NGHIÊN CỨU TRÍCH LY THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CỦ ĐẬU VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO

Nói chung, các chất này dễ bị phân huỷ dưới tác động của oxy hoá, ánh sáng đặc biệt là các tia cực tím, ẩm độ, nhiệt độ và pH môi trường nên chúng ít gây độc cho môi sinh môi trường.[7]

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC BẢNG 4

DANH MỤC SƠ ĐỒ 5

DANH MỤC HÌNH 6

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 Tổng quan về cây củ đậu 11

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 11

1.1.2 Đặc điểm và sinh thái 12

1.1.3 Tì nh hì nh trồng trọt, tiêu thụ và kỹ thuật canh tác cây củ đậu ở Việt Nam 12

1.1.4 Thành phần hóa học 17

1.1.5 Tí nh vị và công dụng 18

1.2 Hợp chất Phenol, Flavonoid và Rotenone 19

1.2.1 Phenol 19

1.2.2 Flavonoid 21

1.2.3 Rotenone 26

1.3 Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật 29

1.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 29

1.3.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng 30

1.4 Phương pháp đánh giá độc tính và xác định giá trị LC50 35

1.5 Phương pháp xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 39

1.6 Sinh vật thí nghiệm 41

1.6.1 Động vật giáp xác - Artemia Nauplii 41

1.6.2 Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 43

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 48

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 48

2.2 Vật liệu nghiên cứu 48

2.3 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 48

2.3.2 Hóa chất 49

2.4 Phương pháp 49

2.5 Nội dung thí nghiệm 49

2.5.1 Phương pháp tách chiết và thu cao chiết 51

2.5.2 Phương pháp định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá cây củ đậu 53

2.5.3 Phương pháp định lượng một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu 55

2.5.4 Phương pháp đánh giá độc tính 58

2.5.5 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn 59

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62

3.1 Thu nhận cao chiết từ lá củ đậu bằng các phương pháp và dung môi khác nhau 62

3.2 Định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu 62

3.2.1 Định tính flavonoid 62

3.2.2 Định tính rotenone 63

3.3 Định lượng một số hợp chất thứ cấp và chất khô trong các loại cao chiết 65

3.3.1 Hàm lượng chất khô 65

3.3.2 Định lượng polyphenol tổng số 65

3.3.3 Định lượng Flavonoid tổng số 69

3.4 Khảo sát độc tí nh 72

3.5 Thử hoạt tí nh kháng khuẩn của các loại cao chiết 75

3.5.1 Hoạt tí nh kháng Enterotoxigenic E.Coli của các loại cao chiết 75

3.5.2 Hoạt tí nh kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết 76

3.5.3 Hoạt tí nh kháng Pseudomonas aeruginosa của các loại cao chiết 77

3.5.4 Không có hoạt tí nh kháng một số vi sinh vật của các loại cao chiết 78

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80

DANH MỤC BẢNG Bảng 1 1 Hiệu quả tác động của Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) đối với

ruồi giấm 37

Bảng 1 2 Phân tích nguồn biến lượng 38

Bảng 2 1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên Artemia Nauplii 58

Bảng 3 1 Kết quả định tính một số hợp chất thứ cấp trong cao chiết và lá củ đậu 64

Bảng 3 2 Kết quả hàm lượng chất khô của các loại cao chiết 65

Bảng 3 3 Kết quả đường chuẩn Acid Gallic 66

Bảng 3 4 Kết quả hàm lượng polyphenol tổng trong 4 loại cao chiết lá củ đậu 67

Bảng 3 5 Bảng kết quả đường chuẩn Rutin 69

Bảng 3 6 Bảng kết quả hàm lượng flavonoid tổng số trong 4 loại cao chiết 70

Bảng 3 7 Kết quả các đường chuẩn và LC50 tương ứng của 4 loại cao chiết 72

Bảng 3 8 Nồng độ LC50 (mg/L) của 4 loại cao chiết 74

Bảng 3 9 Kết quả kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết 75

Bảng 3 10 Kết quả kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết 76

Bảng 3 11 Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của 4 loại cao chiết 77

Bảng 3 12 Kết quả kháng một số loại vi sinh vật của 4 loại cao chiết 79

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2 1 Nội dung thí nghiệm 50

Sơ đồ 2 2 Quá trình tách chiết và thu cao chiết từ lá củ đậu 51

Sơ đồ 2 3 Quy trình định lượng polyphenol tổng 56

Sơ đồ 2 4 Quy trình đánh giả khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu 60

DANH MỤC HÌNH

Hì nh 1 1 Cây củ đậu 11

Hì nh 1 2 Thương lái thu mua củ đậu ngay tại đồng ruộng 13

Hì nh 1 3 Cây củ đậu được trồng theo luống 15

Hì nh 1 4 Củ đậu đến thời gian thu hoạch 17

Hì nh 1 5 Tephrosin 18

Hì nh 1 6 Rotenone 18

Hì nh 1 7 Củ đậu tốt cho sức khỏe 18

Hì nh 1 8 Một số món ăn được chế biến từ củ đậu 19

Hì nh 1 9 Một số hợp chất phenol 20

Hì nh 1 10 Một số Eucoflavonoid 22

Hì nh 1 11 Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của rotenone 26

Hì nh 1 12 Chuỗi truyền điện tử và cơ chế tác động của rotenone trong ty thể 28

Hì nh 1 13 Rotenone ngăn cản sự truyền điện tử đến CoQ 28

Hì nh 1 14 Chiết 2 lớp chất lỏng 29

Hì nh 1 15 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 30

Hì nh 1 16 Bộ chiết Soxhlet 32

Hì nh 1 17 Máy chiết Kumagawa 33

Hì nh 1 18 Bộ lôi cuốn hơi nước 33

Hì nh 1 19 Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn 34

Hì nh 1 20 Cột chiết pha rắn 35

Hì nh 1 21 Ấu trùng và trứng Artemia Nauplii 42

Hì nh 1 22 Vi khuẩn Salmonella 43

Hì nh 1 23 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 44

Hì nh 1 24 Listeria monocytogenes 45

Hì nh 1 25 Vi khuẩn Escherichia coli 45

Hì nh 1 26 Pseudomonas aeruginosa 47

Hì nh 2 1 Lá cây củ đậu 48

Hì nh 2 2 Phương pháp ngâm dầm 52

Hì nh 2 3 Phương pháp chiết Soxhlet 53

Hì nh 2 4 Ngâm lá với chloroform và dịch chiết sau khi cô trên kính đồng hồ 54

Hì nh 2 5 Các loại cao chiết trên kính đồng hồ 55

Hì nh 2 6 Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên ấu trùng Artemia Nauplii 59

Hì nh 3 1 4 loại cao chiết 62

Hì nh 3 2 Cao chiết chuyển từ nâu sang vàng sau khi cho 1% NaOH/etanol 96o 63

Hì nh 3 3 Dịch chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit 64

Hì nh 3 4 Cao chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit 64

Hì nh 3 5 Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic 65

Hì nh 3 6 Màu nâu vàng sang xanh lam của cao chiết sau khi ủ ở 40oC 66

Hì nh 3 7 Đường chuẩn Acid Gallic 66

Hì nh 3 8 Sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng số của 4 loại cao chiết 67

Hì nh 3 9 Dung dịch Rutin chuẩn 69

Hì nh 3 10 Đo hàm lượng flavonoid tổng số của cao chiết 70

Hì nh 3 11 Đường chuẩn Rutin 70

Hì nh 3 12 Sự chênh lệch hàm lượng flavonoid tổng số của 4 loại cao chiết 71

Hì nh 3 13 Đường chuẩn của cao chiết A 73

Hì nh 3 14 Đường chuẩn của cao chiết C 73

Hì nh 3 15 So sánh LC50 của 4 loại cao chiết 74

Hì nh 3 17 Vòng kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết 75

Hì nh 3 18 Vòng kháng Listeria monocytogenes của 4 loại cao chiết 76

Hì nh 3 19 Vòng kháng Pseudomonas aeruginosa 4 loại cao chiết 77

Hì nh 3 20 Kết quả không kháng Salmonella của 4 loại cao chiết 78

Hì nh 3 21 Kết quả không kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết 79

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Từ xa xưa, nông dân ở nhiều nước trên thế giới đã biết sử dụng một số loài thực vật chứa chất độc để trừ một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng và gia súc bằng cách phun lên cây hay dùng nước chiết để tắm cho gia súc Trên thế giới có khoảng 2000 loài cây có chất độc, trong đó có 10 – 12 loài cây được dùng phổ biến

Thuốc thảo mộc diệt trừ côn trùng bằng con đường tiếp xúc và vị độc phổ tác động thường không rộng Một số loài còn có khả năng diệt cả nhện hại cây Sau khi sâm nhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng

Cây củ đậu là loại rau củ ngắn ngày, có thể trồng nhiều vụ trong năm, quen thuộc với con người Việt Nam và diện tích trồng trọt rất lớn do mang đến nhiều hiệu quả kinh tế cao Tuy nhiên, nông dân chỉ thu hoạch và sử dụng củ (rễ phình to), cắt bỏ tất cả phần thân trên gồm thân, lá, hạt Hạt và lá củ đậu có một số thành phần hóa học tương tự nhau, rất độc, gây ngộ độc và có thể dẫn đến tử vong cho con người nếu vô tình ăn phải hoặc cố ý ăn với liều lượng lớn Dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học và độc tính bên trong hạt và lá củ đậu có thể ứng dụng trong trừ sâu, bệnh hại thực vật vẫn còn rất hạn chế ở nước ta

Việc nghiên cứu sản xuất và bổ sung các chất độc được tách chiết từ thiên nhiên vào thuốc bảo vệ thực vật, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây hại cho con người và môi trường luôn được quan tâm Những hợp chất trừ sâu thảo mộc thông dụng như rotenone và rotenoit, arteminisinin, azadirachtin…Hiện diện trong một số bộ phận của một

số loài cây Hàm lượng chất độc phụ thuộc loài cây, bộ phận cây, điều kiện sống và thời gian thu hái chúng Nói chung, các chất này dễ bị phân huỷ dưới tác động của oxy hoá, ánh sáng (đặc biệt là các tia cực tím), ẩm độ, nhiệt độ và pH môi trường nên chúng ít gây độc cho môi sinh môi trường.[7]

Sau khi thu hoạch nhiều vụ mùa củ đậu trong năm, nông dân thải bỏ số lượng lớn lá

và hạt nhưng chỉ có một số ít nhà nông biết sử dụng hạt củ đậu ngâm nước để bảo vệ cây trồng còn rất thủ công và đơn giản Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu về lá củ đậu

cũng như những thành phần độc tính có giá trị của nó rất ít Do vậy, đề tài “Nghiên cứu

trí ch ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tí nh trên mô hì nh in vitro”

được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tạo chế phẩm ứng dụng trong bảo

vệ thực vật mang lại nhiều giá trị thực tiễn

2 Tì nh hì nh nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1 Các nghiên cứu trong nước

- Chuyên đề tốt nghiệp “Thử hiệu lực của một số thuốc trừ sâu có nguồn gốc thảo mộc

đối với sâu hại chính trên lúa và trên rau cải trong vụ mùa năm 2013 tại xã Thanh

An – huyện Điện Biên – tỉnh Điện Biên” Đỗ Đức Anh Đề tài sử dụng chế phẩm được

tách chiết từ hạt củ đậu

- Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu tác dụng diệt ve kí sinh trên cho và bò của chế phẩm thuốc mỡ từ cây thuốc cá” Nguyễn Thanh Hải (2007) Trong đó, độc

tính chủ yếu trong chế phẩm là rotenone tương tự như chất độc bên trong lá củ đậu

- Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp “Đặc điểm dịch tễ bệnh ve chó ở hai huyện,

thị của tỉnh Thái Nguyên, thử nghiệm thảo dược trong trị ve cho chó” Cù Xuân Đức

(2011) Thảo dược của đề tài được dùng cho thử nghiệm là hạt củ đậu

- Luận án phó Tiến sĩ “ Nghiên cứu sử dụng một số loại cây có hoạt tính độc để làm

thuốc trừ sâu ở phí a Bắc Việt Nam” Nguyễn Duy Trang (2016) Trong đó, đề tài có

nghiên cứu về hiệu lực trừ sâu của hạt củ đậu

2.2 Các nghiên cứu ngoài nước

- Sahu Rc, Hameed SF (1983), “Assessment of the rotenoids of Indian yam bean

seeds” Đánh giá rotenoid chiết xuất từ hạt củ đậu trừ các loài sâu, bướm

- Sahu RC, Hameed SF (1989), “Effect of Pachyrrhizus erosus urban seed extracts

against tobacco caterpillar, Spodoptera litura F Tobacco Res 15(1):17-20” Sự ảnh

hưởng của hạt củ đậu đối với sâu

3 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được hàm lượng các chất polyphenol, flavonoid trong cao chiết lá củ đậu

- Đánh giá độc tính và khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu làm tiền đề cho việc nghiên cứu ứng dụng làm dược liệu bổ sung vào BVTV

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu,

làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo

- Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương pháp xác

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về cây củ đậu, thành phần hóa học của lá và hạt củ đậu, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ cấp,

mô hình đánh giá độc tính, phương pháp đục lỗ thạch, sinh vật thí nghiệm

- Phương pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các

nhiệm vụ nghiên cứu

- Phương pháp xử lý số liệu bằng Excel và SAS Các số liệu thu được sẽ được xử lý

nhằm đưa ra kết luận cho đề tài

6 Kết quả đạt được của đề tài

- Thu nhận được các loại cao chiết lá củ đậu bằng 2 phương pháp ngâm dầm và chiết Soxhlet trong 2 loại dung môi etanol 90o và acetone

- Định tính được sự có mặt của flavonoid, rotenone có sự hiện diện học trong cao chiết

lá củ đậu

- Định lượng được: polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các loại cao chiết

- Tìm ra giá trị LC50, so sánh độc tính giữa các loại cao chiết và khả năng kháng một

số loại vi sinh vật của các loại cao chiết

7 Kết cấu đồ án tốt nghiệp

- Mở đầu

- Chương 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Chương 4: Kiến nghị

- Tài liệu tham khảo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây củ đậu

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây củ đậu hay củ sắn, sắn nước (theo cách gọi miền Nam, danh pháp hai

phần: Pachyrhizus erosus) là một cây dây leo Loài này được Carl von Linné miêu tả khoa

học đầu tiên Tên gọi cây gần như chủ yếu nói về củ của nó.[16]

Chi Củ đậu (Pachyrhizus) là một chi nhỏ gồm khoảng 5 – 6 loài dây leo có rể phình

to thành củ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ Sau khi người Châu

Âu khám phá ra Châu Mỹ một số loài quan trọng trong chi này được giới thiệu sang Châu

Phi, Châu Á và Châu Úc

Loài Củ đậu hay củ sắn dây (Pachyrhizus erosus) có nguồn gốc từ Mexico và Trung

Mỹ Người Tây Ban Nha đưa dây củ sắn từ Mexico vào Philippines vào thế kỷ thứ 18 và từ

đó cây củ đậu được lan truyền đến các khu vực khác của Đông Nam Á và Trung Quốc Hiện

nay, Cây củ đậu được trồng nhiều ở Châu Mỹ, Trung Quốc và Đông Nam Á

Ở Việt Nam, Cây củ đậu được người Pháp nhập vào đầu thế kỷ 20 và được trồng

nhiều ở các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long và Miền Đông Nam Bộ, ở Miền Bắc gọi là Cây

củ đậu

Phân loại khoa học

Hì nh 1 1 Cây củ đậu

Họ (familia) Fabaceae

Phân họ (subfamilia) Faboideae

Phân tông (subtribus) Glycininae

1.1.2 Đặc điểm và sinh thái

Cây củ đậu có thể cao 4 – 5 m nếu có giàn Lá kép gồm 3 chét hình tam giác rộng, mỏng Hoa màu tím nhạt; ở Việt Nam thường ra vào tháng 4, tháng 5; hoa khá lớn, mọc thành chùm dài ở kẽ lá Quả hơi có lông, không cuống, dài 12 cm, được ngăn vách nhiều rãnh ngang, thường chứa từ 4 – 9 hạt Củ do rễ phình to mà thành, có thể dài tới 2 m và nặng đến 20 kg Vỏ củ có màu vàng và mỏng như giấy còn ruột có màu trắng kem hơi giống ruột khoa tây hay quả lê

Củ đậu có chứa tinh bột 2,4%, 4,51% đường toàn bộ (glucose) Nó có chứa 86 – 90% nước; nó có một ít protein (1,46%) nhưng không có các chất béo

Trái với củ, phần còn lại của cây củ đậu rất độc; hạt có chứa độc tố rotenone, dùng

để diệt côn trùng và thuốc cá, diệt rệp rau và rệp thuốc lá Lá có chứa các chất độc đối với

cá và động vật nhai lại (trừ ngựa)

Củ đậu nên được bảo quản ở nơi khô ráo, nhiệt độ khoảng 12°C tới 16°C (53°F tới 60°F); nhiệt độ thấp hơn làm hư củ Củ đậu tươi nếu được cất giữ ở nhiệt độ thích hợp có thể để lâu một hoặc hai tháng

Cây củ đậu được trồng ở châu Mỹ, Trung Quốc và Đông Nam Á, nơi củ đậu sống được chế biến thành nhiều món ăn đa dạng, phong phú Tại Việt Nam, cây củ đậu được trồng khắp nơi vùng đồng bằng cũng như miền núi để lấy rễ củ ăn, hạt dùng làm thuốc, nhưng ít dùng vì có độc Mùa thu hoạch hạt: tháng 11 – 12.[17]

1.1.3 Tì nh hì nh trồng trọt, tiêu thụ và kỹ thuật canh tác cây củ đậu ở Việt Nam

là cây trồng ưu tiên hàng đầu, đặc biệt là cây củ đậu Cây củ đậu có quy trình canh tác đơn giản, cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao

Theo điều tra khảo sát tại 4 xã thuộc huyện Kim Thành, tổng diện tích trồng củ đậu đạt trên 347 ha, chiếm 37,5% diện tích gieo trồng vụ đông với bình quân 3,7 sào/hộ Giống chủ yếu được cung cấp bởi hệ thống đại lý cung ứng thường là giống của các tỉnh miền Nam Thời gian trồng chính vụ và trái vụ chênh lệch nhau không nhiều (khoảng 30 ngày) cho năng suất, chất lượng không cao

Sau khi áp dụng sản xuất theo quy trình VietGAP cho năng suất cao, đạt hiệu quả kinh tế lớn hơn so với củ đậu không thực hiện theo VietGAP Năng suất chính vụ đạt trên 3.000 kg/sào, trái vụ đạt trên 1.800 kg/sào, do tiết kiệm được chi phí phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, mỗi sào trồng củ đậu theo VietGAP cho lợi nhuận lớn hơn từ 400 – 500 ngàn đồng, qua đó tăng thu nhập trên 13 triệu đồng/ha/vụ.[18]

Tại Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh Hiện nay, toàn huyện có gần 200 ha trồng củ đậu, tập trung ở các xã Tân Việt, Bình Khê, An Sinh, Tràng An, Đức Chính… Trong đó, xã Tân Việt là địa phương có diện tích trồng củ đậu nhiều nhất huyện với hơn 72 ha Được đưa vào trồng ở đồng đất địa phương từ năm 1997, đến nay cả 4 thôn trong xã, bà con nông dân đều tham gia mô hình này Vụ mùa năm nay, cả xã Tân Việt gieo trồng 164 ha lúa và rau màu, thì củ đậu chiếm hơn 72 ha với gần 600 hộ nông dân tham gia So với vụ mùa năm trước, diện tích cây củ đậu tăng gần 10 ha

Hì nh 1 2 Thương lái thu mua củ đậu ngay tại đồng ruộng

Theo đánh giá của địa phương, mỗi ha củ đậu cho thu nhập bình quân 150 triệu đồng, năng suất cao gấp 3 – 4 lần so với cấy lúa Ngoài ra, cây củ đậu cũng được xã Tân Việt chọn

đăng ký sản phẩm trong chương trình “Mỗi xã, thị trấn một sản phẩm nông nghiệp đặc trưng của huyện” Theo bà con nông dân ở đây cho biết, mỗi sào củ đậu sau khi trừ chi phí, người nông dân thu lãi trung bình 4 – 5 triệu đồng.[19]

Vụ mùa năm 2011, người dân ở thôn Mịn To, xã Trù Hựu (Lục Ngạn – Bắc Giang)

đã có nguồn thu bạc tỷ từ củ đậu Cả thôn Mịn To có 42 hộ trồng cây củ đậu với tổng diện tích lên đến gần chục ha Những hộ trồng diện tích nhiều từ 4 sào trở lên có đến hàng chục

hộ Do điều kiện thời tiết thuận lợi, cộng với việc người dân đã áp dụng tốt kiến thức khoa học kỹ thuật và kinh nghiệm vào sản xuất, nên cây củ đậu sinh trưởng phát triển tốt cho năng suất cao đạt bình quân hơn 3 tấn/sào Ngoài việc bán buôn cho tiểu thương vào tận ruộng thu mua, nhiều bà con nơi đây còn thu hoạch dần và mang đi bán lẻ ở các chợ trong huyện được giá 4 nghìn đồng/kg

Trước kia, chỉ có vài hộ dân trong thôn Mịn To đưa cây củ đậu về trồng với diện tích nhỏ lẻ Nhưng từ năm 2007, thấy việc trồng cây củ đậu không khó lại cho hiệu quả kinh tế cao nên nhân dân đã học tập nhau cùng mua giống về trồng Theo đó diện tích cây củ đậu ngày càng được mở rộng, đến nay đã có gần chục ha.[20]

Năm 2011, Phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang phối hợp với UBND xã Đồng Kỳ xây dựng cánh đồng mẫu củ đậu, diện tích 21,3 ha tại thôn Ngò 1 Mỗi hộ tham gia được hỗ trợ hơn 100 nghìn đồng/sào và hướng dẫn kỹ thuật trồng, chăm sóc Vụ đầu tiên, năng suất đạt 56 tấn/ha, giá tại ruộng bình quân 3 nghìn đồng/kg, một ha

củ đậu người dân có thể thu lãi gần 100 triệu đồng/vụ Nhờ mang lại hiệu quả kinh tế cao nên xã chủ trương mở rộng diện tích Hiện xã Đồng Kỳ trồng hơn 70 ha củ đậu.[21]

Ngoài ra còn một số tỉnh trồng cây củ đậu với diện tích lớn và đạt hiệu quả kinh tế cao như thị xã Long Khánh tỉnh Đồng Nai, tỉnh Vĩnh Long, tỉnh Thái Bình…

 Giống: Hiện tại có 2 giống Chiêm xanh Thái Bình và Chiêm lá nhỏ miền Nam có khả năng chịu được thời tiết khô hạn hoặc ngập úng cũng như lạnh giá

 Lượng hạt cần cho 1 sào (360 m2) khoảng 3,5 – 4,2 kg hạt

 Thời vụ trồng: Củ đậu có thể trồng từ tháng 6 – 9 dương lịch

 Kinh phí đầu tư trung bình khoảng 4 – 4,5 triệu đồng/sào

 Làm đất: Đất trồng củ đậu tốt nhất là đất cát pha hoặc thịt nhẹ giàu mùn Đất được lên luống 2 lần: Lần 1 (luống sơ bộ - lõi luống), lần 2 luống hoàn chỉnh

 Lên luống sơ bộ: Đất được cày vỡ, phân luống (khoảng 4 m/luống) rồi lên luống cao khoảng 40 cm Tiến hành bón lót các loại phân bao gồm:

 Đặt hạt: Bắt đầu đặt hạt cách dõng luống khoảng 20 – 25 cm Hạt được đặt nằm ngang đều và so le nhau sao cho hạt cách hạt từ 8 – 10 cm

Hì nh 1 3 Cây củ đậu được trồng theo luống

 Rắc rạ phủ luống: Trồng củ đậu nhất thiết phải có rạ hoặc rơm phủ kín luống mới mang lại hiệu quả cao cho củ sau này và thuận tiện cho quá trình chăm sóc Rạ phải được phủ dày tối thiểu khoảng 3 – 4 cm Trung bình để trồng được 1 sào củ đậu cần khoảng 1,5 sào lúa để rạ (nên chọn rạ ở những ruộng không bị nhiễm nặng nấm khô vằn)

 Chăm sóc: Cần tưới nước giữ ẩm thường xuyên luống củ đậu giúp cây phát triển thuận lợi Sau trồng khoảng 1 tháng, bón phân thúc để nuôi cây với lượng khoảng 2

kg ure + 3 kg supe lân hoặc phân tổng hợp NPK (cần tưới đủ nước để lá cây không

bị cháy)

Tùy theo thời tiết và chân đất, quan sát màu sắc lá có thể tiến hành bón phân thúc tiếp cho cây từ tháng thứ 2 đến tháng thứ 4 khoảng 2 – 3 lượt (không nên bón đạm quá nhiều cây sẽ không phát triển được củ hoặc củ hay bị thối)

 Bấm ngọn, ngắt hoa: Khi cây củ đậu có khoảng 5 – 6 lá thật, tiến hành bấm ngọn lần đầu tiên Sau đó, khi cây bật ngọn phụ và ra hoa thì cần phải bấm và ngắt bỏ kịp thời

để cây xuống củ được thuận lợi Tuy nhiên, luôn luôn phải đảm bảo duy trì trên mỗi cây củ đậu phải có từ 10 – 12 lá thật để cây quang hợp tốt, củ sẽ nhanh to

 Bảo vệ thực vật:

 Sâu hại: Củ đậu thu đông thường hay bị các loại sâu (sâu xanh, sâu khoang, rệp muội) gây hại Cần thường xuyên thăm đồng kiểm tra, áp dụng các biện pháp tổng hợp và trừ sâu kịp thời khi đến ngưỡng

 Bệnh hại: Một số bệnh chính gây hại củ đậu thu đông đó là: Bệnh chết thắt thân cây con, bệnh vàng lá, bệnh đốm nâu và bệnh gỉ sắt

Biện pháp: Sau khi hạt mọc mầm và phát triển thành cây con nên sử dụng thuốc Validacin để phòng bệnh chết thắt thân cây con (không được sử dụng thuốc Anvil lúc này

sẽ dễ làm cây cháy lá)

 Thu hoạch: Củ đậu có thể thu hoạch sau trồng khoảng 4 tháng Song, thu hoạch tốt nhất khi cây được 5,5 – 6 tháng tuổi Không nên để củ đậu trên 7 tháng tuổi rồi mới thu hoạch vì lúc này củ đã bị xốp, mất hết chất dinh dưỡng và độ ngọt

Với trình độ thâm canh của nông dân Tam Kì, trong nhiều năm gần đây đã đạt được năng suất củ trung bình 3 – 3,5 tấn củ/sào Cá biệt có những hộ đạt được 5 tấn/sào.[22]

Hì nh 1 4 Củ đậu đến thời gian thu hoạch

Tuy thành phần hóa học trong lá cây củ đậu chưa được định tính nhưng lá cũng có một số hợp chất tương tự như trong hạt Một trong số các flavonoid chủ yếu có trong lá củ đậu là rotenone (C23H22O6)

Trong rễ củ (củ đậu), sau khi đã bóc vỏ có tới 90% nước; 2,4% tinh bột; 4,51% đường

toàn bộ (biểu thị bằng glucose); 1,46% protein; 0,39% hợp chất vô cơ; không thấy có chất béo, không thấy có tanin, không có acid xyanhydric Có men peroxydase, amylase và photphatase [16]

1.1.5 Tí nh vị và công dụng

Củ đậu không độc, có vị ngọt nhạt, tính mát, ăn sống thì giải khát, nấu ăn thì bổ ích tràng vị, dùng xào với thịt, tôm, tép, nấu thay rau ăn ngon miệng Người ta còn dùng củ đậu kho với thịt, hầm thịt, làm nộm, làm nhân bánh đa nem, lẫn với thịt nạc băm, thịt cua biển, thịt tôm tươi và mộc nhĩ, bún tàu làm nhân bánh xèo Phụ nữ thường dùng củ đậu tươi thái lát, xoa hoặc ép lấy nước để bôi mặt cho mịn da, khỏi nứt nẻ Củ đậu khô có thể tán bột dùng làm phấn bôi mặt, xoa rôm sảy

Hì nh 1 7 Củ đậu tốt cho sức khỏe

Hì nh 1 6 Rotenone

Hì nh 1 5 Tephrosin

Hì nh 1 8 Một số món ăn được chế biến từ củ đậu

Hạt cây củ đậu chỉ dùng giã nhỏ nấu với dầu vừng để nguội bôi chữa ghẻ Có thể phối hợp với quả Bồ hòn và hạt Máu chó Lá cây chỉ dùng chữa bệnh ngoài da chứ không được uống trong Ở Ấn Độ, người ta dùng hạt giã nhỏ cho vào nước để thuốc cá Hạt tán bột đắp trị bệnh ngoài da cũng như chứng nổi rôm; có khi chúng được dùng như thuốc nhuận tràng và trị giun

Hạt và lá rất độc đối với động vật như sâu, bọ, cá và với loài nhai lại (trừ ngựa) Làm thuốc phun trừ rệp rau và rệp thuốc lá Hạt củ đậu ngâm với nước một đêm, sau giã nhỏ, thêm nước với tỷ lệ 1,5% đến 2% hoăc 4% trộn đều Phun lên những cây bông, cây rau, cây thuốc lá ở ngoài ruộng Sau 24 giờ đến 36 giờ rệp và nhện đỏ chết hết hay gần hết (90 – 100%)

1.2 Hợp chất Phenol, Flavonoid và Rotenone

1.2.1 Phenol

1.2.1.1 Đại cương về hợp chất phenol

Các hợp chất phenol là các hợp chất mà trong cấu trúc có một hoặc nhiều vòng thơm (vòng benzen) mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl –OH Trong thiên nhiên các hợp chất phenol là flavonoid, xanthan, coumarin, qiunon, các phenol đơn vòng, các polyphenol (lignin, tannin…)

Các hợp chất polyphenol chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực vật, chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hoá quan trọng; vào các quá trình trao đổi chất dưới nhiều hình thức khác nhau như quá trình hô hấp tế bào (vận chuyển H+ trong quá trình photphoryl hoá, oxy hoá ), quá trình quang hợp, điều hòa sinh trưởng phát triển của thực vật….[6]

1.2.1.2 Phân loại

Dựa vào số lượng nhóm hydroxyl mà người ta phân biệt thành 2 nhóm: phenol đơn giản và phenol phức tạp (polyphenol)

Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất được cấu tạo từ 1 vòng benzen và 1 hay nhiều

nhóm OH, được phân thành các: monophenol; diphenol (pyrocatechin, rezoxyn ); triphenol (pyrogalon, oxy hydroquinon )

Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo, ngoài

vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, được phân thành các nhóm: monomer và polymer

- Monome hay polyphenol đơn giản

 Nhóm C6 – C1 (axit phenol cacbonic): trong cấu trúc phân tử có thêm nhóm cacbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm

 Nhóm C6 – C3 (axit cumaric, axit cafeic): có gốc cacbonyl được nối với nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thường gặp ở thực vật bậc cao

 Nhóm C6 – C3 – C6: gọi là các flavonoid và được chia thành các nhóm phụ như flavon, flavonol (sắc tố vàng), antoxyanidin (sắc tố xanh, đỏ và tím), catechin (không màu)…

 Nhóm hợp chất polyphenol polymer: được chia thành các nhóm phụ như Tanin, Lignin, Axit Humic….[4]

Hì nh 1 9 Một số hợp chất phenol

1.2.1.3 Tí nh chất hóa lý của polyphenol

Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ở dạng glycoside Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể dựa vào đặc điểm này để theo dõi chúng trong quá trình tách chiết và cô lập chúng ra khỏi cây cỏ Các hợp chất phenol thường bị hủy hoại do tác dụng của enzyme phenolase vốn luôn có mặt trong cây vì thế nên

sự dụng acol nóng để tách chiết do acol giúp hạn chế tác dụng của enzyme Các phenol đều tác dụng với thuốc thử FeCl3 để cho ra màu xanh lục, tím hoặc đen.[6]

Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do có những đặc điểm giống nhau ở cấu trúc được cấu thành từ các vòng benzen nên chúng có một số tính chất chung:

1.2.2.1 Đại cương về flavonoid

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa…Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số các sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản

Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 – diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và

B nối nhau qua một dây có 3 carbon, nên thường được gọi là C6 – C3 – C6 Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm -OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside Các đường thường gặp nhất là đường D - glucose, kế đó là D - galactose, L - rhamnose, L - arabinose,

D - xylose, D - apiose và acid uronic.[6]

1.2.2.2 Phân loại

Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6, đều có 2 vòng thơm Tùy thuộc vào cấu tạo phần mạch C3 trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các nhóm sau[24]:

 Eucoflavonoid: flavon, flavonol, flavanol, flavanon, chalcon, antocyanin, anthocyanidin

Hì nh 1 10 Một số Eucoflavonoid

- Flavon rất phổ biến trong thực vật: Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá), Anh thảo, cây

la apirenin và luteolin

- Chalcon có chủ yếu ở trong một số cây họ Cúc - Asteraceac tập trung nhiều nhất ở

vỏ cây, gỗ lõi (Keo, Bạch đàn, Dẻ, Đậu tương, Trinh nữ hoàng cung, Dương xỉ…) Không tìm thấy ở động vật

 Isoflavonoid: Isoflavon, isoflavanon, rotenoid

 Neoflavonoid: neoflavon và calophylloid

1.2.2.3 Lý tí nh

Trong tự nhiên các hợp chất này thường tồn tại dưới dạng glycoside, dễ tan trong nước và dung môi phân cực, dễ bị thủy phân trong môi trường axit, kiềm nhẹ hoặc bởi enzyme β – glucosidase, emulsin

Có mùi thơm và vị đắng chát đặc trưng Do các nối đôi liên hợp mà các flavonoid thường có màu, đặc biệt là màu vàng Nếu các nối đôi bị phá vỡ thì hợp chất sẽ mất màu

Có khả năng hấp thụ ngoại tử ngoại do có hệ thống nối đôi liên hợp Thường thu được 2 dải hấp thụ cực đại, dải 1 có λmax= 240 – 280 nm, dải hấp thụ 2 thường cố định dài hơn dải 1 và giữ 2 dải thường có 1 vai phụ, đặc biệt là đối với flavon và flavonol Tùy theo

pH của môi trường và điều kiện tạo muối và phức với các kim loại (K, Na, Fe hoặc Al) mà các bước sóng hấp thụ có thể chuyển dịch.[25]

- Phản ứng với kiềm: do các nhóm OH có nhóm axit nên dễ phản ứng với các hydroxit kiềm tạo muối tạo muối tan trong nước, khi có nhóm C=O (cacbonyl) trong phân tử thì tính axit lại càng tăng thêm và flavonoid có thể tan trong dung dịch NaHCO3

- Phản ứng este hóa: trong thiên nhiên ít gặp các este của phenol, nhưng trong thí

nghiệm in vitro, các nhóm OH của phenol thường dễ cho este, thường gặp là este

metylic

- Phản ứng tạo phức với kim loại: Nhóm OH thường tạo phức với AlCl3, NaOH, KOH,…cho màu vàng đặc trưng và nhóm chức này cũng là nguyên nhân làm cho các flavonoid tự nhiên có ái lực mạnh với các ion kim loại nặng có hóa trị 2 như Fe,

Cu, Zn,…và có thể tạo phức chất bền vững với các nguyên tố thuộc chu kỳ 4 Những kim loại này thường có trong các tế bào sinh vật dưới dạng các nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự sinh tồn của tế bào Mặt khác, các flavonoid có thể ngăn chặn sự

hình thành các gốc tự do có hại bằng cách kết hợp với những ion kim loại nặng (Fe,

Mn) vốn là những tác nhân xúc tác nhiều quá trình sinh hóa làm xuất hiện các gốc tự

do

- Tạo liên kết hydro: các nhóm OH tự do rất dễ nối với nhau bởi các liên kết hydro nội phân tử hoặc giữ các phân tử Hiện tượng này ảnh hưởng nhiều đến những tính chất hóa lý học như độ sôi, độ nóng chảy, tính hòa tan,…Khả năng phản ứng cũng có thể giảm đi đáng kể.[25]

1.2.2.5 Hoạt tí nh sinh học

Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là "những người thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên" nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thư

Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thường Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thường là các gốc tự do như -OH, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hoá…)

Một trong những nhóm flavonoids thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins (còn được gọi là procyanidins) Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác

Một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins liên kết với nhau dạng dime, trime…polime được gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO

Năm 1986, Jacques Masquelier là người khám phá ra các đặc tính chống oxy hóa và thu dọn gốc tự do của PCO Nhiều phương pháp hiện đại và phức tạp đã chứng minh hoạt động bảo vệ mạch máu của PCO và tạo cơ sở vững chắc cho việc sử dụng PCO trong điều trị các bệnh lý mạch máu Các phương pháp này cho thấy PCO có khả năng:

- Bắt giữ gốc tự do hydroxyl

- Bắt giữ lipide peroxide

- Làm chậm trễ đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipide

- Kìm giữ các phân tử sắt tự do, giúp ngăn chặn sự peroxide hóa lipide do sắt

- Ức chế sự sản sinh ra gốc tự do bằng cách ức chế không cạnh tranh men xanthin oxidase

- Ức chế sự tổn thương do các enzyme (hyaluronidase, elastase, collagenase ) có thể làm thoái hóa cấu trúc mô liên kết

Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ

Năm 1936, Szent Gyorgy, dược sĩ người Hungari tách từ ớt và quả chanh một chất cùng với vitamin C có tác dụng chữa được chứng chảy máu mao mạch, củng cố thành mạch, ông gọi là vitamin C2 hoặc vitamin P (P là chữ đầu của từ tiếng Pháp perméabilité - có nghĩa

là tính thấm) Về sau người ta thấy trong giới thực vật có nhiều hợp chất thứ sinh có đặc tính tương tự vitamin P và đặt cho chúng một tên chung là Flavonoid

Lavollay, Neumann Porrot (1941, 1942) đã chứng minh catechin có tác dụng mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch

Thực nghiệm cho thấy các Flavonoid có các nhóm OH ở vị trí 3,4 có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch Rutin là chất tiêu biểu về tác dụng này

Hyaluronidase là enzym làm tăng tính thấm của mao mạch, khi thừa enzyme này sẽ xảy ra hiện tượng xuất huyết dưới da Flavonoid ức chế sự hoạt động của hyaluronidase

Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào của nó Hay nói cách khác, vitamin P và flavonoid nói chung duy trì độ mềm dẻo của thành mạch, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch

Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng gan

Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, favanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt, như

là các flavonoid có trong lá Diếp cá, trong cây Râu mèo…

Các dẫn xuất của kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người có biểu hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu gắt…

Quercetin là một flavonoid làm xương sống cho nhiều loại flavonoid khác, gồm rutin, quercitrin, hesperidin – các flavonoid của cam quít Những dẫn xuất này khác với quercetin

ở chỗ chúng có các phân tử đường gắn chặt vào bộ khung quercetin Quercetin là một

flavonoid bền vững và hoạt động nhất trong các nghiên cứu, và nhiều chế phẩm từ dược thảo

có tác dụng tốt là nhờ vào thành phần quercetin với hàm lượng cao

- Quercetin có khả năng chống oxy hóa và tiết kiệm lượng vitamin C sử dụng, giúp tích lũy vitamin C trong các mô tổ chức

- Quercetin có khả năng chống viêm do ức chế trực tiếp hàng loạt phản ứng khởi phát hiện tượng này: ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị ứng

- Quercetin ức chế men aldose reductase rất mạnh, men này có nhiệm vụ chuyển glucose máu thành sorbitol - một hợp chất liên quan chặt chẽ với sự tiến triển các biến chứng của đái tháo đường (đục thủy tinh thể do đái tháo đường, thương tổn thần kinh, bệnh võng mạc, đái tháo đường).[26]

1.2.3 Rotenone

1.2.3.1 Cấu tạo

Tỷ lệ rotenone trong hạt củ đậu khoảng từ 0,56 – 1,01% Thành phần hóa học trong

lá cây củ đậu cũng tương tự như trong hạt Rotenone (C23H22O6) thuộc dẫn chất

isoflavonoid Có phân tử lượng: 394,41 g; Khối lượng riêng: 1,27 g/cm3; Nhiệt độ nóng chảy: 165 – 166oC; Nhiệt độ sôi: 210 - 220oC; Độ hòa tan: tan nhiều trong acetone và ít tan trong etanol.[33]

Hì nh 1 11 Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của rotenone

Rotenone là một chất hóa học không mùi được sử dụng nhiều trong thuốc trừ sâu, piscicide, và pesticide Nó có trong rễ và hạt của một số loài thực vật như jicama Emmanuel Geoffroy đã chiết tách chất này đầu tiên (mà ông gọi là nicouline) từ một tiêu bản của loài

Robinia nicou, hiện là Lonchocarpus nicou, khi ông đến Guiana thuộc Pháp Ông đã viết về nghiên cứu này trong luận án của mình, được xuất bản năm 1895 ngay sau cái chết của ông

do bệnh ký sinh trùng Những nhà nghiên cứu sau đó xác định chất mà Geoffroy gọi là nicouline là rotenone.[27]

1.2.3.2 Ứng dụng

Tại Hoa Kỳ và Canada, sử dụng tất cả ứng dụng của rotenone ngoại trừ tác dụng thuốc cá đang được loại bỏ

Rotenone đã được sử dụng bởi người dân bản địa để bắt cá Thông thường, rotenone

có chứa trong các cây Fabaceae họ đậu được nghiền nát và được đưa vào một vùng nước, và rotenone cản trở hô hấp tế bào, cá sẽ bơi lên gần mặt nước để lấy không khí và chúng dễ dàng bị bắt

Rotenone đã được sử dụng bởi các cơ quan chính phủ để giết cá trên sông và hồ ở Hoa Kỳ kể từ năm 1952 Các nhà nghiên cứu cá sử dụng rotenone để lấy mẫu ở quy mô nhỏ, nghiên cứu đa dạng sinh học của các loài cá biển, sử dụng rotenone để thu thập các loài cá khó bắt, hoặc ẩn, mà đại diện cho một thành phần quan trọng của cộng đồng cá ven bờ Rotenone là công cụ hiệu quả nhất vì liều lượng nhỏ và tác dụng phụ ít ảnh hưởng đến môi trường

Rotenone cũng được sử dụng ở dạng bột để điều trị ghẻ và chấy trên người, và ký sinh bọ ve trên gà, chăn nuôi và nuôi động vật

Rotenone đã được sử dụng như là thuốc trừ sâu hữu cơ cho khu vườn Bên cạnh đó, rotenone còn có tác dụng diệt được một số loại bọ hại cũng như hầu hết các động vật chân đốt khác Nó nhanh chóng phân hủy sinh học trong điều kiện có nắng nhẹ, vì vậy dư lượng

có hại là tối thiểu Một lượng rất nhỏ trên lá của cây sẽ kiểm soát côn trùng trong vài ngày.[27]

1.2.3.3 Cơ chế tác dụng

Rotenone hoạt động bằng cách can thiệp vào chuỗi vận chuyển điện tử trong ty thể

Nó ức chế sự chuyển electron từ các trung tâm sắt – lưu huỳnh trong phức hợp I đến coenzyme Q Điều này gây trở ngại cho NADH trong quá trình tạo năng lượng mà tế bào sử dụng được (ATP) Phức hợp I là không thể vượt qua để mang electron đến một vật mang điện tử tan trong chất béo Coenzyme Q10, các điện tử bị giữ lại trong ty thể Oxy di động bị giảm đến mức cực thấp, tạo ra một loại oxy phản ứng, có thể làm tổn hại DNA và các thành phần khác của ty thể

Hì nh 1 12 Chuỗi truyền điện tử và cơ chế tác động của rotenone trong ty thể

Hì nh 1 13 Rotenone ngăn cản sự truyền điện tử đến CoQ

Rotenone được sản xuất bằng cách chiết xuất từ rễ và thân cây của một số loài thực

vật nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là những người thuộc các chi Lonchocarpus và chi

1.2.3.4 Độc tính

Rotenone được phân loại bởi Tổ chức Y tế Thế giới là tương đối nguy hiểm Đó là độc tính nhẹ với con người và các động vật có vú, nhưng rất độc đối với côn trùng và động vật thủy sinh, bao gồm cả cá Độc tính này cao hơn trong cá và côn trùng là do lipophilic rotenone có thể dễ dàng thông qua mang hoặc khí quản, nhưng không phải là dễ dàng qua

da hoặc qua đường tiêu hóa Rotenone gây độc cho tế bào hồng cầu trong ống nghiệm

Liều tử vong thấp nhất cho một đứa trẻ là 143 mg/kg Trường hợp tử vong do ngộ độc rotenone là rất hiếm bởi vì nó kích thích của gây ra nôn mửa, nếu ăn có chủ ý của rotenone có thể gây tử vong

Các hợp chất phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời và thời gian khoảng 6 ngày

Nó bị oxy hóa thành rotenolone, cường độ ít độc hại hơn rotenone Trong nước, tỷ lệ thủy phân tùy thuộc nhiều yếu tố, bao gồm nhiệt độ, pH và ánh sáng mặt trời Độc tính giảm ½

trong nửa ngày trong vùng nước tự nhiên nằm trong khoảng nhiệt độ 24°C đến 3,5 ngày ở 0°C.[27]

1.3 Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật

1.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

Nguyên tắc của sự chiết lỏng – lỏng là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh

Hì nh 1 14 Chiết 2 lớp chất lỏng

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hoà tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hoà tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi)

Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc

ở dưới so với pha nước

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực ví dụ như: ete dầu hỏa hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate, buthanol… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4…, đuổi dung môi ta thu được cao chiết.[6]

1.3.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng

1.3.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp

Hì nh 1 15 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Bột cây được xay thô đạt kích cỡ thích hợp Mẫu không nên to vì sẽ chiết không kiệt, mẫu xay quá mịn sẽ cản trở dòng chảy Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội

Để yên sau một thời gian, thường là 12 – 24 giờ Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.[6]

1.3.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua

một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết

bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn: có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một lượng ít dung môi

Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết lần sau.[6]

1.3.2.3 Kỹ thuật chiết bằng máy Soxhlet

Dụng cụ: Máy có bán sẵn với nhiều cỡ lớn nhỏ khác nhau, từ bình cầu 250 ml đến

15 lít Máy gồm ba bộ phận tháo ráp được tại các vị trí nút mài (1), (2) và (3) Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ Một bộ phận chứa mẫu bột cây, gồm

ba ống: ống D có đường kính lớn, ở giữa, để chứa bột cây; ống B có đường kính trung bình,

để dẫn dung môi từ bình A bay lên, đi vào ống D chứa bột cây; ống E có đường kính nhỏ, là ống thông nhau, để dẫn dung môi từ D trả ngược trở lại bình cầu A Trên cao nhất là ống C ngưng hơi

Thực hành: bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong ống D hoặc tốt nhất là đặt trong một túi vải để dễ lấy bột cây ra khỏi máy Lưu ý: Đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D

đế tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E Không được để lượng bột cây trong ống

D cao vượt hơn mức cong của ống thông nhau E

Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài số (2), như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau E Lưu ý để thể tích lượng dung môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích của bình cầu

Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơn, rồi theo ống ngưng hơi

để lên cao hơn nữa, nhưng tại đây hơi dung môi bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ thành

những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi Theo quá trình đun nóng, lượng dung mơi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E, vì đây là ống thông nhau Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống D

Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô tả lúc đầu Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây (dung môi eter dầu hỏa chỉ chiết kiệt những chất kém phân cực nào có thể tan được trong eter dầu hỏa nóng)

Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài (3), rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kiếng, nếu thấy không còn vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi, thu được cao chiết.[6]

Hì nh 1 16 Bộ chiết Soxhlet

1.3.2.4 Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa

Sử dụng máy chiết Kumagawa với thiết bị, nguyên tắc giống như máy chiết Soxhlet, chỉ khác ở túi đựng bột cây được đặt gần nguồn nhiệt hơn

Có thể cải biến kỹ thuật này với dụng cụ thủy tinh đơn giản có thể dễ dàng tìm thấy trong phòng thí nghiệm: bình cầu (ngâm bột cây trực tiếp trong bình này) và ống ngưng hơi Sau một thời gian đun cần thiết, dung dịch chiết được rót ra và lọc ngang giấy lọc Dung môi được cho vào bình cầu và tiếp tục chiết vài lần như thế đến khi chiết kiệt.[6]

Hì nh 1 17 Máy chiết Kumagawa

Hì nh 1 18 Bộ lôi cuốn hơi nước

Thực hành: Sự lôi cuốn hơi nước thường được thực hiện trên cây tươi mới thu hái về Mẫu cây được cắt nhuyễn, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao cho phần thể

tích mẫu cây và nước chỉ chiếm tối đa 2/3 thể tích bình cầu Lấp hệ thống và cắm bếp điện đun nóng

Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ trở lại thể lỏng, rớt xuống ống gạn Trong ống gạn, dung dịch tách thành 2 lớp gồm lớp nước và lớp tinh dầu.[6]

1.3.2.6 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn

Nguyên lý của phương pháp siêu tới hạn: Đối với một chất thông thường, dưới mỗi điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng hoặc khí Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng Tuy nhiên, có một giá trị

áp suất mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí,

mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical) Vật chất

ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng

Hì nh 1 19 Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn

Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (31oC), áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn

Tại trạng thái này, CO2 có khả năng hòa tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được tháo ra

ở bình hứng.[28]

1.3.2.7 Kỹ thuật chiết pha rắn

Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất

để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn

Pha rắn (còn được gọi là pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được ankyl hoá nhóm –OH bằng các gốc hydrocarbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18,… hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính… Các hạt này được nhồi vào cột chiết nhỏ (thường là cột có kích thước 5 x 1 cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1 – 2 mm với đường kính 3 – 4 cm (đĩa chiết)

Hì nh 1 20 Cột chiết pha rắn

Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ, dung dịch đệm… Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tương tác với chất phân

tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu

Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích được thực hiện bằng một dung môi thích hợp.[29]

1.4 Phương pháp đánh giá độc tính và xác định giá trị LC 50

Khảo sát một đường thẳng rõ ràng là dễ hơn khảo sát một đường cong Hơn nữa, các

sự tính toán, loại suy hoặc suy diễn dựa trên đường thẳng bao giờ cũng thuận tiện, nhanh chóng và chính xác hơn là thực hiện điều đó trên các đường cong Do vậy mà trong nghiên cứu khoa học người ta thường tìm cách tuyến tính hóa các đường cong gặp phải Ở đây như chúng ta đã thấy, bản chất của “giải tích Probit” chính là vấn đề tuyến tính hóa đường cong Sigmoid.[2]

Từ đó chúng ta cũng có thể áp dụng giải tích Probit để xử lí số liệu nghiên cứu của chúng ta nhất thiết phải tuân theo luật phân phối chuẩn (còn gọi là phân phối bình thường,

phân phối hình chuông hay phân phối Gauss) Ở phân phối này, trị trung bình bao giờ cũng chiếm tỉ lệ (tần số hay mật độ) cao nhất, càng xa trị trung bình, hay nói một cách nôm na là

“thái quá”, thì chiếm tỉ lệ càng ít đi Điều này thường hay gặp trong thế giới tự nhiên, đến nỗi chúng ta cảm thấy điều đó là hết sức “bình thường” Chẳng hạn, trong một quần thể nào

đó bao giờ cá thể có kích thước trung bình cũng chiếm đa số, càng thái quá (kích thước quá lớn hay quá nhỏ) thì chiếm tỉ lệ càng ít đi Tương tự như vậy khi xét tới các khía cạnh khác như tình trạng sức khỏe, sức sống, sức chịu đựng của quần thể

Trong những trường hợp mà số liệu nghiên cứu của chúng ta không tuân theo luật phân phối bình thường, thì nhất thiết phải tiến hành “bình thường hóa” các số liệu đó bằng cách lấy căn bậc hai, căn bậc ba, lấy logarit…cho số liệu nghiên cứu, nghĩa là thay các “x” bằng các “đại diện cho x”, điều này chúng tôi đã trình bày chi tiết ở chương “ thiết lập mô

hình toán học” Chẳng hạn, khi tác động chất độc vào quần thể sinh vậy như côn trùng, nấm,

vi khuẩn, chuột, chim, thú, tôm, cá…thì nồng độ hay liều lượng chất độc không phản ánh đúng bản chất sức chịu đựng của quần thể (biểu hiện ở tỉ lệ chết) Thực nghiệm cho thấy rằng trong đa số các trường hợp, logarit thập phân của nồng độ hay liều lượng của chất độc mới phản ánh đúng bản chất sức chịu đựng của quần thế sinh vật, nghĩa là logarit thập phân của nồng độ hay liều lượng độc chất mới đúng là thước đo dùng để đo sức chịu đựng của quần thể sinh vật, nói một cách khác, thang đo sức chịu đựng của quần thể sinh vật tương ứng với thang logarit nồng độ hay liều lượng độc chất Như vậy, sức chịu đựng của quần thể sinh vật phân bố bình thường qua “lăng kính” logarit nồng độ hay liều lượng độc chất

Tương tự như vậy, khi tác động vào quần thể sinh vật các loại chất kích thích, các loại hormon, pheromon, các loại vitamin, các loại huyết thanh, các loại thuốc kháng sinh…thì trong đa số các trường hợp, mức độ phản ứng hay đáp ứng của quần thể sinh vật (biểu hiện ở tỉ lệ đáp ứng, tỉ lệ được cứu sống hay bình phục…) cũng phân bố bình thường qua “lăng kính” logarit nồng độ hay liều lượng các chất tác động vào quần thể sinh vật đó.[2]

Về phương diện lý thuyết cũng như về mặt thực hành, dù sao chúng ta cũng phải luôn luôn “cảnh giác” một điều là, mặc dù thang “logarit” được sử dụng rất phổ biến và có hiệu quả trong việc “bình thường hóa” số liệu nghiên cứu, chúng ta cũng đừng bao giờ tuyệt đối hóa thang “logarit”, mà phải luôn luôn thận trọng là, trong những trường hợp cụ thể có thể

sử dụng các thang khác, chẳng hạn như thang “căn bậc hai”, thang “căn bậc ba”…để “bình thường hóa” số liệu nghiên cứu tốt hơn là sử dụng thang “logarit”

Để có thể đưa ra các kết luận một cách khách quan, tiến hành “phân tích biến lượng” cho mô hình toán học đã được thiết lập.[2]

Dưới đây là một số ví dụ minh họa

Ví dụ 1: Xác định hiệu quả tác động của chất độc vào quần thể sinh vật

Bảng 1 1 Hiệu quả tác động của Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) đối với ruồi

1.78 1.90 2.04 2.15 2.25

5.38 5.82 6.17 6.36 6.85

= ∑(Y – 𝑌̅)2 – ∑(Y – 𝑌̅)2

= 1.20992 – 1.18094

= 0.02898

Bảng 1 2 Phân tí ch nguồn biến lượng

Nguồn biến lượng Độ tự do Tổng các bình phương Biến lượng

1.18094 0.00966

F = 1.18094 / 0.00966 = 122.25 ; P < 0.005

|𝑅| = 1.18094 / 1.20992 = 0.9879

Từ kết quả trắc nghiệm F chúng ta thấy rằng, khả năng không tương thích của mô

hình toán học đã được thiết lập trong thực tế là rất nhỏ (P < 0.005), do đó, mô hình toán học này là có thể chấp nhận được

Từ mộ hình toán học này chúng ta có thể tính được các ?

50% tử vong → Probit Y = 5, khi đó:

5 = 0.2916 + 2.8826X Hay X = (5 – 0.2916)/2.8826 = 1.63

Từ đó

LD90 = 102.08/102 = 1.20 g/200ml Liều gây chết trung bình (được viết tắt là LD50, LC50 hay LCt50) của một chất là một liều cần thiết giết chết phân nửa số cá thể được dùng làm thí nghiệm trong một thời gian thínghiệm Thí nghiệm này được J.W Trevan đưa ra năm 1927 Loại thuốc có trị số LC50 càng thấp là thuốc có độ độc cấp tính càng cao Ứng dụng trong một số lĩnh vực như:

- Môi trường: Để đánh giá mức độ độc của các chất trong không khí và nước

- Nông nghiệp: biểu thị độ độc cấp tính của một loại thuốc BVTV đối với động vật máu nóng

1.5 Phương pháp xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh

1.5.1 Cơ chế kháng vi sinh vật

Các phenolics là làm thay đổi màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton và làm kết tủa các chất trong tế bào Tầm quan trọng của sự có mặt nhóm hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã được chứng minh, phenolics tác động lên các enzyme như ATPases nằm trong màng tế bào chất và được bao quanh bởi các phân tử lipid Các phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm ảnh hưởng đến tương tác lipid – protein; ngoài ra có thể có sự tương tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với phần kỵ nước của protein.[13,14]

1.5.2 Xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

1.5.2.1 Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn khảo sát

Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được tăng sinh trong môi trường phù hợp Mật độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 107 cfu/ml Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Mật

độ vi khuẩn chỉ thị sử dụng là 106 cfu/ml

Các chủng vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh trên môi trường TSB được pha loãng, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có được mật độ 107 cfu/ml Sau đó 100 µl dịch này được cấy trang trên môi trường phù hợp Đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ

Xác định mật độ các chủng vi khuẩn chỉ thị rồi tiến hành cấy trang 100 µl trên môi trường phù hợp Chờ cho đĩa thạch thật khô, sử dụng một ống trụ đường kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch

Hình 1.21 Cơ chế kháng khuẩn

Đối với các đĩa thạch chứa vi khuẩn khảo sát sau khi nuôi cấy, chọn những vùng vi khuẩn phát triển dầy đặc, tiến hành đục các khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn Dùng kẹp vô trùng gắp từng khối thạch đặt vào trong các giếng trên đĩa đã trang các chủng vi khuẩn chỉ thị Đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ Sau thời gian 24 giờ, đo các vòng kháng khuẩn xung quanh các giếng thạch.[5]

1.5.2.2 Đánh giá khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn khảo sát sau ly tâm

Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong môi trường thích hợp Mật độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 107 cfu/ml Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Mật

độ vi khuẩn chỉ thị sử dụng lần lượt là 106 cfu/ml

Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi trong môi trường thích hợp trên tủ ấm lắc trong 24 giờ Sau đó, pha loãng, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có được mật độ

107 cfu/ml Cấy chuyển 100 µl vào bình tam giác chứa môi trường thích hợp và nuôi cấy trong tủ ấm lắc nhiệt độ 300C trong 24 giờ

Đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị sau khi xác định mật độ, tiếng hành cấy trang 100

µl trên môi trường thích hợp Chờ cho đĩa khô, dùng một ống trụ đường kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch

Hút 100 µl dịch nổi sau khi ly tâm cho vào các lỗ thạch sau khi đục Sau đó, đem ủ

ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ Sau 24 giờ đo các vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch.[5]

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn khảo sát thông qua khả năng tạo vòng tròng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị Một đơn vị hoạt tính kháng khuẩn được định nghĩa như một đơn vị hoạt tính AU (Arbitrary unit) Một AU là một đơn vị diện tích của vùng ức chế trên mỗi đơn vị thể tích, trong trường hợp này là mm2/ml Hoạt tính kháng khuẩn được

tính theo công thức sau (Usmiati à Marwat, 2009):

Hoạt tính kháng khuẩn (mm2/ml) = 𝐿𝑧−𝐿𝑠𝑉

Trong đó: Lz: diện tích vòng kháng khuẩn, bao gồm cả diện tích lỗ (mm2)

Ls: diện tích lỗ (mm2) V: thể tích mẫu cho vào (ml)

1.5.3 Xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp đo độ đục

Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục được thực hiện như sau: