KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRỨNG CÁ Propionibacterium acnes CỦA CAO CHIẾT MỘT SỐ CÂY TRONG CHI DÂM BỤT (Hibiscus L.) TRỒNG PHỔ BIẾN Ở CẦN THƠ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC MÃ SỐ: 52720401 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRỨNG CÁ Propionibacterium ac

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC

MÃ SỐ: 52720401

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN

GÂY BỆNH TRỨNG CÁ Propionibacterium acnes

CỦA CAO CHIẾT MỘT SỐ CÂY TRONG CHI

DÂM BỤT (Hibiscus L.) TRỒNG PHỔ BIẾN Ở

CẦN THƠ

MSSV: 12D720401172 LỚP: ĐẠI HỌC DƯỢC 7B

Cần Thơ, 2017

Đặc biệt, để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin gửi lời tri ân chân thành đến cô Dương Thị Bích, người đã tận tình hướng dẫn em tìm tòi những tư liệu quý giá, chiêm nghiệm được những bài học, kinh nghiệm để hoàn thành tốt khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn Phạm Thị Tường Vy đã cung cấp mẫu vi khuẩn cho đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân yêu luôn bên cạnh động viên, khuyến khích em trong quá trình thực hiện khóa luận và hoàn thành chương trình học tập

Do trình độ nghiên cứu và thời gian có hạn, khóa luận này chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Rất mong được sự góp ý và chỉ dẫn tận tình của quý thầy cô

Cuối lời, em xin gửi lời chúc sức khỏe, chúc mọi điều tốt lành nhất đến cha mẹ, thầy cô, anh chị và những người bạn tốt

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 02 tháng 7 năm 2017

Trần Ngọc Trân

CAM KẾT KẾT QUẢ

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân em Các số liệu, kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ khóa luận nào trước đây

Cần Thơ, ngày 02 tháng 7 năm 2017

Tác giả khóa luận

Trần Ngọc Trân

TÓM TẮT

Tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Propionibacterium acnes ngày

càng trở thành vấn đề gây khó khăn trong việc điều trị bệnh trứng cá, một căn bệnh phổ biến ở lứa tuổi thanh thiếu niên Chính vì vậy, đề tài được thực hiện với mục tiêu

cụ thể là đánh giá và so sánh khả năng ức chế dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes phân lập của chín loại cao chiết từ các bộ phận của cây Bụt giấm (Hibiscus sabdariffa Linn.), cây Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis Linn.) và cây Phù dung (Hibiscus mutabilis Linn.) được trồng phổ biến ở Cần Thơ Kết quả khảo sát khả năng ức chế dòng vi khuẩn P acnes bằng phương pháp pha loãng trong môi trường thạch cho thấy tổng số bảy loại cao cho khả năng ức chế dòng vi khuẩn P acnes phân lập với bề dày

vòng vô khuẩn từ 0,33 ± 0,58 đến 9 mm Trong đó, cao chiết từ hoa Bụt giấm cho thấy

khả năng ức chế mạnh nhất với dòng vi khuẩn P acnes phân lập với đường kính vòng

vô khuẩn đạt 2,67 ± 1,15 mm ở nồng độ 50 mg/ml, 4,00 ± 1 mm ở nồng độ 100 mg/ml

và 9 mm ở nồng độ 200 mg/ml và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đạt 0,6 mg/ml Từ kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ hoa Bụt giấm là một nguồn nguyên liệu tiềm năng cho những nghiên cứu xa hơn trong điều trị bệnh trứng cá

Từ khóa: Bệnh trứng cá, Hibiscus L., Propionibacterium acnes, tính kháng

khuẩn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

CAM KẾT KẾT QUẢ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ 3

2.1.1 Phân loại bệnh trứng cá 3

2.1.2 Nguyên nhân gây bệnh trứng cá 5

2.1.3 Phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay 6

2.2 VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES 7

2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Propionibacterium acnes 7

2.2.2 Phân loại vi khuẩn Propionibacterium acnes 8

2.2.3 Cơ chế gây bệnh trứng cá của vi khuẩn Propionibacterium acnes 9

2.2.4 Tình trạng đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn Propionibacterium acnes 10

2.3 TỔNG QUAN VỀ CHI DÂM BỤT (HIBISCUS L.) 11

2.3.1 Tổng quan về cây Bụt giấm (Hibiscus sabdariffa Linn.) 11

2.3.2 Tổng quan về cây Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis Linn.) 13

2.3.3 Tổng quan về cây Phù dung (Hibiscus mutabilis Linn.) 15

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SÍNH HỌC CỦA CHI DÂM BỤT 17

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 19

3.1.1 Nguyên vật liệu 19

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 19

3.1.3 Hóa chất và môi trường 19

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.2.1 Thiết kế nghiên cứu 21

3.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu 21

3.2.3 Nội dung nghiên cứu 21

3.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 31

3.2.5 Sơ đồ nghiên cứu 31

3.2.6 Biện pháp khắc phục sai số 31

3.2.7 Vấn đề y đức 32

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 KẾT QUẢ 33

4.1.1 Chiết xuất 33

4.1.2 Nuôi cấy và nhận diện dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes 34

4.1.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học 37

4.1.4 Khảo sát khả năng ức chế dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes phân lập của cao chiết 38

4.1.5 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tương đối của cao chiết ethanol từ hoa Bụt giấm trên dòng vi khuẩn P acnes phân lập 41

4.2 THẢO LUẬN 42

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47

5.1 KẾT LUẬN 47

5.2 ĐỀ XUẤT 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 2

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Sản phẩm ngoại bào của P acnes 9

Bảng 2.2: Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P acnes 10

Bảng 2.3: Hoạt tính sinh học của chi Dâm bụt 18

Bảng 3.1: Công thức môi trường TYEG 20

Bảng 3.2: Công thức môi trường thử khả năng làm dịch hóa gelatin 21

Bảng 3.3: Công thức môi trường thử khả năng phản nitrat hóa 21

Bảng 3.4: Định tính alkaloid 27

Bảng 4.1: Hiệu suất chiết cao toàn phần bằng phương pháp đun hồi lưu 33

Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng vi khuẩn phân lập 37

Bảng 4.3: Thành phần hóa học có trong dịch chiết từ các bộ phận dùng nghiên cứu 37

Bảng 4.4: Khả năng ức chế dòng vi khuẩn P acnes phân lập của cao chiết 38

Bảng 4.5: Khả năng ức chế dòng vi khuẩn P acnes phân lập của cao chiết ethanol từ hoa Bụt giấm 41

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Mặt bệnh nhân bệnh trứng cá 3

Hình 2.2 Nang tuyến bã nhờn 6

Hình 2.3 Vi khuẩn Propionibacterium acnes 8

Hình 2.4 Cây Bụt giấm – Hibiscus sabdariffa Linn 12

Hình 2.5 Cây Dâm bụt – Hibiscus rosa-sinensis Linn 14

Hình 2.6 Cây Phù dung – Hibiscus mutabilis Linn 15

Hình 3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn Propionibacterium acnes từ da bệnh nhân bị bệnh trứng cá thông thường 23

Hình 3.2 Các bước tiến hành nhuộm Gram 24

Hình 3.3 Thử nghiệm catalase 24

Hình 3.4 Kiểm tra sự hình thành indol 25

Hình 3.5 Phản ứng hóa lỏng gelatin 26

Hình 3.6 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết 30

Hình 3.7 Sơ đồ nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của các loài thuộc chi Dâm bụt 31

Hình 4.1 Đồ thị so sánh hiệu suất chiết suất cao theo từng bộ phận 33

Hình 4.2 Khuẩn lạc dòng vi khuẩn P acnes 134N phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0.002 % bromocresol purple 34

Hình 4.3 Hình thái tế bào dòng vi khuẩn P acnes 134N dưới kính hiển vi quang học 35

Hình 4.4 Thử nghiệm catalase dòng vi khuẩn P acnes 134N 35

Hình 4.5 Kiểm tra khả năng sinh indol dòng vi khuẩn P acnes 134N 35

Hình 4.6 Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin của dòng vi khuẩn phân lập 36

Hình 4.7 Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa của dòng vi khuẩn phân lập 36

Hình 4.8 Khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết hoa Bụt giấm 39

Hình 4.9 Đồ thị so sánh khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết ethanol ở nồng độ 50 mg/ml 39

Hình 4.10 Đồ thị so sánh khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết ethanol ở nồng độ 100 mg/ml 40

Hình 4.11 Đồ thị so sánh khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết ethanol ở

nồng độ 200 mg/ml 40

Hình 4.12 Khả năng ức chế sự phát triển của dòng vi khuẩn P acnes phân lập 42

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

TSB Trypticase soy broth

TYEG Trypticase-Yeast

Extract-Heart Extract-Glycerol agar

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Bệnh trứng cá (Acne) là bệnh da thông thường gây nên do tăng tiết chất bã và

viêm của hệ thống nang lông tuyến bã, thường khu trú ở những vị trí tiết nhiều chất bã như mặt, lưng, ngực Khoảng 80 % trường hợp trứng cá gặp ở tuổi thanh thiếu niên, đặc biệt giai đoạn dậy thì (Bộ Y tế, 2015) Mặc dù, bệnh trứng cá không ảnh hưởng nghiêm trọng đến tính mạng, tuy nhiên, do tồn tại dai dẳng, mụn mủ, viêm hay sẹo lồi, sẹo lõm ở vùng mặt ảnh hưởng tới thẩm mỹ và chất lượng cuộc sống người bệnh Nhiều vấn đề bất thường về tâm lý bắt nguồn từ bệnh trứng cá, bao gồm trầm cảm tự phát, lo lắng, bối rối, giảm khả năng có việc làm ở tuổi trường thành Ngoài ra, bệnh trứng cá là nguyên nhân cao nhất gây ra các vụ tự tử trong các bệnh về da (Gupta, 1998)

Có nhiều yếu tố dẫn đến bệnh trứng cá như mất cân bằng nội tiết tố, nhiễm khuẩn, căng thẳng, chế độ dinh dưỡng hay mỹ phẩm Theo “Hướng dẫn chẩn đoán và

điều trị các bệnh da liễu” của Bộ Y tế (2015), vi khuẩn Propionibacterium acnes được

xem là một trong những nguyên nhân chính gây ra bệnh trứng cá Theo khảo sát tại

bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh vào năm 2012 cho thấy tỷ lệ phân lập được P acnes là 48,3 % trên tổng số 87 trường hợp bệnh nhân nhiễm bệnh trứng cá (Nguyễn

Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013)

Liệu pháp điều trị bệnh trứng cá bằng kháng sinh đã được chỉ định trên 40 năm

và đã có hiệu quả đáng kể Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều bác sĩ trên thế giới sử dụng kháng sinh như một biện pháp điều trị chính cho bệnh trứng cá Tuy nhiên, hiệu quả của liệu pháp kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá ngày càng giảm theo thời gian do vấn đề đề kháng kháng sinh và tác dụng phụ của thuốc khi sử dụng kéo dài

(Dreno et al., 2014) Nghiên cứu đầu tiên về tình trạng đề kháng kháng sinh của P acnes được trình bày năm 1979 tại Mỹ và sau đó tại các quốc gia Nam Mỹ, Châu Âu, Châu Á Ở Việt Nam, 95,2 % chủng vi khuẩn P acnes đề kháng với ít nhất một loại

kháng sinh (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013) Theo kết quả thống kê

từ nhiều nghiên cứu của Dreno et al (2014), ở nhiều nước trên thế giới có hơn 50 % chủng P acnes có khả năng đề kháng với kháng sinh (đặc biệt là nhóm macrolid) Tỷ

lệ đề kháng với kháng sinh của P acnes tăng từ 34,5 % (1991) lên 55,5 % (2000) ở Anh (Coates et al., 2002); 94 % chủng P acnes phân lập tại Tây Ban Nha và 51 % chủng P acnes phân lập tại Hungary đề kháng với kháng sinh (Ross et al., 2003) Các

dữ liệu trên cho thấy việc điều trị bệnh trứng cá còn nhiều hạn chế, đặc biệt là liệu pháp kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá Vì vậy, việc tiếp cận với phương pháp trị liệu có nguồn gốc từ thực vật đã trở thành một vấn đề cấp thiết được nhiều nghiên cứu

trên thế giới tiến hành nhằm tìm ra liệu pháp điều trị mới có hiệu quả và không để lại nhiều tác dụng phụ

Chi Dâm bụt có tên khoa học là Hibiscus L là một chi khá lớn trong họ Bông

(Malvaceae) có nguồn gốc ở khu vực ôn đới ấm, cận nhiệt đới và nhiệt đới Ở Việt

Nam, một số loài thuộc chi Dâm bụt được trồng phổ biến như Bụt giấm (Hibiscus sabdariffa Linn.), Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis Linn.), Phù dung (Hibiscus mutabilis Linn.) Những loài này được trồng với nhiều mục đích như trồng làm cảnh,

hàng rào, làm thuốc, thực phẩm và nhiều tác dụng sinh học đã được chú ý nghiên cứu như kháng khuẩn, chống oxy hóa, bảo vệ gan Theo Đỗ Tất Lợi (2004), Dâm bụt và Phù dung thường dùng để đắp lên mụn nhọt đang mưng mủ Chiết xuất từ đài hoa Bụt giấm được xác định là có tác dụng kháng sinh (Viện Dược liệu, 2006) Các nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của 3 loài này trên các dòng vi

khuẩn Gram dương và Gram âm (Mohamed et al., 2014) Chiết xuất thô toàn cây Bụt giấm (H sabdariffa) từ nghiên cứu của Chomnawang et al (2005) cũng cho thấy hoạt tính kháng P acnes với giá trị MIC là 2,5 mg/ml Đến nay, chỉ có một vài tác giả

nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của loài Bụt giấm trên vi khuẩn gây bệnh trứng

cá Propionibacterium acnes và chưa có tác giả nào đề cập đến tác dụng kháng khuẩn

của loài Dâm bụt và Phù dung trên vi khuẩn này

Từ những lý do trên, đề tài “Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh

trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết một số cây trong chi Dâm bụt (Hibiscus L.) trồng phổ biến ở Cần Thơ” được thực hiện với mục tiêu cụ thể là đánh giá và so sánh khả năng ức chế dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes phân lập của 9 loại cao chiết từ các bộ phận của cây Bụt giấm (Hibiscus sabdariffa Linn.), cây Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis Linn.) và cây Phù dung (Hibiscus mutabilis Linn.) được

trồng phổ biến ở Cần Thơ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ

Theo Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnh Da liễu của Bộ Y tế (2015),

Bệnh trứng cá (Acne) được định nghĩa là bệnh da thông thường gây nên do tăng tiết

chất bã và viêm của hệ thống nang lông tuyến bã Biểu hiện bằng nhiều loại tổn thương khác nhau như mụn cám, sẩn, sẩn viêm, mụn mủ, mụn bọc, nang, khu trú ở vị trí tiết nhiều chất bã như mặt, lưng, ngực Bệnh trứng cá thường gặp ở lứa tuổi thanh thiếu niên (với tỷ lệ khoảng 85 %), nhưng có thể xảy ra ở hầu hết các nhóm tuổi, kể cả giai đoạn trưởng thành Tỷ lệ mắc bệnh trứng cá ở phụ nữ trưởng thành khoảng 12 %

(Zaenglein et al., 2016) Trứng cá không ảnh hưởng nghiêm trọng đến tính mạng, tuy

nhiên, do tồn tại dai dẳng, mụn, sẩn hay sẹo lồi, sẹo lõm ở vùng mặt ảnh hưởng tới thẩm mỹ và chất lượng cuộc sống người bệnh

Hình 2.1 Mặt bệnh nhân bệnh trứng cá (Cunliffe, 2004) 2.1.1 Phân loại bệnh trứng cá

Bệnh trứng cá tuy rất dễ chẩn đoán qua khám lâm sàng, nhưng đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh không thể thực hiện một cách đơn giản, vì sự tổn thương diễn

ra rất phức tạp, còn tùy thuộc vào hình thức và số lượng tổn thương (Adityan et al.,

2009) Nhiều công cụ đánh giá bệnh trứng cá đã được mô tả dựa trên nhiều yếu tố khác nhau như loại mụn, mức độ nghiêm trọng, số lượng tổn thương/sẹo, chất lượng cuộc sống và các chỉ số tâm lý xã hội Cho đến nay, vẫn chưa có một hệ thống đánh giá thống nhất để phân loại bệnh trứng cá Theo Bộ Y tế (2015) thì đã phân loại bệnh trứng cá dựa trên các triệu chứng lâm sàng thành 2 nhóm chính là trứng cá thể thông thường và trứng cá thể nặng

2.1.1.1 Trứng cá thể thông thường

Là hình thái thường gặp nhất của bệnh trứng cá với các tổn thương rất đa dạng Bắt đầu từ tuổi dậy thì, trên nền da nhờn xuất hiện các tổn thương nhân trứng cá (comedon) hay mụn đầu đen do chất bã bài tiết và tế bào biểu mô cô đặc lại Sau đó, tùy mức độ viêm nhiều hay ít, nông hoặc sâu mà có các tổn thương như mụn đầu đen, đầu trắng, sẩn, mụn mủ, mụn bọc hay ổ áp xe Bệnh thường gặp ở mặt, trán, cằm, má, phần trên lưng, trước ngực; ít khi xuống quá thắt lưng

2.1.1.2 Trứng cá thể nặng

Đây là trạng thái nặng của bệnh trứng cá, chia thành 3 loại:

- Trứng cá dạng cục, dạng kén, thường gặp ở nam, tổn thương sâu hơn trứng cá thường và hình thành các kén có nguồn gốc nang lông Vị trí thường gặp là ở mặt, cổ

và xung quanh tai

- Trứng cá bọc: Đây là loại trứng cá mủ mạn tính, bắt đầu ở tuổi thiếu niên, có tổn thương dạng cục hay để lại lổ dò, luôn luôn để lại sẹo lõm

- Trứng cá tối cấp (còn gọi là trứng cá bọc cấp tính, trứng cá có sốt và loét): Bệnh xảy ra đột ngột với sốt, mệt mỏi, tăng bạch cầu đa nhân, hồng ban nút và các tổn thương trứng cá

- Trứng cá muộn ở phụ nữ: Gặp ở phụ nữ từ 30 - 40 tuổi, nguyên nhân do cường nội tiết sinh dục (nhất là buồng trứng), thường kèm theo rụng tóc

- Trúng cá do hóa chất: Do mỹ phẩm, do các chất halogen, do xăng dầu (còn gọi là trứng cá hạt dầu, thường ở vùng mu bàn tay, cẳng tay, không có nhân)

Ngoài ra, Karen McCoy (2008) còn phân loại bệnh trứng cá dựa vào mức độ nặng, chia thành ba mức độ (Bộ Y tế, 2015):

- Mức độ nhẹ: Dưới 20 tổn thương không viêm, hoặc dưới 15 tổn thương viêm hoặc tổng số lượng tổn thương dưới 20

- Mức độ trung bình: Có 20 - 100 tổn thương không viêm hoặc 15 - 50 tổn

viêm, hoặc 20 - 125 tổng tổn thương

- Mức độ nặng: Trên 5 nang, cục hoặc trên 100 tổn thương không viêm, hoặc tổng tổn thương viêm trên 50 hoặc trên 125 tổng tổn thương

2.1.2 Nguyên nhân gây bệnh trứng cá

Bệnh trứng cá được hình thành dưới tác động của 3 yếu tố chính Đó là tăng sinh chất bã, sừng hóa cổ nang lông và sự gia tăng hoạt động của vi khuẩn

Propionibacterium acnes (Bộ Y Tế, 2015) Trong đó, vi khuẩn P acnes đóng vai trò rất quan trọng gây ra bệnh trứng cá (Loveckova et al., 2002) Ngoài ra, còn có một số

yếu tố khác ảnh hưởng đến việc hình thành bệnh trứng cá như tuổi, giới, yếu tố gia đình, yếu tố thời tiết, chủng tộc, yếu tố nghề nghiệp, yếu tố stress, chế độ ăn, một số bệnh nội tiết, thuốc và các nguyên nhân tại chổ (Bộ Y tế, 2015)

2.1.2.1 Sự tăng sinh chất bã

Sự tiết chất bã ở da là một trong những cơ chế bảo vệ cơ thể Chất bã được tiết

ra làm da không thấm nước, ngăn cản sự bốc hơi nước, làm da mềm mại và giúp cho

da chống lại vi khuẩn, vi nấm Tuyến bã là nơi tiết chất bã ở da, chúng có ở nhiều nơi trên cơ thể, có rất ít ở tay hoặc chân, trừ lòng bàn tay, bàn chân không có tuyến bã Tuyến bã có nhiều ở mặt, da đầu, ngực và lưng Số lượng tuyến bã ở các vùng này có thể lên đến 400 - 900 tuyến/cm2 da, gấp 5 lần những nơi khác (Bộ Y tế, 2010) Tuyến

bã chịu sự điều tiết hoạt động của các hormon, đặc biệt là hormon sinh dục nam, các hormon này kích thích tuyến bã hoạt động và phát triển thể tích làm tăng bài tiết chất

bã lên nhiều lần Những người bị bệnh trứng cá thường có tuyến bã tiết nhiều dầu trên mức cần thiết Dầu thừa sẽ tích tụ trong lỗ chân lông dẫn đến bít tắc trong lỗ chân lông, hình thành nhân trứng cá Dầu của những người bệnh trứng cá có tính chất khác thường Thành phần squalene và wax ester cao hơn bình thường và các acid béo tự do (như linoleic) thấp hơn bình thường Sự thiếu hụt acid linoleic là yếu tố quan trọng gây

ra bệnh trứng cá (Downing et al., 1986)

2.1.2.2 Sừng hóa cổ nang lông

Sự sừng hóa cổ nang lông tuyến bã là hiện tượng lớp tế bào chết ngoài cùng khu vực gần miệng lỗ chân lông kết dính chặt với nhau và không bong ra, dần dần tạo thành rất nhiều lớp tế bào chết xếp chồng lên nhau, làm ống bài xuất tuyến bã bị hẹp lại, chất bã không thoát ra ngoài được nên bị ứ đọng lại trong lòng tuyến bã, tạo nên môi trường kỵ khí cho vi khuẩn phát triển gây bệnh (Thiboutot, 2009)

2.1.2.3 Sự gia tăng hoạt động của vi khuẩn Propionibacterium acnes

Có nhiều loại vi khuẩn gây nên bệnh trứng cá, trong đó vi khuẩn

Propionibacterium acnes là tác nhân chính gây ra bệnh trứng cá Vi khuẩn P acnes cư

trú ở da một cách vô hại ở điều kiện bình thường Khi các lỗ nang lông bị ứ lại, các

chất bã và tế bào chết sẽ tạo nên môi trường kỵ khí, tạo điều kiện cho vi khuẩn P acnes có thể phát triển, trở nên gây bệnh

Hình 2.2 Nang tuyến bã nhờn (Degitz et al., 2007)

A Nang tuyến bã nhờn bình thường B Nhân mụn C Nang bị vỡ do viêm 2.1.3 Phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay

Hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị bệnh trứng cá mang lại kết quả đáng

kể nhưng thời gian điều trị dài và kèm theo nhiều tác dụng phụ không mong muốn

- Kháng sinh: Thường được sử dụng là clindamycin (dạng bôi tại chổ), erythromycin (dạng bôi tại chổ, dùng toàn thân), tetracyclin (dùng toàn thân) và

doxycyclin (dùng toàn thân) (Bộ Y tế, 2015) Kháng sinh có tác dụng diệt P acnes,

chống viêm trực tiếp thông qua ức chế sự hóa ứng động của bạch cầu trung tính Mặc

dù, sử dụng kháng sinh có hiệu quả đáng kể trong điều trị bệnh trứng cá, nhưng hiện nay do tình trạng đề kháng kháng sinh nên phải dùng phối hợp thuốc để làm giảm sự

đề kháng như kết hợp benzoyl peroxid 5 % với erythromycin 3 % hoặc clindamycin 1

% Thuốc được sử dụng ở dạng dung dịch tan trong cồn hoặc gel và lotion để làm giảm kích thích da (Bộ Y tế, 2015; Zaenglein, 2016)

- Benzoyl peroxid: Có tác dụng diệt khuẩn với phổ tác dụng rộng, giúp làm

giảm đáng kể P acnes và acid béo tự do ở tuyến bã, ngoài ra tác dụng chống viêm và

tiêu nhân mụn Thuốc được sử dụng ở dạng cream, gel và dung dịch có nồng độ từ 2,5

- 10 % Mặc dù thuốc có hiệu quả cao trong điều trị bệnh trứng cá, nhưng thuốc có một

số tác dụng phụ như khô da và nhạy cảm với ánh sáng Vì vậy, thuốc nên được dùng vào buổi chiều tối để hạn chế sự nhạy cảm với ánh sáng

- Retinoid: Thuốc được sử dụng ở dạng bôi ngoài da hoặc dùng toàn thân

+ Dạng dùng ngoài da, thuốc có tác dụng làm tiêu nhân mụn, ngăn sự hình thành mụn và chống viêm Tác dụng phụ thường gặp là khô da, đỏ da, kích ứng da, hồng ban tróc vảy, nhạy cảm ánh sáng

+ Dạng dùng toàn thân, thuốc có tác dụng ức chế sự sản xuất chất bã, thúc đẩy quá trình tiêu sừng Tác dụng phụ thường gặp là khô da, bong da môi, loét miệng, kích thích mắt Lưu ý: Không dùng thuốc trong thời kỳ mang thai, cho con bú vì nguy

cơ gây quái thai (khớp sọ thoái hoá nhanh gây não bé, khó đẻ) Dùng phối hợp với tetracyclin làm tăng áp lực nội sọ, gây u Không dùng cho trẻ dưới 16 tuổi (Bộ Y tế, 2015)

- Acid azelaic: Có tác dụng ngăn chặn hình thành nhân mụn và kìm khuẩn Thuốc được sử dụng ở dạng cream 20 % Tác dụng phụ là ngứa và cảm giác bỏng tại chổ

- Liệu pháp hormon: Là loại thuốc đối kháng androgen có nguồn gốc tự nhiên Thuốc được sử dụng ở dạng viên, vỉ 21 viên, bắt đầu uống viên đầu tiên khi có hành kinh, mỗi ngày uống 1 viên, nghỉ 7 ngày Thời gian dùng thuốc từ 3 - 6 tháng (Bộ Y

tế, 2015)

- Điều trị bằng công nghệ ánh sáng và tia lazer: Sử dụng liệu pháp quang, ánh sáng phổ rộng và tia laser, cho kết quả giảm mụn trong thời gian ngắn nhưng cần có thêm nhiều nghiên cứu về hiệu quả lâu dài và so sánh với các liệu pháp cũ (Phùng Thị Yến Thanh, 2015)

2.2 VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES

Theo Douglas and Gunter (1946), vi khuẩn Propionibacterium acnes có vị trí

phân loại như sau [43]:

- Loài: Propionibacterium acnes

2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Propionibacterium acnes

Propionibacterium acnes (Bacillus acnes) là một loại vi khuẩn phổ biến của hệ

sinh vật bình thường trên da người, được phát hiện nhiều ở các vùng da giàu chất béo

như mặt, da đầu và vùng thân trên (Farrar et al., 2007 và Puhvel, 1968) Chúng thường

sinh trưởng ở các nang lông, tuyến bã nhờn, nơi có nồng độ oxy thấp thích hợp Mật

độ vi khuẩn khoảng 105 - 106 tế bào/cm2 ở những vùng có nhiều bã nhờn và khoảng

102 tế bào/cm2 ở những vùng khác (Phùng Thị Yến Thanh, 2015) Vi khuẩn P acnes

là một trong các nguyên nhân chính gây ra bệnh trứng cá (Beylot et al., 2014) Ngoài

ra, vi khuẩn P acnes còn liên quan đến nhiều bệnh khác, bao gồm nhiễm khuẩn trong nhãn khoa, đĩa đệm tủy sống và thiết bị y tế (Neves et al., 2015)

Propionibacterium acnes là một loại trực khuẩn kỵ khí, Gram dương, hình que,

không sinh bào tử, không di chuyển, phát triển chậm (Noble and Overman, 1986 và Phùng Thị Yến Thanh, 2015) Các tế bào có kích thước khoảng 0,4 – 0,5 x 0,8 – 0,9

µm Phát triển tốt ở nhiệt độ từ 35 - 37 oC, pH từ 5 - 8, trong điều kiện kỵ khí Chúng

có khả năng sinh indol, nitrat, dương tính với catalase (Breed et al., 1957)

Khuẩn lạc phát triển trên môi trường nuôi cấy sau khoảng 5 - 7 ngày (Phùng Thị Yến Thanh, 2015) Khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu vàng nhạt, trơn và mô cao, đường kính từ 1,5 - 4,0 mm trong môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 %

bromocresol purple (Breed et al., 1957 và Phùng Thị Yến Thanh, 2015)

Hình 2.3 Vi khuẩn Propionibacterium acnes (Jappe et al., 2002)

a Hình vi khuẩn P acnes chụp dưới kính hiển vi điện tử

b Hình vi khuẩn P acnes chụp dưới kính hiển vi quang học 2.2.2 Phân loại vi khuẩn Propionibacterium acnes

Các chủng vi khuẩn Propionibacterium acnes đã được phân loại từ thập niên

1970 Gần đây, các nghiên cứu mới đã phát hiện ra chỉ có một số chủng P acnes có

liên quan đến bệnh trứng cá, còn lại liên quan đến các loại nhiễm trùng khác (Lomholt

and Kilian, 2010) Hiện nay, P acnes được phân loại dựa vào nhiều cách khác nhau

Phương pháp phân loại chính của P acnes được mô tả bởi Johnson and Cummins (1972) dựa trên xét nghiệm huyết thanh học và phân tích thành phần đường trên thành

tế bào, chia P acnes thành hai loại: Loại I (đường galactose tham gia cấu tạo nên thành tế bào) và loại II (chỉ có đường manose trong cấu tạo thành tế bào) Sau đó, nhờ

sự phân tích trình tự chuổi trên gen recA và hemolysin/cytotoxin (tly) của McDowell

et al (2005), đã chia chủng P acnes thành loại I và loại II Tiếp đó, McDowell et al (2008) tiếp tục phân loại chủng P acnes loại I thành loại IA, IB và tìm ra thêm loại III Sự phân chia gen dựa trên công nghệ Multi-Locus Sequence Typing và những

nghiên cứu về bộ gen đã giúp phân loại sâu hơn các chủng P acnes thành loại IA1,

IA2, IB, IC, II và III (Lomholt and Kilian, 2010; McDowell et al., 2011; McDowell et al., 2012)

2.2.3 Cơ chế gây bệnh trứng cá của vi khuẩn Propionibacterium acnes

Vi khuẩn Propionibacterium acnes là vi khuẩn thuộc hệ sinh vật bình thường của da (Farrar et al., 2007) Ở những người mắc bệnh trứng cá, vi khuẩn này có sự

tăng nhanh về số lượng trong các tuyến bã nhờn (pilosebaceous) (Phùng Thị Yến

Thanh, 2015) Vi khuẩn P acnes sản xuất các enzym ngoại bào và các sản phẩm có

hoạt tính sinh học gây tương tác với hệ thống miễn dịch gây ra các phản ứng viêm và

tạo nhân mụn (Puhvel and Reisner, 1972; Hoeffler, 1977; Ingham et al., 1980; Webster et al., 1985)

Theo Funke et al (1997) và Leyden et al (1998), vi khuẩn P acnes là nhân tố

quan trọng gây bệnh trứng cá, đây là chủng vi khuẩn phổ biến nhất trên da bệnh nhân

mắc bệnh Tại các tuyến bã nhờn, vi khuẩn P acnes tiết ra các enzym như

deoxyribonuclease, gelatinase, chondroitin sulfatase, lipase, hyaluronidase làm phân giải các thành phần của mô thành các sản phẩm chuyển hóa gây tổn thương mô (Hoeffler, 1977) Histamin, tryptamin và những chuỗi acid béo ngắn được tìm thấy

trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn P acnes, các chất này có thể gây ra tình trạng viêm (Csukas et al., 2004) Các enzym ngoại bào và các sản phẩm có hoạt tính sinh học là hai yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn P acnes

Bảng 2.1: Sản phẩm ngoại bào của P acnes (Eady et al., 1994)

kết dính với tế bào

chemotaxins, phân hủy protein, xâm lấn

mô lân cận Hyaluronidase,

neuraminidase

Mucopolysaccharide Xâm lấn mô lân cận, xuất huyết dưới da

2.2.4 Tình trạng đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn Propionibacterium acnes

Kháng sinh dùng trong điều trị vi khuẩn gây bệnh trứng cá P acnes đã được

nhiều tác giả nghiên cứu Nghiên cứu đầu tiên đề cập đến vấn đề đề kháng kháng sinh

của vi khuẩn P acnes liên quan đến erythromycin (Martin et al., 1972) Theo một điều

tra gần đây, các nước Địa Trung Hải có tỷ lệ đề kháng cao nhất với erythromycin và clindamycin Ở Tây Ban Nha, tỷ lệ kháng lần lượt là 91 % và 92,4 %, tỷ lệ đề kháng chung cho cả erythromycin và clindamycin ở Hy Lạp là 75,3 % và ở Italia là 59,5 %

Các nước phía Bắc, tỷ lệ đề kháng khoảng 41,5 đến 51,4 % (Ross et al., 2003) Dreno

et al., (2001) đã công bố tỷ lệ đề kháng erythromycin là 52 % dòng vi khuẩn P acnes

phân lập từ bệnh nhân bị tổn thương kèm theo viêm và 42 % dòng phân lập từ bệnh nhân không sử dụng erythromycin trước đây Những loại thuốc kháng sinh được

khuyến cáo không sử dụng điều trị dài hạn (quá 3 tháng) (Nishijima et al., 2000) Khả năng kháng của vi khuẩn P acnes khá phổ biến và hầu hết chúng đều kháng lại

clindamycin (tỷ lệ đề kháng với kháng sinh clindamycin là 88,1 %) (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013)

Khả năng kháng kháng sinh của P acnes thường liên quan đến đột biến đặc

hiệu đối với các gen mã hóa ARN ribosome, đột biến đơn trong gen 16S rARN, đột

biến trong gen 23S rARN và kháng thuốc qua trung gian erm(X) (Neves et al., 2015) Bảng 2.2: Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P acnes (Neves et al., 2015)

Xuất hiện gen ARN methylase erm (X)

Đột biến đặc hiệu trên gen 23S rARN

(2057G>A)

Đột biến đặc hiệu trên gen 23S rARN

(2059A>G)

Nhóm kháng sinh macrolid - streptoGramin B

- lyncosamid (bao gồm erythromycin và clindamycin)

Đột biến đặc hiệu trên gen 23S rARN

(2058A>T)

Đột biến đặc hiệu trên gen 23S rARN

(2058A>C)

Đề kháng kháng sinh erythromycin và clindamycin

2.3 TỔNG QUAN VỀ CHI DÂM BỤT

Chi Dâm bụt (Hibiscus L.) là một chi khá lớn nằm trong họ Bông (Malvaceae),

có vị trí phân loại như sau:

Chi Dâm bụt, chi Râm bụt hay chi Phù dung (danh pháp khoa học: Hibiscus L.)

là một chi lớn chứa khoảng 250 loài thực vật có hoa trong họ Bông (Malvaceae), có nguồn gốc ở khu vực ôn đới ấm, cận nhiệt đới và nhiệt đới (Neeru and Sharma, 2008) Chi này bao gồm các loại cây thân thảo một năm hay lâu năm cũng như các loại cây bụi thân gỗ và cây thân gỗ nhỏ Lá mọc so le, loại lá đơn hình trứng hay hình mũi mác, thông thường với mép lá dạng răng cưa hay dạng thùy Hoa lớn, dễ thấy, hình kèn, với

5 cánh hoa, có màu từ trắng tới hồng, đỏ, tía hay vàng và rộng từ 4 - 15 cm Quả là loại quả nang năm thùy khô, chứa vài hạt trong mỗi thùy, được giải phóng khi quả nang tách ra khi chín

Các loài thuộc chi Dâm bụt được trồng ở nhiều nơi trên thế giới với nhiều tác dụng như trồng làm cảnh, làm thuốc, làm hàng rào và nhiều loài đã được quan tâm rất nhiều tới những tác dụng sinh học như kháng khuẩn, chống oxi hóa, bảo vệ gan Trong

đó, một số loài đươc trồng phổ biến ở Việt Nam, cụ thể là ở Cần Thơ như Bụt giấm, Dâm bụt, Phù dung

2.3.1 Tổng quan về cây Bụt giấm (Hibiscus sabdariffa Linn.)

2.3.1.1 Danh pháp

Tên Việt nam: Bụt giấm

Tên khoa học: Hibiscus sabdariffa Linn

Tên khác: Cây giấm, đay Nhật (Viện Dược liệu, 2006)

Tên nước ngoài: Indian Sorrel, Jamaica Sorrel, Natal Sorrel, Red Sorrel, Rosella, Rozelle Hemp (Võ Văn Chi, 2011)

Hình 2.4 Cây Bụt giấm – Hibiscus sabdariffa Linn (Harris, 2011)

10

Tùy theo mục đích sử dụng, người ta phân chia thành 2 loại là Hibiscus sabdariffa L var sabdariffa (trồng để lấy đài ăn và làm thuốc) và Hibiscus sabdariffa

L var altissima (chủ yếu để lấy sợi bện thừng)

Bụt giấm có nguồn gốc từ Tây Phi, được nhập vào Việt Nam cách đây khoảng

10 năm Cây ưa sáng, ưa ẩm và có thể hơi chịu hạn Cây trồng ở Việt Nam thích nghi với nhiều loại đất, kể cả đất đồi vùng trung du, hơi chua (Ba Vì – Hà Tây) Là loại cây nhiệt đới, Bụt giấm sinh trưởng và phát triển tốt ở vùng có nhiệt độ trung bình khoảng

23 – 24 oC

2.3.1.3 Công dụng

Lá Bụt giấm có vị chua, dùng là rau ăn ở Đài Loan, cũng được dùng làm gia vị thay giấm, chế nước giải khát, mứt kẹo, siro hoặc đem phơi khô và nấu lấy nước uống Nước hãm đài hoa uống giúp tiêu hóa, chữa các bệnh gan mật, cao huyết áp, thần kinh

Lá, đài hoa và quả còn chữa bệnh scorbut Ở một số nước như Mianma, Đài Loan, hạt Bụt giấm được dùng làm thuốc bổ, nhuận tràng, lợi tiểu Ở Philippin, rễ bụt giấm là thuốc bổ và kích thích ăn uống, còn có hiệu quả đối với bệnh xơ cứng động mạch và các bệnh nhiễm trùng đường ruột

2.3.1.4 Thành phần hóa học

Kết quả thống kê của Mahadevan (2008) về thành phần hóa học của cây Bụt giấm từ các nghiên cứu trên thế giới cho thấy loài này chứa những thành phần hóa học như sau:

- Lá: α-terpinyl acetat, anisaldehyde, β-carotene, β-sitosterol, β-D-galactoside, β-sitosteryl benzoate, kaempferol-3-O-rutinoside, kaempferol-3-O-glucopyranoside, quercetin, 3-O-rutinoside, citrusin C, 2,3-dihydro-2-(4’-hydroxy-3’-methoxyphenyl)- 3-β-D-glucopyranosylmethyl-7-hydroxy-5-benzofuranpropanol, corchoionoside C và trans-carveol-6-O-β-glucopyranoside, niacin, riboflavin, thiamin, acid ascorbic, chất

béo, acid malic, chất xơ và tro

- Hoa: Carbohydrate, arabinan, mannose, sucrose, thiamin, xylose, mucilage,

niacin, pectin, protein, chất béo, arabinogalactan, rhamnogalacturans, riboflavin,

β-carotene, phytosterols, acid citric, acid ascorbic, acid maleic, acid malic, acid hibiscic, acid oxalic, acid tartaric, (+)-allooxycitronic acid-lactone, acid allohydroxycitric, acid glycolic, acid utalonic, acid protocatechuic, cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3-sambubioside, cyanidin-3-xyloglucoside, delphinidin, delphinidin-3-glucoside, delphinidin-3-sambubioside, delphinidin-3-xyloglucoside, delphinin, gossypetin, gossypetin-3-glucoside, hibiscetin, hibiscin, hibiscitrin, sabdaretin, sabdaritrin, daphniphylline, chất xơ, resin, khoáng chất và tro

-Đài hoa: gossypetin, hibiscetin, sabdaretin, alkaloid, β-sitosterol, anthocyanin,

acid citric, cyanidin-3-rutinose, delphinidin, galactose, pectin, acid protocatechuic, quercetin, acid stearic, delphinidin-3-monoglucoside, cyanidin-3-monoglucoside (chrysanthenin), chloride hibiscin và acid ascorbic

- Quả: α-terpinyl acetat, pectin, anisaldehyde, acid ascorbic, calcium oxalate,

acid caprylic, acid citric, acid acetic, acid formic, acid pelargonic, acid propionic và khoáng chất

- Rễ: Acid tartaric và saponin

- Hạt: Tinh bột, cholesterol, cellulose, carbohydrates, campesterol, β-sitosterol,

ergosterol, acid propionic, pentosan, acid pelargonic, acid palmitoleic, acid palmitic, acid oleic, acid myristic, acid malvalic, acid linoleic, acid sterculic, acid caprylic, acid

formic, acid stearic, cis-12,13-epoxy-cis-9-octadecenoic acid, chất xơ và khoáng chất 2.3.2 Tổng quan về cây Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis Linn.)

2.3.2.1 Danh pháp

Tên Việt nam: Cây Dâm bụt

Tên khoa học: Hibiscus rosa-sinensis Linn

Tên khác: Râm bụt, Bông bụt, Hồng bụt, Phù tang, Xuyên cân bì, Mộc cẩn, Bụp, Co ngắn (Thái), Bioóc ngàn (Tày), Phầy quấy phiằng (Dao) (Viện Dược liệu, 2006)

Tên nước ngoài: Rose – mallow, chinese hibiscus, chinese rose, rose of China, shoe-flowered plant (Anh), ketmie (Pháp)

lá hình chân vịt nổi rõ ở mặt dưới với 5 - 7 gân chính Hai mặt lá có ít lông như thân, mặt trên chủ yếu lông ở gân Cuống lá hình trụ, dài 2 - 2,7 cm, màu xanh lục, có nhiều lông đa bào hình sao Lá kèm hình chỉ dài và nhọn, có gân giữa

Hoa mọc to, đơn độc ở kẽ lá, có cuống dài, lưỡng tính, màu đỏ; tiểu đài có 6 - 7 mãnh hình chỉ; đài hợp hình ống màu lục, dài gấp 2 - 3 lần tiểu đài; tràng có 5 cánh rời nhau, phiến rộng, mỏng hẹp; nhị nhiều, không đều, dính liền nhau bởi chỉ nhị rất dài mang những bao phấn chỉ có một ổ phấn; 5 lá noãn dính vào nhau thành một bầu thượng 5 ô, mỗi ô chứa 2 dây noãn theo kiểu dính noãn trưng trụ Vòi dài nằm trong ống nhị, đầu nhụy có 5 núm Quả nang tròn, chứa nhiều hạt Mùa hoa quả từ tháng 5 -

7

Dâm bụt là cây có nguồn gốc từ Trung Quốc, sau được nhân trồng làm cảnh ở khắp châu Á Hiện đang được trồng khắp nơi ở Việt Nam để làm cảnh và làm hàng rào Ngoài ra, Dâm bụt còn được trồng ở Malaysia, Philipin, Indonesia Dâm bụt là cây

làm bờ rào Cây ra hoa nhiều nhưng không đậu quả, có khả năng tái sinh vô tính mạnh

Có thể nhân giống bằng cành hoặc gốc ghép

- Lá: Chứa chất nhầy, ester của acid acetic, β-sitosterol, caroten, stigmasterol,

taraxeryl acetat và 3 hợp chất cyclopropenoid (methyl sterculat, malvalat và hydroxysterculat)

2 Hoa: Chứa flavonoid (quercetin, quercetin2 32 diglucoside, quercetin2 3,72 diglucoside, cyanidin-3,5-diglucoside and cyanidin-3-sophoroside-5-glucoside, kaempferol-3-xylosylglucoside); alkaloid; vitamin (thiamin, riboflavin, acid ascorbic,

quercetin-3,7-β-caroten); chất nhầy

2.3.3 Tổng quan về cây Phù dung (Hibiscus mutabilis Linn.)

2.3.3.1 Danh pháp

Tên Việt nam: Cây Phù dung

Tên khoa học: Hibiscus mutabilis Linn

Tên khác: Mộc liên, địa phù dung (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Tên nước ngoài: Chinese rose, changeable rose, rose-mallow, cotton-rose, confederate rose (Anh), rose changeante (Pháp)

Hình 2.6 Cây Phù dung – Hibiscus mutabilis Linn (William C Welch, 2011)

2.3.3.2 Đặc điểm

Phù dung là một cây nhỏ hay cây bụi, cao 2 - 5 m, thân có lông hình sao, nhiều nhất ở cành non Lá mọc so le, phiến lá có 5 thùy, rộng tới 15 cm, gốc hình tim, đầu nhọn, mép khía răng không đều, mặt dưới trắng nhạt có nhiều lông tơ, có 7 gân chính, hình chân vịt; cuống lá dài bằng lá hoặc hơn, lá kèm sớm rụng Hoa to, đẹp, mọc riêng

lẻ hay tụ họp nhiều hoa ở ngọn thân và đầu cành, khi mới nở vào buổi sáng có màu trắng, đến chiều chuyển dần thành màu hồng nhạt rồi hồng sẫm; cuống hoa có đốt ở quá phần giữa; tiểu đài có 10 phiến rất hẹp, dài, có lông; đài hợp dài gấp đôi tiểu đài, phủ lông, tràng có cánh mỏng; nhị nhiều, dính vào nhau thành cột; bầu có lông.Quả hình cầu, có lông màu vàng nhạt; hạt hình trứng có nếp nhăn nhỏ mang nhiều lông dài

Cây Phù dung mọc hoang và được trồng khắp nơi ở Việt Nam và nhiều nước khác như Trung Quốc, Philipin, Nhật Bản, Ấn Độ Phù dung là cây ưa sáng và ưa ẩm, trồng ở miền núi, thường có hiện tượng rụng lá và mùa đông Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là 15 - 23 oC

2.3.3.3 Công dụng

Theo kinh nghiệm dân gian, lá và hoa phù dung được dùng để chữa mụn nhọt, sưng tấy, kinh nguyệt ra nhiều, rong huyết Nhân dân lấy lá tươi và hoa tươi giã đắp lên mụn nhọt đang mưng mủ để hút mủ và làm cho đỡ đau Có thể dùng lá hoặc hoa phơi khô tán nhỏ, khi dùng thêm nước chè đặc, trộn đều thành một thứ bột nhão, đắp lên chổ sưng đau Khi thuốc khô lại thay bã khác, nếu mụn mới mưng mủ thì mụn có thể đỡ đau và mụn sẽ tiêu đi; nếu mụn đã chín sẽ chóng vỡ mủ Ở Trung Quốc, lá và hoa Phù dung còn được dùng làm thuốc lợi đờm, chữa ho lâu ngày, thuốc giảm đau, chữa vết thương, vết bỏng

2.3.3.4 Thành phần hóa học

Cây Phù dung có chứa sterol-glucoside, lupinus, gibberellin (Raut, 2014) Hoa chứa quercetin-3-sambubioside, isoquercitrin, hyperin, guaijaverin, kaempferol, mutabiloside, cyanidin-3,5-diglucoside, cyanidin-3-rutinoside-5-glucoside, cyanidin-3-xylosylglucoside, cyanidin-3-glucoside và cyanidin-3-sambubioside (Chan, 2016)

Thân chứa naringenin-5,7-dimethyl-D-xylopyranosyl-l-darabino-pyranoside (Raut, 2014)

Lá chứa quercetin (Raut, 2014), steppogenin, genistein, acid salicylic, rutin,

potengriffioside A, kaempferol-3-O-rutinoside và emodin (Chan, 2016)

Rễ chứa fiber và mucilage (Raut, 2014)

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SÍNH HỌC CỦA CHI DÂM BỤT

Chi Dâm bụt thuộc họ Bông (Malvaceae) là một chi khá lớn với khoảng 275 loài thực vật, sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Một số loài thuộc chi này đã được sử dụng trong những phương thuốc dân gian cho những rối loạn khác nhau và đã được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu (bảng 2.3) Lá và hoa của một

số loài thuộc chi này đã được sử dụng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và ức chế tyrosinase Kết quả thống kê các nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ

các loài trong chi Dâm bụt của Mohamed et al (2014) cho thấy:

- Thân và rễ của H taiwanensis có tác dụng kháng viêm, kháng nấm, hạ sốt và

chống giun sán

- Hoa của H tiliaceus được sử dụng rộng rãi trong việc kiểm soát sinh sản và

điều trị nhiễm trùng da

- Nhiều nghiên cứu về loài H rosa-sinensis đã cho thấy nhiều hoạt tính sinh

học có lợi cho việc điều trị bệnh Chiết xuất nước và ethanol từ hoa đã cho thấy khả

năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Salmonella typhimurium và Staphylococcus aureus với kích thước vùng ức chế dao động từ 9 - 14 mm ở nồng độ 50 mg/ml và 100

mg/ml

- Loài H sabdariffa cũng được quan tâm nghiên cứu với nhiều tác dụng sinh

học quan trọng như chống cao huyết áp, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng histamin, bảo vệ gan, chống stress, chống co thắt, thuốc lợi tiểu và các hoạt động chống tiêu chảy Dịch chiết methanol 80 % từ cây có tác dụng ức chế sự phát triển của

vi khuẩn E coli với vùng ức chế 12,66 mm ở nồng độ 10 %, 10,75 mm ở nồng độ 5

%, and 8,9 mm ở nồng độ 2,5 % Nồng độ ức chế tối thiểu của H sabdariffa đối với S aureus, B stearothermophilus, M luteus, Serratia marcescens, Clostridium sporogenes, E coli, Klebsiella pneumoniae, B cereus và P fluorescence là từ 0,30 ± 0,2 - 1,30 ± 0,2 mg/ml Dịch chiết methanol của H sabdariffa có hoạt tính kháng khuẩn chống lại S aureus, B stearothemophilus, M luteus, S mascences, C sporogenes, E coli, K pneumonae, B cereus và P fluorescence

- Loài H mutabilis được cho là có tác dụng kháng khuẩn và kháng viêm Theo

nghiên cứu này, vùng ức chế của chiết xuất methanol và ethyl acetat cho thấy khả năng

ức chế sự phát của Bacillus subtilis khi so sánh với thuốc chuẩn Vùng ức chế của cao

chiết methanol (8 mg) và ethyl acetat (8 mg) là 15 mm và 13 mm so với sulfamethoxazole chuẩn có vùng kháng khuẩn 14 mm Ngoài ra, chiết xuất ethyl acetat còn cho thấy hoạt tính kháng viêm tương đương với thuốc nimesulide tiêu chuẩn trên việc tỷ lệ ức chế 64,52 % phù phổi ở chuột so với thuốc chuẩn là 70,22 %

trimethoprim Loài H esculentus cũng cho thấy chiết xuất nước từ hạt có khả năng ức chế sự phát triển của Salmonella, Shigella và Enterobacter ở nồng độ 200 mg/l

- Loài H tiliaceus đã cho thấy chiết xuất từ cây này có hoạt tính chống oxy hóa

tốt với IC50 = 86,5 µg/ml so với mẫu acid ascorbic có IC50 = 15 µg/ml Chiết xuất

ethanol từ H tiliaceus cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trên 3 chủng vi khuẩn S aureus, E coli và Salmonella paratyphi

Bảng 2.3: Hoạt tính sinh học của chi Dâm bụt (Mohamed et al., 2014)

%) từ hoa

Chống oxy hóa và kháng khuẩn

pháp lắc với nước lạnh

Gajalakshmi (2012)

aceton và nước từ đài hoa

(2011) Chiết xuất methanol 80 % từ đài

hoa

Kháng khuẩn (trên Esherichia coli O157:H7)

Fullerton et al

(2011)

Chiết xuất ethanol-nước (30, 60 &

95 %) từ đài hoa khô và quả khô

Khả năng chống oxy hóa

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Nguyên vật liệu

Mẫu vi khuẩn: Dòng vi khuẩn P acnes 134N lấy từ đề tài nghiên cứu “Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trứng cá Propionibacterium acnes tại thành phố Cần Thơ” của Phạm Thị Tường Vy (2017) được lưu trữ tại phòng

thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô

Mẫu thực vật: Là các bộ phận lá, hoa và vỏ thân của cây Bụt giấm, Dâm bụt và Phù dung được thu hái tại quận Cái Răng, thành phố Cần Thơ

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Sử dụng các trang thiết bị hiện có tại phòng thí nghiệm Dược liệu và phòng thí nghiệm Vi sinh vật - trường Đại học Tây Đô

Các dụng cụ thu mẫu và phân lập vi khuẩn P acnes: Đĩa petri, que cấy, đèn

cồn, ống nghiệm có nắp, bình tam giác, bếp điện, tủ cấy vi sinh vật, nồi hấp khử trùng Sturdy SA-300VF, pH kế, cân điện tử Scout, tủ sấy Boxun GZX-9030 MBE, tủ ủ vi sinh vật SCI FINETECH (Hàn Quốc), tủ lạnh giữ mẫu -40 oC, tủ lạnh Panasonic, máy vortex, bộ micropipet EMC-LAB, bình hút ẩm, lam và lamen

Các dụng cụ chiết xuất: Bình cầu 2000 ml, bộ sinh hàn, bếp đun BOECO, bếp cách thủy, phễu thủy tinh, tủ sấy, cân điện tử, máy xay, tủ lạnh

Các dụng cụ định tính: Chén sứ, pipet nhỏ giọt, ống đong, đũa thủy tinh, ống nghiệm, bếp cách thủy, tủ hốt, đèn soi UV

Các thiết bị và dụng cụ khác: Máy vi tính lưu trữ dữ liệu, máy chụp hình kỹ thuật số Sony Cyber-shot DSC-W710 (Trung quốc), kính hiển vi Olympus CX-22 (Nhật Bản)

3.1.3 Hóa chất và môi trường

3.1.3.1 Hóa chất

- Hóa chất chiết xuất: Ethanol 96 %

- Hóa chất khảo sát thành phần hóa thực vật

+ Hóa chất: Acid sulfuric đậm đặc; anhydrid acetic; chloroform; acid hydrocloric 1 %, 10 %, đậm đặc; kali hydroxyd 10 %; natri hydroxyd 10 %; bột

magnesi; sắt (III) clorid 5 %; gelatin muối; ethanol 25 %; Fehling A, B; natri carbonat

+ Thuốc thử: Carr-Price, Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Baljet

- Hóa chất kiểm tra catalase: Dung dịch oxy già (H2O2) 3 % (Công ty Dược

phẩm Phương Nam)

- Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn P acnes: Bộ nhuộm Gram của Công ty Nam

Khoa

- Thuốc thử Kovac’s dùng để thử khả năng sinh indol (Mecrk)

- Dung dịch dimethyl sulfoxid dùng để hòa tan cao

- Đĩa kháng sinh erythromycin (Công ty Nam Khoa, Việt Nam)

Môi trường pepton dùng để thử khả năng làm dịch hóa gelatin và khả năng phản nitrat hóa

Bảng 3.2: Công thức môi trường thử khả năng làm dịch hóa gelatin (pH = 7,2 - 7,4)

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1.Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm khoa học

3.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu

3.2.2.1 Cỡ mẫu

Tổng số 9 mẫu thực vật là 3 bộ phận của 3 loài Bụt giấm (Hibiscus sabdariffa Linn.), Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis Linn.) và Phù dung (Hibiscus mutabilis Linn.) thuộc chi Dâm bụt (Hibiscus L.) được sử dụng trong nghiên cứu

3.2.2.2 Phương pháp chọn mẫu

Các bộ phận được thu hái là hoa, lá và thân của 3 loài Bụt giấm, Dâm bụt và Phù dung Chọn mẫu:

- Hoa: Chọn những bông hoa còn đang nỡ, không bị sâu bệnh hay hư hại

- Lá: Chọn lá không quá già hay quá non, không bị sâu bệnh hay hư hại, kích thước đồng đều

- Thân: Chọn đọan thân ở giữa cây, không bị sâu bệnh hay hư hại

3.2.3 Nội dung nghiên cứu

3.2.3.1 Phương pháp chiết xuất

mặt trời, sau đó, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC trong 3 giờ (sấy 2 lần) và đem đi vò nát Vỏ thân được tách ra từ thân tươi khi vừa thu hái, phơi khô dưới ánh sáng mặt trời, sau đó, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC trong 3 giờ (sấy 2 lần) và đem xay thành bột Tất cả nguyên liệu sau khi xử lý được sấy lại đến độ ẩm dưới 13 %

Chiết xuất bằng phương pháp đun hồi lưu

Nguyên tắc: Phương pháp đun hồi lưu hay phương pháp chiết bằng dung môi ở

nhiệt độ sôi là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi, có gắn thêm bộ phận sinh hàn Phương pháp này giúp làm tăng khả năng hòa tan của chất tan

và giúp quá trình hòa tan xảy ra nhanh hơn (Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, 2010)

Tiến hành

Cân 100 g bột nguyên liệu cho vào bình cầu, làm ẩm với 200 ml ethanol 96 % trong 30 phút Bổ sung thêm 800 ml ethanol 96 %, đun hồi lưu ở nhiệt độ 60 oC trong

3 giờ Lặp lại 3 lần với mỗi mẫu nguyên liệu

Dịch chiết 3 lần được gọp chung lại, lọc qua bông rồi bốc hơi dung môi đến cắn trên bếp cách thủy ở nhiệt độ 60 oC

3.2.3.2 Nuôi cấy và nhận diện vi khuẩn Propionibacterium acnes

Nuôi cấy dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes

Tiến hành (Kishisita et al., 1980)

Ống vi khuẩn P acnes trữ ở nhiệt độ -40oC được đặt ở nhiệt độ phòng 15 phút, sau đó, cấy phân lập vào môi trường TYEG broth

- Chuẩn bị ống môi trường TYEG broth, hấp tiệt trùng ở 121 oC

- Hút 30 µl chủng vi khuẩn trữ trong tube centrifuge cho vào ống nghiệm chứa môi trường TYEG broth, ủ ở 37 oC từ 5 - 7 ngày

- Tiến hành cấy ria vi khuẩn từ môi trường TYEG broth lên đĩa môi trường TYEG agar có bổ sung bromocresol purple 0,002 %, ủ kỵ khí trong bình hút ẩm (không chứa các hạt hút ẩm, đốt nến, đậy nắp để tạo điều kiện kỵ khí), ủ ở nhiệt độ 37

o

C từ 5 - 7 ngày

- Chọn khuẩn lạc có màu vàng, đục, mô cao hoàn toàn trên môi trường và làm môi trường từ màu tím chuyển sang màu vàng Tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng TYEG, ủ ở 37 oC trong 48h Sau đó, vi khuẩn được nhận diện bằng cách

- Cố định tế bào: Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần

- Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút, rửa nước, để khô trong không khí

Tube centrifuge chứa dòng vi khuẩn P acnes trữ ở nhiệt độ -40 oC

Nuôi cấy dòng vi khuẩn trong môi trường TYEG broth

Nuôi cấy và phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung

bromocresol purple 0,002 %

Nuôi cấy vi khuẩn dòng vi khuẩn P acnes phân lập trên môi

trường thạch nghiêng TYEG

Hình 3.2 Các bước tiến hành nhuộm Gram (Nguyễn Lân Dũng, 2009)

- Soi kính: Dùng vật kính dầu 100X để quan sát Vi khuẩn Gram dương có màu tím xanh, Gram âm có màu đỏ

Thử nghiệm catalase

Thử nghiệm catalase được dùng để thử trên một số vi khuẩn có sản sinh ra enzym catalase Catalase là một enzym có khả năng phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxygen (O) Các bước tiến hành thử nghiệm được thực hiện theo mô tả của John Harley and Lansing Prescott (2002)

- Lấy sinh khối khuẩn lạc trên môi trường thạch TYEG sau 48 giờ ủ Hòa tan sinh khối vào giọt nước đã nhỏ sẳn trên miếng lame

- Thêm vào một hoặc vài giọt H2O23 %

- Quan sát sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả: Nếu dương tính thì có hình thành bọt khí oxi, nếu kết quả âm tính thì không có sự hình thành bọt khí (Hình 3.3)

Kiểm tra sự hình thành indol

Indol (benzyl pyrrole) là một sản phẩm chuyển hóa của tryptophan Những vi khuẩn có enzym tryptophanase có khả năng chuyển hóa tryptophan tạo ra indol Indol sinh ra kết hợp với andehyde có trong thuốc thử Kovac’s tạo vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường Các bước tiến hành thử nghiệm được thực hiện theo mô tả của John

Harley and Lansing Prescott (2002)

- Cấy vi khuẩn vào môi trường Trypticase soy broth, ủ kỵ khí ở 37 oC trong 48h cho vi khuẩn phát triển

- Mỗi ống nghiệm cho 0,5 ml thuốc thử Kovac’s

- Đọc kết quả: Dương tính khi lớp thuốc thử Kovac’s trên bề mặt môi trường chuyển thành màu đỏ Âm tính khi màu của lớp thuốc thử Kovac’s không bị biến đổi (Hình 3.4)

Hình 3.4 Kiểm tra sự hình thành indol (John Harley and Lansing Prescott, 2002)

Kiểm tra khả năng dịch hóa gelatin

Gelatinase là enzym có khả năng làm dịch hóa gelatin, enzym này được sản

xuất ra từ một số vi khuẩn bao gồm vi khuẩn P acnes (Sanchez et al., 2001) Thử

nghiệm này giúp xác định khả năng sinh enzym gelatinase làm tan chảy môi trường gelatin Trình tự thí nghiệm được tiến hành như sau (John Harley and Lansing

Prescott, 2002):

- Pha môi trường pepton có chứa 15 % gelatin, phân vào các ống nghiệm (4 - 5 ml), khử trùng ở 115 oC trong 20 phút

- Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18 - 24 giờ) chích sâu vào môi trường gelatin, nuôi ở 37 oC trong thời gian 2, 7, 10, 14, 30 ngày

- Lúc quan sát kết quả gelatin hoá lỏng cần đặt ống nuôi cấy vào tủ lạnh (khoảng 15 phút) rồi so sánh với đối chứng âm tính

- Phản ứng dương tính khi một phần hay toàn bộ gelatin hóa lỏng (Hình 3.5)

Hình 3.5 Phản ứng hóa lỏng gelatin (John Harley and Lansing Prescott, 2002)

Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa

Sự phản nitrat hóa là một dạng hô hấp kỵ khí sử dụng nitrat như một chất nhận electron Thử nghiệm phản ứng phản nitrat hóa được tiến hành nhằm xác định sự khử nitrat của vi khuẩn Trình tự thí nghiệm được tiến hành như sau (John Harley and Lansing Prescott, 2002):

- Pha môi trường nước thịt pepton có chứa 1 % KNO3, phân môi trường vào các ống nghiệm (4 - 5 ml), khử trùng ở 121 oC trong 30 phút

- Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá Dùng vaselin bịt kín nút để ngăn oxy, đặt ở nhiệt

độ 37 oC trong 1 - 7 ngày

- Quan sát sự phát triển của vi khuẩn (tăng độ đục của dịch nuôi cấy, sinh khí

NH3) Vi khuẩn có phát triển là phản ứng dương tính, không phát triển là âm tính

3.2.3.3 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết

Phương pháp

Thành phần hóa học chính trong chiết xuất ethanol 96 % được xác định bằng phương pháp của Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh (2010)

Tiến hành (Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, 2010)

- Xác định tinh dầu: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng là có tinh dầu

- Xác định chất béo: Lấy vài giọt dịch chiết nhỏ lên cùng một chổ của tấm giấy mỏng, hơ nhẹ cho bay hết dung môi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết có tinh dầu) Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ là có chất béo

- Định tính carotenoid:

+ Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn Thêm vào cắn vài giọt SbCl3 (khan) bão hòa trong chloroform (Thuốc thử Carr-Price) Dung dịch có màu xanh sau đó chuyển sang màu đỏ là có carotenoid

+ Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc Dung dịch có màu xanh dương đậm hay xanh lục ngã xanh dương là có carotenoid

- Định tính triterpenoid: Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ đến cắn Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform Chuyển dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô Dùng pipet Pasteur thêm 1 - 2 giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm Nơi tiếp xúc giữa hai lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím là có triterpenoid tự

do

- Định tính alkaloid: Lấy khoảng 10 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn Hòa cắn trong 3 ml dung dịch acid hydrocloric 1 % Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid bằng thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat Một ống làm ống chứng Nếu dung dịch đục hoặc có tủa là có alkaloid

Bảng 3.4: Định tính alkaloid (Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, 2010)

- Định tính coumarin: Nhỏ vài giọt dịch chiết lên một miếng giấy lọc Để dung môi bay hơi cho đến khô, nhỏ lên vết dịch chiết 1 - 2 giọt dung dịch KOH 10 % trong cồn và sấy nhẹ cho đến khô Che một nữa vết dịch chiết bằng miếng kim loại và soi dưới đèn tử ngoại 365 nm Sau vài phút, lấy miếng kim loại che nữa vết dịch chiết ra

Nếu phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn nữa không bị che nhưng sau đó sáng dần lên cho đến khi có cường độ sáng tương đương là có coumarin

- Định tính anthraquinon: Lấy khoảng 5 ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ Thêm vào 1 ml dung dịch NaOH 10 % và lắc kỹ Nếu lớp kiềm có màu hồng tới

đỏ là có anthraquinon

- Định tính flavonoid: Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi còn khoảng

2 ml và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ Thêm vào dịch cồn một ít magnesi kim loại và 0,5 ml HCl đậm đặc Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ là có flavonoid

- Định tính anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ Thêm 2 - 3 giọt dung dịch HCl 10 % Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ thì nhỏ tiếp 2

- 3 giọt dung dịch NaOH 10 % Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh là có anthocyanosid

- Định tính proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm Thêm

2 ml dung dịch HCl 10 % và đun trên bếp cách thủy 10 phút Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ là có proanthocyanidin

- Định tính tanin: Lấy 2 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn Hòa tan cắn với 4 ml nước trên bếp cách thủy Lọc và cho vào 3 ống nghiệm Một ống dùng làm ống chứng

+ Ống 1: Pha loãng với 1 ml nước cất Thêm 2 - 3 giọt thuốc thử FeCl3 5

%, lắc đều Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu là có polyphenol

+ Ống 2: Thêm vào dịch lọc 5 giọt gelatin muối, lắc đều So sánh với ống chứng, nếu có tủa bông trắng là có tanin

- Định tính saponin: Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thủy tới cắn Hòa cắn trong 5 ml cồn 25 % trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm Thêm 5

ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống Nếu có bọt bền là có saponin

- Định tính các chất khử: Lấy 5 ml dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn Hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 ml dung dịch Fehling B Đun cách thủy 5 phút Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới ống nghiệm là có các hợp chất khử

- Định tính acid hữu cơ: Lấy 2 ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm Pha loãng với 1 ml nước và thêm vào 1 ít tinh thể Na2SO3 Nếu có bọt khí nhỏ sủi lên là từ các tinh thể Na2SO3 là có các acid hữu cơ

- Định tính glycosid tim: Lấy 5 ml dịch chiết cồn cho vào cốc, thêm 2 ml chì acetat 30

%, khuấy và lọc bỏ tủa Thêm vào dịch lọc 2 ml natri sulfat 15 %, khuấy và lọc bỏ tủa

Cô dịch lọc trên bếp cách thủy cho đến cắn Hòa tan cắn trong chloroform, lọc lấy phần dịch trong và cô dịch đến cắn Hòa tan cắn với 1 ml thuốc thử Baljet và cho vào ống nghiệm So màu với ống chứng (chỉ có thuốc thử Baljet) Nếu dung dịch có màu

đỏ cam đậm hơn ống chứng là có glycosid tim

3.2.3.4 Khảo sát khả năng ức chế dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes phân lập của cao chiết

Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết được tiến

hành theo phương pháp khuyết tán trên giếng thạch (agar well diffusion) theo mô tả

của Athikomkulchai et al (2008)

Tiến hành thí nghiệm

- Pha loãng cao: Cao được pha loãng trong dimethyl sulfoxid (DMSO) thành các nồng độ 50, 100 và 200 mg/ml

- Chuẩn bị đĩa môi trường dịch chiết tim TSB agar, dày 4mm

- Huyền phù của P acnes: Dòng vi khuẩn P acnes phân lập đã được nuôi cấy

sau 48 giờ trong môi trường lỏng tăng sinh khối, sao cho mật số vi khuẩn khoảng 108

tế bào/ml (tương đương độ đục ống Mc Farland 0.5)

- Hút 50 μl huyền phù P acnes (mật số 108 tế bào/ml), trãi mẫu lên đĩa môi trường dịch chiết tim TSB agar, để ráo Đục 4 giếng đường kính khoảng 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2 - 3 cm

- Bổ sung 30 µl lần lượt các cao vào các giếng thạch Đối chứng dương sử dụng

erythromycin 15 g/ml và đối chứng âm là DMSO Tiến hành lần lượt ở nồng độ khác

nhau

- Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn Sau đó, ủ kỵ khí ở 37oC trong 48 giờ

- Đọc kết quả: Đo đường kính (ĐK) vùng ức chế theo công thức:

ĐK (mm) = D-d; trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính

lỗ thạch Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình

Sơ đồ thí nghiệm

Hình 3.6 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết

3.2.3.5 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tương đối của cao với vi khuẩn Propionibacterium acnes

Phương pháp

Dựa trên kết quả thu được từ thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế dòng vi

khuẩn P acnes phân lập của cao chiết, chọn ra 1 loại cao có hoạt tính kháng P acnes

cao nhất và khoảng nồng độ chứa giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) để tiến hành thí nghiệm

Nồng độ ức chế tối thiểu được tiến hành theo phương pháp pha loãng trong môi trường thạch của Trương Công Quyền (1986)

Tiến hành thí nghiệm

- Pha loãng cao: Pha dung dịch cao có nồng độ 20 mg/ml Pha loãng để có các dung dịch cao có nồng độ 15; 10; 5; 4; 3; 2; 1; 0,8; 0,6; 0,4; 0,2 mg/ml trong 10 ml môi trường Đối chứng âm là DMSO

- Chuẩn bị môi trường: Pha môi trường dịch chiết tim Trypticase soy broth (TSB) agar, phân vào các ống nghiệm (10 ml) mỗi ống, khử trùng ở 121 oC trong 30 phút Để nguội còn khoảng 50 oC thì pha các dung dịch cao phía trên vào trộn đều Đổ thạch ra đĩa petri có đường kính 70 mm Để nguội ở nhiệt độ thường đến khi đặc lại

Môi trường dịch chiết tim TSB agar

Chủng 100 μl huyền phù Propionibacterium acnes được nuôi

48 giờ, pha loãng đạt mật số 108 tế bào/ml, trải mẫu, để ráo

Tạo các giếng có đường kính 6 mm

Bơm 30 μl các cao lần lượt vào các giếng thạch, ủ ở nhiệt độ

phòng 30 phút

Ủ ở 37 oC, 48 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn