Nghiên cứu và sử dụng chế phẩm vi sinh vật bản địa đối kháng với một số nấm gây hại rễ cây hồ tiêu tại đăk lắk tt

Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu và sửdụng chế phẩm vi sinh vật bản địa đối kháng với một số nấm gây hại rễ cây hồ tiêu tại Đăk Lắk” sử dụng kỹ thuật metagenomics phân tích đầy đủ hơnvề

MỞ ĐẦU

Tây Nguyên có gần 2 triệu ha đất bazan màu mỡ, chiếm đến 60 % đất bazan của cả nước, rất phùhợp với những cây công nghiệp như cà phê, ca cao, hồ tiêu, dâu tằm, chè Hồ tiêu là một trong những cây

công nghiệp quan trọng ở Tây Nguyên Theo số liệu của Bộ NN và PTNT, năm 2019, cả nước hiện có

gần 145.447 ha hồ tiêu Diện tích hồ tiêu ở Tây Nguyên chiếm hơn 1/2 diện tích hồ tiêu của cả nước Khu vực Tây Nguyên, cây tiêu thường bị bệnh thối rễ tác nhân chính do các loại nấm bệnh

Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Phytophthora sp.và một số tác nhân gây hại

khác làm tình trạng hồ tiêu chết hàng loạt diễn biến phức tạp Việc sử dụng thuốc hóa học trong nôngnghiệp trong đó có thuốc trừ nấm ngày càng nhiều gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và làm giảm chấtlượng sản phẩm khi dư lượng thuốc cao

Tây Nguyên từ lâu được xem là mỏ “vàng đen” của Việt Nam, “vàng đen” đã từng giúp rất nhiềunông dân trở thành tỷ phú Nhưng hiện nay, “thủ phủ vàng đen” đang trong vòng xoáy của nợ nần.Nguyên nhân do hàng loạt rẫy tiêu bị dịch bệnh chết cây, héo rũ phủ kín Diên tích hồ tiêu tăng nhanh,người nông dân sản xuất hồ tiêu theo kiểu tận thu, áp dụng nhiều biện pháp canh tác miễn sao đạt đượcmục đích năng suất cao dẫn đến tình trạng bệnh càng hại nặng Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu và sửdụng chế phẩm vi sinh vật bản địa đối kháng với một số nấm gây hại rễ cây hồ tiêu tại Đăk Lắk”

sử dụng kỹ thuật metagenomics phân tích đầy đủ hơnvề tác nhân chính gây bệnh hồ tiêu và ứng dụngsảnxuất chế phẩm vi sinh từ vi sinh vật bản địa khu vực nghiên cứu đểphòng trừ nấm bệnh hại rễ, tăng năngsuất, tạo ra sản phẩm sạch, an toàn, có tiêu chuẩn chất lượng đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu,qua đó góp phần phát triển kinh tế xã hội một cách bền vững

Mục tiêu nghiên cứu:

- Xác định được tác nhân chính gây bệnh trên cây hồ tiêu dựa vào cơ sở dữ liệu của gene 18sRNA metagenome tách chiết từ đất hồ tiêu bị bệnh và không bị bệnh

- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật bản địa có khả năng ức chế các tác nhân gâybệnh trên cây hồ tiêu

- Sản xuất 01 chế phẩm dựa trên các vi sinh vật bản địa đã được tuyển chọn có khả năng đốikháng với một số bệnh hại rễ trên cây hồ tiêu và xây dựng mô hình thử nghiệm

Nội dung luận án

- Đánh giá quần thể eukaryote đất vùng rễ hồ tiêu khu vực bị bệnh và không bị bệnh tại Đăk Lắk

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật bản địa để phòng chống một số tác nhân gây bệnh

rễ trên cây hồ tiêu

- Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh hại rễ cây hồ tiêu tại Đăk Lắk của chế phẩm vi sinh vật bảnđịa kháng nấm bệnh

Những đóng góp mới của luận án

- Bằng kỹ thuật metagenomic đã đánh giá được sự đa dạng của vi nấm và giới phụ Stramenopiles

ở đất trồng vùng rễ cây hồ tiêu tại Đăk Lắk

- Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi sinh vật bản địa hữu ích kháng một số nấm gâybệnh cây hồ tiêu

- Đánh giá hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm Polyfa – TN3 đối với cây hồ tiêu

Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 119 trang bao gồm: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (26trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (40trang); Chương 4: Bàn luận (17 trang); Kết luận, kiến nghị (2 trang) Danh mục công trình công bố (1trang).Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh (6 trang); Tài liệu tham khảo (28) có 193 tài liệu, trong đó có 47tài liệu trong nước và 146 tài liệu ngoài nước, có 40 tài liệu từ 2014 trở lại đây

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về cây hồ tiêu

1.Cây hồ tiêu

2.Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu trên thế giới

3.Tình hình sản xuất và tiêu thụ hồ tiêu tại Việt Nam

4.Một số bệnh hại chính trên cây hồ tiêu

5.Vi sinh vật đối kháng nấm bệnh trên cây hồ tiêu

1.2 Vai trò của các vi sinh vật trong đất trồng tiêu

1.3 Đánh giá khu hệ vi sinh vật bằng kỹ thuật metagenomics

1.4 Tình hình ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật trong phòng trừ bệnh trên hồ tiêu

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu phân tích metagenome trong đất vùng rễ cây hồ tiêu khu vực bị bệnh và không bị bệnh

Nguồn mẫu: các mẫu đất thu thập từ các vườn hồ tiêu bị vàng lá, thối rễ và vườn không bị bệnh

tại huyện Cư M’gar, tỉnh Đăk Lăk (tọa độ thu mẫu 12o49’48.9”N, 108o05’22.5”E) Các mẫu đất được lấy

ở độ sâu 5-30 cm, mỗi vườn lấy 10 điểm và trộn đều chia 4 phần theo đường chéo, chọn hai phần đối diệnnhau để lấy mẫu trung bình, lượng mẫu là 1kg, cho mẫu đất vào túi polypropylen đã được khử trùng ghiđầy đủ địa điểm, ngày, tên người lấy mẫu và giữ ở 4 oC, đem về phòng thí nghiệm để tách chiết DNAtổng số và bảo quản ở -20 oC cho các nghiên cứu tiếp theo.Sử dụng túi polypropylen đã được khử trùng,nhãn ghi chép và bút; hộp giữ lạnh

Vật liệu tách chiết DNA metagenome

- Dung dịch Lysozyme (10% w/v); dung dịch RNase không chứa DNase (1% w/v); Proteinase K(1% w/v); dung dịch SDS (10% w/v); dung dịch Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% w/vhoà trong 0,7 M NaCl; ChCl3 :Isoamyl alcohol; Isopropanol; Ethanol (70% v/v); đệm TE pH 8,0

- Tách chiết DNA metagenome bằng Kit thương mại: Bộ KIT tách chiết DNA từ đất PowerMax®.Catalog No.12988-10 của công ty MO BIO Laboratories Xác định nồng độ DNA metagenome: Quant-iT™ PicoGreen® Kit

2.1.2 Vật liệu tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu

- Các mẫu đất thu thập từ các vùng trồng cây công nghiệp (hồ tiêu, cà phê, cao su) và đất hoàn thổsau khai thác bauxit tại Tây Nguyên

- Các chủng vi sinh vật hữu ích được lựa chọn sản xuất chế phẩm

- Môi trường MPA (pH: 7.4); Môi trường Gauze II (pH: 7 – 7.4); Môi trường Czapek-Dox (pH : 7); hóa chất và hệ thống lên men cần thiết (phụ lục III)

2.1.4 Vật liệu bố trí thí nghiệm xây dựng mô hình sử dụng sản phẩm nghiên cứu trên đất trồng hồ tiêu

Vật liệu nghiên cứu là các vườn hồ tiêu nằm trong vùng đất đang có dấu hiệu bị thoái hoá đất,vườn đang bị sâu bệnh gây hại Các vườn hồ tiêu được lựa chọn tại huyện Cư M’gar, Đắk Lắk Hồ tiêutrên 10 năm tuổi, giống tiêu Vĩnh Linh; mật độ 1.600 cây/ha Thời gian: Diện hẹp: từ tháng 3/2014 đếntháng 12/2014; Diện rộng từ tháng 11/2014 đến tháng 12/2015

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân tích metagenome trong đất vùng rễ cây hồ tiêu khu vực bị bệnh và không

bị bệnh

Phương pháp tách chiết DNA tổng số của hai mẫu đất lấy từ vườn tiêu bị bệnh và không bị bệnh: nguyên lý tách DNA metagenomics cơ bản gồm ba bước: (1) phá vỡ tế bào, (2) loại bỏ các thành

phần không mong muốn, (3) thu nhận DNA Sử dụng bộ KIT tách chiết DNA metagenome từ đất

PowerMax® - Catalog No.12988-10 của công ty MO BIO Laboratories

Phương pháp phân tích tin sinh học

Cơ sở dữ liệu 18S metagenome được giải trình tự 2 chiều (paired-end) bằng thiết bị giải trình tựthế hệ mới Illumina HiSeq Dữ liệu thô được lưu trữ dưới dạng file fastq Chất lượng được trình tự đượcđánh giá bằng phần mềm FastQC Hai file fastq được ghép với nhau bằng phần mềm FLASH (Magoč,2011) Các đoạn trình tự kém chất lượng bị loại bỏ bằng phần mềm Qiime (Caporaso, Gregory và cộng

sự, 2010; Bokulich, Nicholas và cộng sự, 2013) Dữ liệu sau khi tinh sạch sẽ được chia thành các đơn vịphân loại OTUs bằng phần mềm Upase Trong đó, các đoạn trình tự giống nhau ≥97% sẽ được xếp vào 1OTU (Wang, Qiong và cộng sự, 2007) Các OTUs được chú giải phân loài bằng thuật toán RDP classifierphiên bản 2.2, trên cơ sở dữ liệu SILVA (Quast, Pruesse và cộng sự, 2013) Sắp xếp chuỗi được thực hiệnbằng phần mềm MUSCLE (Phiên bản 3.8.31) Chuẩn hóa dữ liệu, các thông tin đa dạng của các OTUsđược chuẩn hóa theo tiêu chuẩn số thứ tự tương ứng với mẫu có trình tự ít nhất

2.2.2 Phương pháp tạo nguồn gene vi sinh vật phục vụ nghiên cứu

và 25-30 oC đối với vi nấm Quan sát sự phát triển của các khuẩn lạc sau các khoảng thời gian nuôi cấythích hợp

Mật độ vi sinh vật tổng số được tính theo công thức sau:

Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 mL mẫu; N: tổng số khuẩn lạc đếm trên các đĩa đã chọn; ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng I; V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa; fi:

độ pha loãng tương ứng

Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ sẽ được làm sạch và giữ giống trong glyxerol lỏng (70 % giống + 30

% Glyxerol) ở -80 oC

2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm bệnh của vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn/xạ khuẩn được nuôi trong môi trường dịch thể, lắc trên máy lắc 220vòng/phút Sau 1-2 ngày, lọc lấy dịch trong, nhỏ vào các lỗ thạch đã đục sẵn trong đĩa petri đã cấy vi sinhvật kiểm định Để tủ lạnh 30 phút cho cơ chất khuếch tán vào thạch, sau đó nuôi ở 30 oC Sau 1-3 ngày,xác định vòng đối kháng HTKS = D-d (mm); D: Đường kính vòng kháng khuẩn; d: Đường kính lỗ

2.2.2.3 Phương pháp xác định khả năng ức chế nấm bệnh của các chủng nấm (Abdel-Motaal FF và

PIMG = (R1 –R2)/R1 ×100

R1, R2 - đường kính khuẩn lạc nấmbệnh; T- khuẩn lạc chủng nấm đối kháng

Đánh giá mức độ đối kháng: (+++) Đối kháng mạnh: chủng nấm phân lập mọc trùm lên và lấn át

sự phát triển của nấm bệnh, làm cho sợi nấm chết lụi dần; (++) Đối kháng trung bình: chủng nấm phânlập mọc trùm lên nấm bệnh nhưng sợi nấm bệnh không bị chết lụi; (+) Đối kháng yếu: chủng nấm phânlập lúc đầu phát triển mạnh, nhưng bị chậm lại và không phủ lên nấm bệnh; (-) Không đối kháng: nấmbệnh phát triển mạnh phủ lên chủng nấm phân lập

2.2.2.4 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Cặn tế bào sau khi ly tâm 10000 rpm trong 5 phút được hòa lại trong dung dịch đệm TE 10:1 (TrisHCl + EDTA), ly tâm tiếp 10000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi Bổ sung 400 μL TE, 20μL SDS 10 %L TE, 20μL TE, 20μL SDS 10 %L SDS 10 %

và 3 μL TE, 20μL SDS 10 %L proteaza K, đảo đều và ủ ở 37 oC trong khoảng 1h để phá vỡ tế bào và loại bỏ protein

Bổ sung tiếp100 μL TE, 20μL SDS 10 %L NaCl 5M, đảo đều, ủ ở 65 oC trong 10 phút Thu dịch, loại bỏ polysaccrit vàchất bẩn ở đáy Chiết DNA hai lần bằng 500 μL TE, 20μL SDS 10 %L dung dịch chloroform:isomylalcohol (24:1) Tủa DNAbằng cách bổ sung NAOAc 3M, cồn 100 % và giữ ở -20 oC tối thiểu trong 1h Ly tâm loại bỏ dịch nổi,rửa cặn DNA bằng cồn 70 %, làm khô DNA Hòa lại cặn trong đệm TE chứa RNAaza (100 µg/mL), ủ ở

37 oC trong 1h để loại RNA Nồng độ và độ sạch của DNA được xác định bằng phổ hấp phụ trên máyquang phổ tử ngoại và điện di trên gel agaroza 1%

2.2.2.5 Phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA

Bảng 2.1 Cặp mồi sử dụng cho PCR khuếch đại gen 16S rRNA vi khuẩn

Cặp mồi sử dụng để khuếch đại gen 16S rRNA của Streptomyces spp có trình tự:

2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen và xây dựng cây phát sinh loài

Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA sau khi đã được tinh sạch sẽ được giải trình tự bằngmáy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 (Applied Bioscience) Xử lý trình tự nhận được bằng phầnmềm Bioedit v.2.7.5 và so sánh với cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen NBCI bằng phần mềm BLASTnnhằm tìm ra các chủng có độ tương đồng cao với chủng nghiên cứu Cây phát sinh loài của các chủngnghiên cứu được xây dựng bằng phần mềm DNASTAR Lasergene v.710

2.2.2.7 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

- Phương pháp nhuộm gram: Chuẩn bị vết bôi, cố định tế bào, sau đó nhuộm bằng dung dịch

Tím kết tinh trong 1 phút, thấm khô Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, thấm khô Nhỏ dịch tẩymàu, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút,rửa nước, để khô trong không khí Soi kính: dùng vật kính dầu 100x

- Xác định khả năng sử dụng đường

- Xác định khả năng lên men – oxi hóa

- Xác định khả năng phân giải tinh bột và casein

- Xác định khả năng phân giải gelatin

- Xác định hoạt tính catalaza

- Xác định khả năng sử dụng citrate

2.2.2.8 Xác định đặc tính sinh hóa của xạ khuẩn

- Khả năng sử dụng các nguồn cacbon (đường

- Sự hình thành sắc tố melanin

- Khả năng sinh enzyme ngoại bào

- Khả năng chịu muối

2.2.2.9 Xác định đặc tính sinh học của nấm

- Khả năng sử dụng các nguồn cacbon và nitơ

- Xác định khả năng chịu muối của nấm

- Thử khả năng sinh enzyme cellulase, protease, amylase

2.2.2.10 Phương pháp đánh giá độc tính cấp của chế phẩm vi sinh vật gốc

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22

g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột thí nghiệm được nuôi trong phòng thí nghiệm,thực hiện các kỹ thuật cần và đủ trước khi thử nghiệm với chế phẩm vi sinh vật gốc

Xác định LD50 của các loại chế phẩm trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương phápLitchfield – Wilcoxon và hướng dẫn của WHO

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ lên men các chủng vi sinh vật nghiên cứu

- Thực hiên phương pháp lên men chìm quy mô phòng thí nghiệm trong bình tam giác

- Thực quy mô pilot với hệ thống lên men thể tích 70 lít

- Thực hiện lên men xốp thanh trùng (bề mặt) buồng lên men 3m3

- Thực hiện phương pháp lên men không thanh trùng trên buồng lên men 70 -100 m3

2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm xây dựng mô hình sử dụng sản phẩm nghiên cứu trên đất trồng hồ tiêu

Phương pháp bố trí thí nghiệm (theo QCVN-01-172:2014/BNNPTNT)

Đối với thí nghiệm diện hẹp: bố trí khối ngẫu nhiên đầy đủ 3 lần lặp lại gồm 4 công thức (CT),

mỗi công thức 30 cây; lượng phân bón ở các công thức sau tính cho 01 cây Lượng phân POLYFA-TN3được thí nghiệm áp dụng trên cơ sở quy trình bón phân hữu cơ cho cây hồ tiêu và đặc tính của phânPOLYFA-TN3 với khả năng bổ sung dinh dưỡng khoáng và số lượng VSV hữu ích

Nền phân vô cơ đồng loạt cho toàn bộ thí nghiệm (phân NPK 16:8:16) 1,0 tấn/ha Phân hữu cơ có 4 CT:

CT1: (đối chứng) bón 2 kg phân chuồng hoai mục

CT2: bón 1,0 kg phân POLYFA-TN3

CT3: bón 1,5 kg phân POLYFA-TN3

CT4: bón 2,0 kg phân POLYFA-TN3

Lượng phân bón trên được bón 2 lần: tháng 6 và tháng 9

Diện tích ô cơ sở: 310 m2 tương đương với 60 cây, tổng diện tích thí nghiệm 3.500 m2 (bao gồm

cả hàng cách ly và bảo vệ) Giữa các công thức thí nghiệm có 1 hàng bảo vệ

Hiệu lực phòng trừ được tính theo công thức Henderson – Tilton

Đối với thí nghiệm diện rộng: chỉ sử dụng 2 CT: đ/c bón 2,0 kg/cây phân chuồng hoai mục và

2,0 kg/cây phân POLYFA-TN3 trên nền phân vô cơ như thí nghiệm diện hẹp; diện tích rộng 10.000 m2;

Các biện pháp kỹ thuật đã áp dụng

Phân bón vô cơ được chia làm 4 lần/năm theo tỷ lệ: 40 % - 20 % - 20 % - 20 % vào các tháng:tháng 5 (mưa ổn định), tháng 7, tháng 9 và tháng 11 Cách bón phân (cả phân vô cơ lẫn phân hữu cơ) hồtiêu: rạch hàng theo tán lá, sâu 6-8 cm, rải phân Tưới nước 3 lần/trong mùa khô Các biện pháp làm cỏ,cắt tỉa cành, vét bồn, thu hoạch bằng thủ công Tất cả biện pháp trên đều đồng đều cho các công thức.

Các chỉ tiêu, phương pháp theo dõi số liệu

Chỉ tiêu đánh giá (theo QCVN – 01 – 172:2014/BNNPTNT)

Đánh giá số gié (chùm quả) trên cây; Yếu tố cấu thành năng suất tiêu: số gié/khung (khung40x50cm); số quả/gié; Năng suất thực thu (tiêu tươi): dùng cân, cân năng suất thực thu trên mỗi nọc; đơn

vị tính (kg); Điều tra bệnh trên lá: mỗi điểm điều tra 1 trụ, mỗi trụ điều tra 3 tầng tán (tầng gốc, tầng giữa

và tầng ngọn), mỗi tầng điều tra 4 hướng đông, tây, nam, bắc; Tính tỷ lệ bệnh (%); Điều tra bệnh trêncành, thân Tính tỷ lệ (%) thân bị bệnh Điều tra định kỳ 30 ngày một lần; Tần số bắt gặp: 1- 25 %: ít phổbiến (+); ≥ 25 – 50 %: Phổ biến (++); > 50 %: Rất phổ biến (+++)

Hiệu lực phòng trừ được tính theo công thức Henderson – Tilton:

Ta x CbHiệu lực (%) = (1 - - ) x 100

Ca x Tb

Thu thấp số liệu trên diện rộng

Chọn 3 mẫu điểm cho mỗi cây trồng, mỗi mẫu điểm 50 cây, từ đó quy đổi cho 01 hecta

- Chỉ tiêu năng suất và bệnh hại: trên diện rộng chỉ lấy số liệu năng suất và bệnh hại chính; chia lôlấy 3 điểm với số cây là 50 cây; quy đổi cho 01 hecta

Ước tính hiệu quả kinh tế

Lợi nhuận tăng thêm = tổng thu sản phẩm công thức thí nghiệm – (tổng thu do phân chuồng + chiphí tăng thêm do thí nghiệm)

Tỷ suất lợi nhuận tăng thêm (VCR) = lợi nhuận tăng thêm/(tổng chi công thức thí nghiệm – tổngchi do phân chuồng (Đ/C))

Tỷ suất lợi nhuận tăng thêm (VCR) được tính:

DNA từ đất PowerMax® - Catalog No.12988-10 của công ty MO BIO Laboratories theo hướng dẫn sửdụng của nhà cung cấp DNA sau khi tinh sạch được chạy điện di để kiểm tra chất lượng Kết quả chothấy, các băng DNA rõ nét, không bị đứt gãy (Hình 3.1) để sử dụng cho phân tích metagenome.

* Đọc trình tự gen 18S rRNA

Gen 18S rRNA được nhân lên bằng cặp mồi EUK1A – 499R với khuôn là ADN metagenome đãtách ở trên được giải trình tự trên máy lllumina Hiseq Dữ liệu sau khi tinh sạch sẽ được chia thành cácOTUs bằng phần mềm Upase

Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số tách chiết từ hai mẫu đất nghiên cứu Mẫu được điện di với

thể tích 5l trong thời gian 30 phút ở điện thế 100V

(D1: mẫu đất vườn hồ tiêu bị bệnh; D2: mẫu đất vườn hồ tiêu không bị bệnh)

Giếng 1: ADN maker chuẩn Giếng D1, D2: ADN tách từ mẫu D1 và D1

* Phân tích dữ liệu

Kết quả cho thấy trong mẫu D1 đất vườn tiêu bị bệnh, tổng số tag phân tích là 121.432; số tagđược làm sạch là 105.323; số tag chưa phân loại được là 15.073, số tag chỉ có duy nhất trong mẫu phântích là 1.036; số OTUs là 1.574 Mẫu D2 đất vườn tiêu không bị bệnh, tổng số tag phân tích là 103.827;

số tag được làm sạch là 97.102; số tag chưa phân loại được là 4.484, số tag chỉ có duy nhất trong mẫuphân tích là 2.241; số OTUs là 1.318

1

Hình 3.2 Phân tích thống kê các tag và số lượng OTUs của hai mẫu đất phân tích

3.1.2 Thành phần và tỷ lệ eukaryote (sinh vật nhân chuẩn) trong hai mẫu đất trồng tiêu

Dữ liệu trình tự 18S rRNA metagenome sau khi sử dụng phần mềm Mothur để phân tích, thànhphần các eukaryote có trong đất vườn tiêu bị bệnh gồm animalia (42 %), alveolta (18 %) vi nấm (9 %);Rhizaria (7 %), stramenopiles (6 %), tuyến trùng (2 %), amoebozoa(2 %) và một số giới, giới phụ khácchiếm tỷ lệ dưới 1 % Đất vườn tiêu không bị bệnh gồm animalia (63 %), alveolta (6 %), vi nấm (16%);Rhizaria (3 %), stramenopiles (6 %), tuyến trùng (4 %), amoebozoa(2 %) so với tổng số sinh vật có tronghai mẫu đất (Hình 3.3; Hình 3.4)

Hình 3.3 Biểu đồ Krona biểu thị thành phần và tỷ lệ các giới sinh vật trong mẫu đất trồng hồ tiêu

bị bệnh tại Tây nguyên (mẫu D1)

Hình 3.4 Biểu đồ Krona biểu thị thành phần và tỷ lệ các giới sinh vật trong mẫu đất trồng hồ tiêu

không bị bệnh tại Tây nguyên (mẫu D2)

3.1.3 Thành phần vi nấm trong đất trồng tiêu

Trong nghiên cứu metagenome thường sẽ phân tích dữ liệu 16S rRNA metagenome của vikhuẩn và 18S rRNA metagenome của eukaryote (bao gồm animalia, stramenopiles, fungi, rhizari,amoebozoa,…) Với mục tiêu nghiên cứu vi sinh vật đối kháng với nấm bệnh hại tiêu và các nghiêncứu trước đây đều cho thấy tác nhân gây bệnh hồ tiêu chủ yếu là vi nấm và giới phụ stramenopiles

vì vậy, chúng tôi tập trung đánh giá và phân tích dữ liệu 18S rRNA metagenome của vi nấm vàstramenopiles trong đất vùng rễ trồng hồ tiêu.Thành phần vi nấm trong mẫu đất tiêu bị bệnh thuộc 5ngành: Ascomycota (34 %), Zygomycota (34 %), Basidiomycota (21 %), Zoopagomycota (8 %),Chytridiomycota (3 %) so với tổng số vi nấm trong mẫu đất vườn tiêu bị bệnh Trong mẫu đất hồtiêu không bị bệnh, ngành Ascomycota (81 %); Basidiomycota (7 %), Chytridiomycota (1 %),Zygomycota (8 %), Zoopagomycota (3 %) so với tổng số vi nấm (Hình 3.5)

0 20 40 60 80 34

81 34

So sánh thành phần và tỷ lệ các chi xuất hiện trong hai mẫu đất cho thấy trong mẫu đất tiêu

bị bệnh D1 có 27 chi và mẫu đất tiêu không bị bệnh có 28 chi nấm xác định được tên chi tập trungtrong 4 ngành Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, Zygomycota Ngành Zoopagomycotakhông có chi nào xác định được tên trong cả hai mẫu đất Có 4 chi chỉ xuất hiện trong mẫu đất bịbệnh và 5 chi chỉ có mặt trong mẫu đất không bị bệnh

Bảng 3.1 Thành phần và tỷ lệ (%) các chi nấm chiếm ưu thế so với Eukaryote tổng số trong

hai mẫu đất vườn tiêu tại Tây Nguyên

nhiều so với đất trồng tiêu không bệnh như chi Rhizoctonia, Rhizophydium Trong khi đó, trong đất

tiêu không bị bệnh, tỷ lệ chi đối kháng tác nhân gây bệnh cây cao hơn so với đất trồng tiêu bị bệnh

như Penicillium

Có 40 loài nấm đều có mặt ở cả hai mẫu đất, 14 loài chỉ có trong mẫu đất bị bệnh và 11 loàichỉ có mặt trong mẫu đất trồng tiêu không bị bệnh Trong đó, các loại định danh được tên gồm 25loài nấm đều có mặt ở cả hai mẫu đất, 4 loài chỉ có trong mẫu đất bị bệnh và 5 loài chỉ có mặt trongmẫu đất trồng tiêu không bị bệnh (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Thành phần và tỷ lệ (%) các loài nấm so với Eukaryote tổng số trong hai mẫu đất

vườn tiêu tại Tây Nguyên

Như vậy, những loài phổ biến bao gồm Mortierella wolfii (1,09 %), Mortierella alpina (0,66

%), Ramicandelabercf L KYK00166 (0,03 %), Tapinella atrotomentosa (0,15 %), Chaetomella oblonga (0,59 %), Cephaliophora tropica (0,095 %) trong mẫu đất bị bệnh và Mortierella wolfii (0,06 %), Mortierella alpina (0,16 %), Ramicandelabercf L KYK00166 (0,002 %), Tapinella atrotomentosa (0,02 %), Chaetomella oblonga (0,16 %) và Cephaliophora tropica (0,001 %) trong mẫu đất không bị bệnh Trong cả hai mẫu đều xuất hiện chi nấm Mortierella thuộc họ

Mortierellaceae với tỷ lệ rất cao, đây là chi xuất hiện phổ biến trong các loại hình sinh thái đất, sốnghoại sinh trong đất, trên thực vật mục nát và các vật liệu hữu cơ khác

3.1.4 Thành phần loài phân loại trong giới phụ Stramenopiles có trong đất trồng tiêu

Kết quả phân tích cho thấy, các chi nấm gây bệnh trên cây trồng trong mẫu đất vườn tiêubệnh đều cao hơn so với vườn tiêu không bị bệnh

Bảng 3.3 Thành phần và tỷ lệ (%) các chi Stramenopiles chiếm ưu thế so với Eukaryote tổng

số trong hai mẫu đất vườn tiêu tại Tây Nguyên