TRẦN THỊ HOÀI ân xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH một số THUỐC HUYẾT áp và lợi TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG dược BẰNG LC MSMS LUẬN văn THẠC sĩ dược học

Để thu hút người dùng sử dụng sản phẩm hay tăng hiệu quả kinh doanh hiện nay một số nhà sản xuất và cơ sở khám chữa bệnh tư nhân đã trộn trái phép vào các chế phẩm đông dược một số loại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HOÀI ÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC HUYẾT ÁP VÀ LỢI TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HOÀI ÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC HUYẾT ÁP VÀ LỢI TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: Nguyễn Thị Kiều Anh

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh là người trực tiếp hướng dẫn tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành Luận văn

Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trường và Trung tâm giám định ma túy của Viện khoa học hình sự - Bộ Công An đã giúp đỡ và tạo điều kiện về trang thiết bị cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và anh chị cán bộ Viện Công nghệ Dược Phẩm Quốc Gia- Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện về thiết bị và hỗ trợ cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp tại Trung tâm KN Dược phẩm, Mỹ phẩm, Thực phẩm Hà Nội đã tạo điều kiện

về thời gian, động viên, hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Dù có nhiều cố gắng trong quá trình thực hiện đề tài, song có thể còn nhiều mặt thiếu sót và hạn chế Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp và

sự chỉ dẫn của thầy cô giáo và các anh chị đồng nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 29 tháng 03 năm 2019

Trần Thị Hoài Ân

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Tăng huyết áp 3

1.1.2 Amlodipin 4

1.1.3 Nifedipin 5

1.1.4 Varsatan 6

1.1.5 Atenolol 7

1.1.6 Hydroclorothiazid 8

1.1.7 Furosemid 9

1.2 Một số các dược liệu và chế phẩm đông dược dùng trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị cao huyết áp, lợi tiểu 10

1.3 Tình hình nghiên cứu xác định thuốc dược dược hạ huyết áp, lợi tiểu trộn lẫn trong chế phẩm đông dược 13

1.4 Tổng quan về phương pháp LC-MS/MS 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Nguyên vật liệu 21

2.1.2 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu 21

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1: Xử lý mẫu 23

2.2.2: Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS: 23

2.2.3: Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng: 23

2.2.4: Ứng dụng phân tích các mẫu chế phẩm đông dược đã thu thập được

trên thị trường 24

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 25

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch 25

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ 25

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 37

3.2.1 Độ phù hợp của hệ thống 37

3.2.2 Độ đặc hiệu của phương pháp 39

3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 43

3.2.4 Độ tuyến tính và khoảng xác định 45

3.2.5 Độ đúng và độ chính xác 48

3.3 Ứng dụng phân tích trên mẫu thực 51

Chương IV: BÀN LUẬN 57

4.1 Về nền mẫu 57

4.2 Về phương pháp phân tích 57

4.3 Về phương pháp xử lý mẫu 58

4.4 Về thẩm định phương pháp phân tích 59

4.5 Về ứng dụng phương pháp 60

KẾT LUẬN 61

KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-MS/MS Liquid chromatography – Mass

Spectrometry/Mass Spectrometry

Sắc ký lỏng hai lần khối phổ

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiên LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

MeOH Methanol

MRM Multiple Reaction Monitoring

NSAID Non steroidal

anti-inflammatory drug

Thuốc chống viêm không steroid WHO Word health organization Tổ chức y tế thế giới HCT Hydroclorothiazid

AML Amlodipin

NIF Nifedipin

ATE Atenolol

VAL Valsartan

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số sản phẩm nguồn gốc đông dược hỗ trợ điều trị cao huyết áp trên

thị trường 11

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1 Tối ưu điều kiện khối phổ của các chất nghiên cứu 26

Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích 27

Bảng 3.3 Khảo sát điều kiện pha động theo chế độ gradient 30

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc vào dung môi 33

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá hiệu suất chiết theo vào thời gian siêu âm 35

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS 38

Bảng 3.7 LOD của các chất phân tích trên nền mẫu 43

Bảng 3.8 Cách pha dãy các dung dịch chuẩn 45

Bảng 3.9 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất nghiên cứu 46

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại trong ngày của phương pháp 49

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại khác ngàycủa phương pháp 50

Bảng 3.12 Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực 52

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1.a Hệ thống LC-MS/MS Bruker 18

Hình 1.1 b Tứ cực chập ba gấp cong trong hệ thống máy LC-MS/MS Brucker 18

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký 29

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát chế độ gradient thành phần pha động 30

Hình 3.3a Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của amlodipin trên nền viên nang 40

Hình 3.3b Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của furosemid trên nền viên nang 40

Hình 3.4a Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên nang 41

Hình 3.4b Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên nén 41

Hình 3.4c Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên hoàn 42

Hình 3.5 Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD, LOQ trên nền viên hoàn 44

Hình 3.6 Phổ đồ định tính amlodipin trong mẫu NHA01 54

Hình 3.7 Phổ đồ định tính furosemid trong mẫu NHA01 55

Hình 3.8 Sắc ký đồ phân tích mẫu NHA01 56

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay xu thế sử dụng các thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng phổ biến Với suy nghĩ thuốc ‘tây y’ là những hóa chất được tổng hợp hóa học tuy tác dụng chữa bệnh nhanh nhưng đem lại nhiều tác dụng phụ thì các chế phẩm đông dược với thành phần tự nhiên được đánh giá là an toàn ít độc hơn Tuy nhiên, do các chế phẩm từ đông dược tác dụng xuất hiện từ từ đòi hỏi người dùng phải sử dụng liên tục trong một thời gian dài Để thu hút người dùng sử dụng sản phẩm hay tăng hiệu quả kinh doanh hiện nay một số nhà sản xuất và cơ sở khám chữa bệnh tư nhân đã trộn trái phép vào các chế phẩm đông dược một số loại thuốc hóa dược để đẩy nhanh tác dụng của thuốc và tạo ra tác dụng điều trị Trong khoảng thời gian gần đây, đã có nhiều trường hợp người dùng do sử dụng các chế phẩm đông dược trộn trái phép chất hóa dược mà chịu nhiều biến chứng nghiêm trọng: gây độc cho gan, thận, suy tuyến thượng thận, nhiễm toan máu ….[36]

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới, tăng huyết áp là một trong những bệnh gây tử vong hàng đầu thế giới và ước tính đang gia tăng Theo thống kê năm 2013, mỗi năm trên thế giới có gần 9 triệu người chết do tăng huyết áp hoặc các biến chứng của tăng huyết áp [31] Các nhóm dược chất hóa dược được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp: nhóm chẹn kênh calci, nhóm tác dụng lên hệ renin-angiotensin, nhóm tác dụng trên hệ giao cảm và thường phối hợp với các thuốc nhóm lợi tiểu Trong đó các dược chất như: amlodipine, nifedipine, atenolol, valsartan, hydroclorothiazid, furosemide… thường hay được

sử dụng trong điều trị tăng huyết áp do có hiệu quả điều trị tốt và có giá thành rẻ Các dược chất này được sử dụng một mình trong điều trị hoặc ở dạng phối hợp 2 đến 3 thành phần Ngoài ra do đặc điểm bệnh lý của tăng huyết áp khiến người bệnh phải sử dụng thuốc thường xuyên đi kèm là các tác dụng không mong muốn cũng xuất hiện nhiều hơn Nắm bắt xu hướng đó trên thị trường

có rất nhiều các chế phẩm đông dược với chỉ định hỗ trợ hoặc thay thế điều trị tăng huyết áp, phòng chống tai biến do tăng huyết áp Nhưng trong những năm gần đây, trên thế giới đã ghi nhận nhiều báo cáo của các nhóm nghiên

cứu phát hiện các trường hợp các chế phẩm đông dược này bị trộn trái phép các dược chất hóa dược như : amlodipin, nifedipin, valsartan, atenolol, clonidin hydrochlorothiazid,… [14],[15],[22],[27],[28] Do vậy trong việc đảm bảo chất lượng thuốc đông dược, bên cạnh việc chuẩn hóa các thành phần hoạt chất trong dược liệu thì cần phải có các phương pháp phân tích xác định các chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược

Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần khố phổ (LC-MS/MS) là một phương pháp phân tích hiện đại, đang được triển khai rộng rãi ở các cơ sở phân tích và kiểm nghiệm thuốc Với ưu thế trong khả năng phân tích tách chất của sắc ký lỏng (LC) kết hợp với khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ (MS), phương pháp này cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao phù hợp với các chế phẩm có nền mẫu phức tạp như các chế phẩm đông dược, sinh học… Với mục đích phát triển một phương pháp phân tích có thể phát hiện đồng thời nhiều hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược ở nồng độ thấp và có độ tin cậy cao, góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu

“Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc huyết áp và lợi tiểu trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS”

Với mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời amlodipin, atenolol, nifedipin, valsartan, hydroclorothiazid và furosemid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng rắn bằng LC-MS/MS

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng được để phát hiện các dược chất trên trộn lẫn trong chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Tăng huyết áp

Tăng huyết áp là một bệnh lý trong đó trị số huyết áp lúc nghỉ cao hơn mức bình thường: tăng huyết áp tâm thu đơn thuần khi ≥ 140 mmHg, tăng

huyết áp tâm trương đơn thuần khi ≥ 90 mmHg, hoặc tăng cả hai [2]

Các nhóm chất hóa dược được sử dụng để điều trị tăng huyết áp hiện nay:

- Nhóm thuốc tác dụng trên hệ giao cảm: atenolol, propanolol, …

- Nhóm thuốc chẹn kênh calci: nifedipin, amlodipin, …

- Nhóm thuốc ức chế hệ RAAS: valsartan, lorsatan, captopril, …

- Nhóm thuốc lợi tiểu: clorothiazid, hydroclorothiazid, furosemid, … Các thuốc lợi tiểu làm giảm thể tích huyết tương dẫn đến làm giảm cung lượng tim và giảm huyết áp nên thường phối hợp với thuốc hạ huyết áp, làm tăng tác dụng của thuốc hạ huyết áp Thường phối hợp thuốc lợi tiểu với thuốc hủy giao cảm và thuốc giãn mạch, ít hiệu quả hơn khi phối hợp với thuốc chẹn calci Trong tăng huyết áp, thuốc lợi tiểu được dùng phổ biến do hiệu quả (đặc biệt đối với tăng huyết áp nhẹ), rẻ tiền, dễ sử dụng và giúp tăng tác dụng của các thuốc điều trị tăng huyết áp phối hợp Các thuốc lợi tiểu hay được lựa chọn: lợi tiểu thiazide (hydroclorothiazid) là thuốc được sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất trong các thuốc lợi tiểu để điều trị tăng huyết áp nhẹ và trung bình khi tim thận bình thường, lợi tiểu quai (furosemide) tác dụng nhanh, mạnh, thời gian ngắn nên chỉ điều trị cơn tăng huyết áp kịch phát Hiện nay trên thị trường có nhiều chế phẩm dạng phối hợp của 2 hoặc 3 nhóm thuốc trong điều trị tăng huyết áp như: Lostad HCT (lorsartan 50 + HCT 12,5mg ), Diovan HCT ( valsartan 80 + HCT 12,5mg) …

Các thuốc tim mạch đều là những thuốc có khoảng điều trị hẹp, nguy cơ gây tai biến và tương tác thuốc với nhiều loại thuốc khác cho nên đây đều là những thuốc nằm trong danh sách 30 danh mục thuốc cần phải kê đơn và bán theo đơn của bộ y tế và phải có sự theo dõi của bác sĩ

- Bột màu trắng hoặc gần như trắng

- Dễ tan trong methanol, hơi tan trong ethanol khan, khó tan trong nước

và 2-propanol

- Dung dịch trong HCl 0,1N trong MeOH có cực đại hấp thụ tại 360 nm [3], [5]

Tác dụng dược lý

- Có tác dụng làm giãn mạch, giảm hậu gánh, hạ huyết áp

- Amlodipin có thể sử dụng cho bệnh nhân suy thận có tăng huyết áp

- Tác dụng không mong muốn:

Giãn mạch gây hạ huyết áp quá mức khi không có điều chỉnh liều, nhất

là khi phải dùng thuốc kéo dài Hoa mắt, chóng mặt, đau đầu, phù cổ chân [2], [9]

- Tiến hành các phép thử trong điều kiện tránh ánh sáng hay dưới ánh sánh có bước sóng dài Dung dịch chế phẩm phải pha ngay trước khi dùng và

để trong bình tối màu tránh ánh sáng [3], [5]

- Dung dịch trong methanol có 2 đỉnh hấp thụ cực đại ở khoảng 340 nm,

235nm

Tác dụng dược lý

- Là thuốc chẹn kênh Calci thuốc nhóm dihydropyridine, có tác dụng chống

cơn đau thắt ngực, chống tăng huyết áp và điều trị bệnh Raynaud [2], [9]

- Tác dụng không mong muốn:

Gây rối loạn tiêu hóa

Tăng enzyme gan, tăng sản lợi, đau cơ, rối loạn thị giác

Liều dùng: uống từ 20 - 60 mg/ngày

Bột màu trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm

- Không tan trong nước, tan tự do trong ethanol khan, hơi tan trong

methylene clorid, tan tốt trong methanol [5], [16]

Tác dụng dược lý

- Valsartan ức chế chọn lọc angiotensin II thông qua gắn vào thụ thể AT1 ở nhiều mô khác nhau trong đó có cơ trơn mạch máu, tuyến thượng thận

Có tác dụng làm giãn mạch, giảm hậu gánh, hạ huyết áp

- Tác dụng không mong muốn:

Suy thận cấp, tăng K+ máu

Phát ban, dị ứng, giảm bạch cầu, phù, mất vị giác, ….[9], [2]

- Tác dụng không mong muốn:

Yếu cơ, mệt mỏi, ớn lạnh các đầu chi, hạ huyết áp thể đứng

Tim đập chậm, ỉa chảy, buồn nôn, khó thở

Có nguy cơ làm trầm trọng thêm bệnh suy tim, lo âu mất ngủ, trầm cảm,

giảm ham muốn tình dục, liệt dương [9], [2]

Liều dùng: uống 50 - 100 mg/ngày [9]

- Tác dụng không mong muốn:

Dùng lâu gây rối loạn điện giải (mệt mỏi, nhức đầu, buồn nôn, chuột rút)

Có thể gây hôn mê gan ở những người bị xơ gan [9], [2]

Liều dùng: uống 12,5 mg - 500 mg/lần x 2 lần/ngày [9]

1.1.7 Furosemid

Cấu trúc, tính chất vật lí

CTPT: C12H11ClN2O5S Tên khoa học: acid 4-cloro-2-[(fural-2-ylmethyl)amino]-5-sulfamoylbenzoic

KLPT: 330,75

- Không tan trong nước; tan trong aceton, methanol, hơi tan trong ethanol,

tan trong dung dịch kiềm loãng, rất tan trong dimethyl formamid [3], [5]

- Dung dịch trong NaOH 0,1M có các đỉnh hấp thụ cực đại tại 228, 270,

333nm

Tác dụng dược lý, liều dùng

- Furosemid ức chế đồng vận chuyển natri, kali, clorid ở nhánh lên của quai Henle Có tác dụng lợi tiểu nhanh, mạnh Được sử dụng cho các trường hợp: phù nặng, phù phổi cấp, tăng huyết áp, tăng calci niệu cấp tính

- Tác dụng không mong muốn:

Rối loạn điện giải do tác dụng nhanh, mạnh nên gây mỏi mệt, chuột rút, nặng có thể dẫn đến tiền hôn mê gan, hạ huyết áp thế đứng

Gây nhiễm toan chuyển hóa (tăng acid uric máu dẫn tới gout, tăng glucose

máu, tăng cholesterol máu ,…), có thể gây xuất huyết tiêu hóa [9], [2]

Liều dùng: uống 20 - 80 mg /ngày [9]

1.2 Một số các dược liệu và chế phẩm đông dược dùng trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị cao huyết áp, lợi tiểu

Cao huyết áp trong đông y được gọi là chứng huyễn vựng Có nhiều nguyên nhân gây ra và tùy từng nguyên nhân có những bài thuốc và sử dụng các dược liệu điều trị khác nhau như tinh thần căng thẳng, lo âu, cáu ngắt, tức giận (Âm hư dương xung) sử dụng bài thuốc thiên ma câu đằng ẩm; khi mắc chứng thiên về âm hư có lục vị quy thược; thiên về dương xung can hỏa thịnh

có long đởm tả can thanh Can thận âm hư có kỷ cúc địa hoàng thang, can thận dương hư dùng lục vị địa hoàng thanh gia giảm, thể tâm tỳ hư điều trị theo bài quy tỳ thang gia giảm… [34]

- Trong đó các dược liệu thường được lựa chọn sử dụng như hòe hoa, cúc hoa, câu đằng, ba gạc, nhàu……được dùng riêng hoặc phối hợp trong các bài thuốc điều trị cao huyết áp

- Các dược liệu được sử dụng để đem lại tác dụng lợi tiểu như râu ngô, mã

đề, trạch tả, bạch phục linh… Các dược liệu này thường được sử dụng phối hợp trong các bài thuốc, chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị cao huyết áp

- Hiện nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm đông dược dùng trong điều trị và hỗ trợ điều trị cao huyết áp Sau đây là một số chế phẩm đông dược

có chỉ định hỗ trợ điều trị cao huyết áp đang được lưu hành trên thị trường:

Bảng 1.1 Một số sản phẩm nguồn gốc đông dược hỗ trợ điều trị cao huyết

áp trên thị trường

STT Tên sản

phẩm Thành phần

Nhà sản xuất, số đăng ký Liều dùng

hạ khô thảo

CT Nam Dược 1464/2014/ATTP- XNCB

CT IMC 23135/2017/ATTP- XNCB

CT CPDP PQA 6950/2012/ATTP- XNCB

2viên/lần Ngày 3 lần

5 Viên nén Hạ

hồi đơn

Táo nhân, đỗ trọng, câu đằng, ngưu tất, hạ khô thảo, bạch thược, đảng sâm, sinh địa, linh chi

Công ty CP Dược VTYT Hải phòng 13689/2013/ATTP- XNCB

2-3 viên/lần Ngày 2 lần

Công ty TNHH IPHA công nghệ Giấy XNNDQC số:

356/2015/

XNQC-ATTP

2-3 viên/lần Ngày 3 lần

10 viên/lần Ngày 2-3 lần

Q10

Công ty trách nhiệm hữu hạn Medistar Việt Nam 4556/2017/ATTP- XNCB

3 viên/lần Ngày 2 lần

CTCP DP OPV VD-2464-07

CTCP DP Phúc Vinh 1253/2009/YT- CNTC

3 viên/lần

3 lần/ngày

1.3 Tình hình nghiên cứu xác định thuốc dược dược hạ huyết áp, lợi tiểu trộn lẫn trong chế phẩm đông dược

1.3.1 Trên thế giới

Các chế phẩm từ đông dược ngày càng được sử dụng rộng rãi với các mục đích điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh Nhu cầu sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên ngày càng tăng đặc biệt ở Nhật Bản, Trung Quốc và một số nước ở Đông Nam Á Tuy việc bổ sung tùy ý các chất phụ gia không được phê duyệt, các dược chất không công bố vào các sản phẩm này bị nghiêm cấm nhưng hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu, báo cáo cho thấy hiện nay việc trộn lẫn trái phép các dược chất tổng hợp vào các sản phẩm bổ sung, thuốc đông y cổ truyền diễn ra rất phổ biến, đặc biệt ở các nhóm PDE-5, corticoid, NSAID, glucocorticoid….[30], [26], [25] Riêng các chất hóa dược điều trị tăng huyết áp, hiện nay trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu được tiến hành và phát hiện ra nhiều trường hợp trộn trái phép các chất nhóm này trong các chế phẩm đông dược như:

Lu Yaling và các cộng sự (2009) tiến hành phân tích 8 loại thuốc hóa

dược trộn bất hợp pháp trong thực phẩm bổ sung chống tăng huyết áp bằng phương pháp HPLC-MS sử dụng cột Spherigel C18, pha động là dung dịch đệm amoni format 0,005M (pH 3,0) - ACN - MeOH, sử dụng ciaslis làm chuẩn nội Chế độ ESI+, LOD thấp nhất là 2,5 µg/l; LOQ thấp nhất là 8,3 µg/l Chế độ ESI-, LOD thấp nhất là 50 µg/l Độ thu hồi trung bình từ 63,3 – 107,4% [27]

Y.L Lu và cộng sự (2010) tiến hành nghiên cứu phân tích 18 dược chất

được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp bao gồm thuốc lợi tiểu, thuốc chẹn kênh calci và thuốc ức chế men chuyển được trộn trong thực phẩm bổ sung và các loại thuốc truyền thống Trung Quốc bằng sắc ký khối phổ ion hóa điện tử (LC/ESI-MS) sử dụng cột Xtimate TM C18, pha động là hỗn hợp MeOH, ACN và dung dịch đệm amoni format 20 mM (pH 3.2) Phương pháp xây

dựng có khoảng tuyến tính từ 0,03 đến 21,52 mg/kg, LOD trong khoảng 6,5 - 86,0 mg/ kg, độ thu hồi từ 71 - 109% Tiến hành phân tích 35 mẫu thực phẩm

bổ sung và các thuốc cổ truyền phát hiện 9 mẫu có hydrochlorothiazid, 2 mẫu phát hiện clonidin, 2 mẫu triamteren [28]

Tại Brazil, Ana Paula Lançanova Moreira và các cộng sự (2016) đã tiến

hành nghiên cứu phân tích đồng thời 13 loại thuốc điều trị huyết áp bao gồm thuốc lợi tiểu, β-blockers, thuốc đối kháng thụ thể angiotensin II và thuốc ức chế men chuyển angiotensin trong các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược bằng phương pháp UHPLC-ESI-MS / MS, cột Zorbax ® SB-C18, pha động: MeOH – dung dịch acid acetic 0,1% và dung môi chiết mẫu là MeOH 100% Phương pháp có giới hạn phát hiện 0,02 – 2,51 mg/l và độ chính xác 80,56 – 111,28% Kết quả phân tích 34 mẫu sản phẩm đã phát hiện 3 mẫu chứa thuốc lợi tiểu hydrochlorothiazid và 2 mẫu có furosemid [24]

Seok Heo và các cộng sự (2016) tiến hành phân tích đồng thời 35 chất

hóa dược điều trị tăng huyết áp trong thực phẩm bổ sung bằng LC/MS/MS sử dụng cột Waters Atlantis dC18, pha động: dung dịch acid acetic 0,5 mM trong nước và dung dịch acid acetic 0,5 mM trong ACN Phương pháp có LOD, LOQ dao động từ 0,20 – 20,0 ng/g và 0,50 – 60 ng/g, độ tuyến tính r2

> 0,999;

độ chính xác trong ngày và khác ngày là 84,36-115,82% và 83,78 – 118,69% Thực hiện thử nghiệm trên 97 mẫu thực phẩm bổ sung có sẵn trên thị trường chưa phát hiện mẫu có chứa 35 dược chất trên [18]

Kesting J R và các cộng sự (2009) khi phân tích viên nang mềm Gold

Night (một thuốc thảo dược của Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp) bằng phương pháp LC–HRMS, cột C18, pha động sử dụng là ACN – nước có acid formic 0,1% và LC–MS–SPE/NMR cột C12, pha động: ACN – nước có acid formic 0,1% đã phát hiện ba chất amlodipin (1,3mg), indapamin (1,3mg),

Zhu và các cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu phát hiện nhanh 4

loại chất hóa dược chống tăng huyết áp: nicardipin.HCl, doxazosin mesylat, propranolol.HCl, hydroclorothiazid bằng phương pháp TLC- SERS cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện khoảng 0,005 µg Kết quả phát hiện 2 trong

số 10 thuốc y học cổ truyền phát hiện dương tính [33]

Nghiên cứu của Seok Heo và các cộng sự (2016) xây dựng phương pháp

xác định đồng thời 25 hợp chất chống tăng huyết áp trong thực phẩm bổ sung bằng phương pháp UPLC detector UV 205 nm sử dụng cột C18, pha động: natri hexansulfonat 0,5 mM (H3PO4 0,1%) – ACN, chiết mẫu đơn giản bằng MeOH Phương pháp có LOD, LOQ của mẫu rắn 0,20 – 1,00 µg/ml và 0,60-3,00 µg/ml, mẫu lỏng là 0,30 – 1,20 µg/ml và 0,90 - 3,6 0 µg/ml Độ chính xác trong ngày và khác ngày 82,25 – 111,42 % và 80,70 – 115,64 % Phân tích 97 mẫu thực phẩm bổ sung trên thị trường phát hiện 2 mẫu có chứa atenolol với hàm lượng từ 16,81 – 28,07 µg/g [19]

Các nghiên cứu đã cho thấy bên cạnh các phương pháp TLC, cận hồng ngoại, HPLC detector UV thì việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS hiện đang là phương pháp phân tích được lựa chọn tối ưu trong nghiên cứu các chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm có nguồn gốc thảo dược Phương pháp giúp cho phân tích được số lượng lớn các hoạt chất cùng lúc với độ đặc hiệu, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp tới nanogam

1.3.2 Tại Việt Nam

Trong Hội nghị “Tăng cường kiểm soát nguồn gốc và chất lượng dược liệu”, tổ chức ngày 14/9/2016 tại Hà Nội, ông Nguyễn Đăng Lâm, Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cho biết có thực trạng phát hiện thuốc đông dược trộn cả tân dược Trước đây, có loại đông dược trộn 1 loại thuốc tây y, nhưng gần đây qua công tác kiểm tra, cơ quan chức năng phát hiện có thuốc trộn đến 3 đến 4 loại thuốc tây y [35]

Các thuốc đông y, thuốc cổ truyền bị pha trộn thêm thuốc tân dược hay gặp như: thuốc giảm đau, thuốc chữa khớp, thuốc chữa ho, thuốc tễ cho trẻ

em và các dược chất thường được trộn: paracetamol trong thuốc đông dược điều trị cảm sốt, đau nhức xương khớp; corticoid trong thuốc trị khớp, hen, ăn uống kém Glibenclamid và metformin trộn vào thuốc đông dược chữa tiểu đường, sildenafil, tadafil trộn trong thuốc có tác dụng bổ dương, tăng cường sinh lực cho nam giới Năm 2012, Sở Y Tế tỉnh Quảng Nam thu hồi hai thuốc đông y là ‘’Thấp khớp tê bại đơn’’, SĐK: V196 – H12 – 10 của cơ sở đông dược Lợi Hoà Đường do thuốc có chứa tân dược paracetamol và thuốc ‘‘Thấp khớp hoàn’’, SĐK: VND – 3345 – 05 của cơ sở Linh Trung sản xuất do thuốc

có chứa dexamethason Năm 2015, Sở Y Tế Hải Phòng thu hồi thực phẩm chức năng “Thận lực phiến” do Công ty cổ phần dược phẩm Khang Đạt sản xuất đã phát hiện có hoạt chất sildenafil citrat, với hàm lượng 18,18 mg/viên Tháng 5/2016, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm ra thông báo số 3133-TB/ATTP về thu hồi thực phẩm bảo vệ sức khỏe Avena plus do dương tính với sildenafil Năm 2018, sản phẩm tăng cân, giảm cân của công ty Tiến Hạnh qua phân tích Viện khoa học hình sự Bộ Công an đã phát hiện các có chứa cinnarizine, sibutramine [6], [35], [7], [4]

Nhóm nguyên cứu của Cao Công Khánh và các cộng sự đã xây dựng quy trình xác định đồng thời sibutramine, furosemid, dexamethason và piroxicam trong thực phẩm chức năng giảm cân và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị các bệnh về xương, khớp, gout bằng kỹ thuật HPLC detector UV 225nm Nghiên cứu sử dụng cột Waters Symmetry C18 (250 mm x 4,6mm, 5µm), pha động là dung dịch đệm acetat (pH 3,5) – MeOH Quy trình xây dựng có khoảng tuyến tính 0,5 – 50 µg/ml với furosemid; LOD và LOQ khoảng 0,1 mg/100g và 0,4 mg/100g; độ thu hồi từ 98,4 -102,7% cho tất cả các chất phân

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Trần Lệ Hoa và các cộng sự đã xây dựng quy trình xác định đồng thời 4 chất trong nhóm huyết áp: amlodipin, nifedipin, valsartan, felodipin bằng phương pháp HPTLC và HPLC Phương pháp HPTLC sử dụng hệ pha động Cloroform – ethylacetat - acid acetic (6 : 5 : 0,2) cho LOD từ 20 – 40 µg/ml Phương pháp HPLC sử dụng dung môi chiết mẫu là MeOH, hệ pha động MeOH – dung dịch đệm phosphat 0,05M (pH 3,0) với thời gian phân tích 50 phút, LOD từ 0,25 – 0,50 µg/ml; LOQ từ 0,83 – 1,67 µg/ml; độ thu hồi từ 80,27 – 109,97% và RSD 0,89 – 5,16% [8]

Từ tổng quan tài liệu cho thấy cần có một phương pháp xác định các chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược với độ chính xác, độ nhạy cao đến ppb sẽ là đem lại hiệu quả và lợi ích rất lớn cho việc kiểm nghiệm và phát hiện chất trộn trái phép

1.4 Tổng quan về phương pháp LC-MS/MS

Hiện nay sắc ký lỏng nối khối phổ (LC-MS) được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, môi trường, thực phẩm, vật liệu công nghiệp Sắc ký lỏng (LC) cho phép tách các thành phần khác nhau trong cùng một mẫu dựa vào sự khác biệt về tính ái lực giữa pha tĩnh và pha động và tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích mà chúng có thể được phát hiện bằng detector UV, huỳnh quang, MS…Phương pháp sắc ký cho phép tách riêng các chất nhưng việc định danh hay định lượng một cách tin cậy sẽ phụ thuộc vào detector

Khối phổ MS là phương pháp phát hiện có độ nhạy cao Đầu tiên các chất phân tích được ion hóa bằng kĩ thuật khác nhau sau đó trong chân không các ion tạo thành này được phân loại dựa trên cơ sở tỉ lệ khối lượng - điện tích của mỗi ion (m/z) và sau cùng tiến hành đo cường độ của chúng Phổ khối thu được cho thấy mức độ xuất hiện các ion sao cho mỗi ion đi kèm với một số

khối, do đó MS hỗ trợ rất lớn trong phân tích định lượng, đồng thời từ số khối của các ion thu được trực tiếp từ khối phổ giúp cho việc định danh chất đó

Hình 1.1.a) Hệ thống LC-MS/MS

Bruker

Hình 1.1 b) Tứ cực chập ba gấp cong trong hệ thống máy LC-MS/MS

Brucker [13]

Hệ thống phân tích khối phổ kế gồm: bộ phận nạp mẫu (trong LC-MS bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký), bộ phận ghép nối giữa bộ phận tiêm mẫu và những bộ phân của hệ thống MS, nguồn ion hóa mẫu (có nhiệm

vụ ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh các phân tử trung hòa thành các mảnh ion, gốc mang điện tích bằng các phân tử mang năng lượng cao), các thấu kính tĩnh điện giúp tạo ion một cách hiệu quả, khối phổ kế phân tách ion theo tỉ lệ m/z (khối

lượng ion/điện tích) và các ion sau khi lọc sẽ đi vào đầu dò, được khuếch đại

thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ Cuối cùng là bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system) [1]

Có ba kiểu hình thành ion: ion hóa điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI) Trong đó, kiểu ion hóa điện tử (ESI) được sử dụng phổ biến nhất, thực hiện ở áp suất khí quyển Các mẫu thử trong dung

phun sương dưới tác động của một dòng khí Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da [17] Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion (Ion trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube) Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole) được cấu tạo gồm 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị

va đập vào tứ cực Hiện nay còn sử dụng ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ trong đó Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là buồng để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để định danh cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm:

+ Quét toàn phổ (SCAN): cho khối phổ toàn ion của tất cả các chất Trong đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS/MS thường được sử dụng để khảo sát ion mẹ, quét tất cả các ion con tạo thành nhằm xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

+ Chọn lọc ion (SIM): ở chế độ quét ion chọn lọc SIM chỉ ghi nhận tín hiệu của một số mảnh ion đặc trưng của chất cần phân tích căn cứ vào số khối Thường không dùng để nhận danh hay so sánh trong các thư viện có sẵn mà được dùng để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã xác định được ion mẹ + SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring) Trong đó chế độ SRM sẽ cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm

và đưa vào đầu dò để phát hiện

+ MRM do yêu cầu trên thực tế về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên cần xác định 2 ion con trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3

và đưa vào đầu dò để phát hiện [13]

Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS là kỹ thuật phân tích tập hợp khả năng phân tách cao của LC và vừa có khả năng phát hiện, định lượng chính xác của

MS đối với các chất hữu cơ ít hoặc không bay hơi Do đó được ứng dụng rộng rãi trong phân tích với phổ mẫu đa dạng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

Bảng 2.2.Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

1 Amlodipin besilat 99,69% WS 0212213.02

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương

2 Valsartan 98,38% (NT) WS.0116335.01

3 Atenolol

100,17%, ẩm: 0,11% WS.0123093

4 Furosemid 99,51% (NT) WS.0103128

5 Nifedipin

100,19%, ẩm: 0,08% 0106200

Viện kiểm nghiệm thuốc Hồ Chí Minh

6 Hydroclorothiazid 99,55% (NT) 0114308.01

2.1.2 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu

- Máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Brucker EVOQ Qube-Mỹ

- Cân phân tích Mettler – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1mg)

- Cân phân tích SHIMAZU – Nhật Bản (d = 0.1mg/0.01mg)

- Máy ly tâm Hermle Z306 – Đức

- Máy lắc siêu âm Daihan-Wuc A22H – Hàn Quốc

- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí Nitơ Hanon – Đài Loan

- Tủ sấy Memmert ULM 500 – Đức

- Máy lọc hút chân không

- Các dụng cụ : các loại pipet, micropipet, bình định mức class A- Đức, ống đong, màng lọc mẫu (syringe filter), cốc có mỏ, vial, …

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Nền mẫu: được xây dựng dựa trên nguyên tắc gia giảm từ các bài thuốc y học cổ phương, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng dược lý lợi tiểu, hạ huyết áp đã công bố và một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị tăng huyết áp, lợi tiểu có thị phần lớn trên thị trường Việt Nam hiện nay

- Mẫu chuẩn tự tạo : Các chất chuẩn trộn vào cùng nền mẫu với tỉ lệ nhất định

- Mẫu thử : thu thập các mẫu chế phẩm đang được lưu hành trên thị trường theo các yêu cầu sau :

+ Lựa chọn theo công dụng công bố: điều trị, hỗ trợ điều trị giảm huyết

áp, chống tai biến do huyết áp cao; tăng huyết áp đi kèm tiểu đường; phù; có tác dụng lợi tiểu trong các trường hợp bí tiểu tiện, hoặc hỗ trợ giảm cân

+ Theo các dạng bào chế rắn: bột cốm/nang, viên nén, viên hoàn, trà + Cách thức thu thập: nhà thuốc, cửa hàng bán chế phẩm bảo vệ sức khỏe, phòng chuẩn trị lương y, qua mạng internet, mẫu gửi …

+ Dạng chế phẩm: có SĐK hoặc không

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Khảo sát phương pháp chiết: sau khi tiến hành lựa chọn dung môi chiết khảo sát các phương pháp chiết sau: siêu âm 10 phút, 15 phút, 25 phút Xác định hiệu suất chiết các chất phân tích thông qua lượng chất phân tích thu hồi được khi thêm chuẩn vào từng nền mẫu để đánh giá khả năng chiết của từng

phương pháp

2.2.2: Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS:

- Khảo sát điều kiện sắc ký: lựa chọn pha động, cột sắc ký, tốc độ dòng

để tách các chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện khối phổ: lựa chọn nguồn ion, năng lượng bắn phá, điều kiện mảnh ion mẹ và các mảnh ion con để phát hiện và phân tích đồng thời hỗn hợp các chất nghiên cứu [29], [32], [21], [24], [23]

2.2.3: Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng:

Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn của AOAC 2016 [20], [12] với các tiêu chí:

- Độ đặc hiệu

- Độ phù hợp của hệ thống

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch

 Dung dịch chuẩn gốc đơn (1 mg/ml): Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn amlodipin besilat, nifedipin, valsartan, hydroclorothiazid, atenolol và furosemid vào bình định mức 10 ml, hòa tan bằng dung môi methanol thu được dung dịch chuẩn gốc đơn mỗi chất nồng độ chính xác 1 mg/ml

 Dung dịch chuẩn đơn (4 µg/ml): dùng micropipet hút chính xác một thể tích khoảng 200 µl dung dịch chuẩn gốc đơn cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn đơn mỗi chất nồng độ chính xác 4 µg/ml

 Dung dịch chuẩn hỗn hợp (100 ng/ml): dùng micropipet lần lượt hút chính xác 250 µl dung dịch chuẩn đơn cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung môi methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 6 chất có nồng độ chính xác khoảng 100 ng/ml

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ

3.1.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Trong phương pháp phân tích LC-MS/MS, đầu tiên cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ), và ion sản phẩm (ion con) đối với từng hoạt chất Với kỹ thuật ion hóa ESI ở cả 2 chế độ âm và dương Trong chế độ dương (positive), các ion phân tử có thể được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+, một số trường hợp thêm hai proton [M-2H]++ còn trong chế độ âm, các ion phân tử được tạo thành do mất đi một proton [M]- Từ ion mẹ đã xác định được, tiến hành bắn phá để lựa chọn các ion con dùng trong định tính và định lượng

Sử dụng các dung dịch chuẩn đơn nồng độ 4 µg/ml, tiêm không qua cột vào hệ thống MS để xác định ion mẹ và các ion con Các điều kiện bắn phá ion mẹ tạo thành các ion con được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ

Từ kết quả tối ưu hóa, lựa chọn 2 ion con có tín hiệu lớn, trong đó ion con có cường độ tín hiệu lớn và ổn định hơn được lựa chọn làm ion con định lượng, ion con còn lại dùng để định tính Điều kiện khối phổ lựa chọn và phổ đồ các

chất phân tích được trình bày trong Bảng 3.1 và Bảng 3.2:

Bảng 3.1.Tối ưu điều kiện khối phổ của các chất nghiên cứu

Điện áp đầu phun

Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích

(m/z)

Ion con (m/z) CE (eV)

Tỷ lệ (%)

(*): Ion con định lượng

Nhận xét: Các giá trị thông số tối ưu được lựa chọn ở Bảng 3.1 và Bảng

3.2 đã xác định được điều kiện khối phổ để phân tích các chất nghiên cứu Kết

quả khảo sát cho thấy: 3 chất phân tích atenolol, amlodipin, nifedipine có ion

mẹ ở dạng [M-H+] có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z =

M + 1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất 3 chất phân tích hydroclorothiazid, furosemide, valsartan có ion mẹ ở dạng [M-] có số khối nhỏ hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z = M-1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất

Lựa chọn chế độ MRM để tiến hành ghi phổ trong đó mỗi chất phân tích được xác định bởi một ion mẹ và hai ion con trong đó một ion con dùng để định lượng, một ion con dùng để định tính Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo quy định Châu Âu (2002/657/EC) với điểm nhận dạng (IP) là 4 (1 ion mẹ: 1,0 điểm và 2 ion con với mỗi ion con: 1,5 điểm)

3.1.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Dựa trên các tài liệu tham khảo đã tổng hợp cùng với điều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm, cố định một số thông số chạy sắc ký sau:

- Pha động: ACN – dung dịch acid formic 0,1%

(a) Cột Ultra C18 (b) Cột InertSustain AQ -C18

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký

Nhận xét: Từ Hình 3.1 cho thấy:

Cột Ultra C18 có khả năng rửa giải làm các chất phân tích tách nhau rõ

ràng: pic atenolol, nifedipin, HCT, furosemid, valsartan được rửa giải ra sớm

Riêng amlodipin phải sử dụng tỷ lệ pha động ACN – dung dịch acid formic

0,1% là 90:10 được rửa giải ra chậm ở 7,1 phút và pic bị tù

Cột InertSustain AQ-C18 cho kết quả rửa giải các chất phân tích tách

nhau rõ ràng, chân pic gọn, các chất được rửa giải ra từ 2,1 đến 5,9 phút Pha

động cần sử dụng tỉ lệ ACN cao nhất là 70% để rửa giải ra 6 chất

Do đó lựa chọn cột InertSustain AQ -C18 để tiến hành phân tích

 Khảo sát tỷ lệ pha động

Dựa vào các tài liệu tham khảo để lựa chọn khảo sát một số tỷ lệ pha động A: B, trong đó kênh A là dung dịch acid formic 0,1% và kênh B là ACN Sử dụng cột InertSustain AQ - C18 tiến hành khảo sát các chế độ gradient sau:

Bảng 3.3 Khảo sát điều kiện pha động theo chế độ gradient

T (phút) A

(%)

B (%)

T (phút)

A (%)

B (%) T (phút) A (%) B (%)

4,0 30 70 1,0 - 5,0 30 70 1,6 – 4,1 60 40 4,1 - 6,0 30 70 5,1 - 8,0 30 70 4,1 - 6,0 30 70 6,1 - 8,5 100 5 8,1 - 10,0 90 10 6,1 – 8,5 95 5

(a) Chế độ Gradient 1 (b) Chế độ Gradient2 (c) Chế độ Gradient3

Từ Hình 3.2 cho thấy:

- Chương trình gradient 1: thời gian lưu của các chất từ 2,7 phút đến 5,9 phút; pic atenolol bị kéo chân trước, đỉnh pic không gọn 5 chất còn lại cho pic gọn, cân xứng

- Chương trình gradient 2: thời gian lưu của các chất từ 1,6 phút đến 5,9 phút; pic atenolol bị chẻ đầu, nhiễu nền không ổn định

- Chương trình gradient 3: thời gian lưu của các chất từ 2,1 phút đến 5,8 phút; các chất phân tích thu được pic gọn, rõ ràng, đường nền ổn định

- Như vậy lựa chọn chương trình gradient 3 để tiến hành phân tích

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện LC-MS/MS như sau:

- Các điều kiện khối phổ: theo Bảng 3.1 và Bảng 3.2

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Chuẩn bị các dung dịch sau:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong methanol có nồng độ amlodipin 20 ng/ml; hydroclorothiazid 50 ng/ml, valsartan 160 ng/ml và 3 chất còn lại có nồng độ 80 ng/ml

- Dung dịch thử: xác định khối lượng trung bình của mỗi nền mẫu, nghiền mịn và đồng nhất Cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng (0,12 g với viên nang; 0,15 g với viên nén và 0,26 g với viên hoàn) cho vào ống falcon 50 ml Thêm chính xác một lượng chuẩn vào nền mẫu sao cho nồng độ các chất phân tích sau khi xử lý tương đương với dung dịch chuẩn Thêm 25 ml dung môi chiết, lắc đều Lắc xoáy nhẹ, siêu âm ở nhiệt độ phòng Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Gạn lấy phần dịch trong, pha loãng thích hợp Lọc qua màng lọc 0,22 µm Tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS

Tiến hành chiết mẫu thử bằng các dung môi khác nhau và thời gian siêu âm khác nhau Mỗi quá trình được thực hiện lặp lại 3 lần Tính độ thu hồi dựa vào diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch thử so sánh với dung dịch chuẩn

3.1.3.1 Khảo sát dung môi chiết

Chuẩn bị các dung dịch thử theo quy trình trên Thêm lần lượt 25 ml dung môi chiết sau: ethanol 96%, methanol, methanol – nước (50-50), methanol – nước (70-30) Lắc xoáy nhẹ, siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Gạn lấy phần dịch trong, pha loãng thích hợp Lọc qua màng lọc 0,22 µm Tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.4 như sau: