NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN TÊN ĐỀ TÀI NGHI

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN

TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM

CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH

Mã số: VAST03.04/15-16

Hướng KHCN: Khoa học vật liệu (Mã hướng: VAST03)

Đơn vị chủ trì:Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trần Thị Thanh Vân

NHA TRANG, 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NHA TRANG

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI THUỘC CÁC HƯỚNG KHCN ƯU TIÊN CẤP VIỆN HÀN LÂM KHCNVN

TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẬT LIỆU NANO ULVAN

POLYSACCHARIDE TỪ ULVAN POLYSACCHARIDE

TRONG RONG LỤC, HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG LÀM

CHẤT DẪN THUỐC TRONG Y SINH

Mã số: VAST03.04/15-16

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài

NHA TRANG, 2017

1.2.2 Ulvan : Thành phần hóa học, cấu trúc và ứng dụng 5

1.4 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của Đề tài 17

2.2.1 Phân tích thành phần hóa học chính của các mẫu rong thu thập được

thuốc

3.1 Thu thập một số loài rong lục thuộc 02 chi ulva hoặc chi Enteromorpha và phân tích thành phần hóa học chính của các mẫu rong thu thập được

38

3.2 Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ một loài rong lục thuộc chi ulva

43

3.2.2 Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết polysaccharide 44

3.3 Xây dựng quy trình chuyển hóa các ulvan polysaccharide thành nano ulvan polysaccharide từ một loài rong lục thuộc chi ulva làm nguyên liệu điều chế chất dẫn thuốc

53

3.3.2 Axetyl hóa ulvan polysaccharide thủy phân 57 3.3.3 Phân tích phổ huỳnh quang của AcU và EU 59 3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ polyme amphiphilic (AcU) lên kích thước hạt nanogel và thế zeta

62

3.4 Nghiên cứu cấu trúc hóa học và cấu hình không gian các sản phẩm ulvan polysaccharide và nano ulvan polysaccharide

71

3.5 Hoạt tính sinh học của ulvan và Acetyl ulvan (AcU) 84

3.6.Đánh giá hiệu quả của việc nano hóa định hướng cho khả năng dẫn thuốc

DA : Mức độ acetyl hóa DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI -MS : Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử Gal : Galactose

GlcA : Glucuronic acid GPC : Sắc ký thẩm thấu gel Hela :Ung thư cổ tử cung Hep-G2 : Ung thư gan người HMBC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết

IC50 : Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm IdoA : Iduronic acid

IR : Phổ hồng ngoại

J (Hz) : Hằng số tương tác MALDI-MS : Phổ khối lượng ion hóa hấp thụ nền laze

Man : Mannose MBC : Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MCF-7 : Ung thư vú người

MIC : Nồng độ ức chế tối thiểu NCI : Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ NOESY : Phổ tương tác không gian đồng hạt nhân 1H-1H

OD : Mật độ quang học PIC-NGs Polyion complex nanogels

Rha : Rhamnose SAXS : Tán xạ tia X góc nhỏ SEM : Hiển vi điện tử quét

SP : Sulfate polysaccharide TFA : Trifluoroacetic acid TMS : Tetramethylsilane

UL : U lvan chiết từ rong lục Ulva lactuca

AcU : Ulvan acetyl hóa từ UL

UR : Ulvan chiết từ rong lục Ulva reticulata

UroA : Uronic acid WHO : Tổ chức y tế thế giới Xyl : Xylose

δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học

DANH MỤC BẢNG

01 Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của polysaccharide dạng ulvan chiết

từ một số loài rong lục thuộc 2 chi rong Ulva và Chaetomorpha

21

02 Bảng 2.1 Danh sách loài rong địa điểm và thời gian lấy mẫu 28

03 Bảng 2.2: Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

05 Bảng 3.2 Thành phần hóa học chính của rong lục 41

06 Bảng 3.3 Thành phần polysaccharide của rong lục 42

07 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết

polysaccharide

45

08 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hiệu

suất chiết polysaccharide

45

09 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết

polysaccharide

46

10 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất chiết polysaccharide 47

11 Bảng 3.8 Các yếu tố khảo sát điều kiện chiết tối ưu 47

12 Bảng 3.9 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa theo phương án CCF 48

13 Bảng 3.10 Phân tích phương sai kết quả thí nghiệm tối ưu hóa 49

14 Bảng 3.11 Kết quả xác định khối lượng phân tử của các ulvan 55

15 Bảng 3 12 Ảnh hưởng của nồng độ polyme amphiphilic lên kích

thước hạt và thế zeta của hạt

62

16 Bảng 3.13 Các đỉnh đặc trưng trên phổ IR của AcU và AcU-Cur 67

17 Bảng 3.14 Kết quả phân tích phổ IR của ulvan chiết từ rong ulva

lactuca

72

18 Bảng 3.15 Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL 79

19 Bảng 3.17 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của

ulvan chiết từ 02 loài rong Ulva reticulata (UR) và Ulva lactuca

85

(UL) và AcU

20 Bảng 3.17 Kết quả thử độc tính trên các dòng tế bào ưng thư của

ulvan chiết từ rong lục Ulva lactuca

88

21 Bảng 3.18 Kết quả thử độc tính trên các dòng tế bào ưng thư của

ulvan chiết từ loài rong Ulva reticulata

02 Hình 1.2 Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan 6

03 Hình 1.3 Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua a) Ca2+ của borate ester

hoặc một phần của b) carboxylate và c) sulfate

8

04 Hình 1.4 Nanogel điều chế dựa vào các tương tác tĩnh điện giữa các

polymer

13

06 Hình 1.6 Nanogel được điều chế từ polymer được biến tính chứa các

gốc kỵ nước

15

07 Hình 1.7 Quá trình hình thành nanogel CHPOA-PEGSH 16

08 Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa 20

09 Hình 1.9 Cấu trúc sợi nano được hình thành bởi tác dụng của Ulvan

với PVA poly(vinyl alcohol) / H3BO3/Ca2+ thông qua các liên kết

13 Hình 3.4 Quy trình tách chiết ulvan từ loài rong Ulva lactuca 51

14 Hình 3.5 Quá trình tự kết tụ tạo michelle cấu trúc lõi-vỏ 53

16 Hình 3.7 Phổ GPC ulvan thủy phân ở trong thời gian 2 giờ 56

17 Hình 3.8: Phổ GPC ulvan thủy phân ở trong thời gian 6 giờ 56

19 Hình 3.10 Phổ 1H NMR mẫu ulvan thủy phân (UL) và ulvan thủy

phân được acetyl hóa (AcU)

58

20 Hình 3.11 Phổ 1H NMR mẫu ulvan thủy phân (U) và ulvan thủy 59

phân được ester hóa (EU)

21 Hình 3.12 Phổ huỳnh quang kích thích pyrene mẫu Ac.U và EU 61

22 Hình 3.13 Phổ huỳnh quang phát xạ pyrene mẫu AcU và EU 61

23 Hình 3.14 Kích thước hạt nanogel tại các nồng độ Polyme

amphiphilic (AcU) khác nhau

63

24 Hình 3.15 Phổ IR của AcU (xanh), AcU-Cur (đỏ) và Cur (vàng) 65

25 Hình 3.16 .Phổ huỳnh quang của curcumin trong nước (Cur-water) và

Curcumin trong nanogel (Cur-Au)

66

28 Hình 3.19 Đặc điểm hình thái của nanogel AcU-Cur a Ảnh

FESEM B Phân bố kích thước hạt curcumin từ ảnh chụp FESEM C

ảnh chụp TEM

69

29 Hình 3.20 Phổ IR của ulvan chiết từ rong ulva lactuca 72

30 Hình 3.21 Phổ 1H-NMR của ulvan chiết từ rong ulva lactuca 73

36 Hình 3.27 Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 81

37 Hình 3.28 Đồ thị Kratky của dung dịch UR 1% trong nước và trong

NaCl 0,5 M

83

38 Hình 3.29 Biểu đồ Guinier của dung dịch UR 1% trong nước 84

39 Hình 3 30 Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng vi khuẩn A) E coli

and B) Pseudomonas aeruginosa và C) Enterobacter cloace của

ulvan chiết từ loài rong Ulva reticulata trên đĩa thạch

85

40 Hình 3 31 Hình ảnh thể hiện sự ức chế các dòng tế bào ung thư a)

HepG2, b) MCF7 và c) Hela của ulvan UL với các nồng độ khác

nhau

87

41 Hình 3.32 Hình chụp curcumin tan trong dung dịch AcU (Au-Cur) và

curcumin tan trong nước (Cur)

91

42 Hình 3.33 Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng giải phóng 91

curcumin

43 Hình 3.34 Hiệu quả gây độc tế bào ung thư gan (HepG2) của

DMSO-Cur và AcU-Cur tại các nồng độ curcumin khác nhau

92

44 Hình 3.35 Hình ảnh thể hiện sự ức chế các dòng tế bào ung thư

HepG2 của AcU-cur với các nồng độ curcumin khác nhau

93

MỞ ĐẦU

Ulvan là dạng sulfate polysaccharide được tách chiết từ một số loài rong lục

thuộc 02 chi rong là Ulva và Enteromorpha Chúng hòa tan trong nước và được

tạo bởi các thành phần chủ yếu là rhamnose, glucuronic, iduronic acid, xylose và nhóm sulfate để tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide chính là ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng A (β-D-GlcA (1 →4) α-L-Rha 3S →1) và ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng B (α-L-IdoA (1 →4) α-L-Rha 3S →1) Tùy theo các loài rong khác nhau mà các thành phần trên biến đổi khác nhau và tên gọi các ulvan theo tên các gốc đường khác nhau như sulfated glucuronoxylorhamnan, glucuronoxylorhamnogalactan và xyloarabinogalactan

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của ulvan cho thấy tất cả các ulvan chiết

từ các loài rong lục khác nhau thuộc 02 chi rong Ulva và Enteromorpha đều thể

hiện các hoạt tính sinh học sau: chống đông máu, chống oxy hóa, hạ mỡ máu, chống ung thư, kháng nấm, tăng cường hệ miễn dịch

Hiện nay, trong lĩnh vực y sinh học các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm các vật liệu sinh học mới với các tính năng đặc biệt để phục vụ cho việc chữa bệnh và phục vụ cuộc sống con người Một trong những vật liệu được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là các polymer sinh học có nguồn gốc thiên nhiên do khả năng tương thích sinh học cao và dễ phân hủy sinh học của chúng Đặc biệt là các polysaccharide từ các loài rong biển Trong một vài năm trở lại đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra các sulfated polysaccharide dạng ulvan chiết từ các loài rong lục, có cấu trúc hóa học tương tự như các glycosaminoglycan (GAGs) của động vật có vú và chúng có tính chất hóa học tương tự các hyaluronan và choidrotin sulfate do trong phân tử của chúng có chứa đồng thời nhóm sulfate và glucuronic acid Sự có mặt 02 nhóm điện tích này tại các gốc đường khác nhau làm cho các sulfate polysaccharide dễ dàng tham gia biến đổi hóa học tạo thành các sản phẩm ulvan có cấu trúc rỗng dạng sợi nano, hạt nano và cấu trúc mạng lưới polymer hydrogel, tạo nhiều kiểu liên kết ngang khác nhau Vì vậy chúng có khả năng được

sử dụng nhiều trong lĩnh vực vật liệu dẫn thuốc Chính vì vậy các nano ulvan polysaccharide thu nhận từ một số loài rong lục được coi như là nguyên liệu ban đầu để tạo ra các hệ chất dẫn thuốc khác nhau

Việc nghiên cứu sử dụng các polyme y sinh có cấu trúc nano làm chất phân phối thuốc là một trong những ý tưởng có tính đột phá khoa học tuy nhiên mới chỉ

là những nghiên cứu bước đầu nhưng theo dự đoán khả năng áp dụng các nghiên cứu này bắt đầu có thể triển khai trong tương lai gần

Nước ta có hơn 3200 km bờ biển với nguồn tài nguyên rong biển rất phong phú

và đa dạng trong đó rong lục mà chủ yếu là các loài thuộc chi Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, Cladophora là nguồn lợi rong biển tự nhiên lớn

nhất với trữ lượng ước tính lên tới hàng ngàn tấn khô/năm Nguồn tài nguyên này dường như bị quên lãng và một số loài rong thuộc chi ulva được coi như là một trong những rác thải của biển gây ô nhiễm môi trường ven biển

Trong những năm gần đây đã có các công trình nghiên cứu qui trình tách chiết, thành phần, cấu trúc, hoạt tính, của các chất có hoạt tính sinh học từ một số loài rong biển Việt Nam, tuy nhiên đối tượng nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các loài rong thuộc 02 ngành rong nâu và rong đỏ trong khi các nghiên cứu về rong lục rất

ít ỏi Đặc biệt là các nghiên cứu về về sulfated polysaccharide từ rong lục hầu như chưa được nghiên cứu Với sản lượng lên đến 42.000 tấn khô/năm trong đó hàm lượng sulfated polysaccharide chiếm tới 10 % rong khô, vì vậy rong lục sẽ là nguyên liệu tiềm năng để sản xuất sulfate polysaccharide ứng dụng trong trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm Để có thể khai thác nguồn rong lục nhằm tăng giá trị kinh tế của nguồn lợi rong biển định hướng cho việc khai thác sử dụng nguồn lợi rong biển hợp lý ở nước ta thì một trong những yêu cầu cấp thiết được đặt ra và cần được tiến hành đó là nghiên cứu tách chiết các ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục cho mục đích ứng dụng trong vật liệu y sinh

Mục tiêu của đề tài:

- Xây dựng được quy trình tách chiết ulvan Polysaccharide từ loài rong lục thuộc

chi rong Ulva hoặc chi Enteromorpha

- Đưa ra quy trình chuyển hóa Ulvan polysaccharide thành dạng nano polysaccharide hướng đến ứng dụng làm chất dẫn thuốc

Phạm vi nghiên cứu

a.Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số loài rong xanh sinh trưởng tại vùng biển Nha Trang –Khánh Hòa

b Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành tại Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, 2A Hùng Vương – Nha Trang – Khánh Hòa

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

1 Thu thập một số loài rong lục thuộc 02 chi ulva hoặc chi Enteromorpha và phân

tích thành phần hóa học chính của các mẫu rong thu thập được

2 Xây dựng quy trình tách chiết ulvan polysaccharide từ một loài rong lục thuộc

chi ulva

3 Xây dựng quy trình chuyển hóa các ulvan polysaccharide thành nano ulvan

polysaccharide từ một loài rong lục thuộc chi ulva làm nguyên liệu điều chế chất

6 Tạo sản phẩm ulvan Polysaccharide từ rong lục

7 Tạo sản phẩm nano ulvan polysaccharide từ ulvan Polysaccharide

8 Đánh giá hiệu quả của việc nano hóa định hướng cho khả năng dẫn thuốc

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Đưa ra số liệu khoa học về hàm lượng, hoạt tính sinh học và một vài dạng cấu trúc của ulvan và quy trình chiết tách chúng từ một loài rong lục sinh trưởng tại vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa

Đưa ra quy trình chuyển hóa Ulvan polysaccharide thành dạng nano polysaccharide hướng đến ứng dụng làm chất dẫn thuốc

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở dữ liệu góp phần mở ra hướng nghiên

cứu và ứng dụng các sulfate polysaccharide từ rong lục ứng dụng làm chất dẫn thuốc Các dữ liệu này chính là cơ sở khoa học định hướng cho việc sử dụng hợp

lý nguồn tài nguyên rong biển để tạo ra những sản phẩm có giá trị gia tăng

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Sulfate polysaccharide từ rong lục

Trên thế giới, các loài rong lục cho sulfate polysaccharide được chia thành

- Nhóm rong cho sulfate arabinogalactan: Bao gồm các loài rong lục thuộc

chi Codium như C fragile, C adhaerens, C cylindricum…

- Nhóm rong cho sulfate galactan: Bao gồm các loài thuộc chi Caulerpa, chủ yếu là loài C cupressoides và C racemosa

Theo sơ đồ ở Hình 1.1 cho thấy: nhóm rong lục chứa số lượng lớn các loài

cho SP bao gồm các chi Ulva (38%), Enteromorpha (nay gọi là Ulva) (14%), Monostroma (14%), Codium (16%), và Caulerpa (11%) Các chi còn lại bao gồm Capsosiphon, Chaetomorpha, Bryopsis, và Halimeda, chỉ chiếm 7% trong tổng số

(Hình 1.1)

Hình 1.1 Sơ đồ biểu thị sự phân bố các loài rong lục có sulfate polysaccharide

[68]

1.2 Rong lục chi Ulva và Ulvan

1.2.1 Rong lục chi Ulva

Rong lục là một trong 3 ngành rong chính đã biết hiện nay, chúng tồn tại trong tự nhiên với số lượng lớn và rất đa dạng về thành phần loài, bao gồm những

chi chủ yếu sau: Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Cladophora, Valonia, Boergessenia, Caulerpa, Bryopsis, Codium Trong đó các loài được sử dụng như

là nguồn thức ăn phổ biến thuộc các chi rong lục là Ulva, Enteromorpha, Caulerpa, Codium [68]

Ở nước ta, nguồn lợi rong lục rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các

chi rong Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm

69 loài trong tổng số 100 loài đã được định danh trên thế giới [2]

Rong lục chi Ulva được cho là rất giàu protein, carbohydrate, vitamins và các khoáng chất Trong đó, polysaccharides ngày càng được quan tâm nhiều nhất

do chúng có những tính chất vật lý và hóa học đáng chú ý và có nhiều tiềm năng ứng dụng trong y sinh học

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng có 4 dạng polysaccharide được tìm thấy từ rong lục chi Ulva bao gồm dạng tan trong nước là Ulvan, dạng không tan trong nước là cellulose, dạng tan trong kiềm là xyloglucan mạch thẳng và lượng nhỏ glucuronan [61]

1.2.2 Ulvan : Thành phần hóa học, cấu trúc hóa học và ứng dụng

* Thành phần hóa học và cấu trúc của ulvan

Theo công trình [72], bốn nhóm polysaccharide đặc trưng đã được xác định từ

sinh khối của các loài rong thuộc chi Ulva bao gồm: polysaccharide không tan là

cellulose, hàm lượng thấp hai loại polysaccharide tan trong kiềm là xyloglucan và glucuronan, và polysaccharide tan trong nước là ulvan Ulvan được phân bố trong không gian các thành tế bào tạo nên bởi hệ mạng các sợi cellulose Trong thân rong, ulvan đóng vai trò là polymer sinh học duy trì chức năng thẩm thấu cho rong

và độ bền vững thành tế bào rong Polysaccharide ulvan được cho là tương tác với các nhóm polysaccharide khác và protein bằng các kiểu liên kết khác nhau [61] Lahay M và các CS đã nghiên cứu về ulvan và đã xác định được các đơn vị lặp đi lặp lại trong cấu trúc của ulvan như sau: [92] [60]

- Cấu trúc ulvanobiuronic được tạo thành bởi các glucuronic acid, iduronic acid liên kết với sulfated rhamnose, ký hiệu là A3S và B3S:

độ tinh sạch cũng như hoạt tính của sản phẩm [20] Manose, galactose và arabinose là các saccharide tạp thường xuất hiện trong ulvan [34] [59] [96, 108]

Hình 1.2 Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan [60]

Như vậy, ulvan từ chi rong lục Ulva được tạo nên bởi các các thành phần

chính chủ yếu là Rha, GlcA, IdoA, Xyl và sulfate tạo thành chuỗi các disaccharide lặp lại với tỉ lệ khác nhau Cấu trúc chi tiết của các phân tử ulvan từ các loài rong

lục Ulva đã được các nhà khoa học công bố, bao gồm, kiểu liên kết glycoside, sự

sắp xếp các phân tử đường, cách phân nhánh và/hoặc kiểu sulfate hóa Các chuỗi oligosaccharide ulvan khác nhau này được tìm thấy trong những polysaccharide có

nguồn gốc từ các loài rong Ulva khác nhau, được giải thích là do chúng bị tác

động bởi các nhân tố sinh lý môi sinh làm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp

của rong Ví dụ, 2 mẫu ulvan từ rong lục Ulva rigida thu hái được ở quần đảo

Canary-Spain, và Brittany-France, cùng có chung cấu trúc chuỗi dạng -A3s-A3s,

-A3s-U3s-, -A3s-U2s,3s- ; khác nhau ở cấu trúc dạng -A3s-U3s-U3s-, -A3s-U2s,3s-U3s-, và -A3s-U2s,3s-U3s-U3s- đối với mẫu xuất xứ từ quần đảo Canary; còn mẫu từ Brittany chuỗi cấu trúc có dạng -A2g,3s-U3s và -A2g3s-U2s,3s- Trong đó U2s,3s là ulvanobiose 2,3-disulfate và A2g,3s gán cho dạng A ulvanobiouronic acid 3-sulfate bị thế ở vị trí C-2 của Rha 3-sulfate bởi một GlcA (Hình 1.2)

* Các tính chất hóa lý của ulvan

Các nhà khoa học đã chỉ rằng ulvan có cấu trúc đa dạng là do thành phần hóa học của ulvan rất phức tạp [80] Tính đều đặn cục bộ của ulvan tự nhiên dựa

vào sự lặp lại của các đơn vị aldobiuronic, được đặt tên là A3s và B3s (Hình 1.2), tồn tại trong thời gian ngắn gây ra sự tạo thành gel yếu [79] Cấu trúc đều đặn của ulvan bền là do tương tác hút và đẩy sinh ra giữa các nhóm chức của ulvan, đặc biệt là lực tĩnh điện Ulvan là một polymer mang điện tích âm do trong cấu trúc của nó chứa nhóm carboxylic và sulfate, độ bền của ulvan phụ thuộc vào độ pH và nồng độ ion trong dung dịch Điện tích thực trong ulvan tác động đến hình dạng của chuỗi polymer và điều khiển quá trình chuyển từ dạng này sang dạng khác của chuỗi [80] Về phương diện hóa học, khả năng thay đổi của ulvan là rất rõ ràng phụ thuộc vào hiệu lực tự nhiên của các nhóm chức Độ tan và hình thái học của ulvan tác động sâu đến khả năng phản ứng của nó trong môi trường làm việc

Ulvan được biết đến là chỉ tan trong nước do nó mang điện tích và bản chất

là có khả năng hút nước cao Tuy nhiên, dung dịch thu được không trong suốt, cho thấy dạng tập hợp cực nhỏ của vật liệu polymer không phân tán hoàn toàn trong dung môi Chính vì vậy, khi phân tích mẫu ulvan trong dung dịch nước, người ta thấy sự có mặt của các tập hợp dạng hình cầu được nối với nhau bởi các sợi rất nhỏ [99] Chuỗi hạt có cấu trúc siêu vi này thường được tạo thành bởi chất điện phân cao phân tử trong điều kiện không đủ dung môi [31, 95 ], hoặc là do sự có mặt nhóm methyl ở monomer rhamnose trong phân tử ulvan với hàm lượng lớn được cho là nguyên nhân của tính chất kị nước khác thường của polysaccharide mang điện tích cao [95] Sự hình thành các tập hợp siêu nhỏ trong dung dịch cũng không cho phép phân tích được khối lượng chính xác của ulvan, dạng tập hợp khác nhau ảnh hưởng mạnh đến sự phân bố píc, điều này thường biểu hiện rất rõ trên sắc đồ của phương pháp đo sắc ký thẩm thấu gel GPC [61]

Ulvan còn có khả năng tạo gel trong nước giống với alginate, khả năng tạo gel này đặc biệt liên quan đến borate ester, điều kiện tối ưu cho sự tạo thành hydrogel là khi có mặt của axit boric và ion canxi trong dung dịch với pH = 7,5, hydrogel tạo thành với độ đàn hồi (storage modulus) khoảng 250Pa Cơ chế của sự tạo gel là không tạo mạng hoàn toàn, bắt nguồn từ việc tạo thành borate ester với ulvan 1,2-diol tiếp theo bằng liên kết ngang qua ion Ca2+ Ion canxi sẽ làm cầu nối của phức và/hoặc làm cho borate ester trở nên bền hơn (Hình 1.3.a), nhóm sulfate

và carboxylic acid cũng có thể tạo liên kết với ion Ca2+ (Hình 1.3.b,c) góp phần vào quá trình tạo gel của ulvan [61]

Hình 1.3 Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua a) Ca2+ của borate ester hoặc một

phần của b) carboxylate và c) sulfate [61]

Không phải cấu trúc nào của ulvan cũng có khả năng tạo gel Trong công trình [60], nhóm các nhà khoa học đã phân tích phổ 11B và 13C NMR của các mảnh gel ulvan đã được thủy phân tự động Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở giá trị pH=7.5 (giá trị được cho là tối ưu để hình thành gel ulvan), các đỉnh của phức ulvan-boron không được quan sát thấy, tương ứng với gel ulvan không được hình thành Khi tăng giá trị pH từ 9 trở lên, ta chỉ quan sát thấy phức ulvan-boron đối với ulvan có cấu trúc A3S Do đó, ta có thể khẳng định rằng cấu trúc ulvan A3S tham gia vào quá trình cố định acid boric trong sự hình thành gel ulvan (cấu trúc B3S với đơn vị cấu trúc lặp lại chứ iduronic acid không tham gia vào quá trình tạo gel) [60]

Các vùng liên kết trong gel gồm bao gồm các liên kết yếu (ví dụ liên kết kém bền giữa nhóm ester borate và các cation) rất dễ bị bẻ gãy khi xử lý bằng nhiệt Do

đó, gel tạo thành dễ biến đổi theo nhiệt, chảy thành dung dịch nhớt khi nâng nhiệt

độ lên cao và tái hình thành gel khi hạ thấp nhiệt độ xuống Cơ tính của gel này biểu hiện kém khi tiếp xúc với các chất dịch trong cơ thể do quá trình trao đổi cation Ca2+ (đóng vai trò duy trì mạng lưới liên kết giữa các anionic polysaccharide) với các cation Na+, K+ có mặt trong các dịch trong cơ thể Do đó, ứng dụng gel này trong kỹ thuật mô tương đối hạn chế bởi tính bất ổn cơ học và khó có thể kiểm soát được khả năng hòa tan của ulvan ở các điều kiện sinh lý khác nhau của cơ thể [9, 23]

*Ứng dụng của ulvan

Với cấu trúc polysaccharide đặc biệt, ulvan là đối tượng polymer mới mang nhiều hoạt tính sinh học và chức năng thú vị, có tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực: thực phẩm, y dược, hóa học nông nghiệp và nuôi trồng thủy sản [59]

Đối với ngành sản xuất hóa chất, sinh khối ulvan là nguồn cung cấp các gốc đường hiếm, tiền chất để sản xuất các hóa chất tinh sạch [122] Polysaccharide ulvan được cấu thành chủ yếu bởi các monomer rhamnose và biuronic acid Rhamnose là loại monomer tương đối khó tìm trong các hợp chất tự nhiên

Rhamnose từ ulvan chiết từ Monostroma (Codiolales) là tiền chất để tổng hợp

hương thơm Rhamnose còn được thêm vào mỹ phẩm chăm sóc da với tác dụng tăng cường tổng hợp collagen, tăng độ đàn hồi, độ sáng của làn da Trong ứng dụng y dược, L-rhamnose là thành phần thiết yếu của kháng nguyên bề mặt của nhiều loại vi khuẩn, được nhận diện bởi các lectin động vật có vú Ulvan còn là nguồn cung cấp tiềm năng acid iduronic, dạng đường được tìm thấy trong tổng hợp heparin (có hoạt tính chống huyết khối), một loại glycosaminoglycan ở động vật có vú Quá trình tổng hợp iduronic acid phải qua nhiều bước rất tốn kém Do

đó, tách chiết iduronic acid từ tự nhiên như ulvan là hướng đi đầy tiềm năng cần khai thác

Bên cạnh monomer, ulvan oligomer và polymer cũng đã được nghiên cứu về những ứng dụng tương ứng với hoạt tính sinh học của chúng Nhiều công trình khác nhau đã cho thấy ulvan dạng oligomer và polymer thể hiện các hoạt tính chống ung thư, hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch, hoạt tính kháng một số chủng virus cúm, hoạt tính chống đông tụ máu Trong nghiên cứu [14], rhamnan, rhamnose, oligomer từ các desulfated polysaccharide có cấu trúc tương tự như

ulvan chiết từ Monostroma đã được sử dụng trong điều trị loét dạ dày Hoạt tính

tương tự ở ulvan đã được thử nghiệm trên chuột Kết quả kiểm nghiệm phát hiện

sự tiết ra các hợp chất mucin (glycoprotein cao phân tử) trong ruột của chuột nhằm bảo vệ niêm mạc ruột Ulvan cũng thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, thuyên giảm

sự nhiễm độc gan khi kháng acetaminophen, chất gây độc gan khi thử nghiệm trên chuột bạch tạng

Nhiều công trình đi vào nghiên cứu tác dụng của ulvan lên hệ tiêu hóa con người Ulvan thuộc nhóm chất xơ tiêu hóa, cấu trúc của chúng không bị phân hủy bởi các enzyme nội sinh của con người Là một chất xơ tiêu hóa có đặc điểm trữ

nước ấn tượng, ulvan đóng vai trò là chất tạo khối phân, ngăn ngừa các bệnh lý liên quan đến rối loạn các chức năng vận chuyển đường ruột [74] Ulvan còn tham gia điều chỉnh các quá trình chuyển hóa lipid khi cho thấy tác dụng hạ thấp nồng

độ mỡ trong máu ở chuột Nồng độ lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao giảm, nồng

độ lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp và triglyceride tăng là những nguy cơ gây

ra các bệnh về tim mạch như xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não Ulvan và các oligosaccharide dẫn xuất làm giảm đáng kể nồng độ cholesterol tổng, cholesterol tỷ trọng thấp và triglyceride cũng như tăng nồng độ cholesterol tỷ trọng cao trong máu

Mặc dù các nghiên cứu được tiến hành với mục đích điều chế thức ăn dinh dưỡng cho con người, các kết quả cũng đã được ứng dụng làm thực phẩm bổ sung chức năng trong chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thủy sản Quá trình xử lý sinh

khối các rong lục thuộc bộ Ulvales bằng enzyme đã hỗ trợ thủy phân ulvan thành

oligosaccharide, tăng hàm lượng protein trong sản phẩm, mang đến hiệu quả kích

thích hệ miễn dịch động vật, giúp kháng nhiều loại bệnh Ulvan chiết từ rong Ulva rigida kích thích các đại thực bào, tăng sức chống chịu ở cá Một sáng chế trong

thời gian gần đây mô tả kết hợp ulvan dạng nano với đất sét, tạo ra sản phẩm khử độc thức ăn cho gia súc [56]

Trong trồng trọt, không nhiều các công trình về ứng dụng của ulvan được công bố Bên cạnh làm phân bón, ulvan còn được nhắc đến làm thuốc xịt phòng

trừ bệnh ở cây Cây họ đậu Medicago truncatula sau khi được phun xử lý bằng dịch chiết ulvan, đã kháng lại loài nấm gây bệnh Colletrichum trifolii Một số tài

liệu khác công bố hiệu quả của ulvan lên khả năng cố định đạm ở rễ cây, thúc đẩy tăng trưởng Với đặc tính trao đổi ion kim loại nhờ có các gốc anion sulfate và carboxylic, ulvan đang được nghiên cứu làm chất chỉ thị sinh học, xác định mức

độ ô nhiễm kim loại nặng ở các vùng biển duyên hải Các nhà khoa học đang nghiên cứu khả năng trao đổi ion một cách có chọn của polysaccharide nhằm tăng hiệu quả xử lý kim loại nặng trong nước thải công nghiệp cũng như tăng hàm lượng khoáng chất trong đất trồng, thức ăn chăn nuôi [35]

Tính chất tạo gel đặc biệt của ulvan mang đến tiềm năng ứng dụng đa dạng

Để duy trì cấu trúc, gel cần được kiểm soát duy trì hàm lượng cation, pH và nhiệt

độ Gel ulvan đã được nghiên cứu biến tính nhằm tăng cường độ bền cơ học, tăng khả năng bắt dính phân tử chất mang Với các ứng dụng làm chất dẫn thuốc, băng

vết thương nhả thuốc, gel ulvan biến tính cần được nghiên cứu sâu hơn để kiểm tra

độ ổn định, độ chính xác trong nhả thuốc [62]

1.3 Nanogel

Nhiều năm trở lại đây, công nghệ nano được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu điều chế các hệ mang thuốc Ngành công nghệ này đã đưa ra các phương pháp hữu hiệu giúp mang tải các tác nhân có hoạt tính sinh học đến các vị trí cần thiết và trong thời gian mong muốn Kích thước nano của các hệ mang thuốc thể hiện nhiều ưu điểm có thể kể đến như: thúc đẩy khả năng hòa tan của thuốc có tính chất kỵ nước, hiệu quả trong truyền dẫn thuốc đến tế bào ung thư, tăng cường độ ổn định và tính bền vững của thuốc điều trị trước sự phân hủy do các tác nhân hóa học hay enzyme cũng như là thuyên giảm các tác dụng phụ trong gây độc tế bào Nhiều loại hệ mang thuốc có kích thước nano khác nhau đã được báo cáo bao gồm micelle của các polymer, liposome, sol-gel, hydrogel … [51] Kể

từ khi hydrogel được tìm thấy, nhiều nỗ lực nghiên cứu trên hệ gel này nhằm nhân rộng khả năng ứng dụng của nó trong đời sống, đặc biệt trong các lĩnh vực y sinh Gel ở đây được xem như là một dạng vật liệu mềm, mang tính chất của cả chất rắn lẫn dịch lỏng Độ tương thích sinh học của chúng được cho là đến từ thành phần nước trong gel khá lớn và sức căng bề mặt thấp trong khi cấu trúc lỗ xốp cho tính tải cao và đặc tính trương nở giúp kiểm soát khả năng nhả thuốc

1.3.1 Định nghĩa nanogel [ 51]

Nanogel là một mạng lưới ba chiều có kích thước dưới micrometer được tạo thành bởi các polymer liên kết đan xen với nhau Theo một định nghĩa khác, nanogel là 1 dạng hydrogel cụ thể chứa các không gian có kích thước nanometer, nên chúng sở hữu đồng thời tính chất của một hydrogel và của một hạt nano Các hạt nanogel này được phân loại trong ngành vật liệu thuộc hạt nanopolymer, bên cạnh các hạt nano lipid và hạt nano vô cơ Nanogel có thể được điều chế từ trực tiếp polymer hoặc bằng cách polymer hóa hỗn hợp các monomer Yếu tố tiên quyết trong quy trình điều chế nanogel đó là công đoạn tạo các liên kết ngang, bao gồm liên kết vật lý và liên kết hóa học Nanogel có một tính chất đặc biệt đó là khả năng hấp thụ một lượng lớn nước và các dịch sinh học trong khi vẫn duy trì cấu trúc của mình Điều này được lý giải là do sư có mặt của các nhóm ưa nước như -

OH, CONH-, -CONH2- và SO3H trên polymer và các liên kết ngang trong thành

phần nanogel giúp chúng chỉ bị trương nở thay vì bị hòa tan trong nước Với tính chất đặc biệt này, nanogel là ứng cử viên đầy hứa hẹn, mang tính ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Nhiều công trình cho thấy nanogel là chất mang thuốc lý tưởng nhờ hiệu suất mang thuốc cao, ổn định bền vững trước các tác nhân môi trường tiếp xúc (ví dụ như các lực tương tác ion, pH, nhiệt độ)

1.3.2.Cơ chế hình thành nanogel

Tương tác vật lý

Tương tác vật lý giữa các polymer bao gồm 2 loại tương tác: tương tác Van der Waals và tương tác tĩnh điện Nanogel được hình thành bằng tương tác vật lý giữa các chuỗi polymer cung cấp một hệ bề mặt có khả năng bắt lấy các hợp chất

có hoạt tính sinh học khác nhau, đặc biệt là các thuốc điều trị có tính kỵ nước và các đại phân tử sinh học Việc hình thành các liên kết ngang vật lý của nanogel thường được diễn ra trong dung môi nước trong điều kiện phản ứng thường Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành nanogel như giá trị pH, lực tương tác ion, nhiệt độ nên được kiểm soát chặt chẽ để quá trình điều chế đạt kích thước hạt nanogel như mong muốn Một số yếu tố ảnh hưởng khác không thể không kể đến như cấu trúc của vật liệu polymer, bản chất các block trên polymer, chiều dài các block [129]

Liên quan đến tính chất amphiphilic

Như chúng ta đã biết, đối với các polymer vừa có cả phần ưa nước vừa có

cả phần kỵ nước, chúng có khả năng tự kết tụ ở các điều kiện thích hợp để tạo nên các micelle với cấu trúc lõi-vỏ Lớp vỏ ưa nước bên ngoài giúp kéo dài khả năng tuần hoàn của hạt nanogel trong dịch thể trong khi lõi kỵ nước cho phép chúng mang tải hiệu quả các loại thuốc Để giải thích chi tiết hơn, lớp vỏ ưa nước bên ngoài không những có chức năng như một rào cản ngăn cản sự tác động từ các protein và các mô của cơ thể mà còn bảo vệ nanogel tránh bị nhận ra và opsonine hóa bởi các hệ thống thực bào [21, 76] Trong khi đó, nhân kỵ nước cho phép tải thuốc điều trị thông qua các tương tác kỵ nước và các tương tác tĩnh điện, và các nhân này thể hiện tính chất động dược học như hiệu quả mang thuốc và nhả thuốc [65,66, 25] Tuy nhiên, cấu trúc lõi-vỏ của nanogel hình thành dựa trên các tương tác kỵ nước thông thường thì tương đối kém bền, đặc biệt khi chúng được đưa vào trong cơ thể con người Còn các nanogel hình thành do các amphiphilic polymer

tự kết tụ thì thường không còn các khuyết điểm này trong khi vẫn duy trì ưu điểm của micelle

đã đưa vào dextran các tetramine có bốn nhóm amino và các tetracarboxylic acid

có bốn nhóm carboxyl PIC-NCs được hình thành dựa vào các liên kết chéo vật lý

là các cầu muối giữa các nhóm cation và anion khi trộn các hỗn hợp lại với nhau

Hình 1.4 Nanogel điều chế dựa vào các tương tác tĩnh điện giữa các polymer Tuy nhiên, polyampholyte với các liên kết ngang hóa học tồn tại một số khuyết điểm Ví dụ như, các phản ứng liên kết hóa học có khả năng làm giảm hiệu quả điều trị của thuốc được mang, đặc biệt là các protein và gen [49]

Liên kết hóa học

Liên kết ngang hóa học bao gồm hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa các polymer tan trong nước trong dung môi hòa tan để hình thành nên mạng lưới polymer không tan [90, 102] Đa dạng phương thức hình thành liên kết ngang hóa học đã được báo cáo, bao gồm sử dụng hợp chất amoni bậc bốn, phản ứng quang hóa, phản ứng click… [110,52, 19]

1.3.3 Phương pháp điều chế nanogel

Như đã đề cập ở trên, trương nở là một trong những đặc tính quan trọng nhất của nanogel, tính chất có được do các liên kết ngang hóa học hoặc vật lý giữa các polymer Nói cách khác, bản chất của việc hình thành nanogel là phải tạo các liên kết ngang phù hợp giữa các polymer [90]

Dựa trên tính chất của các vật liệu được sử dụng để hình thành nanogel, phương pháp điều chế nanogel được chia làm 2 con đường chính: một là điều chế nanogel từ vật liệu polymer, hai là nanogel được hình thành từ quá trình polymer hỗn hợp các monomer Cả 2 cách tiếp cận được diễn giải trên hình 1.5

Hình 1.5 Hai phương pháp điều chế nanogel [102]

Phương pháp 1: Điều chế nanogel từ vật liệu polymer

Trong phương pháp này, polymer sử dụng có thể là các polymer amphiphilic (polymer vừa có nhóm kỵ nước vừa có nhóm ưa nước) hoặc các triblock copolymer (polymer chứa 3 nhóm thành phần khác nhau) có khả năng hình thành gel bằng cách tự kết tụ lại với nhau Polymer amphiphilic thường có mạch chính ưa nước với nhiều nhóm kỵ nước phân bố trên mạch chính như hình

1.6 [102] Chính các nhóm kỵ nước này đã tạo nên một số lượng lớn các liên kết ngang để hình thành nên nanogel thay vì hình thành các cấu trúc tương tự như micelle, do đó giúp cho nanogel bền hơn [8]

Gần đây, các amphiphilic polymer mới đã được tổng hợp rộng rãi với mục đích tạo nên các vật liệu mới phục vụ điều chế nanogel Park và cộng sự [81] đã điều chế nanogel dựa trên chondroitin sulfate ưa nước được biến tính với acetic anhydride Hằng số cân bằng hóa học của nanogel này khi được phân tích bởi phương pháp huỳnh quang thì tương đương với polymeric micelle, chứng tỏ các nhóm acetyl có thể đóng vai trò là nhân kỵ nước mang và nhả thuốc, với hiệu quả mang thuốc doxorubicin lên đến 90% Nghiên cứu in vitro cho thấy nanogel này

có khả năng xâm nhập vào nội bào Hela nhờ vào các thụ thể đường, thể hiện tiềm năng phát triển làm hệ mang thuốc chống ung thư hiệu quả Maeda và cộng sự [69] đã đưa nhóm naphthalene vào các mạch nhánh của β-1,3-glucan schizophyllan (nSPG) nSPG này được cho là dễ bị phát hiện bởi các thụ thể tế bào miễn dịch Dectin-1, có khả năng tạo liên kết chéo vật lý và mang thuốc doxorubicin (Dox) thông qua các tương tác kỵ nước Từ các phương pháp kiểm tra

in vitro, so với SPG/Dox và chỉ riêng Dox, nSPG/Dox cho thấy hiệu quả tiêu diệt các tế bào dRAW ở cùng nồng độ Dox

Hình 1.6 Nanogel được điều chế từ polymer được biến tính chứa các gốc kỵ nước

[102]

Phương pháp 2: nanogel được hình thành từ quá trình polymer hỗn hợp các monomer

Trong phương pháp này, nanogel được tạo thành từ monomer phải trải qua

2 công đoạn: quá trình polymer hóa và quá trình hình thành nanogel, thông thường

2 quá trình diễn ra đồng thời với nhau So với phương pháp 1, điều chế nanogel xuất phát từ monomer cho thấy hiệu suất cao hơn., trong đó, liên kết ngang hóa học đóng vai trò thiết yếu của quy trình Zhou và cộng sự [131] đã phát triển thành công phương pháp trợ giúp quá trình tự kết tụ, tổng hợp nên nanogel từ quá trình polymer hóa các monomer sử dụng dextran, 3-acrylamidophenylboronic acid (AAPBA) và N,N′-methylene bisacrylamide (MBA) Nhóm carboxyl của AAPBA

và nhóm nhận proton của dextran tạo điều kiện cho việc kết tụ thông qua liên kết hydro So với các phương pháp đã báo cáo trước đây, điểm đặc biệt từ phương pháp SAA đó là chuỗi poly AAPBA trở nên không tan trong môi trường phản ứng bởi vì AAPBA monomer mang tính kỵ nước trong dung môi acid, nghĩa là hiệu ứng kỵ nước này tạo điều kiện cho sự kết tụ của các polymer để hình thành nanogel chứ không phải là do liên kết hydro Thành công trong điều chế nanogel dextran-PAAPBA chứng tỏ rằng phương pháp tiếp cận SAA có thể điều chế nanogel từ các monomer kỵ nước, cho phép tổng hợp đa dạng các nanogel trên nền dextran

Hình 1.7 Quá trình hình thành nanogel CHPOA-PEGSH Liên kết disulfide là nhóm chức mang tính kích thích-đáp ứng bởi vì nó có

thể bị phân hủy sinh học dưới tác dụng của chất khử hóa sinh như glutathione

(GSH), thioredoxin, và peroxiredoxin [45] Nanogel hình thành dựa trên các liên

kết chéo cho thấy tiềm năng to lớn ứng dụng tải thuốc đến nội tế bào Li et al [67]

điều chế nanogel dựa trên dẫn xuất dextran–lipoic acid Nanogel này được hình

thành liên kết dần dần bằng cách sử dụng một lượng xúc tác dithiothreitol (DTT),

chất này bền trong các dung môi pha loãng và dung môi có nồng độ muối cao

Nanogel của công trình có hiệu suất mang thuốc lên đến 84%, khả năng tải thuốc

Dox nhanh chóng và hiệu quả đến hạt nhân tế bào Liên kết disulfide không những

được sử dụng để liên kết chéo các polymer mà còn được sử dụng để đưa các nhóm

chức năng thiol lên polymer [36] Liên kết chéo hóa học và vật lý cần các kỹ thuật

tổng hợp tối ưu khác nhau Với việc ứng dụng nanogel làm hệ mang thuốc ngày

càng được mở rộng, nhiều nỗ lực to lớn nhằm thiết kế và điều chế các nanogel

Phương pháp polymer hóa kết tủa là phương pháp đặc thù phù hợp để hình thành

các liên kết ngang vật lý giữa các nguyên liệu điều chế nanogel có khả năng tan

trong nước Phương pháp này là phương pháp tối ưu để bắt lấy các thuốc kỵ nước

và các đại phân tử sinh học Nanogel có các liên kết ngang hóa học thường được

điều chế từ các nhũ tương micro hoặc bằng cách polymer hóa các nhũ tương nano

Tuy nhiên, các phương pháp này tương đối phức tạp và đòi hỏi nhiều bước tinh

sạch nhằm loại bỏ các monomer dư không phản ứng và chất hoạt động bề mặt được sử dụng trong quá trình phản ứng nhằm duy trì tính ổn định của hệ nhũ tương Chính vì vậy, đã có nhiều công trình nhằm xây dựng các phương pháp thay thế, điều chế nanogel trong các môi trường khác nhũ tương, một trong những phương pháp cụ thể đó là sử dụng disulfide kém bền [100] Polymer chứa 30% oligoethyleneglycol methacrylate (đóng vai trò nhóm ưa nước, cho phép polymer tan được trong nước) và 70% dẫn xuất pyridyl disulfide (PDS)-thioethylmethacrylate (điều chế bằng phương pháp RAFT, reversible addition –fragmentation chain transfer) polymer hóa tại các nhóm chức năng có khả năng liên kết ngang Một lượng vừa đủ DTT, chất làm đứt gãy liên kết PDS được thêm vào dung dịch polymer Tiếp theo đó, một phần trăm nhỏ nhóm PDS sẽ được chuyển hóa thành thiol tự do, phản ứng với một lượng tương ứng các nhóm chức năng PDS để tạo liên kết disulfide, liên kết ngang các chuỗi polymer Tuy nhiên, các nhóm chức năng PDS có thể bị bẻ gãy bởi thuốc lipophilic trong dung môi nước do tính kỵ nước tương tự nhau Các nanogel được tạo thành không qua hệ nhũ tương có cấu trúc hình cầu với kích thước ~190 nm, quan sát rõ rang bằng phương pháp TEM (transmission electron microscopy) và dynamic light scattering Nile red, chất nhuộm kỵ nước, được bọc bên trong các nanogel, được giải phóng ở nồng độ thấp GSH (10 μM, tương ứng với lượng chất thấy được bên ngoài tế bào và bên trong plasma máu) trong khi một lượng lớn thuốc nhuộm được nhả ra ở nồng độ cao GSH (10 mM, tương ứng với lượng chất tìm thấy bên trong

tế bào) Kết quả cho thấy nanogel có thể nhả chất mang theo liều lượng kiểm soát được bằng chất kích hoạt sinh học tương ứng Ngoài ra, phản ứng trao đổi thiol–disulfide với nhóm PDS giúp chức năng hóa khác nhau bề mặt nanogel Nanogel phản ứng với lượng dư fluoresceinisothiocyanate (FITC) hay FITC-SH (1 mg/ml),

và phổ phát xạ của nanogel được xử lý bởi thiol-modified FITC (FITC-SH) và FITC cho thấy sự khác biệt đáng kể

1.4 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của Đề tài

1.4.1 Ngoài nước

Trên thế giới, hướng nghiên cứu áp dụng Công nghệ Nanô vào lĩnh vực Y- Sinh-Dược như chẩn đoán, chữa trị bệnh, bào chế thuốc và các sản phẩm y dược khác là một trong những hướng nghiên cứu mũi nhọn, thu hút được sự quan tâm

của đông đảo các nhà khoa học hàng đầu trong các lĩnh vực liên nghành (Vật liệu, Hoá học, Sinh học phân tử, Điện tử ) với sự đầu tư mạnh mẽ của các Viện nghiên cứu, phòng thí nghiệm, các hãng sản xuất

Việc kiểm soát quá trình phân phối thuốc/protein để điều trị những căn bệnh hiểm nghèo như HIV, Ung Thư, bệnh tiểu đường ….là một trong những thử thách trong lĩnh vực Y dược Hiện có nhiều loại dược phẩm (thuốc /protein) chứng tỏ được khả năng chữa bệnh tốt, tuy nhiên các phương pháp sử dụng dược phẩm truyền thồng như uống, tiêm, xạ trị, hóa trị để điều trị các loại bệnh trên có những nhược điểm lớn như: sự tập trung đột ngột của thuốc/protein tại một điểm, lúc đó thuốc/protein trở thành chất độc hại cho cơ thể ; Vì dược phẩm dược dẫn truyền theo đường máu, chỉ khi gặp tế bào mầm bệnh (ung thư) thì mới thể hiện chức năng chữa trị, nhưng trong quá trình vận chuyển dược phẩm này còn tác dụng lên tất cả các tế bào khác mà nó gặp Do đó chỉ có một lượng nhỏ dược phẩm có tác dụng hữu hiệu cho việc điều trị, còn phần lớn dược phẩm lại tạo ra các phản ứng phụ khác trong quá trình điều trị; Thêm vào đó, sự suy giảm hình thức (profile) của thuốc/protein đến dưới khoảng liều dùng trong quá trình điều trị đòi hỏi một liều thuốc/protein mới Tất cả các nhược điểm trên hoàn toàn được khắc phục nếu

sử dụng hệ dẫn thuốc là các polyme y sinh có cấu trúc nano particle Nhờ chúng có

ưu điểm vượt trội sau: đúng nơi, đúng lúc và đúng liều

Việc nghiên cứu sử dụng các polymer y sinh có cấu trúc nano làm chất dẫn thuốc là một trong những ý tưởng có tính đột phá khoa học tuy nhiên mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu nhưng theo dự đoán khả năng áp dụng các nghiên cứu này bắt đầu có thể triển khai trong tương lai gần

Hiện nay, trong lĩnh vực y sinh học các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm các vật liệu sinh học mới với các tính năng đặc biệt để phục vụ cho việc chữa bệnh

và phục vụ cuộc sống con người Một trong những vật liệu được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là các polymer sinh học có nguồn gốc thiên nhiên do khả năng tương thích sinh học cao và dễ phân hủy sinh học của chúng Một số polysaccharide có nguồn gốc thiên nhiên thường được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu để điều chế các hạt nano là Cellulose, Alginate, Chitosan, Pullulan and dextran, Hyaluronic acid, Ulvan và Polyhydroxyalkanoate ứng dụng trong y sinh [22] Trong số các polysaccharide kể trên chỉ có duy nhất ulvan là chưa có sản

phẩm được thương mại hóa Chúng mới được nghiên cứu trong thời gian một vài thập kỷ trở lại đây với quy mô trong phòng thí nghiệm

Cấu trúc hóa học của ulvan

Trên thế giới, ulvan từ rong lục đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950 Thời gian đầu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc chiết tách và xác định thành phần đường trong ulvan từ các loài rong lục khác nhau Brading [17] và Percival [83] đã xác định sulfate, rhamnose, xylose, và glucuronic acid là các thành phần hóa học có trong ulvan Tuy nhiên, phải đến năm 1997, Quemener và CS [89], nhờ vào phương pháp cắt mạch hóa học kèm enzyme, mới phát hiện ra iduronic acid cũng là một đơn

vị đường trong ulvan Các tác giả cũng khẳng định rằng, thành phần đường, tỉ

lệ đường đơn, hàm lượng sulfate trong ulvan phụ thuộc rất nhiều vào loài rong,

vị trí địa lý nơi rong thu hái và thời điểm thu hái

Lahaye, Robic và các CS [57, 58, 63] là nhóm nghiên cứu rất mạnh về cấu trúc của ulvan trên thế giới hiện nay Các công trình của nhóm nghiên cứu này cho thấy rằng cấu trúc ulvan rất phức tạp và phụ thuộc nhiều vào loài rong nghiên cứu Các tác giả cũng đã quan tâm đến các sulfate đường hiếm như rhamnose 3-sulfate và xylose 2-sulfate trong ulvan và cho rằng: Rhamnose, thành phần chủ yếu của ulvan, được sử dụng như là tiền chất để tổng hợp các

hợp chất thơm tạo tiền đề cho khả năng ứng dụng L-rhamnose trong lĩnh vực

công nghiệp dược phẩm

Ulvan là sulfate polysaccharide có điện tích cao hòa tan được trong nước

và được tạo bởi các thành phần chủ yếu là rhamnose, glucuronic, iduronic acid, xylose và nhóm sulfate để tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide chính là ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng A (β-D-GlcA (1→ 4) α-L-Rha 3S

→ 1) và ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng B (α-L-IdoA (1 → 4) α-L-Rha 3S → 1) (Hình 1.5) [68]

Lahaye, Robic và các CS [65, 99] đã nghiên cứu cấu trúc của ulvan từ

Ulva rigida bằng cách thủy phân tạo oligosaccharide và desulfate hóa Cấu

trúc hóa học và chuỗi đường của những oligomer này được xác định bằng phổ NMR Tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi liên kết glycoside có dạng sau: α-

L-rhamnosyl-(1→4)-D-xylose, β-D-glucuronosyluronic

acid-(1→2)-α-L-rhamnosyl-(1→4)-D-xylose, β-D-glucuronosyluronic

acid-(1→4)-α-L-rhamnose 3sulfate, β-D-glucuronosyluronic glucuronosyluronic acid (1→2)]α-L- rhamnosyl -(1→4)-D-xylose và β-D-

acid-(1→4)-[β-D-glucuronosyluronic acid-(1→4)-[β-D-glucuronosyluronic acid-(1→2)]-α-L-

rhamnose Sự phân nhánh ở các chuỗi liên kết thường xảy ra ở vị trí O-2 của

liên kết (1→4)-α-L-rhamnose là β-D-glucuronic acid; tác giả cũng khẳng định

lại rằng nhóm sulfate nằm ở vị trí O-3 của rhamnose Các nghiên cứu sau đó cho thấy các liên kết glycoside và vị trí sulfate này trong cấu trúc ulvan là phổ

biến cho các loài Ulva khác nhau

Masakuni Tako và CS [72] đã thành công trong việc xác định cấu trúc hóa

học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa thu thập ở vùng biển Okinawa – Nhật Bản,

bằng các phương pháp phổ IR và NMR Tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi

liên kết glycoside có dạng sau: β-D-glucuronic acid hoặc α-L- iduronic acid [(1→3)-α-L-rhamnose-(1→4)-α-L-rhamnose, (1→4)-α-L-rhamnose-(1→4)-α-L- rhamnose-(1→4)-α-L-rhamnose-(1→4)-β-D-xylose Sự phân nhánh ở các chuỗi liên kết thường xảy ra ở vị trí O-2 của liên kết (1→4)-α-L-rhamnose là β-D-

glucuronic acid; tác giả cũng khẳng định nhóm sulfate nằm ở vị trí C-3 và C-2 của rhamnose; ở vị trí C-3 của xylose, chuỗi liên kết trong cấu trúc của ulvan có dạng như ở Hình 1.8 dưới đây

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa

You S G và CS [128] đã chiết tách ulvan từ Ulva pertusa ở biển Hàn

Quốc, bằng việc sử dụng các phương pháp GC/MS và NMR, các tác giả đã khẳng định rằng, mạch chính của phân tử polysaccharide được tạo thành bởi

liên kết của α-(1→4)-L-rhamnose hoặc (1→4)-D-glucuronic acid với (1→2)-L-rhamnose và β-(1→4)-D-xylose với sự phân nhánh ở vị trí O-2 của

β-(1→4)-rhamnose và nhóm sulfate hầu hết được tìm thấy trên glucuronic acid ở

vị trí O-3

Costa, Alves và CS [26] đã chiết tách ulvan từ rong lục Ulva lactuca bằng

dung môi nước, mẫu ulvan thu được được đo khối lượng phân tử, xác định thành phần hóa học và phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ NMR Kết quả cho thấy, mẫu ulvan thu được được tạo thành bởi các thành phần chính là rhamnose (22.4%), glucuronic acid (22.5%), xylose (3.7%), iduronic acid (3.1%) và glucose (1.0%); hàm lượng sulfate trong phân tử ulvan cũng rất cao (32.2%); khối lượng phân tử của ulvan chiết tách được là rất cao (790 kDa) Cấu trúc của phân tử SP từ

rong lục Ulva lactuca được tạo thành chủ yếu bởi disaccharide ulvanobiuronic

acid 3-sulfate dạng A: [→4)-β-D-GlcA-(1→ 4)-α-L-Rha 3S-(1→] và một lượng nhỏ của ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng B [→4)-α-L-IdoA-(1→ 4)-α-L-Rha 3S-(1→] Lahaye Marc [65] đã nghiên cứu thành phần và cấu trúc của 2

oligosaccharide từ loài rong lục Ulva rigida được thu thập từ 2 vùng biển khác

nhau (Tây Ban Nha và Pháp) Kết qủa chỉ ra rằng thành phần đường của 2 ulvan tách chiết được là giống nhau nhưng với tỷ lệ khác nhau; cấu trúc hóa học và chuỗi polysaccharide trong 2 phân tử ulvan được nghiên cứu bằng phương pháp phổ NMR, kết quả đã khẳng định rằng, cả 2 ulvan đều có cấu trúc mạch chinh dạng ulvanobiuronic acid 3-sulfate dạng A3s [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha 3-sulfate-(1→] nhưng chúng khác nhau ở mạch nhánh và vị trí phân nhánh Như vậy, thành phần và cấu trúc của ulvan từ cùng một loài rong phụ thuộc vào vị trí địa lý nơi rong sinh sống

Hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của ulvan cho thấy tất cả các ulvan chiết từ

các loài rong lục khác nhau thuộc 02 chi rong Ulva và Enteromorpha đều thể hiện

các hoạt tính sinh học sau: Hoạt tính chống oxi hóa, chống đông máu, hạ mỡ máu

và chống đọc gan, hoạt tính điều hòa miễn dịch và chống ung thư, kháng nấm, tăng cường hệ miễn dịch [68] (Bảng 1)

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của polysaccharide dạng ulvan chiết từ một số loài

rong xanh thuộc 2 chi rong Ulva và Chaetomorpha

Hoạt tính sinh học Nguồn gốc rong Tài liệu trích dẫn

Hoạt tính chống oxi hóa

(Antioxidant)

Enteromorpha intestinalis, Ulva pertusa,

U fasciata, U reticulata

[70,104]

Hoạt tính hạ mỡ máu Ulva pertusa, U lactuca [103]

Hoạt tính kháng virut Ulva.sp, U lactuca, U

fasciata

[33, 75]

Hoạt tính chống ung thư Enteromorpha

intestinalis, Ulva lactuca, ulva fasciata

[53, 106]

Các kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của các polysaccharide chiết từ 02 chi

rong Ulva và Enteromorpha cho thấy hàm lượng sulfat, khối lượng phân tử và sự

phân nhánh đóng vai trò quan trọng đến hoạt tính sinh học của polysaccharide chiết từ rong lục

Phương pháp tách chiết ulvan

Ulvan là thành phần polysaccharide được phân bố trên thành tế bào của rong lục [64, 94], phương pháp chiết ulvan dựa trên đặc tính của một anion polysaccharide và các thành phần khác của rong lục, bao gồm 2 giai đoạn chiết sau

Giai đoạn tiền xử lý rong : các chất được chiết trong dung môi hữu cơ, mục đích của giai đoạn này là nhằm loại bỏ các chất chuyển hóa thứ cấp như polyphenol, lipite….Dung môi thường dùng alcohol, cloroform Mới đây để thu hồi các nhóm sản phẩm chuyển hóa thứ cấp khác nhau Shonima Govindan M, năm

2012 đưa ra phương pháp tiền xử lý rong bằng các dung môi hữu cơ lần lượt như petroleum ether, chloroform và acetone, sau đó mới chiết như các công bố khác [106] Nhìn chung, để loại bỏ lipid và các hợp chất màu trước khi chiết, các nhà khoa học thường sử dụng dung môi chủ yếu là ethanol Như công trình [48], bột

rong được đun sôi trong ethanol 70o trong 1 tiếng, sau đó được ly tâm để thu bột rong và loại ethanol

Giai đoạn chiết ulvan polysaccharide Trong thành phần của ulvan có chứa các axit aldobiouronic và nhóm sulfat, chúng tồn tại trong thành tế bào của cây rong chủ yếu dưới dạng muối ít tan của kim loại hóa trị 2 là Canxi (Ca) Vì vậy để chiết ulvan cần phải hòa tan muối của Ca Chính vì vậy phương pháp chiết ulvan thường sử dụng là phương pháp chiết nước nóng và bổ xung các chất tạo phức chelat với Ca như sodium oxalate, ammonium oxalate [61, 96], và các tác nhân hòa tan muối canxi khác Kiềm, sodium chlorite, DMSO, acetic acid, nước hoặc axit (HCl) [94, 98, 97, 46] Điều thú vị là tùy điều kiện chiết khác nhau mà hàm lượng axit uronic, các gốc đường trung tính và khối lượng phân tử là hoàn toàn khác nhau Để thu được hiệu suất chiết ulvan cao nhất, khi sử dụng hệ chiết nói trên các thông số tối ưu tương ứng là sodium oxalate (50 mM, pH 6.5, 2 h, 85 0C), ammonium oxalate (20 mM, pH 4.6, 1 h, 85 0C) và HCl (50 mM HCl, 0.5 h or 1 h

at 85 0C) Phụ thuộc vào loài rong và cấu trúc hóa học của ulvan mà các điều kiện chiết tối ưu là hoàn toàn khác nhau Tùy theo mục đích sử dụng của sản phẩm chiết ulvan mà phương pháp chiết có thay đổi Với mục đích thu nhận các nhóm ulvan

có cấu trúc gần nhau, Ray B và M Lahaye năm 1995 [94], đã chiết ulvan tuần tự trong môi trường Na oxalate, nước, sau đó là môi trường kiềm nồng độ khác nhau

và phân đoạn sản phẩm trên nhựa trao đổi ion, đây là phương pháp chiết tổng quát hơn Trên cở sở các sản phẩm chiết nhận được, Ray B và M Lahaye đã đưa ra định nghĩa chung cho ulvan là “sulfated glucuronorhamnoxyloglycans” Tập thể tác giả này, đã chiết các polysaccharide từ thành tế bào của rong Ulva bằng dung dịch acid oxalic nóng, nước nóng, dung dịch KOH 1M, KOH 4M ở nhiệt độ phòng, thành phần hóa học của các chất tan và không tan trong nước, các phân đoạn của chất chiết tan trong nước trên DEAE-Sepharose CL-6B được xác định Như vậy có thể cho rằng tùy theo mục đích của việc sử dụng ulvan và phụ thuộc vào từng loài rong mà có thể lựa chọn phương pháp chiết khác nhau

Một phương pháp khác hỗ trợ cho quá trình chiết polysaccharide từ rong khi

sử dụng các enzyme như cellulase để thủy phân cellulose, proteinase để thủy phân protein, amylase để thủy phân tinh bột [20] Dung môi chiết có bổ sung enzyme có

giá trị pH đỡ “khắc nghiệt” hơn, giảm sự thủy phân ulvan nhưng cần xử lý enzyme sau khi chiết

Mặc dù có rất nhiều công trình về quy trình tách chiết polysaccharide dạng ulvan từ rong lục nhưng tất cả các quy trình đều có điểm chung là các quy trình đều

có quy mô phòng thí nghiệm với lượng rong nguyên liệu sử dụng ban đầu tư 5-100

g và tất cả giai đọan chiết ulvan đều tiến hành chiết nhiều lần với các dung môi chiết khác nhau Đây là thách thức không nhỏ trong việc xây dựng quy trình tách chiết ulvan đơn giản, hiệu quả và ổn định từ rong lục sinh trưởng tại Việt Nam

Ứng dụng ulvan trong y sinh

Trong một vài năm trở lại đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra các sulfate polysaccharide dạng nano ulvan chiết từ các loài rong lục, có cấu trúc hóa học tương tự như các glycosaminoglycans (GAGs) của động vật có vú và chúng có tính chất hóa học tương tự các hyaluronan và choidrotin sulfate do trong phân tử của chúng có chứa đồng thời nhóm sulfate và glucoronic acid Sự có mặt 02 nhóm điện tích này tại các gốc đường khác nhau làm cho các sulfate polysaccharide dễ dàng tham gia biến đổi hóa học tạo thành các sản phẩm ulvan có cấu trúc rỗng dạng sợi nano [114], hạt nano và cấu trúc mạng lưới polyme hydrogel [12], tạo nhiều kiểu liên kết ngang khác nhau [11, 78] Hơn nữa sự có mặt của 03 nhóm ưa nước trong phân tử của chúng là hydroxyl, cacbonyl và sulfat làm tăng khả năng bám dính với mô sinh học giống như biểu mô và màng sử dụng nhiều trong lĩnh vực vật liệu dẫn thuốc Chính vì vậy các nano ulvan polysaccharide thu nhận từ một số loài rong lục được coi như là nguyên liệu ban đầu để tạo ra các hệ chất dẫn thuốc khác nhau

Một ưu điểm vượt trội của ulvan so với một số polysaccharide tự nhiên khác

có thể sử dụng làm hệ dẫn thuốc, đó là chúng có hoạt tính sinh học và quan trọng hơn cả là nguyên liệu sản xuất chúng là loài rong lục Đây là loài thực vật biển có sinh khối phát triển nhanh và có thể tự tái tạo trong tự nhiên Vì vậy chi phí sản xuất chúng sẽ thấp có thể cạnh tranh với các polyme tổng hợp Kết quả này mở ra khả năng ứng dụng ulvan trong y sinh đầy triển vọng và có thể ứng dụng trong thực tế

Hình 1.9 Cấu trúc sợi nano được hình thành bởi tác dụng của Ulvan với PVA

poly(vinyl alcohol) / H3BO3/Ca2+ thông qua các liên kết hydrogel [114]

Mặc dù vậy theo tài liệu tham khảo mà chúng tôi nhận được thì các nghiên

cứu về nano ulvan mới bắt đầu được tiến hành trong thập kỷ trở lại đây Toskas

cùng các cộng sự là một trong nhóm khoa học đầu tiên công bố về điều chế và ứng

dụng ulvan ở kích thước nano Năm 2011, nhóm đã công bố công trình điều chế

sợi nano ulvan bằng phương pháp quay điện hóa [114] Gel ulvan ban đầu được

hình thành bằng cách bổ sung vào dung dịch ulvan H3BO3 và CaCl2 Dung dịch gel

đồng nhất tiếp tục được phối trộn với Polyvinylalcohol ở các tỷ lệ khác nhau trước

khi được đưa vào quy trình quay điện hóa Sợi nano sản phẩm có đường kính trung

bình dưới 84 nm, cấu trúc tinh thể có độ trật tự cao, tiềm năng ứng dụng cao trong

y sinh Năm 2012, Toskas và công sự tiếp tục công bố về tạo ra màng micro

ulvan-chitosan mà trên bề mặt xuất hiện các lỗ xốp kích thước đo được là từ 23 đến 58

nm [116] Màng nano này có tác dụng thúc đẩy sự bám dính và nhân sinh của các

tế bào xương 7F2 Kết quả nghiên cứu này đã được đăng ký patent [115] Gần đây,

nhóm tác giả này tiếp tục công bố về tạo biocomposite nanofibres dựa trên nền

ulvan/PCL và ulvan/PEO hướng tới ứng dụng trong vật liệu y sinh [55] Ngoài ra

còn có các nghiên cứu của nhóm tác giả Alaves và Công sự về tạo ulvan dạng nano

để phục vụ cho việc nghiên cứu cấu trúc 2 D của hạt nano ulvan, dự báo khả năng

ứng dụng trong vật liệu y sinh và có một công bố đưa ra ứng dụng cụ thể hơn Đó

là sử dụng ulvan-PDLLA có cấu trúc 3D rỗng để làm cố định xương [11, 12] Như

vậy các nghiên cứu gần đây về ulvan được biết như là polyme đầy tiềm năng cho

sự phát triển vật liệu gel cho mục đích ứng dụng y sinh Việc tạo liên kết ngang

vật lý hay hóa học đều liên quan đến việc điều chế ulvan hydrogel và sau đó là

dạng nano ulvan bằng cách nghiên cứu tạo phức poly điện ly (polyelectrolyte) với

chitosan, tạo hydride nanofibre bằng khuấy trộn vật lý với các polyme tương thích sinh học hoặc tạo mạnh lưới liên kết cộng hóa trị [116, 55, 15, 12, 11, 78 ] Tất cả các liên kết kể trên đều liên quan đến các nhóm ưa nước trong phân tử ulvan là sulfate, hydroxyl và nhóm cacboxyl

Qua tham khảo tài liệu cho thấy chưa có quy trình cụ thể nào để điều chế hạt nano làm chất dẫn thuốc từ polysaccharide dạng ulvan chiết từ rong lục trong khi

có rất nhiều nghiên cứu công bố về việc điều chế hạt nano từ các polysacchride tự nhiên hướng đến làm chất dẫn thuốc như alginate, chitosan, tinh bột, … Tùy theo cấu trúc của polysaccharide mà quy trình điều chế sẽ thay đổi Tuy nhiên quy trình chung để điều chế hạt nano thường chia là 02 bước chính sau Đầu tiên là thực hiện việc chuyển hóa polysaccharide nhằm thu được các copolymer dạng amphiphilic hoặc các chất có thể tạo gel kiểu liên kết cộng hóa trị, liên kết ion và sau đó thực hiện một số các kỹ thuật khác nhau để thu được các hạt nano polymer Các kỹ thuật chủ yếu hay dùng là bay hơi dung môi nhũ tương hóa, khuyếch tán dung môi trong hệ nhũ tương, phân tử tự lắp ghép và kỹ thuật thẩm tách trong hệ dung môi không hòa tan và hòa tan polymer

1.4.2 Trong nước

Với thông tin không nhiều về quy trình tạo vật liệu nano ulvan từ rong xanh thì việc đưa ra quy trình với quy mô phòng thí nghiệm là 2g/mẻ, chúng tôi sẽ phải đưa ra quy trình với những thay đổi về tác nhân chuyển hóa polysaccharide dạng ulvan thích hợp với cấu trúc phân tử của chúng gồm 3 nhóm chức ưa nước là hydroxyl, sulfate và nhóm carboxylic từ những thông tin chủ yếu là các chuyển hóa của các polysaccharide chỉ có từ 1 đến 02 nhóm chức ưa nước như alginate, chitosan, tinh bột Đây là khó khăn khi thực hiện đề tài cần phải giải quyết để đưa ra quy trình ổn định thu được sản phẩm hạt nano

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về polysaccharide sinh học có nguồn gốc từ tài nguyên biển đã được nghiên cứu từ những năm 90 của thế kỷ trước tại một số cở

sở nghiên cứu như Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học Nha Trang nhưng chủ yếu tập trung vào xây dựng quy trình tách chiết, xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số polysaccharide như chitosan, alginate, carrageenan, agar, fucoidan trong đó sản phẩm fucoidan đã được thương mại hóa