KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨNESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔRỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂNNUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN,TỈNH VĨNH LONG

Để chăn nuôi hạn chế được các rủi ro, tăng hiệu quảthức ăn, kích thích tăng trưởng thì nhiều nơi đã sử dụng kháng sinh mộtcách liên tục, đặc biệt là trên cả gà khỏe, gà chưa có biểu hiện

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

PHẠM THỊ THÙY LINH

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂN NUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN,

TỈNH VĨNH LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH THÚ Y

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI SINH β-LACTAMASES PHỔ

RỘNG TRÊN GÀ KHỎE VÀ MÔI TRƯỜNG CHĂN NUÔI TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ Ở HUYỆN TRÀ ÔN,

TỈNH VĨNH LONG

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

MSSV: B1207161 Lớp: CN12Y4A1 – K38

Cần Thơ, 2016

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Chăn nuôi gà là một nghề không chỉ cung cấp thực phẩm cho bữa ăn hàngngày của mỗi gia đình mà còn đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho ngườichăn nuôi nên những năm gần đây ngành chăn nuôi gà ở Vĩnh Long pháttriển rất mạnh Theo báo cáo sơ kết 6 tháng đầu năm 2014 của Sở NôngNghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Vĩnh Long, tổng đàn gà của toàn tỉnhtrên 3 triệu con, tăng 24,7% so với cùng kỳ năm 2013 (Chi cục Thú y tỉnhVĩnh Long, 2014) Hơn nữa, việc phát triển nhanh chóng đồng thời cũnglàm tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh, ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất vàhiệu quả chăn nuôi Theo Hồ Việt Thu (2012), hầu hết các loài gia cầm ở

mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với vi khuẩn E coli Trong các bệnh nhiễm cầu trùng trên gà thì E coli là phổ biến nhất, xảy ra ở mức độ ngày càng tăng và

có thể trở thành một vấn nạn trong ngành công nghiệp chăn nuôi gia cầm(Võ Thị Trà An, 2012) Để chăn nuôi hạn chế được các rủi ro, tăng hiệu quảthức ăn, kích thích tăng trưởng thì nhiều nơi đã sử dụng kháng sinh mộtcách liên tục, đặc biệt là trên cả gà khỏe, gà chưa có biểu hiện bệnh, làm cho

vi khuẩn không chỉ đề kháng với chính kháng sinh đó mà còn đề kháng chéovới nhiều kháng sinh khác (Trần Huy Hoàng, 2013)

Hiện nay đã xuất hiện các chủng vi khuẩn gram âm sinh men β-lactamasesphổ rộng (ESBL) có khả năng đề kháng với các kháng sinh nhóm β-lactamases bao gồm cả các kháng sinh phổ rộng như cephalosporin thế hệ 3

và 4 Trên thế giới đã có rất nhiều báo cáo về E coli ESBL trên gà được

công bố, tại Zagazig - Ai Cập tiến hành nghiên cứu trên 106 mẫu thịt gà bán

lẻ thì có 69 chủng E coli ESBL được tìm thấy, chiếm 65,09% (Abdallah et al., 2015) Theo Hetty Blaak et al (2015), nghiên cứu trên các mẫu phân tại các trại gà thịt và gà đẻ ở Hà Lan cho thấy tỉ lệ E coli dương tính với ESBL

trên gà thịt và gà đẻ lần lượt là 65% (46/71) và 81% (57/70) Tuy nhiên tạiViệt Nam các nghiên cứu về vấn đề này đa phần chỉ thực hiện trên người ở

những bệnh viện lớn, có rất ít nghiên cứu về E coli ESBL trên vật nuôi nói

chung và trên gà nói riêng Xuất phát từ tình hình trên, đề tài “Khảo sát sự

hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh β-lactamases phổ rộng trên

gà khỏe và môi trường chăn nuôi tại một số nông hộ ở huyện Trà Ôn tỉnh Vĩnh Long” được thực hiện với mục tiêu:

-Xác định tỉ lệ hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL trên gà khỏe và môi

trường chăn nuôi tại một số nông hộ ở huyện Trà Ôn, tỉnh Vĩnh Long

Kiểm tra tính nhạy cảm của các chủng E coli ESBL phân lập được đối với

một số loại kháng sinh

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli

Bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Echerich đã phân lập và tìm ra đặc điểmcủa vi khuẩn này lần đầu tiên trong tả lót trẻ em vào năm 1885, tại Munchen

và công bố nó dưới cái tên Bacterium coli commune E.coli là loài quan trọng

được tìm thấy trong phân (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970).Năm 1991, vi khuẩn

này được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli hay E coli E.coli được xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gramma Proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae Là vi khuẩn

Gram âm thường trực ở trong ruột, chiếm 80% các vi khuẩn hiếu khí; một sốchủng là vi khuẩn cộng sinh giúp tổng hợp một số vitamin B, E và K và cânbằng hệ vi sinh đường ruột nhưng hầu hết là vi khuẩn gây bệnh đường ruột và

các cơ quan khác Ở ruột, vi khuẩn E.coli sống kháng với một số vi khuẩn khác như Salmonella và Shigella nhờ có khả năng tạo ra một loại chất ức chế

có tên là colicin (Lê Xuân Phương, 2009)

Theo Đậu Ngọc Hào (2012) E coli sống ở khắp nơi trong môi trường và đặc

biệt sống phổ biến trong ruột, đường hô hấp của động vật khỏe mạnh Tuy

nhiên, khi cơ thể suy yếu, một số chủng E.coli có thể gây bệnh.Vi khuẩn E.coli hiện diện thường xuyên trong đường ruột gà và được thải qua phân với

số lượng lớn (Hồ Thị Việt Thu, 2012)

2.1.1 Đặc điểm hình thái

Theo Lưu Hữu Mãnh (2010) E.coli là một trực khuẩn Gram âm, có hình gậy

ngắn, hai đầu tròn, kích thước 2-3 x 0,6 µm, không sinh nha bào Trong cơ thể

có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớnE.coli di động do có lông nhung bao xung quanh thân nên có khả năng didộng, nhưng có thể gặp một số chủng đột biến không lông và không thấy diđộng

Dưới kính hiển vi điện tử, người ta còn phát hiện được cấu trúc pili – yếu tố

mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli (Lê Thị Hoài, 2008).

2.1.2 Đặc tính nuôi cấy

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Một số

có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo dinh dưỡng Là vi khuẩnhiếu kỵ khí tùy ý Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 400C, nhiệt độ thích hợp

nhất là 37oC, pH tối ưu nhất là 7,4 (Hồ Thị Việt Thu và Nguyền Đức Hiền,2012).

Môi trường nước thịt: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E.coli phát triểnrất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôikhi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi thối (do vikhuẩn phát triển sinh ra H2S ) (Phùng Thị Minh, 2008)

Môi trường thạch MC (MacConkey Agar): vi khuẩn hình thành khuẩn lạc to,tròn đều, màu hồng nhạt, khuẩn lạc hơi lồi, kích thước 2-3 mm (Nguyễn NgọcHải, 2012)

Môi trường NA (Nutrient Agar): sau khoảng 8 giờ đến 10 giờ nuôi cấy ở ,dung 37oC kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc Sau 24 giờ khuẩn lạc

có kích thước khoảng 1,5mm, hình tròn, ướt bóng láng, không trong suốt, màutro trắng nhạt, hơi lồi Nếu nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng

ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucoid)(Theo Lê Thị Hoài, 2008)

Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): qua 18-24 giờ ủ trong tủ ấm 37oC,hình thành khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đườngkính 2-3 mm (Đào Trọng Đạt, 2001)

Môi trường EMB (Eosin Methylen Blue Agar): sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vikhuẩn hình thành hững khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim (Nguễn Ngọc Hải,2012)

Môi trường TBX (Tryptone Bile X-Glucurnide Agar): đây là một phương tiện

và đã được phát triển như là một môi trường chọn lọc để phân lập và địnhlượng Escherichia coli trong mẫu thực phẩm Dựa trên Tryptone Bile Agar kếthợp các tác nhân chromogenic X-glucuronide, trong đó phát hiện hoạt độngcủa enzyme glucuronidase, đây là enzyme cùng được phát hiện bởi thuốc thửMUG đã được chứng minh là rất cụ thể cho Escherichia coli, có thể đượcphân biệt với các sinh vật coliform khác Kết quả ở các khuẩn lạc là màu xanh,trong khi coliforms khác là không màu (Bavo Verhaegen, 2015)

2.1.3 Đặc tính sinh hóa

Hầu hết các trường hợp E coli có thể lên men một số loại đường bao gồm

arabinose, glucose, galatose, fructose, saccharose và maltose Khả năng lênmen glucose với việc sản xuất acid, sinh hơi cũng như sinh Indole là một đặc

tính cơ bản của E coli (Soja, 1965; Bettelheim, 1994; trích dẫn bởi Anna

Milena Ulmer Franco, 2011)

Phản ứng Voges Proskauer và oxidase âm tính Có thể dung các xét nghiệm

sinh hóa phân biệt E coli từ các loài Escherichia khác và vi khuẩn thuộc họ Enterobaccteriaceae E coli phân lập từ gia cầm có đặc tính sinh hóa tương tự

E coli phân lập từ các nguồn khác (Hồ Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Theo Nguyễn Tiến Dũng (2007), vi khuẩn E.coli xuất hiện sớm ở động vật

ngay sau khi sinh khoảng 2 giờ, chúng thường ở phần sau của ruột Trongnhiều trường hợp còn tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác trong cơ

thể Để phân biệt vi khuẩn E.coli với vi khuẩn đường ruột khác, người ta

thường sử dụng phản ứng IMViC qua các môi trường Tryton (thử nghiệm sinhindole), MR (Methyl Red), VP (Voges Prokauer), Simmons citrate (NguyễnNgọc Hải, 2012)

Phản ứng sinh Indole

Tiến hành phản ứng: cấy vi khuẩn vào môi trường tryptone, ủ ở 37oC Sau 24giờ, nhỏ 5 giọt dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, để yên vài phút,theo dõi sự tạo màu đỏ trrong lớp dung môi hữu cơ

Phản ứng (+): vòng thuốc thử chuyển màu đỏ, phản ứng (-): có lớp màu vàngcủa thuốc thử trên bề mặt môi trường

Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có thể sản xuất indol từ axit amin tryptophanbằng cách sử dụng enzyme tryptophanase (Trần Linh Thước, 2003)

Tryptophan > Indole + pyruvic acid + NH3

âm tính thì môi trường không đổi màu (Stephan et al., 2013).

Nguyên tắc: Điều này là để phát hiện những khả năng của một sinh vật để sảnxuất và duy trì sản phẩm axit cuối ổn định từ quá trình lên men glucose Một

số vi khuẩn sản xuất ra một lượng lớn axit từ quá trình lên men glucose mà nóvượt qua những tác dụng đệm của hệ thống Methyl red là một chỉ số pH, màvẫn còn màu đỏ ở độ pH 4,4 hoặc ít hơn

tryptophanase

H2O

Phản ứng (+): có màu đỏ trên bề mặt môi trường, phản ứng (-): môi trườngkhông đổi màu.

Nguyên tắc: trong quá trình lên men glucose, E coli có thể cho những sản

phẩm cuối khác nhau, một trong số đó là acetonin Khi bổ sung vào môitrường vài giọt VP1 và VP2 aceton sẽ tạo ra một phức hợp máu đỏ (Trần LinhThước, 2003)

Glucose + 1/2O2 > 2,3-butanediol + H2O + 2 CO2

2,3-butanediol > Acetoin

Acetoin + α – Naphthol > Diacetyl

Diacetyl + Guanidine > màu đỏ

citrate làm nguồn carbon duy nhất (Quinn et al., 2004).

Citrate > Oxaloacetate + Acetate

2,3-butanediol dehydrogenase

40% NaOH

O2

E coli là vi khuẩn không sinh nha bào nên không chịu được nhiệt độ cao, có

thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C sau 30 phút, ở 70oC sau 2 phút, trong điều kiệnđông khô vi khuẩn có thể sống lâu (Hồ Thị Việt Thu, 2012)

Các chất sát trùng thông thường như acid phenic, formol, hydroperoxide 1%diệt được vi khuẩn trong vài phút Sự sinh sôi của hầu hết các chủng bị ức chế

khi pH < 4,5 và pH > 9 nhưng không chết E coli ở dạ dày ruột có thể sống sót

ở pH 2,5 ít nhất là 2 giờ Muối 8,5 % sẽ ngăn ngừa sự tăng trưởng nhưng

không bất hoạt vi khuẩn (Barnes et al., 2008).

Escherichia coli thường là một vi khuẩn đường ruột không gây bệnh Tuy

nhiên, một số chủng đã có được các yếu tố độc tính và có thể gây ra nhiềubệnh ở động vật khi sức đề kháng của chúng bị giảm sút (Stenutz, 2006) Dựatrên đặc điểm gây bệnh, chúng được phân thành tám nhóm nhỏ như sau

(Antão et al., 2008)

EPEC (Enteropathogenic E coli): E coli gây bệnh đường ruột.

ETEC (Enterotoxicgenic E coli): E coli sinh độc tố ruột.

EIEC (Enteroinvasive E coli): E coli xâm nhập ruột.

EAEC (Enteroaggregative E coli): E coli ngưng tập ruột.

DAEC (Diffusely adherent E coli) : E coli bám dính phân tán.

EHEC (Enterohaemorrhagic E coli) : E coli gây xuất huyết ruột.

MAEC (Meningitidis-associated E coli): E coli gây bệnh viêm màng não UPEC (Uropathogenic E coli): E coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu.

2.1.5 Phương thức lây truyền bệnh

Tính gây bệnh

Theo Wilson et al (2002), để có thể gây bệnh trước hết vi khuẩn E coli phải

bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính Sau đó nhờcác yếu tố xâm nhập vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột

Ở đó vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá hủy lớp tế bào biểu mô gây viêm ruộtđồng thời sản sinh độc tố đường ruột Độc tố đường ruột tác động vào quátrình trao đổi muối, nước, làm rối loạn chu trình này Nước từ cơ thể tập trungvào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ơ ruột gây nên một tácdụng cơ học làm nhu động ruột tăng, đẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây nênhiện tượng tiêu chảy Sau đó phát triển ở thành ruột vi khuẩn vào hệ lâm bađến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu Trong máu, vi khuẩn chống lại hiệntượng thực bào gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu Từ hệ tuần hoàn, vikhuẩn đến các tổ chức, cơ quan khác nhau Ở đây vi khuẩn phát triển lên lầnthứ hai, phá hủy tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết Các yếu tố gây

bệnh của E coli gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất độc tố E coli có sẵn trong

ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề kháng của con vật

giảm Bệnh do E coli có thể xảy ra như một bệnh truyền nhiễm kế phát trên

cơ sở thiếu vitamin và mắc bệnh do virus và kí sinh trùng Khi tỉ lệ E coli

giảm xuống dưới 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột thì mới xuất hiệncác triệu chứng rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn

E.coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề

kháng của con vật giảm Tuy từng loại mà cơ chế gây bệnh có khác nhau:EPEC (Enteropathogenic E.coli) gây viêm ruột non: ETEC (EnterotoxigenicE.coli) gây bệnh do sinh độc tố; EIEC (Enteroinvasive E.coli) gây bệnh do cókhả năng xâm nhập vào niêm mạc ruột già, cơ chế giống vi khuẩn Shigella gâytiêu chảy có đờm lẫn máu; EAEC (Enteroaggregative E.coli) gây bệnh do bámvào niêm mạc và làm tổn thương chức năng ruột; EHEC (EnterohaemorrhagicE.coli) gây bệnh làm tổn thương xuất huyết ruột (Lê Hồng Hinh, 2008)

Các chủng EHEC là một mối đe dọa cho sức khỏe con người, đặc biệt làserotype O157:H7 Vi khuẩn được truyền sang người chủ yếu thông qua việc

sử dụng các thực phẩm sống hoặc chưa nấu chín kỹ, ngoài ra vi khuẩn có thể

bị lây nhiễm vào thực phẩm thông qua môi trường xung quanh Chỉ cần mộtlượng rất nhỏ vi khuẩn cũng đủ gây bệnh và EHEC thường dẫn đến hội chứngtán huyết-tăng ure máu (HUS) rất phổ biến ở trẻ em EHEC thường được tìmthấy nhiều nhất ở động vật nhai lại, nhưng đôi khi chúng vẫn có thể hiện diệntrên các động vật khác như heo, chó mèo hoặc gà (WHO, 2011)

Vi khuẩn E coli gây bệnh trên gia cầm thuộc nhóm APEC (Avian Pathogenic

E.coli), chúng gây ra bệnh Colibacillosis (nhiễm khuẩn E.coli) trên gà, đây làmột bệnh cấp tính, dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể trong ngành công nghiệpchăn nuôi gà trên toàn thế giới (Ewers C, 2003) Tỉ lệ nhiễm trong đàn thườngtrên 10%, tỉ lệ chết thường thấp hơn 5% nhưng đôi khi có thể lên đến 20% (Hồ

Thị Việt Thu, 2012) Gà mắc bệnh do E coli có biểu hiện đờ đẩn, giảm tăng

trọng, có triệu chứng hô hấp Sau đó gà bị nhiễm trùng huyết, nhiệt độ tăngcao 420C- 430C Lông xù có bết phân, sau đó gà chết Một số gia cầm mắcbệnh cố triệu chứng què từ mức độ nhẹ cho đến nặng, đi dứng khó khăn

Nguồn lây nhiễm

Theo Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền (2012), hầu hết các loài động vật

đều có E coli thường trú trong ống tiêu hóa Ở ống tiêu hóa gia cầm, mật độ

E coli có thể đến 106CFU/g Sự lây nhiễm E coli từ trứng thì phổ biến và là

nguyên nhân gây tỉ lệ chết cao cho gia cầm mới nở Bình thường có khoảng

0,5-6% trứng gia cầm khỏe có chứa E coli, 26,5% gà mái nhiễm E coli đẻ trứng có vi khuẩn E coli Tuy nhiên đường lây nhiễm qua phân vẫn là cách

lây truyền quan trọng nhất

Vi khuẩn E coli hiện diện thường xuyên trong đường ruột và được thải qua

phân với số lượng lớn Sự tiếp xúc trực tiếp, gián tiếp với phân có thể đưanhững chủng mới vào bầy đàn Bệnh có thể lây qua đường tiêu hóa, qua vết

thương ngoài da, qua niêm mạc bị tổn thương (Barnes et al., 2008).

Ngoài ra, E coli có thể truyền qua trứng do cơ thể gà mẹ bị nhiễm bệnh,

truyền lây qua đường hô hấp do niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn từmôi trường xâm nhập qua vết thương vào cơ thể, truyền qua vỏ trứng do bịnhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường ở chuồng trại bị nhiễm trùng, lây qua thức

ăn và nước uống bị nhiễm trùng (Nguyễn Xuân Bình và ctv., 2005).

Mặt khác, E coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh

khi sức đề kháng của con vật bị giảm sút (do chăm sóc, nuôi dưỡng, thời tiết

và thức ăn,…) Bệnh do trực khuẩn E coli có thể xảy ra như một bệnh truyền

nhiễm kế phát trên cơ sở thiếu vitamin, mắc các bệnh virus và ký sinh trùng

E coli thường gây bệnh cho gia súc mới đẻ từ 3 - 5 ngày hoặc 4 - 8 ngày Người ta gọi Colibacillosis là một bệnh đường ruột ở ngựa, bê, cừu, lợn và gia cầm non do E coli gây ra (Lưu Hữu Mãnh, 2009).

Nguồn gây bệnh E coli chủ yếu là từ con bệnh và con khỏe mang trùng bài

xuất mầm bệnh ra môi trường nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các

loài gậm nhấm lây truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từmôi trường bên ngoài vào (Nguyễn Xuân Bình, 2005).

Côn trùng cánh cứng (bọ hung) có thể làm lan truyền bệnh E coli do ăn phân của gia cầm, vi khuẩn E coli có thể tồn tại bên ngoài cơ thể bọ cánh cứng đến

12 ngày và trong phân 6 - 10 ngày (Nguyễn Bá Hiên, 2013)

2.1.6 Kháng nguyên

E coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp nên hệ thống phân nhóm

serotype được sử dụng dựa vào việc xác định kháng nguyên bề mặt O, K, H.Hiện có khoảng 180 kháng nguyên O, 80 kháng nguyên K, 60 kháng nguyên

H (Ana Milena Ulmer Franco, 2011)

Vi khuẩn E coli được chia thành các serotype khác nhau dựa vào cấu trúc kháng nguyên Cấu trúc kháng nguyên của E coli gồm: kháng nguyên thân O,

kháng nguyên vỏ K, kháng nguyên lông H và kháng nguyên F

và cs, 2007)

Kháng nguyên K

Bản chất hóa học của kháng nguyên K là polysaccharide, hòa tan trong dungdịch phenol45%, gồm 3 loại kháng nguyên L, A, B (P H Makela và H Mayer,

2006) Một số nhóm kháng nguyên K của E.coli tính kháng nguyên rất kém,

cơ thể vật chủ không đáp ứng miễn dịch (Gyles và Thoen, 2003) Kháng

nguyên K của rất nhiều chủng E.coli có khả năng ngưng kết chéo với nhau Một số kháng nguyên K của nhóm E.coli này có thể ngưng kết chéo với kháng thể O của nhóm E.coli khác (Orskov và cs, 2007)

Kháng nguyên H

Cho đến nay đã có 56 kháng nguyên H được phát hiện, đó là nhóm kháng

nguyên có nguồn gốc từ lông tế bào vi khuẩn E.coli (flagella antigens) và

chúng được gọi là kháng nguyên H Khả năng phòng vệ của kháng nguyên Hvẫn chưa được nghiên cứu kỹ Tuy nhiên nhiều tác giả cho rằng kháng nguyên

H không phải là một yếu tố kích thích miễn dịch, thường xuyên biến đổi Đa

số các chủng ETEC là không có kháng nguyên H, chúng thường không diđộng (Phạm Hồng Ngân, 2011)

Kháng nguyên F (Kháng nguyên pili)

Ngoài lông ra, ở nhiều vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn E.coli nói

riêng còn có những bộ phận khác hình sợi, gọi là pili Tất cả các kháng nguyênpili đều là protein, chúng được cấu tạo từ các amino axit cơ bản Môi trườngnuôi cấy, nhiệt độ, cấy chuyển lên các môi trường nhiều lần ảnh hưởng đếntổng hợp kháng nguyên pili (Duchet-Suchaux và cs, 2006) Kháng nguyên pilikích thích sản sinh kháng thể đặc hiệu, ngưng kết hồng cầu một số loài gia súc(Isaacson, 2007) Kháng nguyên pili không cùng serotype, mặc dù trong cấutrúc một số kháng nguyên pili có một vài thành phần giống nhau (De Graaf,2002)

Theo Ewers C (2003) hiện nay các serotype O1:K1, O2:K1 và O78:K80 được

công nhận là phổ biến nhất trong các chủng E coli gây bệnh trên gà.

Theo Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền (2012), hầu hết các chủng E coli

phân lập từ gia cầm chỉ gây bệnh cho gia cầm, ít nguy hại đến người và cácđộng vật khác như: O1, O2, O35, O78, O18, O81, O115 , O 116 và O132 Tuy

nhiên loài gia cầm cũng mẫn cảm với chủng E coli O157:H7 là một chủng

sinh độc tố Shiga gây hại cho người

Hiện nay có hơn 700 type kháng nguyên hay serotype của E coli từ sự tổ hợp

của các nhóm kháng nguyên O, H, K Gần đây, vài phân lập từ gia cầm bệnhthuộc các serotype O18, O81, O115, O116, O132 cho thấy đã xuất hiện một sốtác nhân gây bệnh mới (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

2.1.7 Độc tố gây bệnh của vi khuẩn E Coli

Dựa vào khả năng gây bệnh, các E Coli có khả năng gây bệnh được chia làm

2 nhóm: nhóm gây bênh đường ruột (IPEC) và nhóm gây bệnh ngoài đường

ruột (ExPEC) Mặc dù đa số các nhiễm trùng E coli ở gia cầm xảy ra ở ngoài đường ruột nhưng một số chủng APEC có đặc tính liên quan đến E Coli gây

bệnh đường ruột như EPEC, ETEC, EIEC và EHEC Các thử nghiệm cho thấy

48% các serotype E coli là nguyên nhân gây viêm màng ngoài tim và gây chết

ở gà 3 tuần tuổi Ngoài đường ruột gồm MAEC (Meningitidis-associated E Coli), UPEC (Uropathogenic E coli) (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền,

2012)

2.2 Tổng quan đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn

2.2.1 Khái niệm kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Khái niệm kháng sinh

Kháng sinh là những chất hóa học được chiết xuất từ môi trường nuôi cấy visinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp, chúng có khả năng kìm hãm sự phát triểnhoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạnchuyển hóa cần thiết của vi snh vật (Võ Thị Trà An, 2010)

Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc sản xuất bằng những conđường tổng hợp Kháng sinh chỉ gồm những chất ở nồng độ thấp đã có tácdụng ức chế hay tiêu diệt sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn gây bệnh,nhưng không, hay rất ít gây độc cho con người, gia cầm và gia súc (Bùi ThịTho và Nghiêm Thị Anh Đào, 2005)

Đề kháng kháng sinh

Về nguyên lý, kháng sinh là chất chế sự phát triển của vi khuẩn, nhưng nếutrong môi trường kháng sinh ở nồng độ thường dùng mà vi khuẩn vẫn pháttriển được gọi là hiện tượng đề kháng kháng sinh

Trong tự nhiên phần lớn các vi khuẩn đều sỡ hữu riêng các gen kháng khángsinh Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên và sự đấu tranh sinh tồn đã giúp các loài vikhuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, do vậy sự đề khángkháng sinh của vi khuẩn thường xuất hiện rất nhanh ngay sau khi kháng sinhđược đưa vào sử dụng, ví dụ streptomycin được đưa vào sử dụng năm 1943đến năm 1959 vi khuẩn đã đề kháng với khấng sinh này (Trần Huy Hoàng,2013)

2.2.2 Phân loại đề kháng kháng sinh

Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có nguồn gốc ở gene Các gene khángthuốc hiện diện hoặc ở trong nhiễm sắc thể (đề kháng nhiễm sắc thể), hoặctrong một yếu tố di động như các plasmide, các yếu tố có thể chuyển vị tríhoặc integron (đề kháng ngoài nhiễm sắc thể) (Hiroshi Nikaido, 2009)

Đề kháng tự nhiên

Vi khuẩn đã có tính kháng thuốc từ trước khi tiếp xúc với kháng sinh Mỗi loàihoặc mỗi giống được đặc trưng và phát họa phổ hoạt động kháng sinh riêng.Các gene đề kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn Đề kháng tự nhiên

là đặc điểm có ở tất cả các chủng của cùng một loài, và được biết ngay từ lúcđầu khi nghiên cứu xác định hoạt tính của kháng sinh và xác định phổ tácdụng của thuốc kháng sinh (Kathleen and Arthur, 2001)

Đề kháng mắc phải

Vi khuẩn đang nhạy cảm với kháng sinh nhưng sau một thời gian tiếp xúc trởnên không nhạy cảm nữa Nguyên nhân là do: đột biến hoặc kháng qua nhiễmsắc thể dẫn đến thay đổi đích tác động của kháng sinh; kháng qua plasmid,thường là sản xuất các enzyme làm bất hoạt kháng sinh; hoặc làm giảm ái lựccủa kháng sinh với mục đích tác động hoặc thay đổi đường chuyển hóa.Plasmid là những đoạn DNA nhỏ có dạng vòng tròn, nằm ngoài DNA nhiễmsắc thể Điểm thuận lợi của plasmid là chúng có thể di chuyển dễ dàng qua cácmàng tế bào và chúng có thể trao đổi các đoạn DNA với nhau giữa các vikhuẩn (Trang Quan Sen, 2005) Plasmid được tìm thấy trong hầu hết các loại

vi khuẩn, có khả năng tồn tại một cách độc lập với bộ gen của vi khuẩn Cácplasmid kháng thuốc (R-plasmid) mang các gen mã hóa các enzyme làm bấthoạt kháng sinh và thay đổi hệ thống vận chuyển qua màng tế bào (Bùi VănNghĩa, 2012) Đáng chú ý là có nhiều gen kháng thuốc có thể cùng nằm trênmột plasmid duy nhất, do đó tính đa kháng có thể được lan truyền giữa cácchủng vi khuẩn khác nhau (Hiroshi Nikaido, 2009)

Vi khuẩn kháng kháng sinh có thể phát triển sự kháng chéo với các kháng sinhtrong cùng họ Các tính chất di truyền cũng như tính đề kháng từ một nhóm vikhuẩn này có thể truyền sang một nhóm hoặc loài vi khuẩn khác trong môitrường, đặc biệt là giữa các vi khuẩn đường ruột gram âm(Enterobacteriaceace), do vậy có những vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc vớikháng sinh nhưng đã mang trong mình tính đề kháng do một vi khuẩn kháctruyền sang (Võ Văn Ninh, 2001)

Nghiên cứu của Leverstein Van Hall et al (2011) về mặt di truyền của các

chủng E coli ESBL thì các gen ESBL nằm trên plasmid phân lập được trênngười và trên gia cầm thì tương tự nhau do đó ESBL có thể di truyền quachuỗi thức ăn Ngoài ra, có thể có nhiều gen kháng thuốc đều cùng nằm trênmột plasmid duy nhất di đó một vi khuẩn có thể đề kháng với nhiều loại kháng

sinh cùng lúc (Pitout et al., 2004).

2.2.3 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Theo Nguyễn Thị Yến Chi (2011), có 4 cơ chế chính gây đề kháng kháng sinhcủa vi khuẩn như sau

Ức chế bằng enzyme

Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh Sựsản xuất enzyme có thể được cảm ứng bới một yếu tố bên ngoài (một khángsinh khác) hoặc bất biến (không bị ảnh hưởng bởi kích thích bên ngoài)

Sự sinh men beta-lactamase: các beta-lactamase là các men do vi khuẩn sinh

ra và lây truyền theo đường nhiễm sắc thể hoặc plasmid Các men này đềkháng kháng sinh rất hiệu quả Chúng làm bất hoạt các thuốc nhóm beta-lactamine bằng cách phá hủy nối amide của vòng beta-lactam Trên toàn cầu,kháng sinh họ Beta-Lactamines được sử dụng nhiều nhất trong tất cả cácnhóm, vì thế vấn đề đề kháng với kháng sinh nhóm này rất đáng lo ngại

Giảm tính thấm của tế bào vi khuẩn

Các vi khuẩn là các vi sinh vật đơn bào: màng tế bào chất phân cách tế bàochất với môi trường bên ngoài Các vi khuẩn gram âm còn được trang bị thêmmột vỏ bên ngoài, gọi là thành ngoài, có tác dụng như một hàng rào che chởcho các bộ phận nằm ở bên trong Chất dinh dưỡng và kháng sinh phải đingang qua lớp vỏ này để thấm vào bên trong vi khuẩn, theo cách thức khuyếntán thụ động ngang qua các kênh (lỗ nhỏ) Sự giảm tính thấm của tế bào làmgiảm lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác dụng, nguyên nhân dobiến đổi tính thấm lớp màng bên trong hoặc bên ngoài vi khuẩn Sự biến đổicác lỗ của lớp thành tế bào vi khuẩn gram âm có thể làm giảm hoặc ngăn cản

sự khuếch tán của kháng sinh vào vị trí tác dụng Dạng đề kháng này nóichung xảy ra đối với nhiều kháng sinh của nhiều nhóm khác nhau, do có khicác kháng sinh khác nhau nhưng có thể dùng chung một loại lỗ Mặt khác, sự

đề kháng này là đặc hiệu khi một kháng sinh chỉ dùng riêng một loại lỗ Ví dụ

sự đề kháng của Pseudomonas aeruginosa với imipenem là sự đề kháng đặc

hiệu gây ra do mất đi các lỗ riêng dành cho các carbapeneme

Các đột biến của các lỗ đóng vai trò quan trọng trong việc phát tán đề kháng,đặc biệt tiếp theo sự giảm kích thước lỗ hoặc giảm số lượng các lỗ Tính thấmliên quan đến các lỗ thường phối hợp với việc tổng hợp các beta-lactamases vàtạo nên sự đề kháng cho vi khuẩn Đôi khi, có vi khuẩn chỉ trở nên đề kháng

khi xảy ra đồng thời hai hiện tượng trên Ví dụ, với vi khuẩn Enterobacter sp.

và vi khuẩn Serratia sp., sự đề kháng với imipeneme là do sự biến đổi đồng

thời tính thấm tế bào và tăng tổng hợp các men beta-lactamases ở nhiễm sắcthể