NGUYỄN THỊ DUNG xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN và các CHẤT CHUYỂN hóa TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN THAM GIA NGHIÊN cứu TƯƠNG ĐƯƠNG SINH học LUẬN văn THẠC sĩ dược học

Hiện tượng chuyển dạng này không chỉ diễn ra trong cơ thể mà còn diễn ra trong quá trình bảo quản, xử lý và phân tích các mẫu huyết tương, ảnh hưởng lớn đến độ chính xác của các kết quả

NGUYỄN THỊ DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

ĐỒNG THỜI ATORVASTATIN VÀ

CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA TRONG

HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN

THAM GIA NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Tạ Mạnh Hùng PGS.TS Đoàn Cao Sơn

HÀ NỘI 2019

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đoàn Cao Sơn, TS Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, hai người thầy đã tận tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa Phân tích - độc chất đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các đồng nghiệp tại Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ với tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè

đã giúp đỡ và động viên để tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận văn

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ, động viên, khích lệ của Quý Thầy, Cô, Cơ quan, Bạn bè và Gia đình đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Hà nội, ngày 31 tháng 03 năm 2019 Học viên: Nguyễn Thị Dung

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.TỔNGQUANVỀATORVASTINVÀHAICHẤTCHUYỂNHÓA 3

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa 3

1.1.1.1 Công thức cấu tạo 3

1.1.1.2 Tính chất lý hóa 3

1.1.2 Các đặc tính dược lý, dược động học 4

1.1.2.1 Tác dụng dược lý 4

1.1.2.2 Chỉ định [2] 4

1.1.2.3 Liều lượng và cách dùng [2] 4

1.1.2.4 Dược động học 4

1.1.3 Một số phương pháp định lượng atorvastatin và chất chuyển hóa trong dịch sinh học 6

1.2.PHƯƠNGPHÁPPHÂNTÍCHTHUỐCTRONGDỊCHSINHHỌC 8

1.2.1 Kỹ thuật xử lý mẫu 9

1.2.2 Phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI) 10 1.2.2.1 Bộ phận nạp mẫu 11

1.2.2.2 Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI – Electron spray ionization) 11

1.2.2.3 Bộ phận phát hiện (detector) 13

1.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 13

1.2.3.1 Độ chọn lọc 13

1.2.3.2 Giới hạn định lượng dưới 14

1.2.3.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 14

1.2.3.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày 14

1.2.3.5 Ảnh hưởng của nền mẫu 15

1.2.3.6 Độ thu hồi hoạt chất và chuẩn nội 15

2.1.NGUYÊNLIỆU,TRANGTHIẾTBỊNGHIÊNCỨU 17

2.1.1 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất 17

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 17

2.2.ĐỐITƯỢNGNGHIÊNCỨU 18

2.2.1 Mẫu huyết tương 18

2.2.2 Thuốc nghiên cứu (trong đánh giá tương đương sinh học) 18

2.3.NỘIDUNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 18

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 18

2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định AT, o-AT, p-AT 18

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 19

2.3.1.3 Khảo sát qui trình xử lý mẫu huyết tương 19

2.3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội: 20

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 20

2.3.3 Xác định nồng độ AT, o-AT, p-AT trong mẫu huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu tương đương sinh học chế phẩm Atorvastatin23 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1.KẾTQUẢXÂYDỰNGPHƯƠNGPHÁPPHÂNTÍCH 25

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng AT, o-AT, p-AT 25

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ định lượng AT 25

3.1.1.2 Điều kiện khối phổ định lượng o-AT và p-AT 28

3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 29

3.1.3 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu huyết tương 31

3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội 35

3.1.5 Kết quả xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng AT, o-AT và p-AT trong huyết tương 35

3.2.KẾTQUẢTHẨMĐỊNHPHƯƠNGPHÁPPHÂNTÍCH 37

3.2.1 Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS 37

3.2.2 Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp 38

3.2.3 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 41

3.2.5.2 Độ đúng, độ chính xác khi pha loãng mẫu 4 lần 46

3.2.6 Ảnh hưởng của nền mẫu 46

3.2.7 Xác định tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội 47

3.2.8 Độ nhiễm chéo 49

3.2.9 Nghiên cứu độ ổn định 50

3.2.9.1 Độ ổn định dài ngày dung dịch chuẩn gốc 50

3.2.9.2 Độ ổn định dung dịch chuẩn nội làm việc ở nhiệt độ phòng 51

3.2.9.3 Độ ổn định mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 52

3.2.9.4 Độ ổn định sau 5 chu kỳ đông – rã đông 53

3.2.9.5 Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler) 54

3.2.9.6 Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 55

3.3.KẾTQUẢĐỊNHLƯỢNGAT, O-AT, P-ATTRONGMẪUHUYẾT TƯƠNGNTN 56

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 64

4.1.PHƯƠNGPHÁPPHÂNTÍCHĐỊNHLƯỢNGĐỒNGTHỜIAT, O -ATVÀ P-ATTRONGHUYẾTTƯƠNGNGƯỜI 64

4.1.1 Lựa chọn phổ khối MS/MS cho AT, o-AT và p-AT 64

4.1.2 Kỹ thuật xử lý mẫu 64

4.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 65

4.2.KẾTQUẢPHÂNTÍCHMẪUHUYẾTTƯƠNGNTN 66

KẾT LUẬN 68

KIẾN NGHỊ 69

EMA : Cơ quan quản lý Dược Châu Âu

(European Medicines Agency) ESI : Ion hóa kiểu phun điện tử (Electrospray ionization) GlI : Glibenclamid

HDC : Mẫu pha loãng ở nồng độ cao

MDC : Mẫu pha loãng ở nồng độ trung bình

MQC : Mẫu kiểm tra ở nồng độ giữa (Medium quality control) NTN : Người tình nguyện

o-AT : ortho-hydroxy atorvastatin

p-AT : para-hydroxy atorvastatin

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) SKD : Sinh khả dụng

SKĐ : Sắc ký đồ

SPE : Chiết pha rắn (Solid phase extraction)

SQC : Mẫu kiểm tra bổ sung (Supplement quality control) STT : Số thứ tự

TĐSH : Tương đương sinh học

TLTK : Tài liệu tham khảo

Tmax : Thời gian đạt nồng độ cực đại

ULOQ : Giới hạn định lượng trên (Upper limit of quantitation) US-FDA : Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

(United States – Food and Drug Administration) v/v : Thể tích/thể tích

AT trong HT 7

Bảng 2.1- Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn trong huyết tương 21

Bảng 2.2- Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương 22

Bảng 2.3- Cách chuẩn bị các mẫu pha loãng trong huyết tương……… 22

Bảng 3.1- Tỷ lệ thu hồi của AT, o-AT, p-AT khi chiết bằng các dung môi khác nhau……… 34

Bảng 3.2- Điều kiện khối phổ định lượng AT, o-AT, p-AT và IS 36

Bảng 3.3- Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS 38

Bảng 3.4- Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu của AT và IS 39

Bảng 3.5- Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu của o-AT và p-AT 39

Bảng 3.6- Đáp ứng pic của mẫu LLOQ và Zero 42

Bảng 3.7- Độ đúng – độ chính xác của mẫu LLOQ 43

Bảng 3.8- Kết quả khảo sát đường chuẩn đối với AT, o-AT, p-AT 44

Bảng 3.9- Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày của AT, o-AT, p-AT 45

Bảng 3.10- Độ đúng, độ chính xác khác khi pha loãng mẫu 4 lần 46

Bảng 3.11- Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu đối với AT 47

Bảng 3.12- Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu đối với o-AT và p-AT 47 Bảng 3.13- Kết quả xác định tỷ lệ thu hồi của AT, o-AT và p-AT 48

Bảng 3.14- Kết quả xác định tỷ lệ thu hồi của IS 49

Bảng 3.15- Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo- AT 49

Bảng 3.16- Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo- o-AT và p-AT 50

Bảng 3.17- Kết quả độ ổn định dài ngày của các dung dịch chuẩn gốc 51

Bảng 3.18- Kết quả độ ổn định của dung dịch IS làm việc ở nhiệt độ phòng 51

Bảng 3.19- Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ 52

Bảng 3.22- Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 55Bảng 3.23- Nồng độ trung bình của AT, o-AT, p-AT trong huyết tương 27 NTN 59Bảng 3.24- Thống kê mô tả một số thông số dược động học của AT trên NTN Việt Nam 60Bảng 3.25- Thống kê mô tả một số thông số dược động học của o-AT trên NTN Việt Nam 61Bảng 3.26- Thống kê mô tả một số thông số dược động học của p-AT trên NTN Việt Nam 62

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa atorvastatin trong cơ thể [25] 5

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ 11

Hình 1.4 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba 12

Hình 3.1 Phổ khối MS dung dịch chuẩn AT với chế độ ESI (+)……… …25

Hình 3.2 Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có m/z = 559,59 26

Hình 3.3 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [AT+H]+ 27

Hình 3.4 Giản đồ năng lượng phân mảnh [AT+H]+ 28

Hình 3.5 Phổ khối MS dung dịch chuẩn p-AT 28

Hình 3.6 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [p-AT+H]+ 29

Hình 3.7 Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 575,2 Da (a) và Giản đồ năng lượng phân mảnh [p-AT+H]+ (b) 29

Hình 3.8 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,001% (70 : 30, v/v) 30

Hình 3.9 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (100 mm x 2,1 mm; 1,7 µm), pha động MeOH : acid formic 0,001% (70 : 30, v/v) 30

Hình 3.10 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng hệ pha động MeOH : acid formic 0,001% (75 : 25, v/v) 30

Hình 3.11 SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng hệ pha động MeOH : acid formic 0,001% (65 : 35, v/v) 30

Hình 3.12- Sơ đồ chiết AT, o-AT, p-AT trong HT bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng 32

Hình 3.13 SKĐ mẫu HT chứa AT, o-AT, p-AT khi tủa bằng MeOH 33

Hình 3.14 SKĐ mẫu HT chứa AT, o-AT, p-AT khi tủa bằng MeCN 33

Hình 3.15- SKĐ dòng ion AT, o-AT, p-AT khi phân tích mẫu huyết tương trắng đã được chiết lỏng - lỏng bằng diethylether-cloroform (1:1) 34

Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu HT chứa AT, o-AT, p-AT và IS phân tích bằng LC-MS/MS 37

Hình 3.19 SKĐ mẫu HT thời điểm 0h của NTN L03 có thêm chuẩn nội 56Hình 3.20 SKĐ mẫu HT thời điểm 24 giờ sau khi uống thuốc thử của NTN L03 57Hình 3.21 SKĐ mẫu HT thời điểm 24 giờ sau khi uống thuốc chứng của NTN L03 57Hình 3.22 Đường cong trung bình nồng độ AT theo thời gian của 27 NTN 57Hình 3.23 Đường cong trung bình nồng độ o-AT theo thời gian của 27 NTN 58Hình 3.24 Đường cong trung bình nồng độ p-AT theo thời gian của 27 NTN 58

ĐẶT VẤN ĐỀ Atorvastatin (AT) là một thuốc thuộc nhóm statin, có khả năng làm giảm tổng hợp cholesterol trong gan và làm giảm nồng độ cholesterol trong tế bào thông qua việc ức chế men HMG-CoA reductase.Atorvastatin được chỉ định để làm giảm cholesterol toàn phần và cholesterol LDL ở người bệnh tăng cholesterol huyết gia đình đồng hợp tử, bổ trợ cho các cách điều trị hạ lipid khác [2]

Trong cơ thể atorvastatin bị chuyển hóa bởi hệ enzym microsom cytochrom

P450 mà chủ yếu là isoenzym 3A4 (CYP 3A4) thành hai chất chuyển hóa có hoạt tính

là ortho-hydroxy atorvastatin (o-AT) và para-hydroxy atorvastatin (p-AT) [2] Tác dụng ức chế men HMG-CoA reductase của các chất chuyển hóa này tương đương với atorvastatin Khoảng 70% các hoạt tính ức chế trong tuần hoàn đối với men khử HMG-CoA là do các chất chuyển hóa có hoạt tính [26] Đồng thời trong cơ thể, AT

và hai chất chuyển hóa o-AT, p-AT có mặt ở trạng thái cân bằng với các dạng lacton không hoạt động tương ứng Quá trình chuyển từ dạng acid sang dạng lacton và ngược lại từ dạng lacton sang dạng acid được xúc tác bởi các enzym tương ứng là uridin diphosphat (UDP)-glucuronosyltransferase (UGTs) và esterases (paraoxonases) [27], [25] Hiện tượng chuyển dạng này không chỉ diễn ra trong cơ thể mà còn diễn ra trong quá trình bảo quản, xử lý và phân tích các mẫu huyết tương, ảnh hưởng lớn đến độ chính xác của các kết quả trong quá trình tiến hành nghiên cứu dược động học của AT và các chất chuyển hóa [21], [22] Theo khuyến nghị của FDA về đánh giá tương đương sinh học đối với chế phẩm atorvastatin, ngoài các dữ liệu về atorvastatin, các dữ liệu về hai chất chuyển hóa o-AT, p-AT (nồng

độ trong huyết tương, các giá trị dược động học, trung bình hình học và tỷ lệ trung bình của AUC và Cmax) cũng cần được báo cáo [14] Tuy nhiên nồng độ tối đa của

AT, o-AT, p-AT trong huyết tương khi uống một liều đơn 10 mg hoặc 20 mg atorvastatin tương đối thấp (khoảng 0,1 – 20 ng/ml) [29], [30] Do vậy để định lượng được AT và các chất chuyển hóa trong các mẫu huyết tương người đòi hỏi phải có phương pháp bảo quản, xử lý mẫu phù hợp cũng như một phương pháp phân tích

có đủ độ nhạy, đặc hiệu và chính xác cao Mặt khác hiện nay nhu cầu đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa AT sản xuất tại Việt Nam ngày càng

tăng cao nhưng chưa có phương pháp phân tích nào về định lượng đồng thời AT

và các chất chuyển hóa có hoạt tính trong huyết tương được chính thức công bố tại Việt Nam

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời atorvastatin và các chất chuyển hóa trong huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu tương đương sinh học” với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời atorvastatin và hai chất chuyển hóa có hoạt tính ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng atorvastatin và hai chất chuyển hóa ortho-hydroxy atorvastatin, para-hydroxy trong huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học chế phẩm viên nén Atorvastatin sản xuất tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ATORVASTIN VÀ HAI CHẤT CHUYỂN HÓA

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

1.1.1.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của atorvastatin, para-hydroxy atorvastatin,

ortho-hydroxy atorvastatin

* Atorvastatin:

- Công thức phân tử: C33H35FN2O5

- Khối lượng phân tử: 558,65 g/mol

- Tên khoa học: Acid (

3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-(1-methylethyl)-3-phenyl-4-(phenylcarbamoyl)-1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic

* Ortho-hydroxy atorvastatin:

- Công thức phân tử: C33H35FN2O6

- Khối lượng phân tử: 574,7 g/mol

- Tên khoa học: Acid (

3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-(1-methylethyl)-3-phenyl-4-(2 –hydroxyphenylcarbamoyl)-1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic

* Para-hydroxy atorvastatin:

- Công thức phân tử: C33H35FN2O6

- Khối lượng phân tử: 574,7 g/mol

- Tên khoa học: Acid (

3R,5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-(1-methylethyl)-3-phenyl-4-(4 –hydroxyphenylcarbamoyl)-1H-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanoic

1.1.1.2 Tính chất lý hóa

AT, o-AT và p-AT đều là dẫn chất của acid heptanoic AT ở dạng bột màu trắng

hoặc hơi trắng, dạng muối calci rất ít tan trong nước, ít tan trong ethanol, dễ tan

trong methanol, dimethyl sulphoxid AT calci có nhiệt độ nóng chảy khoảng 159,2oC – 160,7 oC; logP = 6,36; pKa1 = 4,3 (carboxy); pKa2 = 14,9 (hydroxy) [5], [26]

1.1.2 Các đặc tính dược lý, dược động học

1.1.2.1.Tác dụng dược lý

Atorvastatin thuộc nhóm thuốc điều hòa lipid huyết, là một chất ức chế cạnh tranh với HMG-CoA reductase Thuốc làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần, LDL-cholesterol và VLDL-cholesterol trong huyết tương Thuốc cũng có khuynh hướng làm giảm nồng độ triglycerid và làm tăng HDL-cholesterol trong huyết tương Ngoài ra thuốc còn có tác dụng chống xơ vữa động mạch [2]

1.1.2.2 Chỉ định [2]

- Rối loạn lipid huyết

- Dự phòng biến chứng tim mạch

1.1.2.3 Liều lượng và cách dùng [2]

Có thể uống liều duy nhất vào bất cứ lúc nào trong ngày Liều khởi đầu 10

mg một lần mỗi ngày Liều duy trì 10-40 mg/ngày Nếu cần có thể tăng liều nhưng không quá 80 mg/ngày [2]

1.1.2.4 Dược động học

Các chế phẩm chứa AT trên thị trường thường dưới dạng viên nén hoặc viên nén bao phim với hàm lượng 10 mg; 20 mg; 40 mg và 80 mg AT được hấp thu nhanh chóng sau khi uống, nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được trong vòng từ 1 đến 2 giờ Tỷ lệ gắn kết với protein huyết tương của AT ≥ 98% Thuốc chuyển hóa mạnh ở gan (> 60%) chủ yếu do enzyme CYP 3A4 thành các chất chuyển hóa có hoạt tính là ortho-hydroxy atorvasttatin và para-hydroxy atorvastatin Tác dụng ức chế men HMG-CoA reductase của các chất chuyển hóa này tương đương với AT Trong cơ thể, AT và hai chất chuyển hóa o-AT, p-AT có mặt ở trạng thái cân bằng với các dạng lacton không hoạt động tương ứng Quá trình chuyển từ dạng acid sang dạng lacton và ngược lại từ dạng lacton sang dạng acid được xúc tác bởi các enzym tương ứng là uridin diphosphat (UDP) -glucuronosyltransferase (UGTs) và esterases (paraoxonases) (Hình 1.2) [25], [27]

Ngoài cơ thể, khi pH huyết tương > 6 thì cân bằng giữa dạng acid và dạng lacton

của AT, o-AT, p-AT sẽ bị phá vỡ, dạng lacton sẽ dễ dàng chuyển sang dạng acid

làm sai lệch kết quả định lượng nồng độ các chất trong huyết tương Để hạn chế

quá trình trên thì cần điều chỉnh pH huyết tương về khoảng 4 – 6 [5], [19], [21],

[22] AT được đào thải qua nước tiểu và phân với nửa đời bán thải (t1/2) khoảng 14

giờ [2], [26]

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa atorvastatin trong cơ thể [25]

Kết quả xác định các thông số dược động học của AT, o-AT và p-AT trong

một số nghiên cứu được trình bày trong bảng 1.1:

Bảng 1.1 Giá trị một số thông số dược động học của AT, o-AT, p-AT

Thiết kế

nghiên cứu Chất

Cmax (ng/ml)

Tmax (giờ)

(1,819)

1,29 (1,42) 1,21 (1,47)

25,593 (12,747) 25,133 (12,341)

28,942 (21,4920 28,736 (21,102)

14,01 (6,73) 16,44 (12,87)

[30] o-AT

1,885*

(0,941) 1,872**

(1,064)

5,15 (2,80) 5,08 (2,68)

31,306 (16.876) 30,652 (18,468)

33,233 (17,849) 32,637 (20,132)

10,60 (3,04) 10,71 (3,45)

p-AT

0,155*

(0,172) 0,166**

(0,171)

12,50 (13,47) 12,21 (12,63)

3,450 (3,556) 2,781 (3,419)

96,743 (31,482) 3,901 (4,567)

21,00 (15,93) 22,80 (12,13)

(6,86)

1,16 (1,06) 0,69 (0,66)

38,22 (32,72) 40,02 (32,92)

42,73 (34,31) 44,51 (34,03)

7,42 (3,33) 7,45 (3,34)

[29] o-AT

5,78*

(3,25) 5,77**

(2,26)

2,11 (1,74) 1,53 (1,45)

47,32 (22,16) 48,47 (21,62)

52,36 (23,29) 53,14 (21,66)

7,83 (2,94) 7,35 (1,88) Liều đơn 40

mg, 20 người

tình nguyện

AT

61,66 (3,05) 62,16 (0,76)

4,21 (0,76) 4,22 (0,86)

821,37 (1,13) 825,39 (1,22)

1021 (1,98)

1023 (1,67)

40,02 (1,07) 40,12 (1,23)

(56,01)

1,85 (1,18) 2,13 (1,20)

314 (134)

329 (229)

319 (135)

334 (229)

12,36 (3,38) 10,96 (2,81)

[22] o-AT

31,75*

(21,59) 27,78**

(14,88)

2,55 (1,73) 2,46 (1,20)

267 (132)

255 (151)

272 (132)

259 (151)

12,74 (3,35) 15,51 (10,15)

p-AT

2,30*

(2,65) 1,85**

(1,52)

10,06 (8,10) 8,01 (3,93)

49 (35)

47 (48)

64 (39)

68 (64)

23,30 (7,88) 19,45 (4,25) (*): thuốc thử; (**): thuốc chứng 1.1.3 Một số phương pháp định lượng atorvastatin và chất chuyển hóa trong dịch sinh học

Các nghiên cứu về sinh khả dụng, dược động học, đánh giá tương đương sinh học chế phẩm AT và các chất chuyển hóa o-AT, p-AT đã công bố cho thấy sau khi uống viên nén AT với liều từ 10 mg – 80 mg nồng độ cực đại của AT và o-AT, p-AT trong huyết tương (HT) rất thấp (0,1 ng/ml – 100 ng/ml) và dao động giữa các cá thể [18], [22], [29], [30] Vì vậy để định lượng đồng thời AT, o-AT, p-

AT trong dịch sinh học, phương pháp phân tích phải có giới hạn định lượng thấp (0,1 ng/ml – 3 ng/ml đối với AT; 0,1 ng/ml – 1 ng/ml đối với o-AT; 0,01 ng/ml – 0,1 ng/ml đối với p-AT) Do đó, trong các nghiên cứu đã được công bố, các tác giả chủ yếu sử dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng đồng thời AT, o-AT, p-

AT

Tóm tắt một số phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời AT và các chất chuyển hóa trong huyết tương được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời AT, o-AT, p-AT

trong HT Điều kiện sắc ký

Xử lý mẫu LLOQ

(ng/mL)

TLTK

- Cột C18; 75 x 4,6 mm; 2,7 µm

- Pha động: Acetonitril (MeCN) - Methanol

(MeOH) - acid formic 0,005% (25:40:35)

- Thời gian phân tích: 6 phút

- Nguồn ion hóa ESI (-)

Chiết SPE

AT: 0,05 o-AT: 0,05 p-AT: 0,05 [22]

- Cột Lichro CRART 55-2, Purospher STAR

RP-18e; 3 µm

- Pha động: acid formic 0,3%/nước - acid

formic 0,3%/MeCN (50:50)

- Thời gian phân tích: 4 phút

- Nguồn ion hóa ESI (-)

Chiết lỏng bằng ethylacetat

lỏng-AT: 2,04 o-AT: 1,51 p-AT: 0,25 [23]

- Cột CAPCELL PARK CR 1:4; 150 x 2,0 mm;

5 µm

- Pha động: MeCN - amoni acetat 20 mM chứa

acid formic 0,3% (50:50)

- Thời gian phân tích: 6 phút

- Nguồn ion hóa ESI (+)

Chiết lỏng bằng ethylacetat-methyl tert-butyl ether (50/50, v/v)

lỏng-AT: 0,035 o-AT: 0,020 p-AT: 0,015 [30]

- Thời gian phân tích: 3,5 phút

- Nguồn ion hóa ESI (+)

Chiết bằng methyl tert-butyl ether

AT: 0,5 o-AT: 0,5 p-AT: 0,5 [21]

- Cột RP-80A; 150 x 4,6 mm; 4 µm

- Pha động: nước - MeOH (14:96) điều chỉnh

về pH 3,2 bằng acid tricloroacetic

- Thời gian phân tích: 6 phút

- Nguồn ion hóa ESI (+)

Tủa protein bằng MeCN

AT: 1,5 o-AT: 1,0 p-AT: 0,2

[20]

- Phương pháp của Rajesh Dhiman [23], Ying Zhou [30], Mohammed Jemal [21]

sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với dung môi chiết là ethylacetat, methyl butyl ether hoặc hỗn hợp ethylacetat-methyl tert-butyl ether (50/50, v/v) với quy trình chiết dễ thực hiện và áp dụng tại các phòng thí nghiệm Việt Nam Tuy nhiên phương pháp của Rajesh Dhiman [23], Mohammed Jemal [21] có giới hạn định lượng dưới đối với o-AT và p-AT cao (0,2 ng/ml – 1,5 ng/ml) Phương pháp của Ying Zhou [30] có giới hạn định lượng dưới đạt yêu cầu nhưng đòi hỏi cần có cột phân tích có độ chọn lọc, phân giải cao, chưa phổ biến tại nhiều phòng thí nghiệm

tert-ở Việt Nam (Cột CAPCELL PARK CR 1:4)

- Phương pháp của Mahmoud Yacoub [21] sử dụng kỹ thuật tủa protein bằng MeCN cho quá trình xử lý mẫu nhanh, đơn giản nhưng giới hạn định lượng dưới đối với o-AT và p-AT còn cao (1,0 ng/ml và 0,2 ng/mL)

1.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC

So với các phương pháp phân tích thuốc trong chế phẩm bào chế, phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học có nhiều điểm khác biệt: nền mẫu phức tạp (chứa muối vô cơ, lipid, protein, chất nội sinh,…), nồng độ hoạt chất thấp, khoảng nồng độ biến thiên rộng, lượng mẫu ít và số lượng mẫu phân tích nhiều do vậy phương pháp phân tích cần phải có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn định lượng dưới thấp, độ lặp lại tốt và thời gian phân tích cho một mẫu đủ ngắn Chính

vì vậy, khi tiến hành xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học cần chú trọng ba vấn đề cơ bản, đó là: kỹ thuật xử lý mẫu, kỹ thuật phân tích định lượng và cách tiến hành thẩm định phương pháp phân tích nhằm đảm bảo độ tin cậy của phương pháp

1.2.1 Kỹ thuật xử lý mẫu

Phần lớn các phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học đều không thể định lượng được các hoạt chất trực tiếp từ mẫu mà chỉ có thể định lượng được sau khi mẫu đã được xử lý Vì vậy, mẫu cần phải được chiết tách, xử lý để loại tạp chất, các ảnh hưởng của nền mẫu và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ nhạy của phương pháp Hiện nay, để xử lý mẫu dịch sinh học, người

ta thường hay áp dụng ba kỹ thuật cơ bản đó là: tủa protein, chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn [24]

- Kỹ thuật tủa protein:

Nguyên tắc của kỹ thuật này là sử dụng tác nhân gây tủa để loại đi phần lớn lượng protein có trong nền mẫu Tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh học thường dùng là acid (như acid tricloroacetic, acid percloric ), dung môi hữu cơ (như methanol, acetonitril…), muối vô cơ (như (NH4)2SO4, NaCl…) [17]

Kỹ thuật tủa protein có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, sử dụng lượng dung môi ít và kinh tế Trên thực tế, để xử lý mẫu huyết tương dùng cho phân tích định lượng, người ta hay dùng kỹ thuật tủa protein bằng dung môi hữu cơ hoặc acid

Nhược điểm của kỹ thuật này là mẫu bị pha loãng khi tủa bằng dung môi hữu cơ, mẫu sau xử lý còn chứa nhiều tạp chất làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký và gây nhiễu đường nền, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả khi phân tích bằng các phương pháp sắc ký, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng khối phổ [10]

- Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng:

Chiết lỏng - lỏng là phương pháp được dùng phổ biến nhất để phân tích thuốc trong dịch sinh học Nguyên lý của kỹ thuật này là chuyển chất phân tích được hoà tan trong dung môi này sang dung môi khác không đồng tan [1] Tỉ lệ thu hồi hoạt chất phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong dung môi chiết, tính phân cực của dung môi chiết, pH của pha nước, hệ số/hằng số phân bố của hoạt chất trong hai pha lỏng không trộn lẫn với nhau

Trong thực nghiệm, các dung môi hay được lựa chọn là diethylether, methyl tert-butyl ether, cloroform, dicloromethan, n-hexan, Các dung môi này có thể

dùng đơn thành phần hoặc dùng phối hợp với tỷ lệ thích hợp tuỳ theo từng hoạt chất phân tích

Ưu điểm của kỹ thuật chiết lỏng - lỏng là mẫu thu được tương đối sạch và

có thể làm giàu mẫu, áp dụng được với nhiều dược chất, phù hợp với điều kiện và thiết bị của nhiều phòng thí nghiệm Nhược điểm của kỹ thuật này sử dụng nhiều dung môi ảnh hưởng tới sức khỏe người phân tích và môi trường, thời gian xử lý mẫu dài hơn so với kỹ thuật tủa protein, có thể hình thành nhũ tương trong quá trình chiết ảnh hưởng đến kết quả phân tích [24]

- Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE):

Là kỹ thuật được phát triển dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật tách sắc

ký (chất phân tích được lưu giữ trên cột và sau đó được rửa giải nhờ một hệ dung môi thích hợp) Các giai đoạn chính của kỹ thuật SPE gồm các giai đoạn: hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa và rửa giải Kỹ thuật này đòi hỏi người phân tích phải được đào tạo và có kinh nghiệm trong việc chọn cột và dung môi thích hợp để rửa tạp và rửa giải Ưu điểm của kỹ thuật này là nền mẫu sạch ít gây ra hiện tượng ảnh hưởng của nền mẫu, tỷ lệ thu hồi cao, độ lặp lại tốt Hiện nay trên thế giới kỹ thuật SPE được

áp dụng khá phổ biến nhưng trong các phòng thí nghiệm của Việt Nam kỹ thuật này chưa được áp dụng nhiều do cột dùng cho SPE đắt nên chi phí phân tích cao Mặt khác nếu sử dụng kỹ thuật SPE thủ công thì thời gian xử lý mỗi mẫu kéo dài

do quá trình chiết trải qua nhiều giai đoạn, nếu sử dụng kỹ thuật SPE tự động thì

có thể xử lý đồng thời nhiều mẫu nhưng đòi hỏi thiết bị hiện đại, giá thành cao [24]

1.2.2 Phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)

Để định lượng thuốc trong dịch sinh học thường sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý như sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE)… Tùy thuộc vào nồng độ, cấu trúc phân tử, tính chất hóa lý, khả năng hấp thụ UV-VIS, khả năng phát huỳnh quang… của chất phân tích mà lựa chọn detector phù hợp để phát hiện Đối với những mẫu dịch sinh học có nồng độ dược chất ở ngưỡng thấp (ng/ml), hiện nay người ta hay sử dụng phương

pháp phân tích khối phổ (MS), đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) vì phương pháp có độ đặc hiệu và độ nhạy cao

Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa khả năng phân tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối của detector khối phổ [1]

Trong số các kỹ thuật LC-MS, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)

có độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao do vậy thường được sử dụng để phân tích thuốc trong dịch sinh học [3], [4]

Sơ đồ khối của một máy khối phổ được miêu tả như trong Hình 1.3

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ 1.2.2.1 Bộ phận nạp mẫu

Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ Với LC-MS mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua hệ thống HPLC [1]

1.2.2.2 Nguồn ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI – Electron spray ionization)

Nguồn ion hóa là nơi diễn ra quá trình chuyển các hoạt chất cần phân tích thành các ion/tiểu phân mang điện ở pha khí bằng các kỹ thuật ion hóa khác nhau Trong nguồn ion sử dụng kĩ thuật ion hóa kiểu phun sương điện tử (ESI), tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt Khí

và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn, lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn Quá trình này được lặp lại nhiều lần để

hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào

bộ phận phân tích khối Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị khối phổ Nguồn ESI, với kỹ thuật ion hóa mềm, nhiễm điện bề mặt nên có thể áp dụng để ion hóa nhiều hoạt chất với các đặc điểm hóa lý khác nhau [7], [8]

Hình 1.4 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba

Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực Dưới tác động của điện trường trong lòng ống điện cực, các ion có số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và quỹ đạo khác nhau Ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại

Tại Q1 sẽ lựa chọn các ion có tỷ số m/z xác định và được đưa đi thẳng đến Q2, những ion khác sẽ bị loại đi do bị va đập vào các bản điện cực trái dấu Quá trình phân mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Q2 Trong buồng Q2, ion ban đầu (ion mẹ) chuyển động Brown, va chạm với các phân tử khí trơ có mặt trong buồng (khí argon) Nhờ va chạm này năng lượng động học củacác ion chuyển thành nội năng nên chúng phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn (ion con) tùy theo mức độ bền vững của các liên kết trong ion ban đầu Các ion con mới hình thành có số khối m/z khác nhau tiếp tục được phân tách riêng tại Q3

với cơ chế phân tích khối lượng tương tự như tại Q1và cuối cùng được đưa đến detector để định lượng [8]

Các hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m/z của ion mẹ cũng như cơ chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau Vì vậy, có thể định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS 1.2.2.3 Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận này cho phép phát hiện và khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ

1.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp phân tích nói chung và phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học nói riêng Mục đích của thẩm định phương pháp là chứng minh phương pháp có đủ độ nhạy, tin cậy và lặp lại để phân tích các mẫu thực

Theo hướng dẫn của US-FDA [13] và EMA [11] thẩm định phương pháp LC-MS/MS phân tích thuốc trong dịch sinh học gồm những chỉ tiêu sau:

1.2.3.1 Độ chọn lọc

Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu Phương pháp LC-MS/MS được coi là chọn lọc đối với chất phân tích (AN) và chuẩn nội (IS) khi:

- Trên SKĐ mẫu chuẩn, các pic của AN và IS phải được nhận diện rõ ràng

và không bị ảnh hưởng bởi các pic khác

- Trên SKĐ của từng mẫu trắng (ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau), tại thời điểm trùng với thời gian lưu của pic AN tín hiệu đo phải không vượt quá 20% đáp ứng pic của mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ nhất trong đường chuẩn và tại thời điểm trùng với thời gian lưu của pic IS tín hiệu đo của từng mẫu trắng phải nhỏ hơn 5% so với đáp ứng trung bình của pic IS trong các mẫu đường chuẩn và mẫu kiểm tra (QC)

1.2.3.2 Giới hạn định lượng dưới

Mẫu chuẩn có nồng độ AN thấp nhất của đường chuẩn được coi là mẫu giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp khi:

- Pic AN được nhận diện rõ ràng, không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác và có tín hiệu đo ít nhất bằng 5 lần tín hiệu đo của mẫu trắng có thêm IS (zero)

- Độ đúng (so với nồng độ thực) phải đạt từ 80% đến 120%, độ chính xác với giá trị CV ≤ 20%

1.2.3.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa tín hiệu đo của thiết bị và nồng

độ của chất phân tích có trong mẫu Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ AN có trong mẫu với tỷ lệ tín hiệu đo của AN

- Ít nhất 75% số điểm thuộc đường chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm

cả mẫu có nồng độ thấp nhất (LLOQ) và nồng độ cao nhất (ULOQ)

1.2.3.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của nồng độ AN định lượng được với nồng độ thực Độ chính xác phản ánh mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt của nồng độ AN định lượng được giữa các lần phân tích khác nhau trên cùng một nồng độ

Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 4 mức nồng độ khác nhau (LLOQ, LQC, MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu

Độ đúng trong ngày và khác ngày phải đạt trong khoảng 85% - 115%; độ chính xác trong ngày và giữa các ngày với giá trị CV ≤ 15% Riêng nồng độ LLOQ cho phép độ đúng trong khoảng 80% - 120% và các giá trị CV ≤ 20%

1.2.3.5 Ảnh hưởng của nền mẫu

Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau thu được dung dịch nền mẫu Thêm chuẩn nội và chất phân tích ở nồng độ LQC và HQC vào từng dung dịch nền mẫu trên Song song chuẩn bị các mẫu chuẩn trong pha động chứa chuẩn nội và chất phân tích ở nồng độ tương ứng với nồng độ của các mẫu chuẩn trong nền mẫu Phân tích sắc

ký các mẫu trên Xác định giá trị MFAN, MFIS của AN và IS bằng cách so sánh diện tích pic AN và IS giữa các mẫu pha trong nền mẫu với các mẫu pha trong pha động

Phương pháp LC-MS/MS không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu khi giá trị CV của tỷ số MFAN/MFIS trên ít nhất 6 nền mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau phải ≤ 15%

1.2.3.6 Độ thu hồi hoạt chất và chuẩn nội

Độ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của AN và IS sau quá trình chiết tách, xử lý mẫu Xác định độ thu hồi AN và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của AN hoặc IS trong các mẫu QC có qua quá trình chiết tách, xử lý với đáp ứng tương ứng của các mẫu chuẩn không qua xử lý, chiết tách (mẫu trong nền mẫu)

1.2.3.7 Đánh giá khả năng nhiễm chéo

Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương trắng, 6 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ LLOQ và 6 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ cao nhất của đường chuẩn Phân tích sắc ký các mẫu LLOQ, sau đó tiêm xen kẽ từng mẫu huyết tương trắng sau mẫu ULOQ

Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình phân tích khi tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu trắng không được lớn hơn 20% so với đáp ứng pic trung bình của mẫu LLOQ và tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu trắng không được lớn hơn 5% so với đáp ứng pic trung bình của mẫu LLOQ

1.2.3.8 Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh học

Trong các nghiên cứu SKD, TĐSH…quá trình phân tích thường kéo dài vì

số lượng mẫu lớn Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định của các mẫu này sau các quá trình phân tích và bảo quản mẫu Trong thẩm định phương pháp cần đánh giá các loại độ ổn định sau:

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc thời gian dài và/hoặc thời gian ngắn

- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau các chu kỳ để đông – rã đông

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

+ Độ ổn định thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản

+ Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler)

Các mẫu được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu (trừ độ ổn định của dung dịch) nếu độ đúng của mẫu ổn định nằm trong khoảng 85% - 115% so với nồng độ lý thuyết ban đầu

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

- Dung môi, hóa chất:

+ Methanol, acetonitril, acid formic, amoniacetat, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC và LC-MS

+ Các dung môi, hóa chất khác như: cloroform, diethyl ether, methyl tert-butyl ether, ethyl acetat, đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho phân tích

- Huyết tương (HT): Huyết tương trắng được cung cấp bởi Viện huyết học và truyền máu Trung ương, gồm các lô: 17PO272515, 17PO272528, 17PO272704, 17PO272852, 17PO272911, 17PO272965

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích

- Hệ thống LC-MS loại Triple Quadrupole, model TSQ Quantum Vantage với nguồn ion hóa kiểu phun điện tử - ESI, Thermo Fisher Scientific;

- Cân phân tích Sartorius CP224S (d = 0,1 mg);

- Máy ly tâm Sartorius Sigma 2-16K;

- Thiết bị bay hơi dung môi bằng khí nitơ có gia nhiệt Reacti-Therm III, Thermo scientific;

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP scientific;

- Máy lắc ngang 3006 GFL;

- Tủ lạnh sâu -70°C ± 10°C, Sanyo MDF-236;

- Micropipet Eppendorf: 10-100 µL, 100-1000 µL, 1000 - 5000 µL

- Bình định mức, pipet thủy tinh class A: Prolabo-Pháp

Tất cả các thiết bị phân tích tại Trung tâm đánh giá tương đương sinh học (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) đều được kiểm tra, hiệu chuẩn định kỳ đáp ứng các tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025- 2005

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mẫu huyết tương

2.2.2 Thuốc nghiên cứu (trong đánh giá tương đương sinh học)

- Thuốc thử: INSUACT 10 (Viên nén bao phim Atorvastatin 10 mg) do Công ty

Cổ phần Dược phẩm SAVI sản xuất Số lô: 1807029; Ngày sản xuất: 26/07/18; Hạn dùng: 26/07/21; SĐK: VD-29107-18

- Thuốc chứng: LIPITOR® 10 mg (Viên nén bao phim Atorvastatin 10 mg) do công ty Pfizer Pharmaceuticals LLC, Mỹ sản xuất Số lô: W73927; Ngày sản xuất: 230118; Hạn dùng: 230120; SĐK: VN-17768-14

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định AT, o-AT, p-AT

Sử dụng hệ thống LC-MS loại Triple Quadrupole với nguồn ion hóa kiểu ESI, tiến hành thực nghiệm như sau:

- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ AT:

Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn AT trong hỗn hợp MeOH : H2O (1 : 1) nồng

độ khoảng 1 µg/mL vào nguồn ESI của thiết bị Tiến hành phân tích phổ khối lượng với chế độ quét toàn phổ (full scan) và quét chọn lọc ion (selected ion mornitoring – SIM) xác định mảnh phổ tương ứng với ion ban đầu của AT Sau khi xác định được số khối của ion mẹ, tiến hành tối ưu điều kiện nguồn ion hóa bao gồm: điện thế, nhiệt độ đầu phun; lưu lượng khí nitrogen cung cấp cho nguồn ion để bay hơi dung môi pha động sắc ký; điện thế của bộ phận hội tụ dòng ion… tới quá trình ion hóa AT tại nguồn ESI

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn các điều kiện của nguồn ESI phù hợp để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối có cường độ tín hiệu (vạch phổ) cao và ổn định Tiến hành nghiên cứu quá trình phân mảnh mẹ ở tứ cực thứ 2 của thiết bị MS với các mức năng lượng thay đổi từ thấp đến cao để xác định cơ chế phân mảnh ion ban đầu; số khối của các ion tạo thành; số khối của ion con đặc trưng cho quá trình phân mảnh dùng để định tính, định lượng AT trong phương pháp phân tích

và mức năng lượng tối ưu cho quá trình phân mảnh ion mẹ ban đầu

- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ o-AT, p-AT: Tiến hành tương tự như tối ưu hóa điều kiện khối phổ AT

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa đồng thời AT, o-AT, p-AT và IS trong pha động Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các cột C18 (100 × 2,1 mm; 1,7 µm và 50 × 2,1 mm; 1,7 µm ); C18 (100 × 2,1 mm; 1,9 µm) của các hãng khác nhau, trên các hệ pha động gồm dung môi hữu cơ (MeCN hoặc MeOH) phối hợp với dung dịch đệm (amoni acetat 2 mM, 10 mM; acid formic 0,001%; amoni format 2 mM) theo các tỷ lệ khác nhau

2.3.1.3 Khảo sát qui trình xử lý mẫu huyết tương

Dựa trên đặc tính hóa lý của dược chất và dựa vào tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các phương pháp xử lý mẫu trên mẫu HT trắng và các mẫu HT tự tạo chứa chuẩn AT, o-AT, p-AT với nồng độ thích hợp bằng các kỹ thuật như: + Tủa protein với tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ gồm methanol, acetonitril

+ Chiết lỏng - lỏng sử dụng các dung môi diethyl ether, methyl tert-butyl ether, ethyl acetat, cloroform, và hỗn hợp dung môi diethyl ether : cloroform (hoặc ethyl acetat); methyl tert-butyl ether : cloroform được phối hợp theo các tỷ lệ khác nhau

+ Chuẩn bị các mẫu có nồng độ tương ứng trong pha động (không qua chiết tách) để so sánh đáp ứng pic với các mẫu có nồng độ tương ứng trong huyết tương

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu đơn giản, hiệu quả có thể chiết tách AT, o-AT, p-AT với độ thu hồi cao, ổn định và không gây ra ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích bằng MS

2.3.1.4 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội:

Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất để tiến hành lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp Chuẩn nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có thể tham gia quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chuẩn Dự kiến chất chuẩn nội lựa chọn gồm có: glibenclamid, glipirid, telmisartan, diltiazem HCl, methylprednisolon

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng AT, o-AT, p-AT trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS theo qui định của US-FDA [13] và EMA [11] về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học Các chỉ tiêu cần thẩm định bao gồm: độ đặc hiệu - chọn lọc của phương pháp; ảnh hưởng của nền mẫu; giới hạn định lượng dưới; đường chuẩn - khoảng tuyến tính; độ nhiễm chéo;

độ đúng – độ chính xác trong ngày, khác ngày; tỉ lệ thu hồi và độ ổn định của hoạt chất trong quá trình xử lý, phân tích và bảo quản mẫu

Tiến hành thẩm định trên các mẫu HT trắng và các mẫu HT tự tạo chứa chuẩn

AT, o-AT, p-AT có nồng độ phù hợp

Các mẫu HT trắng được thêm H3PO4 20% theo tỷ lệ 8 µl acid H3PO4 20% :

1 ml huyết tương trắng Các mẫu HT trắng đã thêm H3PO4 20% sẽ được sử dụng trong quá trình chuẩn bị các mẫu HT tự tạo Các mẫu HT tự tạo chứa AT, o-AT, p-AT được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mẫu chuẩn:

Hòa tan 25 mg chuẩn AT trong bình định mức 100 ml và 2 mg chuẩn o-AT hoặc p-AT trong các bình định mức 20 ml với MeOH để thu được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ chính xác khoảng 250 g/ml (đối với AT) hoặc 100 g/m (đối với o-AT và p-AT) Từ dung dịch chuẩn gốc tiến hành pha loãng bằng MeOH

để thu được dung dịch chuẩn làm việc trong MeOH có nồng độ AT, o-AT, p-AT lần lượt chính xác khoảng 200 ng/ml, 100 ng/ml và 20 ng/ml Hút 1 ml dung dịch này, bốc hơi dưới dòng khí nitơ ở 40°C để thu được cắn Hòa tan cắn bằng 10 ml

HT trắng để thu được dung dịch chuẩn làm việc (WS-CC1) trong HT có nồng độ

AT, o-AT, p-AT lần lượt chính xác khoảng 20 ng/ml, 10 ng/ml và 2 ng/ml Hút 0,5 mL dung dịchWS-CC1 vào bình định mức 10 ml, bổ sung HT trắng vừa đủ để thu được dung dịch chuẩn làm việc (WS-CC2) trong HT có nồng độ AT, o-AT, p-

AT lần lượt chính xác khoảng 1 ng/ml; 0,5 ng/ml và 0,1 ng/ml

Từ dung dịch chuẩn làm việc WS-CC1 và WS-CC2, phối hợp với HT trắng theo bảng 2.1 để được các mẫu đường chuẩn có nồng độ AT từ 0,1 ng/ml đến 20 ng/ml; o-AT có nồng độ từ 0,05 ng/ml đến 10 ng/ml và p-AT có nồng độ từ 0,01 ng/ml đến 2 ng/ml

Bảng 2.1- Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn trong huyết tương

Nồng độ o-AT (ng/ml) 0,05 0,1 0,2 0,5 1,5 4 7 10 Nồng độ p-AT (ng/ml) 0,01 0,02 0,04 0,1 0,3 0,8 1,4 2

- Chuẩn bị mẫu kiểm tra:

Mẫu kiểm tra được chuẩn bị từ dung dịch gốc độc lập với mẫu chuẩn Tiến hành tương tự như mẫu chuẩn làm việc WS-CC1 và WS-CC2 để thu được dung dịch WS-QC1 và WS-QC2

Từ dung dịch chuẩn làm việc WS-QC1 và WS-QC2, phối hợp với huyết tương trắng theo bảng 2.2 để được các mẫu kiểm tra LQC, MQC, HQC có nồng

độ dự kiến Mẫu LQC có nồng độ dược chất bằng khoảng 3 lần nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ) Mẫu MQC có nồng độ dược chất bằng khoảng 40% - 60% nồng độ cao nhất của đường chuẩn (ULOQ) Mẫu HQC có nồng độ dược chất bằng khoảng 75% – 90% ULOQ

Bảng 2.2- Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương

- Chuẩn bị các mẫu thẩm định chỉ tiêu độ pha loãng mẫu 4 lần

Từ dung dịch chuẩn gốc AT, o-AT, p-AT, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương WSS-DC1 và WSS-DC2 có nồng độ AT lần lượt khoảng

80 ng/ml và 4 ng/ml; nồng độ o-AT khoảng 40 ng/ml và 2 ng/ml; nồng độ p-AT khoảng 8 ng/ml và 0,4 ng/ml

Từ các dung dịch WSS-DC1 và WSS-DC2 chuẩn bị các mẫu pha loãng (DC) trong huyết tương theo bảng 2.3

Bảng 2.3- Cách chuẩn bị các mẫu pha loãng trong huyết tương

Mẫu Nồng độ (ng/ml) V huyết tương trắng(µl) V WSS-DC1

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn nội:

Cân chính xác khoảng 25 mg chất chuẩn nội vào bình định mức 100 ml, hòa tan trong MeOH để thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ chính xác khoảng

250 g/ml

Từ dung dịch chuẩn nội gốc, pha loãng bằng hỗn hợp MeOH : H2O (1 : 1) để thu được dung dịch chuẩn nội làm việc có nồng độ thích hợp

2.3.3 Xác định nồng độ AT, o-AT, p-AT trong mẫu huyết tương người tình nguyện tham gia nghiên cứu tương đương sinh học chế phẩm Atorvastatin

Áp dụng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng xác định nồng độ AT,

o-AT, p-AT trong huyết tương người tình nguyện (NTN) tham gia nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học chế phẩm Atorvastatin Đề cương nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phê duyệt (Phiếu chấp thuận số 36/2018/CN-HĐĐĐ ngày 24 tháng 10 năm 2018) Thiết kế nghiên cứu là nghiên cứu lặp lại, nhãn mở, đơn liều, 2 thuốc, 3 trình

tự (TRR, RTR và RRT), 3 giai đoạn Nghiên cứu thực hiện trên 27 NTN

NTN được uống 02 viên nén chứa atorvastatin 10 mg thử hoặc chứng theo bảng ngẫu nhiên với 240 ml nước sau khi nhịn đói qua đêm Lấy mẫu từ tĩnh mạch cẳng tay NTN ở các thời điểm: ngay trước khi uống thuốc (thời điểm 0 giờ) và sau khi uống thuốc các khoảng thời gian: 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 6; 8; 10; 12; 16; 24; 36; 48 giờ (Tổng cộng 19 mẫu máu cho 1 giai đoạn) Mỗi lần lấy khoảng 5 ml máu Mẫu máu sau khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm chứa chất chống đông Na2-EDTA, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút x 10 phút ở nhiệt

độ 4°C, tách lấy phần huyết tương, thêm acid phosphoric 20% vào phần huyết tương với tỷ lệ 8 µl acid H3PO4 20% : 1 ml huyết tương trắng và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -70°C ± 10°C cho đến khi được phân tích

Sau khi kết thúc lấy mẫu:

- Tiến hành phân tích xác định nồng độ AT, o-AT, p-AT trong các mẫu huyết tương NTN theo phương pháp đã được xây dựng và thẩm định

- Từ kết quả xác định nồng độ AT, o-AT, p-AT trong các mẫu HT NTN, đánh giá sự phù hợp của phương pháp phân tích đã được xây dựng và thẩm định

- Xác định các thông số dược động học cơ bản của thuốc nghiên cứu trên NTN:

+ Cmax, Tmax: xác định trực tiếp từ dữ liệu thực nghiệm

+ AUC0-t: được tính theo nguyên tắc hình thang sử dụng công thức tính sau:

[𝐴𝑈𝐶]0𝑡 = (𝐶𝑖+ 𝐶𝑖+1) × (𝑡𝑖+1− 𝑡𝑖)

2

𝑛−1

𝑖=0

Trong đó:

Ci, Ci+1 là nồng độ AT, o-AT, p-AT trong huyết tương ở thời điểm ti và ti+1

n là thời điểm lấy mẫu cuối cùng mà nồng độ còn định lượng được + AUC0-∞ = AUC0-t + Cn/λZ

Với Cn là nồng độ AT, o-AT, p-AT tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng còn định lượng được và λzlà hệ số thải trừ

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng AT, o-AT, p-AT

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ định lượng AT

* Ion hóa AT và phổ khối MS

Phân tích phổ khối trên thiết bị LC-MS/MS với chế độ phân tích khối 1 lần, sử dụng kỹ thuật ghi toàn phổ tại tứ cực Q1 (full scan) và khảo sát trên nguồn ion hóa ESI ở chế độ điện tích dương và điện tích âm Với chế độ ESI (+) trên phổ đồ của dung dịch chuẩn AT 1 µg/ml, xuất hiện vạch phổ có cường độ lớn và ổn định với

tỷ số m/z = 559,59 (hình 3.1) Vạch phổ phù hợp với cấu trúc phân tử AT (CTPT:

C33H35FN2O5, KLPT: 558,6 g/mol) nhận một proton và mang điện tích +1 ([AT+H]+) Với chế độ ESI (-) trên phổ đồ của dung dịch chuẩn AT 1 µg/mL, xuất hiện vạch phổ có cường độ lớn và ổn định với tỷ số m/z = 557,4 Vạch phổ phù hợp với cấu trúc phân tử AT mất một proton và mang điện tích -1 ([AT-H]-) Tuy nhiên vạch phổ tỷ số m/z = 559,59 ở chế độ ESI (+) cho tín hiệu lớn hơn và ổn định hơn vạch phổ tỷ số m/z = 557,4 ở chế độ ESI (-) Do vậy chế độ ESI (+) và mảnh khối có m/z = 559,59 được lựa chọn để khảo sát các điều kiện khối phổ tiếp theo

Hình 3.1 Phổ khối MS dung dịch chuẩn AT với chế độ ESI (+)

Tiến hành tối ưu hóa điện thế của “thấu kính hội tụ”, để các ion [AT+H]+

hình thành ở nguồn ESI được “tập trung” và đi vào bộ phận phân tích khối với số lượng nhiều nhất trong một thời gian ngắn Giản đồ mối quan hệ giữa điện thế

“thấu kính hội tụ” và tỷ lệ tương đối số lượng ion có m/z = 559,59 đi vào bộ phận phân tích khối (hình 3.2) cho thấy ở mức điện thế 115 V các ion [AT+H]+ “hội tụ”

đi vào bộ phận phân tích khối là tối ưu nhất

Hình 3.2 Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có m/z = 559,59

 Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: điện thế, nhiệt độ đầu phun; lưu lượng khí nitơ cung cấp tại nguồn ESI theo các nội dung đã trình bày ở mục 2.3.1.1 Kết quả khảo sát cho thấy:

- Khi điện thế đầu phun tăng, cường độ vạch phổ có m/z = 559,59 tăng nhưng đồng thời nhiễu đường nền tăng và ngược lại Điều này, có thể do khi điện thế tăng có nhiều phần tử được tích điện hơn (bao gồm cả AT và tạp chất) làm cho dòng ion

mẹ đi vào bộ phận phân tích khối tăng lên đồng thời các ion khác đi vào bộ phận phân tích khối cũng tăng lên và ngược lại Khi điện thế tăng cao trên 4500 V thì

có hiện tượng phóng hồ quang điện ở đầu phun ảnh hưởng đến hoạt động của thiết

bị Khi điện thế dưới 2500 V, thì cường độ vạch phổ có m/z = 559,59 thấp, làm giảm độ nhạy của phương pháp

- Khi đặt nhiệt độ đầu phun tăng lên, cường độ tín hiệu tăng lên và ngược lại Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng cao trên 100oC hoặc hạ thấp dưới 50oC, cường độ tín hiệu thu được đều thấp và không ổn định

- Khi áp suất dòng khí thổi ở mức dưới 10 psi, có hiện tượng ngưng tụ hơi nước ở đầu phun nên cường độ tín hiệu thấp và không ổn định Khi tăng áp suất dòng khí hiện tượng ngưng tụ hơi nước giảm đi và cường độ tín hiệu tăng Tuy nhiên, khi

áp suất dòng trên 30 psi thì cường độ tín hiệu của dòng ion mẹ giảm xuống, có thể

do một phần ion mẹ bị thổi qua đường thải cùng với dung môi pha động làm giảm lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối

Từ kết quả thực nghiệm, các thông số của nguồn ESI (+) tối ưu cho phân tích

AT được xác định là: Điện thế đầu phun: 3200 V; nhiệt độ đầu phun: 80oC; áp suất khí mang, khí bổ trợ, khí quét ion lần lượt là 30 psi, 5 psi và 2 psi; nhiệt độ mao quản vận chuyển ion là 360oC

* Phân mảnh ion ban đầu và phổ khối MS/MS của AT

Sau khi phân mảnh ion mẹ, phân tích khối lần thứ 2 được thực hiện tại tứ cực Q3 với chế độ ghi toàn phổ MS/MS để xác định số khối của các ion con tạo thành

Hình 3.3 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [AT+H]+

Trên phổ đồ phân mảnh ion [AT+H]+ (hình 3.3) trong số các ion con tạo thành, ion

có tỷ số m/z = 440,2 có cường độ cao nhất, ổn định, lặp lại và đặc trưng cho quá trình phân mảnh AT Do vậy, cặp ion có m/z = 559,59 và 440,2 được lựa chọn cho các thực nghiệm tiếp theo Quá trình phân mảnh ion ban đầu có m/z = 559,59 tạo thành các ion con có m/z = 440,2 phụ thuộc vào mức năng lượng được cungcấp

Hình 3.4 Giản đồ năng lượng phân mảnh [AT+H]+

Hình 3.4 biểu diễn sự phụ thuộc giữa số lượng ion m/z = 440,2 tạo thành với mức năng lượng phân mảnh ion [AT+H]+ ban đầu Kết quả cho thấy mức năng lượng tối ưu để phân mảnh ion [AT+H]+ thành ion con có m/z = 440,2 là 21V

Từ kết quả thực nghiệm, xác định điều kiện khối phổ MS/MS phân tích AT như sau: Cặp ion đặc trưng cho phân tích AT có m/z lần lượt là 559,59 (ion mẹ)

và 440,2 (ion con) Điện thế hội tụ chùm ion mẹ là 115 V và năng lượng phân mảnh ion mẹ là 21V

3.1.1.2 Điều kiện khối phổ định lượng o-AT và p-AT

Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của o-AT và p-AT tương tự như AT thu được kết quả như sau: Cặp ion đặc trưng cho phân tích o-AT và p-AT có số m/z lần lượt là 575,24 (ion mẹ) và 440,2 (ion con) Điện thế hội tụ chùm ion mẹ là

115 V và năng lượng phân mảnh ion mẹ là 20V

Hình 3.5 Phổ khối MS dung dịch chuẩn p-AT