Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh tạo bệnh viện c thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HÀ THỊ MINH HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TẠI BỆNH VIỆN C THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHI

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HÀ THỊ MINH HUYỀN

Tên đề tài:

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC CỦA MỘT SỐ

VI KHUẨN GÂY BỆNH TẠI BỆNH VIỆN C THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Đại học chính quy Chuyên nghành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2015-2019

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HÀ THỊ MINH HUYỀN

Tên đề tài:

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH KHÁNG THUỐC CỦA MỘT SỐ

VI KHUẨN GÂY BỆNH TẠI BỆNH VIỆN C THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Đại học chính quy Chuyên nghành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2015-2019 Giảng viên hướng dẫn : 1 TS Nguyễn Văn Duy

2 CkI.ktyh Việt Tiến Dũng

THÁI NGUYÊN, NĂM 2019

LỜI CẢM ƠN

Qua quá trình học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, được sự đồng ý của Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm em được phân công đến thực tập tại Khoa Vi

sinh - Bệnh viện C Thái Nguyên với đề tài: “Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh tạo Bệnh viện C Thái Nguyên”

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới CkI.ktyh Việt Tiến Dũng và toàn thể kỹ thuật viên làm việc tại Khoa Vi sinh – Huyết Học Bệnh viện C Thái Nguyên

đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực tập

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Duy – Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời, em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy/cô trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập

Với điều kiện thời gian có hạn cũng như kinh nghiệm và kiến thức còn hạn chế nên đề tài của em sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy/cô để em có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức phục vụ cho việc học tập, công việc sau này

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

Hà Thị Minh Huyền

DANH MỤC VÀ TỪ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Tên thuật ngữ

viết tắt Nghĩa đầy đủ của thuật ngữ

ANSORD

Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens

(Mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á)

CDC Center for Control and Prevention (Trung Tâm Kiểm Soát và

Phòng Bệnh Hoa Kỳ)

CLSI Clinnical and Laboratory standards Institude (Viện Tiêu Chuẩn

và Xét Nghiệm)

I Intermediate (Trung gian)

KIA Kligler Iron Agar

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Tỷ lệ các loại vi khuẩn gây bệnh bệnh nhân điều trị

tại Bệnh viện C Thái Nguyên 25

Bảng 4.2: Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm trùng bệnh viện theo lứa tuổi 27

Bảng 4.3: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli tại Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 29

Bảng 4.4: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus

tại Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 33

Bảng 4.5: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae

tại Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 35

Bảng 4.6: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

tại Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 37

Bảng 4.7: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

tại Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 39

Bảng 4.8: Tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii

tại Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1: Phân bố tình trạng nhiễm khuẩn theo lứa tuổi 27

Hình 4.2: Kháng sinh đồ của vi khuẩn E coli phân lập

được trên bệnh nhân Trần Văn H ngày 23/03/2019 32

Hình 4.3: Kháng sinh đồ của vi khuẩn S aureus phân lập

được trên bệnh nhân Nguyễn Hồng P ngày 14/03/2019 34

Hình 4.4: Kháng sinh đồ của vi khuẩn S pneumoniae phân lập

được trên bệnh nhân Đặng Văn Đ ngày 18/02/2019 38

Hình 4.5: Kháng sinh đồ của vi khuẩn P aeruginosa phân lập

được trên bệnh nhân Nghiêm Tuấn H ngày 19/04/2019 40

Hình 4.6: Kháng sinh đồ của vi khuẩn A baumanniiphân lập

được trên bệnh nhân Nguyễn Văn H ngày 25/02/2019 42

MỤC LỤC

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1.Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.2.1 Định nghĩa của kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh 5

2.2.1.1 Cơ chế tác động của kháng sinh 5

2.2.2 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 7

2.3 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn kháng thuốc 10

2.3.1 Lấy bệnh phẩm 11

2.3.2 Nhuộm soi 11

2.3.3 Nuôi cấy 12

2.3.4 Xác định vi khuẩn 13

2.3.5 Kháng sinh đồ 16

2.3.6 Phương pháp giữ chủng vi sinh vật 18

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 19

3.2 Nội dung nghiên cứu 19

3.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.3.1 Phương pháp phân lập, xác định vi khuẩn và lưu giữ chủng 19

3.3.2 Phương pháp: Kháng sinh đồ 23

3.4 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng 23

3.5 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 24

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả nghiên cứu tỷ lệ các loại vi khuẩn gây bệnh bệnh nhân

điều trị tại Bệnh viện C Thái Nguyên 25

4.2 Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số loại vi khuẩn phân lập

tại Bệnh viện C Thái Nguyên 28

4.2.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli 29

4.2.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus 33

4.2.3 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Streptococcus pneumoniae 35

4.2.4 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 36

4.2.5 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Klebsiella pneumonae 39

4.2.6 Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter baumannii 41

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 45

Xu hướng kháng lại các thuốc kháng sinh thường dùng, làm cho thuốc đó không còn tác dụng trên lâm sàng, không còn tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Khi đó thuốc kháng sinh đang dùng điều trị cho người bệnh không tiêu diệt được vi khuẩn gây bệnh Ngay cả khi chúng ta sử dụng kháng sinh với nồng độ cao, thời gian kéo dài Việc kháng thuốc kháng sinh là một mối hiểm họa to lớn bởi lẽ vi khuẩn gây bệnh sẽ thoải mái lộng hành, phát triển mà không còn sợ hãi trước các vũ khí của con người [36]

Tuy nhiên, cùng với sự ra đời của thuốc kháng sinh thì việc sử dụng tự phát

và lạm dụng thuốc quá mức dẫn đến một thực trạng là vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng Nhất là ở những nơi sử dụng thuốc kháng sinh nhiều và tập trung nhiều bệnh nhân như bệnh viện [15] Thực sự, các vi sinh vật kháng kháng sinh đang là mối đe dọa chung của toàn cầu

Bệnh viện C Thái Nguyên là một trong số bệnh viện trong khu vực Phía Đông Bắc Việt Nam, tập trung nhiều bệnh nhân nặng và là tuyến cuối của các bệnh viện cơ sở trong khu vực nên là nơi nghi ngờ sẽ có khả năng kháng thuốc cao Nhiễm trùng bệnh viện không chỉ làm tăng thêm số ngày nằm viện, chi phí điều trị của bệnh nhân mà còn tăng nguy cơ đa kháng thuốc, nhất là kháng sinh tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân

- Vì vậy, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn gây bệnh tạo Bệnh viện C Thái Nguyên” Nhằm mục đích đánh

giá thực trạng vi khuẩn kháng thuốc, cung cấp thông tin về tình hình gây bệnh và tình hình kháng thuốc kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh ở bệnh viện

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn chủ yếu

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp nguồn tài liệu khoa học phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy

- Đánh giá thực trạng vi khuẩn kháng thuốc ở Bệnh viện C Thái Nguyên và cung cấp thông tin về tình hình gây bệnh và tình hình kháng thuốc kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh ở bệnh viện

- Các cuộc khảo sát là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực liên quan

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Xây dựng kháng sinh đồ cho từng bệnh nhân cụ thể giúp góp phần xây dựng chế độ hóa trị liệu liên quan cho bệnh nhân, góp phần hạn chế sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngoài cộng đồng

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nhiễm trùng bệnh viện đang là mối lo ngại trên thế giới Hàng năm các thống

kê về các vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện và khả năng kháng thuốc ở trên thế giới được cập nhập và quan tâm Theo nghiên cứu của Pitt T L và cộng sự năm 2003 ở

Anh có tới 50% chủng P aeruginosa kháng Gentamycine, 39% kháng Ceftazidime,

32% kháng Piperacine và 30% kháng Ciprofloxaxin (2003) [30] Theo nghiên cứu của Pereira L.P năm 2004 đề kháng Ciprofloracine thậm chí được ghi nhận ở trẻ em và người trưởng thành trước đó chưa từng sử dụng kháng sinh Quinolon Theo Báo cáo của Pereira L.P năm 2004 tại Barbodas, Jamaica và Trinidad, họ Enterobacteriaceae kháng Cephalosporin hàng 3 [28] Theo báo cáo của WHO năm 2008 sự đề kháng của Acitrobacter với các kháng sinh khác lần lượt là Aminoglucoside khoảng 20%, Ciprofloracine (30%), Ceftazidime (70%), Piperacine/Tazobactam (50%), Cefotaxime (89%) ở châu Âu, tỷ lệ kháng cao nhất được báo cáo ở vùng Địa Trung Hải bao gồm

Hi Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ý và Nhật Bản [33] Theo báo cáo của Adjei M A năm 2010 tại

Úc (1992) và Philippin (2001) Ciprofloracine đã được báo cáo thất bại trong điều trị nhiễm khuẩn do lậu cầu khuẩn [25]

Các kháng sinh nhóm Carbapenem là kháng sinh được lựa chọn cuối cùng trong điều trị nhiễm khuẩn nhưng theo báo cáo của WHO vào năm 2010 ở Anh đã

có sự xuất hiện chủng kháng kháng sinh Carbapenem xảy ra từ năm 2000 với vi khuẩn Aciterobacter Giữa năm 2004 và năm 2008 tỷ lệ đề kháng với Meropenem

đã tăng từ 13 lên 29% [33] Theo báo cáo của CDC năm 2011 Klebsiella và E coli

đang dần kháng với Carbapenems [34] Điều này càng làm tăng mối lo ngại về tình

hình kháng kháng sinh trên thế giới

2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về kháng thuốc Theo báo cáo vào năm 2000-2001 của Song J H và cộng sự năm 2004 [32], tỷ lệ kháng Penicillin

chiếm 71,4% và Erythromycine 92,1% của Streptococcus pneumoniae (nguyên

nhân thường gặp và gây nhiễm khuẩn hô hấp tại Việt Nam) được ghi nhận là cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORD) [11] Theo báo cáo khác phân tích về thực trạng sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt Nam năm 2015 chỉ ra rằng tỷ lệ đề kháng kháng sinh được ghi nhận là tăng đột biến theo thời gian, vào năm 1990 tại

Thành phố Hồ Chí Minh mới chỉ có 8% các chủng S pneumoniae kháng với

Penicillin, đến năm 1990 - 2000, tỷ lệ này tăng 56% xu hướng tương tự tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam [11] Một nghiên cứu khác vào năm 2000 - 2001, chỉ ra rằng có tới 25% số vi khuẩn phân lập được tại bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh đề kháng với kháng sinh Cephalosporin hàng 3 Theo tổng kết của Bộ Y tế năm 2004, phần lớn những kháng sinh sử dụng thường xuyên hiện nay đã bị kháng như Ceftriaxone 70%, Ceftazidime 64%, Cipfloxacine 55% [17] Cũng theo kết quả nghiên cứu thực trạng kháng kháng sinh tại 4 bệnh viện lớn ở Hà Nội (Việt Đức, Saint Paul, Bệnh viện 108, Bệnh viện Quân Y 103 của Bùi Khắc

Hậu và cộng sự từ năm 2005-2008) [9] cho thấy P aeruginosa đề kháng có với

kháng sinh Tetracyne (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và Gentamycine (54%) Trong báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam năm 2008 - 2009 thì tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam ở mức độ cao [11] Theo nghiên cứu sự 13 kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh tại Bệnh viện

Thống Nhất của Cao Minh Nga năm 2008 [16] P aeruginosa kháng cao với các

kháng sinh thường dùng nhóm Aminoglycid trong đó, Gentamicin (chiếm 62,9%), Amikacin (chiếm 49,0%), Imipenem (chiếm 36,1%) Các nghiên cứu khác chỉ ra rằng có tới 75% các chủng Pneumococci kháng với 3 loại kháng sinh trở lên [26] Theo kết quả nghiên cứu công bố năm 2009 của Le T M [27] cho thấy 42% chủng Enterobacteriaceae kháng với Ceftazidime, 60% kháng với Gentamycine và 70% kháng với Nalidixic axit, tỷ lệ kháng cao này được ghi nhận ở người khỏe mạnh trong cộng đồng Cũng theo báo cáo năm 2011 của Lý Ngọc Kính và cộng sự [19] về tình hình kháng thuốc tại một số đơn vị điều trị

tích cực thì tỷ lệ vi khuẩn kháng Gentamycine, Tobramycine và kháng cao trên 50% với nhóm Quinolon, nhạy cảm với Vancomycine, Colistin, Carbapenem

Theo một báo cáo của Trần Thị Lan Phương và cộng sự năm 2008 S pneumoniae và Acinetobacter là 2 vi khuẩn thường gây nhiễm trùng bệnh viện

và kháng với hầu hết kháng sinh thông thường [19]

2.2 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

2.2.1 Định nghĩa của kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh

Định nghĩa kháng sinh đầu tiên ra đời: Theo Bộ Y tế năm 2015, Kháng sinh

(antibiotic) là những chất kháng khuẩn được tạo ra từ các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn…) có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [3]

Định nghĩa khác về kháng sinh là: “Kháng sinh (antibiotic) là những hợp chất ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế, hoặc tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc hiệu, bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh học ở tầm phân tử (nồng độ thấp: nồng độ điều trị nhỏ hơn nhiều lần so với liều độc với cơ thể; đặc hiệu: mỗi kháng sinh chỉ có tác dụng trên một loại vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn)” [15]

2.2.1.1 Cơ chế tác động của kháng sinh

Kháng sinh có tác động vào nhiều quá trình như ngăn cản quá trình vận chuyển thành phần tạo màng, ức chế các enzyme tổng hợp các yếu tố của màng vi khuẩn Chúng làm rối loạn quá trình nhân lên của vi khuẩn làm chúng nhân lên nhưng không có vách hoặc vách không hoàn chỉnh dễ bị tiêu diệt bởi điều kiện môi trường xung quanh Ví dụ: Kháng sinh nhóm β-lactam, Vancomycin…

 Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn

Các kháng sinh nhóm β-lactam, Fosfomycin và Vancomycin ngăn cản sinh tổng hợp lớp peptidoglycan nên không tạo được khung murein - tức là vách không được hình thành Tế bào con sinh ra không có vách, vừa không sinh sản được vừa

dễ bị tiêu diệt hoặc bị li giải, đặc biệt ở vi khuẩn Gram (+) Như vậy, những kháng sinh này có tác dụng diệt khuẩn nhưng chỉ với những tế bào đang phát triển (degenerative bactericide) [24].

 Gây rối loạn chức năng màng bào tương

Chức năng đặc biệt quan trọng của màng bào tương là thẩm thấu chọn lọc, khi bị rối loạn các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài và nước từ bên ngoài ồ ạt vào trong, dẫn tới chết, ví dụ Polymyxin B, Colistin Với cơ chế tác động này, Polymyxin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối (absolute bactericide) Tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cả tế bào ở trạng thái nghỉ - không nhân lên[24].

 Ức chế tổng hợp axit nucleotic: gồm 3 cấp độ

- Ức chế tổng hợp DNA: Ngăn cản sự sao chép của DNA tạo DNA con, ví

dụ do kháng sinh gắn vào enzym gyrase nên DNA không mở được vòng xoắn, như nhóm Quinolon [24]

- Ức chế tổng hợp RNA: Ngăn cản sinh tổng hợp RNA, ví dụ do gắn vào enzym RNA-polymerase như rifampicin [24]

- Ức chế sinh tổng hợp các chết chuyển hóa cần thiết cho tế bào: Ví dụ sinh tổng hợp acid folic một coenzym cần cho quá trình tổng hợp các purin và pyrimidin (và một số acid amin) bị ngăn cản bởi sufamid và trimethoprim Trimethoprim và sufamid tác động vào hai điểm khác nhau nhưng cùng trên chặng đường tổng hợp acid folic nên hai loại thuốc này có tác dụng hiệp đồng (synergic) [24]

Như vậy, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vị trí nhất định trong thành phần cấu tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khác nhau của

tế bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào [24]

Nếu vi khuẩn không bị li giải hoặc không bị nắm bắt (thực bào) và tiêu diệt, thì khi không còn tác động của kháng sinh (ngừng thuốc) vi khuẩn sẽ có thể hồi phục/sống trở lại (reversible) Chỉ cần 1 tế bào sống sót, với tốc độ sinh sản nhanh

chóng, sau vài giờ số lượng tế bào vi khuẩn đã không thể đếm được (ví dụ E coli

nếu 20 phút “đẻ 1 lứa” thì sau 5 giờ: từ 1 tế bào mẹ - ban đầu phát triển thành 215 tế bào và sau 10 giờ lên đến hơn 1 tỷ); sẽ nguy hiểm hơn nữa nếu tế bào sống sót đó

đề kháng kháng sinh [24]

 Ức chế tổng hợp protein

Tham gia tổng hợp protein ngoài ribosom còn có các mRNA và các tRNA Điểm tác động là ribosom 70S của vi khuẩn: Tại tiểu phần 30S ví dụ như

streptomycin (nơi RNA thông tin trượt qua), tetracylin (nơi RNA vận chuyển mang acid amin tới) hoặc tại tiểu phần 50S như Erythromycin, Cloramphenicol và kết quả

là các phân tử protein không được hình thành hoặc được tổng hợp nhưng không có hoạt tính sinh học [24]

2.2.2 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

2.2.2.1 Định nghĩa và phân loại đề kháng kháng sinh

Kháng sinh có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn nhưng trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh [7]

Kháng thuốc thật gồm kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc thu được

Kháng thuốc tự nhiên: Một số loài vi khuẩn nhất định không chịu tác dụng của một số kháng sinh nhất định, ví dụ Pseudomonas không chịu tác dụng của penicillin G hoặc tụ cầu không chịu tác dụng của colistin Những vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh ức chế sinh tổng hợp vách, ví dụ β-lactam [7]

Kháng thuốc thu được: Do một biến cố di truyền là đột biến hay nhận dược gen đề kháng mà một vi khuẩn đang từ không trở thành có gen đề kháng, tức là

đang từ nhạy cảm trở nên kháng kháng sinh [7]

2.2.2.2 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn

Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn là do đột biến gen hoặc nhận được gen kháng thuốc Đột biến kháng thuốc phát sinh trước đó khi gặp môi trường kháng sinh thì những đột biết không kháng được thuốc sẽ bị chết, còn những đột biết có trước đó rồi nó biểu hiện gen kháng lại Đột biến một bước mức độ đề kháng kháng sinh không phụ thuộc vào nồng độ thuốc kháng sinh được tiếp xúc chỉ sau một lần tiếp xúc mà tính đề kháng đã cao như Streptomycin, Lincomycin… Đột biến nhiều bước (mức độ đề kháng phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh chúng trải qua nhiều lần đột biến mới đề kháng mạnh như Penicillin, Chloramphenicol, Aminoglycoside… Tần suất xuất hiện đột biến rất nhỏ khoảng từ 10-6 đến 10-11 [18]

 Nhận gen kháng thuốc

Trong tế bào vi khuẩn có tồn tại những phân tử DNA xoắn kép dạng vòng khép kín nằm ngoài nhiễm sắc thể của vi khuẩn có khả năng tự sao chép là các plasmid Có 1

loại plasmid kháng thuốc (plasmid R) là plasmid mang một hoặc nhiều gen mã hóa cho

sự kháng với một hoặc nhiều loại kháng sinh khác nhau Chúng không chỉ có khả năng

di truyền dọc từ thế hệ này qua thế hệ khác mà còn có khả năng di truyền ngang giữa các vi khuẩn qua quá trình tiếp hợp Ngoài ra, vi khuẩn còn có các Transposon hay là các “gen nhảy” chứa 1 hoặc nhiều đoạn gen, chúng có khả năng nhảy từ plasmid vào nhiễm sắc thể hoặc từ plasmid này sang plasmid khác trong lúc vô tình là phương tiện chuyển các gen kháng thuốc [18] Trong vi sinh y học có những Transposon mang các gen đề kháng như Tn3 mang gen kháng Ampicillin, Tn5 mang gen kháng Kanamycin, Tn10 chứa gen kháng Tetraclin, Tn4 chứa gen kháng 3 kháng sinh Ampicillin, Streptomycin, Sulfamid [7]

 Cơ chế lan truyền đề kháng

Vi khuẩn mang gen đề kháng kháng sinh sẽ được di truyền dọc truyền từ thế hệ ngày qua thế hệ khác hoặc có thể truyền ngang từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác

Cơ chế lan truyền trong tế bào truyền từ phân tử DNA này sang phân tử DNA khác trong tế bào, giữa các tế bào thông qua các hình thức như tiếp hợp (là sự vận chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn đực sang cái qua tiếp xúc nhau), biến nạp (là sự vận chuyển của 1 đoạn DNA từ vi khuẩn cho nạp vào vi khuẩn nhận), tải nạp (là sự vận chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận qua phage)

để chuyển gen đề kháng từ tế bào này sang tế bào khác trong cùng một loài hoặc khác loài [13]

Trong quần thể vi sinh vật có thể chọn lọc dưới tác dụng của kháng sinh các

vi khuẩn đề kháng phát triển và thay thế những vi khuẩn nhạy cảm, trong quần thể đại sinh vật những vi khuẩn đề kháng sẽ lây lan từ người này sang người khác qua con đường trực tiếp hoặc gián tiếp [13]

 Các cơ chế kháng kháng sinh khác của vi khuẩn

a, Giảm sự tích lũy bên trong tế bào vi khuẩn

Vi khuẩn có thể làm giảm nồng độ thuốc kháng sinh bên trong tế bào bằng một trong những cơ chế sau:

+ Nhờ hệ thống bơm chủ động: Nồng độ kháng sinh trong tế bào sẽ giảm dần

do kháng thuốc được vận chuyển tích cực ra khỏi tế bào vi khuẩn (sự đề kháng của

vi khuẩn với Tetracycline, Macroline, Quinolone)

+ Làm giảm tính thấm của màng tế bào vi khuẩn như vi khuẩn làm thay đổi các kênh porin trên màng tế bào làm giảm tính thấm của màng tế bào với các kháng sinh nhóm β-lactam

+ Làm mất hệ thống vận chuyển qua màng do đó kháng sinh không lọt vào được trong tế bào vi khuẩn, sự đề kháng của vi khuẩn với nhóm Aminoglycoside [13]

b, Vi khuẩn tạo ra một số enzyme làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc hóa học của phân tử kháng sinh:

Một số vi khuẩn có khả năng đề kháng với một số kháng sinh β-lactam nhờ enzyme β-lactamase vì enzyme có khả năng thủy phân vòng β-lactam của thuốc kháng sinh

Một số vi khuẩn kháng Chloramphenicol nhờ tiết enzyme Chloramphenicol acetyltransferase, enzyme này gây hiện tượng acetyl hóa phân tử Chloramphenicol khiến chúng không còn khả năng bám vào tiểu phần 50S ribosom của vi khuẩn [13]

c, Làm thay đổi đích tác động nên kháng sinh không gắn được vào đích:

- Sự đề kháng của vi khuẩn do đột biến xảy ra ở tiểu phần β của enzyme RNA-polymerase kháng Rifampicin

- Vi khuẩn phế cầu kháng Penicillin G và tụ cầu kháng Methicillin nhờ biến đổi các phân tử protein gắn penicillin

- Vi khuẩn đề kháng nhóm Quinolone do sự đột biến gen mã hóa cho enzyme DNA gyrase trên nhiễm sắc thể vi khuẩn [13]

d, Vi khuẩn tăng tổng hợp enzyme chuyển hóa để bù năng lượng enzyme đã

Vi khuẩn đề kháng với Sulfonamide một số vi khuẩn không cần sử dụng

PAPA tự tổng hợp nữa mà chúng sử dụng PAPA sẵn có trong môi trường [13] 2.2.2.3 Các biện pháp hạn chế sự gia tăng kháng kháng sinh

Các biện pháp hạn chế sự gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh gồm:

- Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh nhiễm khuẩn (những kháng sinh kháng khuẩn không có tác dụng với virus)

- Chọn kháng sinh theo kết quả kháng sinh đồ: Nên ưu tiên kháng sinh có phổ hẹp, tác dụng đặc hiệu trên vi khuẩn gây bệnh và khuếch tán tốt nhất đến ổ vi khuẩn

- Dùng kháng sinh đủ liều lượng và thời gian (cho một đợt điều trị)

- Đề cao các biện pháp khử trùng và tiệt trùng, ngăn ngừa sự lan truyền vi khuẩn đề kháng

- Liên tục giám sát sự kháng kháng sinh của vi khuẩn để có chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý

2.3 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn kháng thuốc

Để phát hiện vi khuẩn kháng thuốc có nhiều phương pháp khác nhau Trong

đó phổ biến là phương pháp sinh học phân tử và kháng sinh đồ Trong phương pháp sinh học phân tử, các kỹ thuật thường dùng là PCR, multiplex PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp được Kary Mullis phát minh năm 1980 là quá trình nhân một đoạn DNA lặp đi lặp lại nhiều lần Nếu ta có mồi phát hiện gene kháng thuốc phù hợp với đoạn DNA kháng thuốc trong vi khuẩn đó qua phản ứng PCR sẽ nhanh chóng phát hiện vi khuẩn kháng thuốc hay không Phương pháp này thực hiện nhanh chóng trong một ngày sẽ có kết quả Multiplex PCR là hình thức cải biên của PCR sử dụng nhiều mồi để phát hiện cùng lúc với nhiều mẫu Tuy nhiên, việc chạy phản ứng PCR rất tốn kém và không thể chọn ra được kháng sinh phù hợp nhất với từng bệnh nhân cụ thể mà trong khi phương pháp kháng sinh đồ có thể làm được điều

Kháng sinh đồ là phương pháp phổ biến được dùng ở các bệnh viện, để chọn được kháng sinh, nồng độ kháng sinh phù hợp với từng bệnh nhân đang điều trị Tuy nhiên phương pháp này tốn thời gian Để thực hiện kháng sinh đồ cần phân lập

được vi khuẩn có trong bệnh phẩm Phân lập là quá trình tách riêng một loại vi khuẩn gây bệnh trong số nhiều vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm Để phân lập được vi khuẩn cần trải qua các bước sau:

2.3.1 Lấy bệnh phẩm

Bệnh phẩm là những chất có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ người bệnh Bệnh phẩm có thể là phân (trong nhiễm khuẩn đường ruột), có thể là máu (trong nhiễm trùng máu), các chất dịch (dịch não tủy, dịch khớp gối, dịch màng bụng, dịch màng phổi), hoặc các chất dịch ở các hốc tự nhiên (dịch họng, dịch âm đạo) Để lấy bệnh phẩm đúng kỹ thuật, phải đảm bảo nguyên tắc sau:

- Đúng vị trí: Lấy ở nơi đang có biểu hiện bệnh lý, trong các viêm nhiễm thì nên lấy ở ranh giới giữa nơi lành và nơi tổn thương

- Đúng thời gian: Lấy đúng lúc bệnh phẩm có nhiều vi khuẩn hoặc chưa dùng kháng sinh

- Phải vô khuẩn: Không để vi khuẩn nhiễm từ bên ngoài nhiễm vào bệnh phẩm làm cho sai kết quả và không gây nhiễm khuẩn thêm cho bệnh nhân

Bệnh phẩm lấy xong phải ghi đầy đủ họ tên người bệnh, khoa, tuổi, phòng điều trị… đóng gói đúng quy cách gửi về phòng xét nghiệm Bệnh phẩm cần được chuyển và làm xét nghiệm ngay, nếu chưa có điều kiện phải giữ chúng trong môi trường có dung dịch bảo quản và ở nhiệt độ thích hợp để đảm bảo giữ vi khuẩn còn sống [7]

2.3.2 Nhuộm soi

Đây là phương pháp sơ bộ và đánh giá sự có mặt của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, biết được hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn có thể định hướng cho nuôi cấy, phương pháp này vừa nhanh, vừa đơn giản, ít tốn kém [7]

Phổ biến hơn cả là phương pháp nhuộm gram được phát minh do nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 - 1938) nhằm phân biệt thành vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) dựa trên cấu trúc thành tế bào

Nguyên lý: Vi khuẩn Gram (+) có thành tế bào dày do nó có nhiều lớp peptidoglucan chất này có khả năng giữ phức hệ tím tinh thể-iot và bắt màu tím khi

nhuộm trong khi đó vi khuẩn Gram Âm lại có lớp peptidoglucan mỏng hơn sẽ giữ màu hồng của fuchsin

Sau khi nhuộm với tím Gentian, các tinh thể màu tím bám vào trong lớp peptidoglucan và được cố định bởi logul phức hợp tím tinh thể-iot sẽ bám chặt vào thành peptidoglycan sau khi dùng cồn tẩy nếu là vi khuẩn Gram (+) thì sẽ có màu tím vì hỗn hợp khử màu làm mất nước làm giảm khoảng trống giữa các phân tử nên các tím tinh thể vẫn bám vào lớp peptidoglucan nên khi nhuộm với màu của fuchsin

sẽ không có vị trí để fuchsin bám vào lớp peptidoglucan Ngược lại, vi khuẩn Gram (-) khi tẩy cồn do chúng có lớp peptidoglucan rất mỏng dù tím tinh thể bám vào thì dưới tác dụng của cồn sẽ bị tẩy dưới tác dụng của cồn tạo nên các khoảng trống để fuchsin bám vào [7]

2.3.3 Nuôi cấy

Vi khuẩn phát triển khác nhau trong một số môi trường khác nhau Nếu nuôi

vi khuẩn trong môi trường lỏng thì vi khuẩn nào phát triển sẽ làm đục môi trường, còn nuôi chúng trong môi trường đặc thì sẽ mọc các khuẩn lạc Khuẩn lạc là tập hợp của 1 quần thể vi khuẩn duy nhất phát triển từ một vi khuẩn ban đầu Quan sát hình thái khuẩn lạc về màu sắc, kích thước… có thể nhận biết sơ bộ về vi khuẩn Có 3 loại khuẩn chính: Khuẩn lạc R, S và M Để nuôi cấy bệnh phẩm, thường nuôi cấy trên môi trường phân lập môi trường này ngoài các chất dinh dưỡng cần thiết còn có một số chất khác có tác dụng ức chế hoặc kích thích chọn lọc các vi khuẩn khác nhau phát triển [7]

Ví dụ: Bệnh phẩm là phân thì nuôi cấy trên môi trường DCL (Dezoxicolat Xitrat Lactoza) đây là môi trường ức chế cầu khuẩn phát triển vì môi trường có

thành phần Xitrat Sau khi cấy phân và cất tủ ấm 370C, 24h thì E coli có khuẩn lạc

màu hồng, samolella, shigella có khuẩn lạc màu trắng

Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch máu thì quan sát có vòng tan huyết không vì có các vi khuẩn có khả năng gây tan huyết Tan huyết là khả năng có thể sản xuất enzyme phá hủy hồng cầu gây tan máu Có 3 dạng tan huyết là tan huyết α (Vòng tan huyết không hoàn toàn), β (Tan huyết hoàn toàn) và γ (Xung

quanh khuẩn lạc không tìm thấy vòng tan máu, hồng cầu trong thạch vẫn giữ nguyên màu hồng nhạt) Phế cầu thường có tan huyết α hoặc β màu xanh, liên cầu nhóm D thường có tan huyết γ [7]

2.3.4 Xác định vi khuẩn

Phương pháp thường sử dụng để xác định vi khuẩn là dựa vào xác định tính chất hóa học của vi khuẩn đó Hiện nay, người ta đã sản xuất ra các bộ xác định đồng thời các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn như bộ chạy đường API 20E hoặc 20NE của hãng Biomerieux, xác định 20 tính chất của vi khuẩn sau đó có máy đọc tự động để xác định tên vi khuẩn Nhưng việc sử dụng chúng rất tốn kém nên ít

sử dụng hơn và chỉ sử dụng đối với các trực khuẩn đường ruột xác định thử oxyda

âm hoặc dương Người ta thường dựa vào các tính chất chuyển hóa glucid và chuyển hóa đường để xác định vi khuẩn

Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) là môi trường tổng hợp gồm có hai loại đường là lactose và glucose, trong đó tỷ lệ giữa lactose và glucose là 10/1 và chất chỉ thị

pH phenol đỏ Nuôi cấy vi khuẩn và môi trường để ở nhiệt độ 37oC trong 24h nếu vi khuẩn có màu đỏ sang màu vàng ở phần chân ống thạch thì vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose mà không lên men đường lactose Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose thì toàn bộ môi trường chuyển sang màu vàng [15]

Hình 2.1 Thử nghiệm khả năng lên mên đường trên môi trường KIA [8]

Ghi chú: 1: Đối chứng âm, 2: Môi trường KIA dương tính

Môi trường Manit là môi trường có chứa đường manit Nuôi cấy vi khuẩn và môi trường để ở nhiệt độ 37oC trong 24h nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng manit thì môi trường sẽ chuyển từ màu đỏ đậm sang màu vàng Môi trường có màu đỏ đậm thạch bằng nên khi cấy dùng que thẳng chọc vào giữa ống [15]

+ Các tính chất khác trong quá trình len men đường

Phản ứng Red Methyl (RM): Một số loài vi khuẩn có khả năng sản sinh ra các axit (Lactic, acetic, formic…) từ glucose qua con đường lên men nhất là các vi khuẩn đường ruột Chúng sản sinh đủ một lượng axit để môi trường nuôi cấy luôn giữ ở pH ≤ 4,4 Sử dụng các môi trường lỏng như Clark – lubs để nuôi cấy vi khuẩn

để 24-48h và nhỏ 2-3 giọt RM là ta có thể phát hiện ra chúng [15]

Phản ứng Voges-Proskauer (VP): một số vi khuẩn trong quá trình lên men đường có khả năng tạo ra chất trung gian là acethyl-methyl-carbinol (Acetone) Có thể phát hiện chất này dựa trên sự biến đổi của Acetoin thành diacetyl qua tác dụng của KOH và O2 trong không khí Sau đó diacetyl bị biến đổi thành một phức chất màu đỏ dưới sự xúc tác của α-naphthol và creatin Để phát hiện khả năng này ta nuôi vi khuẩn trong môi trường Clack-lubs để 24-48h nhỏ dung dịch thử VP nếu phản ứng dương thì môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang màu đỏ [15]

+ Khả năng sử dụng citrat

Môi trường Xitrat Simmons là môi trường thạch nghiêng có màu xanh lá cây Môi trường có chứa Natri citrate là một muối của axit citric, là phân tử chứa một anion cũng là một nguồn carbon duy nhất và môi trường còn có (NH4)H2PO4 chứa nguồn nitro duy nhất Nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng citrat thì sẽ khử được nitro

từ muối amoni với sản phẩm tạo thành amnion hydroid (NH4OH) làm kiềm hóa môi trường, do đó sẽ làm chất chỉ thị xanh bromthymol trong môi trường chuyển thành màu xanh nước biển [15]

+ Khả năng sinh H2S

Một số loài vi khuẩn có khả năng giải phóng sulfua từ các axit amin hoặc hợp chất khác chứa lưu huỳnh ở dạng H2S Nếu có H2S sinh ra thì môi trường sẽ xuất hiện màu đen do tạo thành các muối sulfua (FeS hoặc PbS) [15]

+ Khả năng di động

Có những vi khuẩn có lông, chúng có thể phát hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch mềm (thạch bằng có màu trắng) Nếu vi khuẩn có khả năng di động thì chúng mọc lan xung quanh đường cấy và có thể lan cả bề mặt môi trường [15] + Xác định men catalase

Có những vi khuẩn có lông, chúng có thể phát hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch mềm (thạch bằng có màu trắng) Nếu vi khuẩn có khả năng di động thì chúng mọc lan xung quanh đường cấy và có thể lan cả bề mặt môi trường [15]

+ Xác định men catalase Ngoại trừ tụ cầu phần lớn vi khuẩn kỵ khí và vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện có chứa enzyme catalase Đây là một enzyme thủy phân hydro peroxyd (H2O2) Để phát hiện khả năng này có thể thực hiện trên phiến kính hoặc trong ống nghiệm bằng cách nhỏ một giọt H2O2 nghiền vi khuẩn lên nếu có hiện tượng sủi bọt thì phản ứng dương tính [15]

+ Oxydase

Các vi khuẩn hiếu khí luôn có oxidase để phát hiện tính chất này ta nhỏ một giọt dung dịch dimetylparaphenylendiamin lên một miếng giấy lọc rồi lấy một khuẩn lạc của vi khuẩn để lên miếng giấy ẩm nếu phản ứng dương tính thì miếng giấy có màu hồng tím [15]

+ Ngưng kết với kháng thể đặc hiệu

Là sự kết hợp giữa kháng nguyên hữu hình và kháng thể tạo thành phức kháng nguyên kháng thể dưới dạng những hạt có thể quan sát bằng mắt thường hay kính lúp gồm có ngưng kết chủ động và ngưng kết thụ động Phản ứng ngưng kết chủ động phổ biến hơn kháng nguyên nằm ngay trên bề mặt tế bào vi khuẩn trộn vi khuẩn với kháng thể tương ứng trên phiến kính và quan sát Phương pháp này đơn giản và hay thực hiện nhiều ở các phòng thí nghiệm vi sinh Ví dụ: Phản ứng WeilFelix chuẩn đoán Rickettsia giám định Salmonella bằng huyết thanh miễn dịch đặc hiệu kháng Oxy và kháng Hydro [18]

có thể thử với nhiều kháng sinh cùng một lúc chỉ trong 1-2 đĩa thạch nên ít tốn kém hơn, cũng nhanh có kết quả nên được sử dụng phổ biến trong bệnh viện để định tính khả năng kháng thuốc của vi khuẩn WHO khuyến cáo thực hiện phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên bề mặt thạch và so sánh đường kính theo tiêu chuẩn CLSI trên các bệnh viện trên thế giới để cùng nhau so sánh về tình hình kháng kháng sinh của các nước trên thế giới để đưa ra các khuyến cáo đồng thời [4]

Kỹ thuật phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch Mueller-Hinton thực hiện theo kỹ thuật của Kibry-Barer Mỗi khoanh giấy thấm một loại kháng sinh với một hàm lượng nhất định

Nguyên lý: Kháng sinh được thấm vào những khoanh giấy tròn với nồng độ nhất định và được đặt tại một điểm trên mặt đĩa thạch Từ khoanh giấy, kháng sinh khuếch tán dần ra xung quanh, càng xa nơi đặt khoanh giấy nồng độ kháng sinh càng thấp và ngược lại nơi càng gần khoanh kháng sinh nồng độ kháng sinh càng cao

Nơi có kháng sinh, vi khuẩn không phát triển được gọi là vùng ức chế Đường kính vùng ức chế lớn, thì chứng tỏ vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh đó Ngược lại, đường kính vùng nhỏ hoặc không có vùng ức chế chứng tỏ vi khuẩn đề kháng kháng sinh này Sau khi có đường kính vùng ức chế ta đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh theo mức độ (S), (I) và (R) theo tiêu chuẩn CLSI (Clinnical and Laboratory standards Institude) Mỗi năm CLSI sẽ cập nhập bảng đường kính mới nhất để đánh giá chính xác độ nhạy cảm với kháng sinh

Đường kính giới hạn của khoanh kháng sinh SIR: Sensitivity – Interdiata – Resance Nhóm kháng

CLA Clarithromycin 14-16

RO, RD, RP Rifampicin 17-19 5-nito-imdazol MZ Metroxondazle 15-17

vi khuẩn kháng thuốc [35]

2.3.6 Phương pháp giữ chủng vi sinh vật

Có nhiều phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật như: Bảo quản trong môi trường thạch bằng, định kỳ kiểm tra cấy truyền, giữ giống trong cát hoặc trong đất sét vô trùng, bảo quản bằng phương pháp lạnh đông, giữ giống bằng phương pháp đông khô Trong đó, ở hầu hết các bệnh viện đều chọn bảo quản bằng phương pháp lạnh đông trong tủ âm sâu vì quy trình đơn giản, nhanh, bảo quản được lâu

Nguyên lý: Ở nhiệt độ lạnh sâu -19°C đến -80°C nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt, tế bào vi sinh vật bị ức chế không tăng sinh Tuy nhiên tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu do tích lũy chất điện giải trong quá trình bảo quản hình thành nước trong tế bào bổ sung chất dung dịch bảo vệ như glycerol 15%, DMSO…

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Một số vi khuẩn gây bệnh phân lập trên mẫu bệnh

phẩm của bệnh nhân đang được điều trị tại Bệnh viện C Thái Nguyên

- Phạm vi nghiên cứu: Trên các bệnh nhân được điều trị tại Bệnh viện C

Thái Nguyên

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu tỷ lệ các loại vi khuẩn gây bệnh trên các bệnh

nhân điều trị tại Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019

- Nội dung 2: Khảo sát tình hình kháng thuốc của một số loại vi khuẩn chủ

yếu tại Bệnh viện C Thái Nguyên từ 01/01/2019 đến 30/5/2019

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân lập, xác định vi khuẩn và lưu giữ chủng

3.3.1.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

Hình 3.1: Chai chứa môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật

nhiễm trùng trong máu của hãng BacT/ALERT

Bệnh phẩm có thể do các khoa phòng nội trú mang đến và đạt yêu cầu về vô trùng hoặc lấy bệnh phẩm tại khoa vi sinh Bệnh phẩm phải đảm bảo lấy đúng vị trí, đúng thời gian và vô khuẩn [7]

Đối với bệnh phẩm là phân, nước tiểu, đờm phải lấy bằng ống có tăm bông

vô khuẩn Nước tiểu đảm bảo thể tích > 0,5ml [7]

Đối với bệnh phẩm là mủ do các khoa phòng mang đến thường là sau mổ nên lấy bằng bơm tiêm vô trùng mang nhanh nhất đến khoa để cấy Đối với bệnh phẩm là máu thì có các chai cấy máu có chứa môi trường dinh dưỡng để vi khuẩn trong máu sống, lấy 3 – 5 ml máu bệnh nhân bơm vào trong chai [7]

3.3.1.2 Quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi

Quan sát bằng kính hiển vi cho phép nhìn hình dạng, khả năng bắt màu của

vi khuẩn Có thể là làm tiêu bản soi tươi để phát hiện khả năng di động của vi khuẩn, sự có mặt của nấm, trùng roi gây bênh hoặc chúng ta nhuộm tiêu bản để xem hình thái của vi khuẩn

- Soi tươi: Để phát hiện khả năng di động của vi khuẩn [20]

+ Tiêu bản giọt ép: Dùng que cấy hoặc ống hút lấy bệnh phẩm lỏng hoặc canh khuẩn, rồi nhỏ một giọt lên lam kính còn các bệnh phẩm đặc thì nhỏ 1 giọt NaCl 0,9% vô khuẩn lên lam kính và hòa đều vào giọt NaCl 0,9%

+ Đặt lá kính lên giọt canh khuẩn thật nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí

+ Soi kính hiển vi với vật kính X10, vật kính X40

- Nhuộm:

+ Làm tiêu bản bằng cách dùng que cấy bệnh phẩm (hoặc canh khuẩn) dàn mỏng lên phiến kính theo đường xoắn ốc đường kính 1cm để khô tự nhiên hoặc cho vào tủ ấm 37°C sau đó cố định tiêu bản bằng nhiệt, hóa chất, hoặc phối hợp

+ Kỹ thuật nhuộm Gram [20] là phương pháp phổ biến dùng ở các trường học, bệnh viện,… để phân loại vi khuẩn thành vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+) Cách tiến hành:

- Nhỏ dung dịch tím Gentian lên tiêu bản cố định để 1 phút, rửa nước

- Nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản, để 30s, rửa nước

- Tẩy màu bằng nhỏ cồn tuyệt đối lên tiêu bản quan sát phiến kính khi nào thấy màu tím trên đồ phiến vừa phai hết, rửa nước ngay

- Nhỏ dung dịch Fuchsin (hoặc Safranin) lên tiêu bản để 1 phút rửa nước kỹ

- Để khô tiêu bản, soi kính hiển vi với vật kính dầu X100

- Quan sát nếu các vi khuẩn bắt màu tìm thì đó là vi khuẩn Gram (+), các vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram (-) [20]

- Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng: Môi trường thông dụng nhất là canh thang dùng que cấy hoặc pipet Pasteur cho bệnh phẩm vào canh thang Đem ủ

ở nhiệt dộ thích hợp 37°C trong 18 - 24 giờ Vi khuẩn có thể phát triển làm đục môi trường hoặc tạo váng trên bề mặt nước

- Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc: Thông dụng nhất là môi trường thạch dinh dưỡng ở trên bề mặt môi trường mọc khuẩn lạc có thể quan sát bằng mắt thường Dựa vào màu sắc, hình thái, kích thước khuẩn lạc có thể giúp định danh sơ

bộ về vi khuẩn đó Pha môi trường có bổ sung 8 – 12 % agar đổ ra ống thạch nghiêng hoặc đĩa peptri hút dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch cấy trải đều Để vào tủ

ấm 37°C quan sát sự mọc của khuẩn lạc [20]

3.3.1.4 Xác định vi khuẩn

- Khảo sát những tính chất sinh hóa

+ Giám định vi khuẩn bằng môi trường đường: Các loại đường như glucose, lactose, mantose… Chia vào ống nghiệm, khử trùng, cấy vi khuẩn lên và quan sát tùy tùng loại vi khuẩn có khả năng mọc thành màu khác nhau ở môi trường có đường và chỉ thị khác nhau Có các môi trường như KIA chứa đường lactose, glucose, môi trường manit chứa đường mantose… Cấy vi khuẩn vào môi trường để

tủ ấm 37°C qua đêm, quan sát màu sắc của thạch

+ Giám định vi khuẩn bằng phản ứng VP (Voges-Proskauer): cấy vi khuẩn vào môi trường lỏng như Clack-bus để tủ ấm 37°C từ 2 - 4 ngày sau đó nhỏ dung

dịch thử vào nếu màu đỏ hồng là dương tính [20]

3.3.1.5 Ngưng kết với kháng nguyên đặc hiệu

- Ngưng kết chủ động: Kháng nguyên nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn, trong

vi khuẩn với kháng thể tương ứng sẽ có hiện tượng ngưng kết

- Ngưng kết thụ động: Kháng nguyên hòa tan hoặc kháng thể được gắn trên nền mượn (hồng cầu, hạt chất dẻo hoặc tế bào vi khuẩn) khi gặp kháng thể hoặc kháng nguyên tương ứng thì sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết

- Ngưng kết kháng nguyên là phương pháp ít sử dụng với các vi khuẩn khác nhau thì có phương pháp khác nhau để xác định đối với các trường hợp mà nuôi cấy, chạy đường mà không cho kết quả mong muốn, còn nghi ngờ thì sẽ ngưng kết

Ví dụ: Vi khuẩn đường ruột để kiểm tra có phải là Samonella thì sử dụng ngưng kết kháng nguyên

3.3.1.6 Phương pháp bảo quản mẫu

Sau khi phân lập, xác định vi khuẩn và làm kháng sinh đồ tìm được một chủng thuần nhất thường sẽ giữ chủng để kiểm tra lại hoặc phục vụ cho nghiên cứu sau đó Ở bệnh viện thường sử dụng phương pháp lạnh đông bảo quản trong tủ âm sâu ở -80°C

- Toàn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngoài tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng

- Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3°C/phút để đạt tới nhiệt độ -30°C ban đầu Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp

với tốc độ cao hơn 10-15°C/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (100°C đến -80°C)

- Hoạt hoá mẫu: Mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thông thường đưa ngay vào tủ ấm 37°C trong 40-60 giây) Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau

10 năm bảo quản [15]

+ Đặt khoanh giấy cấy kháng sinh: Có thể dùng kim tiêm hoặc pank đầu nhọn vô trùng đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch cho mép các khoanh giấy áp sát mặt thạch (mỗi khoanh giấy cách thành đĩa >1cm và khoang giấy cách nhau > 2 cm), để ở nhiệt độ phòng 20 phút

+ Ủ đĩa kháng sinh đồ ở 37°C qua đêm (18- 20 giờ)

+ Đánh giá độ nhạy của kháng sinh theo mức độ (S), (I) và (R) theo tiêu chuẩn CLSI đo đường kính vùng ức chế từ sau mặt đĩa thạch bằng thước đo tính bằng mm So sánh đường kính vùng ức chế đo được với bảng “Giới hạn đường kính vùng ức chế” cho từng loại kháng sinh để phân loại mức độ nhạy cảm của vi khuẩn thành: S (Suceptible = nhạy cảm), I (Intermediate = trung gian), R (Resistant = đề kháng) [20]

3.4 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng

- Dụng cụ: Đĩa peptri, kính hiển vi, lam kính, phiến kính, đèn cồn, ống

nghiệm, que cấy, tăm bông…

- Hóa chất:

+ Thuốc nhuộm gram (tím tinh thể, cồn 1000, nước rửa, thuốc Fuchsin (hoặc Safranin)

+ Các loại kháng sinh

+ Nước muối sinh lý

+ Chỉ thị màu như phenol đỏ, xanh metylen

+ Các thuốc nhuộm gram: tím tinh thể

+ Các hóa chất làm môi trường như: agar, đường đa lượng, vi lượng, khoanh giấy kháng sinh…

- Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy, cân phân tích, máy hấp vô trùng, máy cấy máu, tủ

lạnh…

3.5 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng Vi sinh, Bệnh viện C Thái Nguyên

- Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 01/01/2019 đến ngày 30/05/2019