các tế bào thuộc giai đoạn từ bốn đến tám tế bào trong quá trình phát triển của phôi sau thụ tinh được gọi là tế bào gốc toàn năng, chúng chỉ tồn tại trong giai đoạn phát triển phôi sớm Với tế bào gốc toàn năng, mỗi tế bào ban đầu có thể hình thành một cơ thể hoàn chỉnh Chúng có tiềm năng cao nhất và nhiều nhất để có thể trở thành tất cả các tế bào của cơ thể Ở động vật có vú trưởng thành (bao gồm cả người), có khoảng 200 loại tế bào thuộc các nhóm như tế bào thần kinh, tế bào cơ,

tế bào biểu mô, tế bào máu,…Những tế bào khác, bản chất cũng phát triển từ phôi, nhưng không hợp nhất tạo cơ thể gồm: mô ngoài phôi, nhau thai, dây rốn Các dạng trên được tạo ra từ một tế bào toàn năng Những tế bào ở giai đoạn phôi sớm đến giai đoạn phôi nang cũng có tính toàn năng và cũng có thể tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh [1]

b Tế bào gốc vạn năng

- Tế bào gốc phôi

Cuối thập niên 20 được đánh dấu bằng sự bùng nổ của một hướng nghiên cứu non trẻ nhưng đầy tiềm năng, đó là công nghệ tế bào gốc, với khởi điểm là việc James Thomson phân lập được các tế bào gốc từ phôi người (1998) [18] Các tế bào gốc phôi là các tế bào đa năng có thể được phân lập từ khối tế bào bên trong của tiền phôi Tế bào gốc phôi đã nổi lên như một ứng cử viên hấp dẫn cho các liệu pháp dựa trên tế bào có khả năng phục hồi chức năng tế bào và mô bị mất Những tế bào độc đáo này có thể tự làm mới vô thời hạn và có khả năng biệt hóa thành cả ba lớp mầm phôi (lá trong, lá giữa, lá ngoài) Ba lá mầm phôi này là nguồn gốc của tất

cả các loại tế bào chuyên biệt khác nhau của cơ thể Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên của tế bào gốc phôi để điều trị chấn thương tủy sống và thoái hóa điểm vàng trong năm 2010 đánh dấu sự khởi đầu của một kỷ nguyên mới trong y học tái tạo [40] Tuy nhiên nghiên cứu này châm ngòi cho cuộc tranh luận về vấn đề đạo đức khi nguồn sử dụng là phôi người

Tế bào gốc phôi khi tiêm vào vị trí tổn thương có khả năng hình thành nên khối u quái (teratomas) tại vị trí tiêm Do đó tế bào gốc cần được định hướng biệt

hóa thành các tế bào mong muốn trước khi được tiêm vào vị trí tổn thương Hiện nay có một số kỹ thuật được dùng để kiểm soát sự biệt hóa tế bào gốc trên nuôi cấy thực nghiệm, ví dụ: thay đổi thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy, tác động vào bề mặt của đĩa nuôi cấy (tạo các giá thể), hay gài các gen đặc hiệu vào những tế bào này

- Tế bào gốc vạn năng cảm ứng

Vào năm 1962, John B Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành của ếch có lưu mọi thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình Gurdon đã phát hiện rằng có thể đảo ngược sự chuyên môn hóa của các tế bào Trong một thí nghiệm cổ điển, ông đã thay thế nhân tế bào chưa trưởng thành trong tế bào trứng của ếch bằng nhân từ tế bào ruột trưởng thành Tế bào trứng biến đổi này phát triển thành một con nòng nọc bình thường Kết quả thí nghiệm này chứng minh rằng DNA của tế bào trưởng thành mang thông tin cần thiết để phát triển thành tất cả các

tế bào trong ếch và nguyên sinh chất của tế bào trứng chứa các tác nhân cảm ứng quá trình phát triển đảo ngược từ tế bào trưởng thành [19]

Phát hiện mang tính bước ngoặt của Gurdon ban đầu bị hoài nghi nhưng đã được chấp nhận khi các nhà khoa học khác xác nhận, dẫn tới khởi xướng nghiên cứu mạnh mẽ và kỹ thuật này đã được phát triển hơn nữa, cuối cùng dẫn đến việc nhân bản của động vật có vú Nghiên cứu của Gurdon đã cho thấy hạt nhân của một

tế bào trưởng thành, chuyên biệt có thể được đưa trở lại trạng thái đa năng, chưa trưởng thành Nhưng thí nghiệm của ông liên quan đến việc loại bỏ nhân tế bào, sau đó là việc đưa chúng vào các tế bào khác Liệu có thể biến một tế bào nguyên vẹn trở lại thành tế bào gốc đa năng không?

Shinya Yamanaka đã trả lời câu hỏi này trong một bước đột phá khoa học 40 năm sau phát hiện của Gurdon Năm 2006 Shinya Yamanaka đã sử dụng các vector retrovirus để biểu hiện rất nhiều yếu tố phiên mã, đơn lẻ và kết hợp, trong nguyên bào sợi (fibroblasts) của chuột trong điều kiện nuôi cấy Đáng lưu ý là ông đã phát hiện ra rằng cả tế bào người và chuột có thể được lập trình lại về trạng thái vạn

năng, được gọi là tế bào gốc vạn năng cảm ứng, tương tự như tế bào gốc phôi, sau khi xâm nhiễm (transduction) bằng retrovirus chỉ mã hóa 4 yếu tố : KLF4, SOX2, OCT4, và c-MYC [13] Ngoài ra, James Thomson báo cáo rằng tổ hợp các yếu tố khác (OCT4, SOX2, NANOG và LIN28) có khả năng tái lập trình các tế bào sinh dưỡng của con người thành iPSC [28]

Các phòng thí nghiệm trên khắp thế giới đã nhanh chóng sử dụng kỹ thuật mang tính cách mạng này và đến năm 2009, chỉ sau 3 năm khi Yamanaka tạo thành công iPSC, khoảng 300 bài báo về iPSC được xuất bản [15]

Giải Nobel về Y Sinh học năm 2012 đã vinh danh 2 nhà khoa học Gurdon và Yamanaka với công trình tạo ra iPSC Đến năm 2007, hai nhóm nghiên cứu độc lập

đã tạo ra iPSC từ nguyên bào sợi của người [28], [32] Việc phát hiện ra công nghệ

tế bào gốc vạn năng cảm ứng đã mở ra những cơ hội chưa từng có trong y học tái tạo, mô hình bệnh và khám phá thuốc [7]

Đối với mô hình bệnh, tế bào sinh dưỡng sở hữu đặc điểm của các tế bào bị bệnh từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra iPSC và được tiếp tục sử dụng để nghiên cứu các bệnh [7] Các tế bào sinh dưỡng từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra các iPSC Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này có thể được sửa chữa bằng liệu pháp gen

và tiếp tục được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng khỏe mạnh được cấy ghép cho bệnh nhân, hoặc chúng có thể được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng chưa được chỉnh sửa để mô hình hóa bệnh hoặc sàng lọc thuốc [7] Ví dụ, vào năm

2012, các tế bào gốc thần kinh được tạo ra từ những người mắc bệnh Familial dysautonomia - một rối loạn di truyền hiếm gặp, ảnh hưởng đến các dòng tế bào thần kinh, phát triển tế bào thần kinh đã được sử dụng để sàng lọc gần 7000 phân tử nhỏ và xác định phân tử nhỏ sử dụng mô hình bệnh dựa trên iPSC có thể xác định thuốc bổ trợ để can thiệp điều trị bệnh Familial dysautonomia[9] Các nghiên cứu phát triển thuốc trong đó gồm sàng lọc các phân tử nhỏ, kiểm tra độc tính để đánh giá sự an toàn, đã khai thác thành công dựa trên kỹ thuật iPSC [7] Công nghệ này đã mở ra một trang sử mới đối với các liệu pháp tế bào gốc sử dụng tế bào gốc vạn năng cảm ứng trên người (human induced pluripotent stem cell- hiPSC)

của chính bệnh nhân do tránh được nguy cơ đào thải miễn dịch cũng như các vấn

đề đạo đức đi kèm với việc sử dụng tế bào gốc phôi [45]

Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mô hình bệnh và

khám phá thuốc

Năm 2014, Nhật Bản lần đầu tiên sử dụng các tế bào biểu mô sắc tố võng mạc có nguồn gốc iPSC để điều trị thoái hóa điểm vàng [15] Năm 2019, tại Nhật Bản đã thử nghiệm liệu pháp iPSC cho chấn thương tủy sống Liệu pháp này thu tế bào đã biệt hóa từ bệnh nhân và tái lập trình chúng thành tế bào thần kinh thông qua

tế bào gốc vạn năng cảm ứng, sau đó các bác sĩ lâm sàng sẽ tiêm 2 triệu tế bào vào

vị trí tổn thương của mỗi bệnh nhân [53] Hiện tại, có một nhu cầu được công nhận

để đảm bảo an toàn cho bất kỳ liệu pháp có nguồn gốc iPSC nào và cần phải xác minh một cách có hệ thống các đặc điểm và sự an toàn của các dòng, bằng cách

kiểm tra bộ gen và biểu hiện của gen [54] Ví dụ, nghiên cứu của Bhutani và cộng

sự năm 2006 lần đầu tiên đánh giá sự an toàn của ba phương pháp tái lập trình phổ biến (retroviral vector, non-integrating Sendai virus, synthetic mRNAs) Ưu điểm quan trọng nhất của iPSC so với ESC là khả năng sử dụng tế bào sinh dưỡng trưởng thành từ những bệnh nhân mắc bệnh do di truyền xác định [23],[6] So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng

Tế bào gốc vạn năng

Tế bào gốc phôi Tế bào gốc vạn năng cảm ứng

c Tế bào gốc đa năng

Tế bào gốc đa năng (Multipotent) là những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của cơ thể Các tế bào được tạo thành nằm trong một hệ tế bào có liên quan mật thiết Ví dụ như tế bào gốc trung mô có thể biệt hóa thành tế bào xương, sụn, mỡ Các tế bào gốc đa năng có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như mô mỡ, cuống rốn, tủy xương, tủy răng sữa,…

Mặc dù có giới hạn về khả năng biệt hóa, nhưng gần đây, loại tế bào này cũng đã được y sinh học tập trung khai thác, và qua đó đã được ứng dụng rất thành công trong nhiều liệu pháp dựa vào tế bào gốc (stem cell therapy) Tế bào gốc trưởng thành có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào có chức năng khác như thế bào gan, biểu bì, xương, giác mạc Những tế bào này có thể rất hữu ích

trong việc sửa chữa mô, cơ quan bị tổn thương một cách trực tiếp cho chính bệnh nhân [1]

Các chức năng chính của tế bào gốc đa năng:

 Có mặt với số lượng nhỏ trong các mô chuyên biệt

 Chức năng chính là bổ sung các tế bào bị hư hỏng

 Vẫn hoạt động cho đến khi chúng nhận thấy tín hiệu để phân biệt thành các các loại tế bào cụ thể

d Tế bào gốc đơn năng

Tế bào gốc đơn năng còn được gọi là tế bào gốc định hướng đơn dòng hay tế bào đầu dòng (progenitor cells) là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo một dòng Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc trưởng thành trong nhiều tổ chức đã biệt hóa thành một dòng tế bào Khả năng biệt hóa theo dòng này cho phép duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo mô, thay thế các tế bào mô chết vì già cỗi bằng các tế bào phôi mới

Tóm lại, theo tiềm năng biệt hóa, tế bào gốc được phân loại thành 4 loại, và được tóm tắt tại bảng 2.1

Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa

Tên gọi Số tế bào biệt hóa Ví dụ Số kiểu tế bào

biệt hóa

Toàn năng

(Totipotent) Tất cả

Hợp tử (trứng được thụ tinh)

Tất cả những tế bào trong cơ thể Vạn năng

(Pluripotent)

Tất cả, trừ tế bào màng phôi

Những tế bào thu nhận từ lớp ICM

Những tế bào thu nhận từ ba lớp phôi

Đa năng

(Multipotent) Nhiều

Tế bào gốc tạo máu Tất cả tế bào máu Đơn năng

Tiền thân dưỡng bào (Mast cell precursor)

Dưỡng bào

2.2 Các nhân tố tái lập trình

2.2.1 OCT4

Miền protein của OCT4 được trình bày ở hình 2.4

Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4

OCT4 (yếu tố phiên mã gắn với octamer 4) còn được gọi là POU5F1, là một nhân tố phiên mã thuộc họ POU (POU trancription factor family), lớp 5, yếu tố phiên mã 1, thuộc họ protein liên kết DNA POU (Pit, Oct, Unc) OCT4 nằm trên NST số 6 ở người (6p21.33), gene dài 6.4 kbp OCT4 chứa một trình tự nhận diện octamer (8bp) được thấy trong promoter và enhancer của nhiều gen chuyên biệt và biểu hiện thường xuyên [24] OCT4 dường như chỉ biểu hiện ở các dòng tế bào vạn năng [50] OCT4 biểu hiện trong phôi chuột ở các giai đoạn phôi sớm từ 4-8 tế bào, đến khi “ngoại phôi bì” bắt đầu biệt hóa Phôi chuột đột biến OCT4 sẽ chết sau khi làm tổ bởi thiếu khối tế bào bên trong (inner cell mass - ICM) [24] và phôi này chỉ

có duy nhất một tế bào là tế bào túi phôi (trophoblast)

Tế bào gốc phôi ở chuột (mouse embryonic stem cell - mESC) bị giảm biểu hiện của OCT4 sẽ biệt hóa thành tế bào túi phôi [16] và nếu gia tăng sự biểu hiện của OCT4 trong mESC có thể làm các tế bào này biệt hóa Có thể OCT4 ức chế biệt hóa thành tế bào túi phôi và hoạt động cùng các nhân tố phiên mã khác hay các yếu

tố đồng điều hòa (co-regulator), và tỷ lệ giữa nồng độ của các nhân tố đó sẽ quyết định số phận của tế bào [1] Vai trò của OCT4 trong sự duy trì tính đa năng của tế bào gốc phôi người (human embryonic stem cell - hESC) giống với vai trò của nó trong mESC Sự phiên mã OCT4 bị hạn chế ở tế bào gốc phôi và trong tế bào vạn năng invitro Sự biểu hiện ở mức độ thấp các marker OCT4 đã được phát hiện trong nhiều dòng tế bào ngoại bì hay ngoại bì thần kinh (octoderm/neurooctoderm) cả ở invitro và invivo Thí nghiệm trên chuột loại bỏ gen OCT4 cho thấy, OCT4 giữ vai trò quyết định trong sự thiết lập tính đồng nhất của tế bào gốc vạn năng [26]

Hai tiểu phần của OCT4 được tổng hợp bằng cách cắt nối thay thế (alternative splicing) Pou5f1 mRNA Hai tiểu phần, OCT4-IA và OCT4-IB có kích thước lần lượt là 360 và 265 axit amin, trong đó có 225 axit amin tại đầu C giống hệt nhau, khác nhau về trình tự ở đầu N OCT4-IA phải đạt đến ngưỡng nhất định

để duy trì khả năng tự đổi mới và toàn năng của tế bào gốc, OCT4-IB đã được chứng minh không liên quan đến việc này Trong cơ thể, mRNA của OCT4 có măt trong các giai đoạn phôi sớm, từ noãn bào chưa được thụ tinh cho đến hình thái chưa hoàn chỉnh (uncompacted morula) OCT4 có vai trò quyết định sự phân cực của hợp tử bằng cách cùng với yếu tố phiên mã SOX2, KLF4 tạo thành phức hợp ba trên DNA điều khiển sự biểu hiện của một số gene liên quan đến phát triển phôi như YES1, FGF4, UTF1 và ZFP [24]

Cách hoạt hóa của các gen mục tiêu OCT4 và duy trì tính đa năng vẫn chưa rõ Bằng cách kết hợp với yếu tố đồng điều hòa khác, OCT4 có thể hoạt động vừa như một nhân tố hoạt hóa phiên mã, vừa như một nhân tố ức chế phiên

mã

2.2.2 SOX2

Miền protein của SOX2 được trình bày ở hình 2.5

Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2

SOX2 là thành viên họ gen SOX (box HMG liên quan đến SRY), mã hóa nhân tố phiên mã với một miền gắn DNA HMG đơn (singer high mobility group DNA-binding domain), có vị trí 3q26.33 trên nhiễm sắc thể số 3 cánh q băng 26.33, nằm ở sợi dương, kích thước gene 2513 bp và 317 axit amin [17], [30]

Giống với OCT4, SOX2 biểu hiện trong các tế bào đa năng của phôi chuột trong giai đoạn phôi sớm, ICM, ngoại phôi bì và tế bào mầm sinh dục Nhưng khác với OCT4, SOX2 cũng biểu hiện trong nhiều tế bào ngoại bì và phôi, và trong các tế bào tiền thân thần kinh, và quan trọng cho sự duy trì tính đồng nhất của chúng Sự

biểu hiện giảm của SOX2 liên quan đến quá trình biệt hóa Phôi chuột loại bỏ gen SOX2 sống bình thường ở giai đoạn phôi nang, nhưng chết nhanh sau khi phôi làm

tổ Các phôi này thiếu cấu trúc xi lanh trứng (egg cylinder) và thiếu các tế bào biểu

mô Khi nuôi cấy in vitro để thiết lập dòng gốc phôi, phôi nang loại bỏ gen SOX2 phát triển bình thường vào ngày đầu, nhưng sau đó biệt hóa thành tế bào tế bào túi phôi (trophectoderm) và tế bào nội mô vách Vai trò in vitro của SOX2 là duy trì quần thể tế bào đa năng ở giai đoạn sớm của phôi [1]

Các phôi sớm biểu hiện ở mức cao các protein SOX2 có nguồn gốc từ mẹ Ngay trong chuột loại bỏ gen SOX2, các protein SOX2 từ mẹ vẫn được duy trì cho đến giai đoạn phôi nang Do đó, nguyên nhân mà các phôi đột biến vẫn sống sót đến khi làm tổ có thể là do mức biểu hiện hiệu quả của SOX2 có nguồn gốc từ bố mẹ đến giai đoạn đó

Do vậy, có thể SOX2 không cần thiết cho sự duy trì hay tạo ra tính đa năng trong các giai đoạn phôi sớm, nhưng không thể được phát hiện trong chuột bị loại

bỏ bởi vì sự hiện diện của SOX2 có nguồn gốc từ mẹ Hơn nữa, SOX2 có vai trò trong sự suy trì của các tế bào tế bào túi phôi [1]

2.2.3 KLF4

Miền protein KLF4 được trình bày ở hình 2.6

Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4

KLF4 mã hóa một loại protein thuộc họ yếu tố phiên mã Kruppel Protein ngón tay kẽm (zinc finger protein) được mã hóa là cần thiết cho sự phát triển bình thường của chức năng bảo vệ cơ học của da, có vị trí 9q31.2, nhiễm sắc thể

số 9 cánh q băng số 31.2, có kích thước gene 5,631 bp, 513 axit amin và nằm ở sợi âm

Protein KLF4 kiểm soát quá trình chuyển đổi từ pha G1 sang pha S của chu trình tế bào sau tổn thương DNA bằng cách làm trung gian gen ức chế khối u p53 Chuột thiếu gen này có ngoại hình bình thường nhưng giảm cân nhanh chóng

và chết ngay sau khi sinh do bốc hơi chất lỏng do chức năng hàng rào biểu bì bị tổn thương [29]

KLF4 có miền kích hoạt phiên mã đầu N, tiếp theo là miền ức chế phiên mã, chứa hai gốc lysine K225 và K229 Các gốc này được acetyl hóa bởi p300/CBP, tương tác với miền kích hoạt Có một chuỗi PEST tiềm năng giữa các miền kích hoạt Đầu C có một miền liên kết DNA chứa ba ngón tay kẽm, nhận biết và liên kết với các chuỗi mục tiêu của GC/CACCC trong nhân Tín hiệu hướng nhân (Nuclear Localization Signal - NLS) (6 aa) nằm giữa các miền liên kết và ức chế DNA, tạo điều kiện cho việc vận chuyển KLF4 vào hạt nhân [14]

2.2.4 MYC

Cấu trúc miền protein của gen MYC được trình bày ở hình 2.7

Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC

Họ MYC của các yếu tố sao chép dây kéo xoắn ốc xoắn ốc cơ bản bao gồm MYC, MYCN và MYCL [21] MYC (homelocytomatosis virus oncogene homolog) đại diện cho một trong những mục tiêu thuốc được tìm kiếm nhiều nhất trong ung

thư Yếu tố phiên mã MYC là một yếu tố điều hòa thiết yếu cho sự phát triển của tế bào, nhưng trong hầu hết các bệnh ung thư, nó được biểu hiện quá mức và liên quan đến kết quả kháng trị và kháng thuốc Gen MYC dài khoảng 6 kb, được tìm thấy tại locus 8q24,21 trên nhiễm sắc thể 8 và có 439 axit amin MYC chứa ba exon – exon

1 có kích thước lớn và không được dịch mã, tiếp theo là exon mã hóa 2 và 3, bốn trình khởi động riêng biệt - P0, P1, P2 và P3 - điều khiển phiên mã MYC, hai bộ ba

mở đầu là (CTG và ATG), từ đó phát sinh hai protein MYC được biểu hiện [34]

Yếu tố phiên mã này kiểm soát sự biểu hiện của hàng trăm gen mục tiêu, nhiều trong số đó cũng là gen gây ung thư hoặc ức chế khối u và có vai trò trong sự tăng sinh tế bào và chu kỳ tế bào [9]

2.2.5 LIN28

Miền protein của LIN28 được trình bày ở hình 2.8

Hình 2.8: Cấu trúc miền protein của LIN28

LIN28 là protein liên kết với RNA có vai trò thúc đẩy tính đa năng thông qua

sự điều tiết của microRNA let-7 [25] Ở động vật có vú, có hai loại gen LIN28 là LIN28A và LIN28B Các gen LIN28A và LIN28B của con người có 209 và 250 axit amin [20] LIN28 nằm ở vị trí 1p36.11 có kích thước 18,951 bp và nằm ở sợi dương [13] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LIN28A là một yếu tố đa năng của tế bào gốc Sử dụng OCT4, SOX2, NANOG và LIN28A, các nguyên bào sợi ở người trưởng thành đã được tái lập trình lại thành công thành các tế bào gốc đa năng cảm

ứng [14] Đáng chú ý, ba trong số bốn yếu tố Yamanaka sử dụng để tái lập trình có LIN28 [22]

2.2.6 GLIS1

Miền protein của GLIS1 được trình bày ở hình 2.9

Hình 2.9: Cấu trúc miền protein của GLIS1

GLIS1 kết hợp với một số yếu tố tái lập trình khác, đã được chứng minh là làm tăng đáng kể hiệu quả của việc tạo ra các tế bào gốc vạn năng cảm ứng từ các tế bào sinh dưỡng [7] GLIS1 có vị trí 1p32.3, kích thước 231 874 bp, 620 axit amin

và nằm trên sợi âm [11] Sự biểu hiện quá mức ban đầu của OCT3/4 (POU5F1), SOX2 và KLF4 (OSK) được sử dụng rộng rãi để tái lập trình các tế bào sinh dưỡng thành iPSC Tuy nhiên, hiệu quả của việc tạo ra iPSC rất thấp, điều này được cho là

do những khó khăn trong việc vượt qua các rào cản biểu sinh trong tế bào khởi đầu

Sự biểu hiện của C-MYC làm tăng hiệu quả, nhưng cũng tăng cường khả năng gây khối u tiềm tàng của các tế bào biệt hóa có nguồn gốc iPSC GLIS1 làm tăng đáng

kể số lượng khuẩn lạc iPSC được tạo ra khi được biểu hiện với OSK (gọi là OSKG) trong nguyên bào sợi của người hoặc chuột [39] Ngược lại, giảm biểu hiện GLIS1 bằng shRNA (short hairpin RNA) làm giảm hiệu suất tạo ra các khuẩn lạc iPSC do OSK gây ra trong các nguyên bào sợi chuột, cho thấy GLIS1 nội sinh

có thể thúc đẩy quá trình tái lập trình qua trung gian OSK Hơn nữa, cấy ghép gen OSKG iPSC dưới da đã hình thành các khối u có chứa các tế bào biệt hóa từ cả ba lớp mầm Những dữ liệu này đã chứng minh rằng GLIS1 hoạt động như một công

cụ thúc đẩy mạnh mẽ việc lập trình lại tế bào sinh dưỡng Hơn nữa GLIS1 được tinh chế cùng với OCT3/4, SOX2 và KLF4 cho thấy rằng nó là một phần của phức hợp lớn hơn của các protein này [7]

Sự gia tăng hiệu quả lập trình bởi GLIS1 cũng được thể hiện bởi

Yoshioka và cộng sự khi ông sử dụng một số thí nghiệm khác nhau để tạo ra iPSC

sử dụng virus RNA viêm não ngựa ở Venezuela (Venezuelan equine encephalitis)

đã biểu hiện OCT4, SOX2, KLF4 và GLIS1 (OSKG) [42] Các nghiên cứu gần đây

đã chứng minh rằng GLIS1 biểu hiện trong một số quần thể tế bào gốc và tế bào tiền thân, cho thấy vai trò có thể có của các protein này trong việc điều hòa duy trì, biệt hóa hoặc tự đổi mới của các tế bào này [7]

2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC

Hiện nay, rất nhiều loại tế bào đã được sử dụng để tạo dòng iPSC thành công [9] Độ phổ biến dòng tế bào để tái lập trình như: tế bào đơn nhân máu ngoại

vi (Peripheral blood mononuclear cell - PBMC), nguyên bào sợi (Fibroblast), tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell), tế bào gốc tủy răng sữa (Dental pulp stem cells), tế bào gốc dây rốn (Cord blood cells), tế bào gan (hepatocytes), tế bào nước

ối (Amniotic fluid cells), tế bào mầm sinh dục (Germline stem cell)

Độ phổ biến dòng tế bào để tái lập trình tế bào gốc vạn năng cảm ứng được thể hiện tại hình 2.10

Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC

Có nhiều nguồn thu nhận tế bào gốc vạn năng cảm ứng như nguyên bào sợi, máu cuống rốn, máu ngoại vi Nguyên bào sợi là một nguồn chủ yếu để tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng với khả năng tăng sinh qua nhiều lần cấy chuyển trong nuôi cấy, và khả năng tiếp nhận hiệu quả các virus biểu hiện tổ hợp các yếu tố phiên mã cho tái lập trình [8] Tuy nhiên, nguyên bào sợi sinh thiết từ da đòi hỏi các thủ thuật xâm lấn, tốn nhiều công sức và lấy đủ số lượng tế bào để tái lập trình cần có thời

gian Ngoài ra, khả năng tạo iPSC từ da có tương quan nghịch với tuổi của người hiến tặng do khả năng gây đột biến bên ngoài lớp da [12]

Cuống rốn là một bộ phận giúp cung cấp dinh dưỡng nuôi thai nhờ sự kết nối thai nhi với nhau thai trong tử cung người mẹ Máu cuống rốn là máu được lấy từ cuống rốn và nhau thai sau khi sinh con và cắt rốn Trước đây, cuống rốn và nhau thai thường được bỏ đi sau mỗi ca sinh nở như một loại rác thải y tế Tuy nhiên, thực tế máu cuống rốn là nguồn cung cấp dồi dào tế bào gốc tạo máu Lấy máu cuống rốn được xem là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không gây đau cho cả mẹ

và bé, có thể áp dụng cho cả sinh mổ và sinh thường Trong máu cuống rốn chứa một lượng lớn tế bào gốc tạo máu có khả năng tái tạo các tế bào máu và tăng cường

hệ miễn dịch cho cơ thể

Việc tái lập trình các tế bào CD34+ trong máu cuống rốn thành các tế bào gốc vạn năng cảm ứng có các ứng dụng tiềm năng trong y học tái tạo bằng cách chuyển đổi các ngân hàng máu cuống rốn thành ngân hàng iPSC để điều trị thay thế tế bào

dị ghép [49] Tế bào CD34+ từ máu ngoại vi cũng đã tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng [49]

Một trong những dấu hiệu để nhận biết tế bào tạo máu (hematopoietic) là protein bám màng (marker) - CD34 Nhiều dòng iPSC ở người được tạo ra từ máu dây rốn đông lạnh từ tế bào CD34+ của các bệnh nhân khỏe mạnh và có thể được chuyển hướng đến biệt hóa tạo máu [52] CD34 được biểu hiện trên bề mặt tế bào tủy xương ở người từ 1-5%, máu cuống rốn là ~1% và <0,1% từ máu ngoại vi [55] Mặc dù CD34 được biểu hiện với cường độ cao ở tế bào tủy xương, nhưng việc lấy

tế bào gốc tủy xương cần thủ thuật xâm lấn gây ra những tác dụng phụ không mong muốn cho bệnh nhân, vì thế trong thí nghiệm này tôi đã sử dụng tế bào CD34 được phân lập từ máu cuống rốn

Tế bào sinh dưỡng phải được biểu hiện các gene của tế bào gốc để tạo thành iPSC Hiện nay có nhiều biện pháp khác nhau để tế bào biểu hiện những gene mong muốn như: lentivirus, excisable lentivirus, RNA, transposon, episomal vector, các phân tử nhỏ (Small molecule, ví dụ: mi RNA), Protein Lentivirus chèn vào hệ gene

của tế bào nhận vì thế iPSC rất dễ bị thay đổi kiểu nhân, và lo ngại gây ra khối u khi

sử dụng iPSC trong liệu pháp tế bào Tạo iPSC bằng protein có độ an toàn rất cao

nhưng hiệu quả lại thấp Sử dụng mRNA có tính an toàn cao nhưng cần nhiều thời

gian để thao tác và hiệu suất thành công không cao Episomal vector là một phương

pháp chuyển gene mà không chèn vào hệ gene của tế bào đích Episomal vector là

vector DNA tồn tại trong nhân tế bào và có khả năng tự tái bản độc lập với DNA

của tế bào đích [41] Các yếu tố tái lập trình có thể chuyển vào tế bào sinh dưỡng

bằng cách sử dụng episomal vector như plasmid hoặc DNA nhỏ dạng vòng

(minicircle DNA) Không như retrovirus và lentivirus, phương pháp này đơn giản

hơn, dễ tiến hành và gây biến đổi hệ gene của tế bào đích Bên cạnh đó, RNA,

transposon, các phân tử nhỏ (Small molecule) là các phương pháp tạo iPSC mà

không tác động đến hệ gene của tế bào chủ nhưng lại có những nhược điểm như:

thời gian tiến hành thí nghiệm lâu hơn, hiệu suất thấp hơn, tỉ lệ thành công không

cao, chi phí đắt [51] Chính vì thế chúng tôi đã sử dụng Episomal vector với tính an

toàn cao, giá thành rẻ, hiệu quả tốt và thời gian thao tác thí nghiệm nhanh [3] Tuy

nhiên, biểu hiện của episomal không kéo dài, nên hiệu quả tái lập trình của nó thấp

khi so sánh với minicircle DNA

Các phương pháp biểu hiện gen được trình bày ở hình 2.11

Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tế bào gốc tạo máu CD34 (80% tinh sạch) trữ đông thu từ máu cuống rốn được cung cấp bởi Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec

3.1.2 Địa điểm và thời gian

Địa điểm: Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec Time City – Hà Nội

Thời gian thực hiện: 01/01/2019 – 31/5/2019

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Nhận vector tái lập trình

- Nuôi cấy tế bào gốc tạo máu của người

- Biểu hiện hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, L-MYC, GLIS1 trên tế bào gốc tạo máu

3.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Vật liệu

3.3.1.1 Hóa chất và sinh phẩm

Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

imMediaTM Amp Blue for

lacZ+ AmpR recombinant E

coli strains

InvitrogenTM life technologies

Môi trường nuôi cấy chọn lọc

E coli

imMediaTM Amp Liquid for

AmpR recombinant E coli

strains

InvitrogenTM life technologies

Môi trường nuôi cấy tăng sinh

E coli

QiAprepR Spin Miniprep Kit QIAGEN Tinh sạch DNA

RedSafeTM Nucleic Acid iNtRON Thuốc nhuộm DNA

Tên hóa chất Hãng sản xuất Công dụng

Staining Solution Biotechnology

10X FastDigest Green Buffer Themo Scientific DNA Loading dye

GeneRuler 1kb DNA Ladder Themo Scientific Thang DNA cho điện di

technologies

Gel chạy điện di phân tích DNA

tách

nghiệm Tripan blue solution Gigma Life Science Dung dịch nhuộm để đếm tế

bào

Stem Kit Reagents Beckman coulter Xác định tỷ lệ tế bào CD34+

sau khi nuôi tăng sinh

trong chạy flow cytometry iPS Brew XF 50X

Supplement

Stem MACSTM Các thành phần dinh dưỡng bổ

sung cho môi trường nuôi cấy

iPS Brew XF Stem MACSTM Môi trường cơ bản để nuôi cấy

tế bào sau chuyển gene Nuclease Free Water Themo Scientific Nước cất không chứa nuclease

sử dụng cho sinh học phân tử

QiAprepR Spin Maxiprep Kit QIAGEN Kit tinh sạch DNA plasmid từ

vi khuẩn

Power SYBR™ Green PCR

Master Mix

Themo Scientific qRT-PCR kit sử dụng để xác

định biểu hiện của các gene tái lập trình

3.3.1.2 Thiết bị

Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Tên thiết bị Hãng sản

Tủ an toàn sinh học cấp 2 Esco, Mỹ Bảo vệ mẫu tế bào nuôi cấy khỏi các tác

nhân gây nhiễm

Tủ nuôi cấy tế bào Thermo

Scientific

Cung cấp nhiệt độ, nồng độ CO2 phù hợp cho tế bào tăng sinh

Kính hiển vi quang học Carl Zeiss Quan sát tế bào trong quá trình nuôi cấy

Bể ổ nhiệt Memmert Rã đông hoặc làm ấm mẫu và môi

trường nuôi cấy Pipet man Eppendorf Hút xả chất lỏng với thể tích xác định Máy li tâm lạnh loại nhỏ Eppendorf Tách hỗn hợp hai pha rắn - lỏng hoặc

lỏng - lỏng thành các phần riêng biệt Vortex Eppendorf Trộn đều mẫu, hóa chất thí nghiệm Máy lắc nhiệt nuôi vi

khuẩn

Thermo Scientific

Nuôi tăng sinh vi khuẩn

BD FACS Canto II: Flow

Xác định nồng độ và độ tinh sạch của nucleic acid

Máy chuyển gen 4D

X-unit

Lonza Chuyển plasmid mang gen tái lập trình

vào tế bào đích Máy li tâm lạnh loại nhỏ Beckman

Coulter

Sử dụng trong quá trình phân tách và tinh sạch DNA, RNA

Máy điện di ngang Optima Kiểm tra plasmid sau khi tinh sạch

Lò vi sóng Sharp Pha gel chứa agar sử dụng cho nuôi cấy

vi khuẩn Nồi hấp khử trùng

Tủ lạnh 40 và -200 Toshiba Bảo quản hóa chất, mẫu thí nghiệm

Tủ -800 Sanyo Bảo quản hóa chất, mẫu thí nghiệm Cân điện tử HR200 A&D Cân hóa chất có độ chính xác 0,001g trở

lên

Máy soi gel Bio rad Phát hiện DNA dưới tia UV

Máy 7500 Real time PCR

System

Thermo Scientific

Xác định các biểu hiện của các gen tái lập trình

PCR Proflex 3 block Thermo

Scientific

Tổng hợp cDNA cho phản ứng Realtime PCR

3.3.1.3.Dụng cụ vật tư tiêu hao

Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm

Micropipette loại 10μl, 20μl, 100μl,

200μl, 1000μl

Corning Hút, trộn đều dung dịch

nuôi cấy, hóa chất trong các thí nghiệm

Serological pipette 5 ml Thermo Fisher

Hút dung dịch Serological pipette 10 ml Thermo Fisher

Serological pipette 25 ml Thermo Fisher

Gạc sạch/ giấy sạch Bảo Thạch Vệ sinh dụng cụ và khu vực

thí nghiệm bằng cồn 70 Ống 5 ml chạy Flow cytometry BD Science Đựng tế bào để chạy flow

cytometry Que cấy trải vô trùng Sarstedt Cấy E coli lên đĩa thạch

cDNA Dãy ống realtime PCR 0.2 ml Bimetech Đựng phản ứng realtime

PCR

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.3.2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài

3.3.2.2 Các phương pháp sử dụng trong đề tài

3.3.2.2.1 Tế bào gốc tạo máu CD34 + trữ đông thu từ máu cuống rốn của người (CD34 + 80%)

Tế bào CD34 trữ đông thu từ máu cuống rốn của người (80% tế bào dương tính với marker tế bào gốc tạo máu CD34+ sau khi tinh sạch bằng cột) được cung cấp bởi Viện nghiên cứu tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec