HỨA THỊ THU HUYỀN NGHIÊN cứu TINH CHẾ, THIẾT lập CHẤT CHUẨN NYSTOSE từ dược LIỆU rễ BA KÍCH LUẬN văn THẠC sĩ dược học

Tổng quan về chất chuẩn Chất chuẩn standard substances hay chất đối chiếu reference standards là chất đồng nhất đã được xác định là đúng và ổn định đối với một hay nhiều tính chất qui đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỨA THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN NYSTOSE TỪ DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỨA THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN NYSTOSE TỪ DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đoàn Cao Sơn

ThS NCS Phạm Văn Kiền

HÀ NỘI 2019

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

- PGS TS Đoàn Cao Sơn, Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo sau đại học,

bộ môn Hóa phân tích và các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình hoàn thiện luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến ThS Trần Thị Thu Trang, DS Bạch Thị Thắm

và các anh chị em, bạn bè đồng nghiệp tại Khoa Kiểm nghiệm Đông dược - Dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn - Chất chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

đã hết sức giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi tiến hành thực nghiệm trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, chia

sẻ và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua

Hà Nội, ngày 20 tháng 3 năm 2019

Học viên Hứa Thị Thu Huyền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về dược liệu Ba kích (Morinda officinalis How., Rubiaceae) 2

1.1.1 Tên khoa học 2

1.1.2 Mô tả cây 2

1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.2 Tổng quan về nystose 5

1.2.1 Đặc điểm và tính chất 5

1.2.2 Tác dụng dược lý 6

1.3 Phương pháp tinh chế các chất từ dược liệu và nhận dạng hợp chất sau khi tinh chế 6

1.3.1 Phương pháp tinh chế các chất từ dược liệu 6

1.3.2 Nhận dạng hợp chất sau khi tinh chế 7

1.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8

1.4.1 Nguyên tắc 8

1.4.2 Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký 8

1.4.3 Detector tán xạ bay hơi (ELSD) 9

1.5 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 10

1.5.1 Nguyên tắc 10

1.5.2 Ứng dụng 11

1.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 12

1.6.1 Nguyên tắc 12

1.6.2 Các đại lượng đặc trưng 12

1.6.3 Ứng dụng 13

1.7 Phương pháp sắc ký cột 13

1.7.1 Cột 13

1.7.2 Hóa chất dùng làm cột 13

1.7.3 Dung môi 13

1.7.4 Ứng dụng: 14

1.8 Tổng quan về chất chuẩn 14

1.9 Tình hình thiết lập chất chuẩn trên thế giới và tại Việt Nam 16

1.9.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn trên thế giới 16

1.9.2 Tình hình thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu Ba kích 16

1.10 Phương pháp thiết lập chất chuẩn 17

1.10.1 Thiết lập, bảo quản chất chuẩn theo hướng dẫn của WHO và ASEAN 17

1.10.2 Yêu cầu của nội dung quy trình phân tích theo quy định của Asean 18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương tiện nghiên cứu 20

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử 20

2.2.2 Trang thiết bị 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Lựa chọn phương pháp: 22

2.3.2 Kiểm tra phương pháp 24

2.3.3 Kiểm tra nguyên liệu nystose trước khi tinh chế 25

2.3.4 Quy trình tinh chế nystose 25

2.3.5 Xác định cấu trúc, nhận dạng nguyên liệu nystose sau khi tinh chế 27

2.3.6 Thiết lập chất chuẩn nystose 27

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 29

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Tinh chế nguyên liệu nystose 33

3.1.1 Kiểm tra sơ bộ nguyên liệu nystose trước khi tinh chế 33

3.1.2 Quy trình tinh chế nystose 33

3.1.4 Xác định cấu trúc, nhận dạng hợp chất sau tinh chế 38

3.1.4.1 Phổ NMR 38

3.1.4.2 Phổ MS 40

3.1.4.3 Đo phổ IR 41

3.1.4.4 Đo điểm chảy 42

3.2 Thẩm định lại phương pháp HPLC định tính, định lượng 42

3.2.1 Độ thích hợp hệ thống sắc ký 42

3.1.2 Tính đặc hiệu 43

3.1.3 Độ tuyến tính 44

3.1.4 Độ đúng 45

3.1.5 Độ lặp lại 46

3.1.6 Độ chính xác 47

3.1.7 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 48

3.6 Thiết lập chất chuẩn nystose 48

3.6.1 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu theo quy trình thiết lập chất chuẩn nystose 49

3.6.2 Đóng lọ chất chuẩn nystose 51

3.6.3 Đánh giá đồng nhất quá trình đóng gói 52

3.6.4 Đánh giá liên phòng 53

3.6.5 Xử lý kết quả phân tích theo phương pháp thống kê 55

3.7 Xác định hàm lượng nystose trong một số dược liệu Ba kích tại Việt Nam 56

3.7.1 Điều kiện sắc ký 56

3.7.2 Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn 57

3.7.3 Tiến hành 57

3.7.4 Kết quả đạt được 58

Chương 4 BÀN LUẬN 61

4.1 Về kết quả, phương pháp của đề tài 61

4.1.1 Về tinh chế nystose 61

4.1.2 Về xác minh cấu trúc nystose tinh chế được 61

4.1.3 Về thiết lập chất chuẩn, xây dựng TCCL 61

4.1.4 Về định tính, định lượng nystose trong dược liệu Ba kích bằng phương pháp HPLC với detector ELSD 62

4.2 Về ý nghĩa thực tiễn của đề tài 62

4.2.1 Về tính mới 62

4.2.2 Về hiệu quả kinh tế, xã hội 62

4.2.3 Về ý nghĩa thực tiễn 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

1 Kết luận 64

2 Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance - Phổ cộng hưởng carbon

1H-NMR : Hydrogen - 1 Nuclear Magnetic Resonance - Phổ cộng hưởng proton ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN

DĐVN : Dược điển Việt Nam

ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay hơi

EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn dược điển Châu Âu

FHH : Diễn đàn hòa hợp về thuốc thảo dược của các nước Tây Thái Bình

Dương

GC : Gas Chromatoghraphy - Sắc ký khí

GC-MS : Gas Chromatoghraphy - Mass spectrometry - Sắc ký khí khối phổ

HPLC : High Performance Liquid Chromatoghraphy-Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC : High Performance Thin Layer Chromatograhpy - Sắc ký lớp mỏng

hiệu năng cao ICRS : Chất chuẩn dược điển Quốc tế

KNV : Kiểm nghiệm viên

LC-MS : Liquid Chromatography - Mass spectrometry - Sắc ký lỏng khối phổ

MS : Mass spectrometry - Phổ khối

MP : Mobiphase – Pha động

NMR : Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân

TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng

TGA : Thermal Gravimetric Analysis - Phân tích nhiệt trọng lượng

USPRS : USP Reference Standards - Chất chuẩn dược điển Mỹ

UV-VIS : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến

VKNTTW : Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

VKNT

TP.HCM : Viên kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh

WHO : World health organization - Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Phân loại Ba kích ở Việt Nam Error! Bookmark not defined.

Bảng 1 2 Một số chất trong dược liệu Ba kích 3

Bảng 1 3 Một số chất chuẩn chiết từ dược liệu Ba kích 16

Bảng 2 1 Một số dược liệu Ba kích thu hái tại Việt Nam 20

Bảng 2 2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2 3 Danh mục thiết bị thực hiện đề tài 21

Bảng 2 4 Các chỉ tiêu kiểm tra phương pháp 24

Bảng 2 5 Hướng dẫn loại bỏ giá trị thô 29

Bảng 3 1 Độ thích hợp của hệ thống sắc ký 42

Bảng 3 2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính 44

Bảng 3 3 Kết quả khảo sát độ đúng 46

Bảng 3 4 Kết quả đánh giá độ lặp lại 46

Bảng 3 5 Kết quả xác định độ chính xác 47

Bảng 3 6 Kết quả xác định giới hạn phát hiện 48

Bảng 3 7 Kết quả định lượng nystose trong nguyên liệu trước tinh chế 33

Bảng 3 8 Kết quả mất khối lượng do làm khô 33

Bảng 3 9 Kết quả định lượng nystose sau tinh chế 38

Bảng 3 10 Phổ cộng hưởng từ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) 38

Bảng 3 11 Phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) 39

Bảng 3 12 Kết quả đo điểm chảy nguyên liệu nystose sau tinh chế 42

Bảng 3 13 Kết quả đo điểm chảy nguyên liệu nystose 49

Bảng 3 14 Kết quả mất khối lượng do làm khô 49

Bảng 3 15 Kết quả định lượng nguyên liệu nystose 50

Bảng 3 16 Kết quả tạp chất liên quan 50

Bảng 3 17 Kết quả thích hợp hệ thống sắc ký 52

Bảng 3 18 Đường hồi quy tuyến tính đánh giá độ đồng nhất 52

Bảng 3 19 Kết quả đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ 53

Bảng 3 20 Kết quả đánh giá liên phòng 54

Bảng 3 21 Kết quả đánh giá thành phẩm 54

Bảng 3 22 Bảng kết quả F-test 55

Bảng 3 23 Bảng kết quả T-test 55

Bảng 3 24.Tập hợp kết quả của các KNV 56

Bảng 3 25 Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống 58

Bảng 3 26 Khoảng tuyến tính định lượng nystose trong dược liệu 58

Bảng 3 27 Hàm lượng nystose trong dược liệu Ba kích 59

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Rễ và cây Ba kích 2

Hình 1 2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 8

Hình 1 3 Sơ đồ các giai đoạn thiết lập chất chuẩn 19

Hình 2 1 Sơ đồ chiết xuất nystose từ Ba kích 26

Hình 3.1 Sắc kí đồ HPLC của chất nystose sau tinh chế 34

Hình 3.2 Phổ [M-H]- của nystose 35

Hình 3.3 Phổ ESI-MS của hợp chất nystose 36

Hình 3.4 Sơ đồ tinh chế nystose bằng sắc ký cột 37

Hình 3.5 Phổ 1H NMR của hợp chất sau tinh chế 39

Hình 3.6 Phổ 13C NM , R của hợp chất sau tinh chế 40

Hình 3.7 Phổ ESI-MS của hợp chất sau tinh chế 40

Hình 3.8 Phổ IR của hợp chất sau tinh chế 41

Hình 3.9 Cấu trúc phân tử của hợp chất sau tinh chế - nystose 41

Hình 3 10 Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phương pháp 43

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa ln(cont) và ln(dientich) 45

Hình 3 12 Sắc ký đồ tạp chất liên quan 50

Hình 3 14 Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ba kích là một dược liệu quý, có giá trị sử dụng cao như làm tăng cường sinh lực, tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm, tăng cường khả năng sinh dục… từ lâu

đã được sử dụng rộng rãi trong dân gian theo phương thức truyền thống Theo danh mục

số đăng ký thuốc trong nước cấp SĐK từ năm 2010 đến hết tháng 4/2016, có 36 chế phẩm

có thành phần từ dược liệu Ba kích gồm: dạng viên hoàn cứng, thuốc nước, viên nang cứng, cao lỏng, hoàn mềm và dược liệu Ngoài ra, có rất nhiều thực phẩm chức năng chứa

Ba kích đang được cấp phép lưu hành trên thị trường [3]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về một số hợp chất hữu cơ trong rễ Ba kích như: monotropein có tác dụng chống viêm [24], oligosaccharid có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron [31], hay nhóm anthraquinon và polysaccharid có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương [39] Ở Việt Nam, cũng có nhiều đề tài nghiên cứu về Ba kích như: Ứng dụng phương pháp HPTLC để định lượng nystose trong rễ Ba kích [32]…

Hiện nay, chỉ có hai dược điển có chuyên luận Ba kích là dược điển Trung Quốc và dược điển Việt Nam Dược điển Trung Quốc có chỉ tiêu định lượng nystose bằng phương pháp HPLC sử dụng detector ELSD [30], còn dược điển Việt Nam V chưa có chỉ tiêu định lượng bất kì thành phần hóa học nào có trong Ba kích

Để đánh giá chất lượng dược liệu và các chế phẩm có chứa dược liệu rễ Ba kích, cần phải có một số chất chiết xuất từ dược liệu này với độ tinh khiết phù hợp làm chất chuẩn

để phân tích Hơn thế nữa, tại Việt Nam chưa có đơn vị nào cung cấp chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu này Do đó, để chủ động nguồn chất chuẩn để kiểm tra chất lượng và

chuẩn hóa dược liệu Ba kích, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tinh chế, thiết lập

chất chuẩn nystose từ dược liệu rễ Ba kích” với các mục tiêu:

1 Tinh chế nguyên liệu nystose đạt độ tinh khiết trên 95%

2 Thiết lập được 50 lọ (20mg/lọ) chất chuẩn nystose

3 Xác định được hàm lượng nystose trong một số dược liệu Ba kích tại Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về dược liệu Ba kích (Morinda officinalis How., Rubiaceae)

1.1.1 Tên khoa học

Tên khoa học: Morinda officinalis How., họ Cà phê (Rubiaceae)

Tên gọi khác: Ba kích thiên, dây ruột gà, chẩu phóng xì (Hải Ninh), thau tày cáy (Tày), chồi hoàng kim, sáy cày (Thái), chày kiang dòi (Dao), liên châu Ba kích, Medicinal indian mulberry (Anh) [4], [14]

Hình 1 1 Rễ và cây Ba kích

1.1.2 Mô tả cây

Ba kích là một loại cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng mét Thân non màu tím, có lông, sau nhẵn Cành non có cạnh Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài 6-14 cm, rộng 2,5-6 cm, cuống ngắn, lúc non có lông dày hơn ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân và mép lá, màu xanh lục, sau già lá ít lông hơn và có màu trắng mốc; lá kèm mỏng, ôm sát vào thân Hoa nhỏ, màu trắng sau hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu cành, dài 0,8-1,5cm; đài hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa hàn liền ở phía dưới thành ống ngắn, nhị 4, bầu hạ Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh Mùa hoa: tháng 5-6 Mùa quả: tháng 7-10 [5], [14]

Trong thiên nhiên và trồng trọt hiện nay còn có loài Ba kích mà hoa và quả tụ lại

(Morinda sp.) Cụm hoa dài 0,5 - 2 cm Lá đài kém phát triển Lá dày hơn loài trên, có

lông ngắn

Hiện nay Ba kích vẫn bị nhầm lẫn: do hình dáng với Ba kích lông (Morinda cochinchinensis Lour), cây mặt quỷ (Morinda villosa Hook), cây giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var lineare Cost) hoặc đôi khi do tên gọi Dây ruột gà còn dùng chỉ

Sam trắng - Bacopa monnieri (L.)Pennell (Herpestis monnieri (L.) Rothm.) Rau đắng biển, thyme- leaved gratiola (Anh), họ Hoa mõm chó Scrophulariaceae hoặc Mộc thông – Clematis chinensis Osbeck (C.minor L.) Họ Mao lương Ranunculaceae [6], [7], [14]

1.1.3 Phân bố, thu hái, chế biến

- Ở Việt Nam: Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang [14]

- Ba kích cũng mọc nhiều ở Trung Quốc: Quảng Đông, Quảng Tây

- Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay

- Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae officinalis)

- Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi không dính tay, đập nhẹ cho bẹp, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô [6], [14], [15]

Bảng 1.1 Một số chất trong dược liệu Ba kích

STT Tên khoa học Công thức phân tử Công thức cấu tạo

I Nhóm antharaquinon

1

1,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyanthraquinone C16H12O6

STT Tên khoa học Công thức phân tử Công thức cấu tạo

STT Tên khoa học Công thức phân tử Công thức cấu tạo

- Tên khoa học: 1,1-Kestotetraose

- Khối lượng phân tử: 666,58

- Thuộc nhóm Oligosaccharid: có 1 phân tử sucrose liên kết với 3 gốc frutosyl

- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị ngọt, dễ tan trong nước Nhiệt độ nóng chảy từ 134oC đến 135oC Độ tan, nhiệt độ đông đặc, nhiệt độ sôi, thông số quá trình kết tinh gần giống với sucrose

Do thành phần oligosaccharid không hấp thụ tia cực tím mạnh, nên máy dò UV thông thường không phù hợp để phân tích kiểm nghiệm Để phát hiện đa oligosaccharid cần khúc xạ kế vi sai, tán xạ ánh sáng bay hơi, ampe kế xung, điện tích khí dung, phép đo phổ khối và các phương pháp khác Ngoài ra, sử dụng phương pháp phát hiện huỳnh quang sau cột được tạo dẫn xuất

- Năm hợp chất có tác dụng chống trầm uất: acid succinic, nystose, 1-F-fructose- furanosylnystose, hexasaccarid kiểu inulin và heptasaccarid [5]

- Ngoài ra, nystose có tác dụng ngăn ngừa sự tiêu xương [34]

1.3 Phương pháp tinh chế các chất từ dược liệu và nhận dạng hợp chất sau khi tinh chế

1.3.1 Phương pháp tinh chế các chất từ dược liệu

Thông thường sau khi phân lập, độ tinh khiết của chất thường đạt 80% Trong quá trình tinh chế làm sạch nhằm tăng độ tinh khiết, loại tiếp các vết tạp hoặc phần chất phân lập kèm theo, chưa thể hoặc không thể loại hết trong điều kiện phân lập Các Phương pháp tinh chế được thực hiện [1]:

- Kết tinh trong các dung môi thích hợp: Với ưu điểm kỹ thuật tiến hành đơn giản,

dễ tiến hành đối với các chất có khả năng kết tinh Kỹ thuật này cũng là kỹ thuật cơ bản

và thường được áp dụng

- Tinh chế trên cột sắc ký: Sử dụng sắc ký lỏng điều chế hiệu năng cao, với các cột phân tách khác nhau như Octadecyl silica gel, rây phân tử (Sephadex, divinylpolystyrene), cột tách đồng phân quang học…

- Sắc ký điều chế/bán điều chế thường được sử dụng ở nước ngoài trong phân lập và tinh chế Khác với sắc ký phân tích, sắc ký điều chế được sử dụng để tách một lượng chất nhất định ra khỏi hỗn hợp Sự khác nhau cơ bản giữa hai kỹ thuật là hỗn hợp không được xác định hay phân tích hoàn toàn mà dung dịch chứa chất cần lấy được tách riêng và thu hồi lại để sử dụng về sau

1.3.2 Nhận dạng hợp chất sau khi tinh chế

Cấu trúc các chất sau khi tinh chế được xác định bằng sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao Một số phương pháp dùng:

- Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): Phổ cộng hưởng 1H-NMR và 13C-NMR thường được sử dụng để xác định cấu trúc của phân tử hợp chất hữu cơ hoàn toàn chưa biết Phổ cộng hưởng từ proton 1H-NMR và phổ cộng hưởng carbon 13C-NMR cho biết số nguyên

tử hydro và số nguyên tử carbon (carbon bậc 1, bậc 2, bậc 3 và bậc 4)… Từ các thông tin cộng hưởng từ, phân tích bằng nhiều kỹ thuật, kết hợp với các phương pháp mô phỏng (phần mềm), có thể xác định lại cấu trúc khung phân tử hữu cơ một cách chính xác [23]

- Phổ khối lượng (MS): Mỗi hợp chất hữu cơ có phân tử lượng xác định, khi dung năng lượng bẻ gẫy phân tử sẽ cho phổ khối là tập hợp nhiều mảnh có tỷ số khối m/z xác định đặc trưng cho các hợp chất hữu cơ Vì vậy, phổ khối là một trong những kỹ thuật phân tích cấu trúc và sử dụng để định tính mang tính khẳng định: có thể so sánh phổ khối của hợp chất hữu cơ với phổ chuẩn trong thư viện hoặc song song với 1 mẫu chuẩn Phổ khối phân giải cao (HR EI-MS) sử dụng kỹ thuật ion hóa gãy phân tử bằng va chạm điện

tử (Electron Impact) hoặc bằng phun điện tử (Electron Spray Ionisation ESI) kết hợp đo thời gian bay qua tứ cực Quadrupole/Time of Flight (Q/TOF) [23]

- Điểm chảy: Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng Thông thường, phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm chảy Điểm chảy là tiêu chuẩn kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng mẫu thử rất ít Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua 2 lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,5oC thì có thể xem là sản phẩm kết tinh tinh khiết Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo có thể kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu [1]

1.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.1 Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp chia tách trong đó pha động là một chất lỏng còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc là một chất lỏng phủ trên một chất mang dạng rắn hay một chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ [1],[2]

Hình 1 2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.2 Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký

* Thời gian lưu

- Thời gian lưu (tR): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định

* Độ phân giải R

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

18,1)(

2

'

'

2 / 1 2

/ 1

, , ,

,

k

k W

W

t t W

W

t t R

B B A

B

A R B R A

B

A R B R s

N





với: W là độ rộng đáy pic

Trong thực tế nếu các pic cân đối thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu là R=1,0 Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp

* Hệ số bất đối AF(assymetry factor)

a

2

20 / 1



trong đó:

W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20

a: khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic ở 1/20 chiều cao

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ Trong phép định lượng thì yêu cầu AF nằm trong khoảng 0,8 - 2

N

2 / 1

54 , 5 16

2 2

1.4.3 Detector tán xạ bay hơi (ELSD)

ELSD là một trong những detector được sử dụng với HPLC và được ưa thích hơn các phương pháp phát hiện khác để phân tích các chất như carbohydrate, đường tự nhiên

và phân tích polymer cũng như được sử dụng cho một loạt các ứng dụng khác

Nguyên lý hoạt động

ELSD phân tích dung môi sau khi rửa giải từ HPLC Khi chất rửa giải đi từ HPLC,

nó được trộn với khí mang trơ và được ép qua máy phun sương, tách chất lỏng thành các giọt khí dung Những giọt này sau đó đi vào một ống trôi nóng, nơi dung môi pha động bị

bay hơi, các giọt trở nên nhỏ dần cho đến khi tất cả những gì còn lại là các hạt phân tích khô Những hạt này được đẩy qua ống trôi bởi khí mang đến vùng phát hiện Trong vùng này, một chùm ánh sáng đi qua cột chất phân tích và sự tán xạ ánh sáng được đo bằng ống photodiode hoặc photomultiplier Đầu ra của máy dò là phi tuyến tính trên nhiều bậc độ lớn và hiệu chuẩn thích hợp là cần thiết để phân tích định lượng.

Áp suất khí và tốc độ dòng chảy, nồng độ mẫu và dung môi được sử dụng làm dung môi là các yếu tố chính ảnh hưởng đến kích thước hạt đạt được trong quá trình bay hơi Bằng cách tối ưu hóa các tham số này, có thể tạo ra các giọt có kích thước đồng nhất nhất có thể để cải thiện kết quả Độ tinh khiết của khí (thường là nitơ) được sử dụng cũng

là chìa khóa vì nó cần phải sạch (không dầu), khô và trơ, để tránh nhiễu đường nền và tối

ưu hóa phát hiện

Để đạt được độ nhạy tối đa, bán kính hạt thường phải đo trong vùng 4-10, một lần, tùy thuộc vào bước sóng được sử dụng detector Điều này đòi hỏi áp suất khí thấp (khoảng 2 bar) với độ tinh khiết và áp suất không đổi được duy trì trong suốt quá trình phân tích Nói chung, tốc độ dòng khí có liên quan trực tiếp đến độ bay hơi của dung môi

Phân tích chính

Một phân tích quan trọng sử dụng các điểm mạnh của ELSD là phân tích đường Một lợi thế mà ELSD cung cấp so với các kỹ thuật phát hiện khác như IR cho phân tích này là nó cho phép rửa giải gradient đường Rửa giải gradient sử dụng một loạt các dung môi có các cực khác nhau làm thay đổi thành phần hoặc tỷ lệ, để tối ưu hóa quá trình rửa giải các hợp chất

1.5 Phương pháp phân tích khối phổ (MS)

1.5.1 Nguyên tắc

Khối phổ được thực hiện dựa trên cơ sở xác định khối lượng (thường là trị số m/z)

và số lượng tương đối của các ion tạo ra từ phân tử bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh Nguyên tắc: Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10-6mmHg) Trong quá trình đó, chất hữu cơ bị ion hóa

và bị phá vỡ thành mảnh Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối

1.5.2 Ứng dụng

* Xác định đồng vị

Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau số neutron nên khối lượng nguyên tử khác nhau Có thể dùng MS để xác định thành phần đồng vị của các nguyên tố trong mẫu

* Định tính

- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)+, (M+2)+ Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác định được công thức nguyên của chất phân tích

- Trong phân tích dược thường sử dụng kết nối GC/MS hoặc LC/MS Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu

* Xác định công thức cấu tạo

Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion hóa thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR, phổ IR

* Định lượng

Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng phương pháp thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để xác định nồng độ

Trong phân tích thường dùng kết nối LC/MS, GC/MS hoặc CE/MS để có thể tăng cường tính chọn lọc và giới hạn định lượng cho phương pháp phân tích Nét nổi bật của phân tích khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy Giới hạn phát hiện có thể lên tới 10-14

gam Nên thường dùng kỹ thuật này để phân tích hàm lượng vết trong mẫu thành phần phức tạp

1.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

1.6.1 Nguyên tắc

Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi từ trường sẽ dẫn tới hấp thu năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối lượng nguyên tử là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín hiệu NMR Các hạt nhân có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là số chẵn thì không có momen

từ và không cho tín hiệu NMR Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó

1.6.2 Các đại lượng đặc trưng

) (





với: νmau: tần số cộng hưởng của proton của mẫu

νTMS: tần số cộng hưởng của proton của chất chuẩn nội tetramethylsilan

νmay: tần số của phổ kế

* Hằng số tương tác spin-spin (J):

Hằng số tương tác spin-spin (J) là khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng cho sự tương tác spin Trị số J phụ thuộc vào tương quan không gian và mật độ e ở vùng lân cận của 2 proton tương tác

* Diện tích dưới tín hiệu

Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó Đường cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu

Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố) [1], [2]

1.7.1 Cột

Cột là những ống thủy tinh hình trụ dài 30 - 70 cm, đường kính 1 - 5 cm, đầu dưới

có 1 vòi thủy tinh có khóa để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi

Các dung môi thường dùng trong sắc ký cột là: n-hexan, benzen, cloroform, aceton, ethanol, methanol, butanol, nước

Sau khi rửa giải, dụng cụ dùng để hứng là ống nghiệm (thường là 20 ml) Các ống nghiệm đều được đánh số từ 1 trở đi, và sắp xếp sẵn trong các giá theo thứ tự để khỏi nhầm lẫn trong quá trình tập hợp Các phân đoạn sau khi phân tích và tập hợp chung, tùy theo thể tích mỗi phân đoạn mà xử lý bằng cách cất thu hồi trong bình cầu ở áp suất giảm hoặc cho bốc hơi tự nhiên trên nồi cách thủy

1.7.4 Ứng dụng:

Ứng dụng chủ yếu của phương pháp sắc ký cột là tách các chất ra khỏi hỗn hợp Tùy thuộc bản chất của chất phân tích để lựa chọn cột tách và pha động rửa giải thích hợp với mục đích thu được chất phân tích có độ tinh khiết cao

1.8 Tổng quan về chất chuẩn

Chất chuẩn (standard substances) hay chất đối chiếu (reference standards) là chất đồng nhất đã được xác định là đúng và ổn định đối với một hay nhiều tính chất qui định, được thiết lập phù hợp với việc sử dụng dự kiến trong một quá trình đo (các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý, sinh học) Trong các phép thử đó, các tính chất của chất chuẩn đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử Chất chuẩn đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [1], [10], [28]

Trong những năm gần đây, danh mục thuốc mới được nghiên cứu, phát triển ngày càng nhiều từ nguồn tổng hợp hóa dược, hoặc các chất chiết từ sản phẩm tự nhiên (dược liệu) góp phần không nhỏ trong việc bảo vệ, chăm sóc và điều trị bệnh, đặc biệt một số bệnh hiểm nghèo như ung thư, tim mạnh, tiểu đường… Đồng nghĩa với danh mục dạng thuốc mới ngày càng nhiều là danh mục các hoạt chất mới cũng càng nhiều cả về hoạt chất hóa dược và các chất đặc trưng từ dược liệu (Có hơn 2.400 hoạt chất được chuẩn hóa thành chất chuẩn) [10] Do đó, việc tinh chế và chuẩn hóa các hoạt chất này để

có độ tinh khiết thích hợp thành chất chuẩn hóa học để đánh giá chất lượng nguyên liệu

- Chất chuẩn Châu Âu:

+ Cách sử dụng: Theo kết quả ghi trong Catalogue tính theo nguyên trạng

+ Mục đích sử dụng: Có 14 mục đích sử dụng khác nhau, phụ thuộc vào từng chuyên luận cụ thể trong Dược điển

- Chất chuẩn theo Dược điển Mỹ: Một số chất phải xác định lại độ ẩm trước khi sử dụng

- Chất chuẩn ASEAN : Cách sử dụng và mục đích sử dụng theo chứng chỉ phân tích

Để thiết lập được chất chuẩn, các trung tâm nêu trên thường tiến hành các bước sau:

- Các chất chuẩn hóa dược:

+ Xây dựng quy trình phân tích dựa theo phương pháp phân tích nêu trong Dược điển có độ chính xác và độ lặp lại cao, ổn định nhằm đánh giá đúng chất lượng nguyên liệu dự kiến thiết lập chất chuẩn và phù hợp với mục đích sử dụng

+ Lựa chọn nguyên liệu thiết lập chất chuẩn dựa theo nguyên tắc: Độ tinh khiết của nguyên liệu dự kiến thiết lập chất chuẩn phụ thuộc vào mục đích sử dụng Một chất chuẩn

dự kiến sử dụng cho phép thử định tính bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại hay phương pháp TLC không yêu cầu có độ tinh khiết quá cao, trong khi đó các nguyên liệu được sử dụng thiết lập chuẩn để dùng trong định lượng nên có độ tinh khiết ít nhất 99% hoặc cao hơn nữa

+ Để đáp ứng cho yêu cầu của một chất đối chiếu, điều cần xem xét quan trọng nhất

là ảnh hưởng của tạp chất đến phép đo trong khi định lượng

+ Việc phân tích chất lượng nguyên liệu, nhất là nguyên liệu dùng để thiết lập chất chuẩn thường phức tạp, tốn kém, đòi hỏi những trang thiết bị hiện đại, những hoá chất, chất chuẩn đặc biệt, người làm phân tích phải có trình độ và kinh nghiệm, do đó tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu phải luôn đề cập đến các chỉ tiêu nhằm chứng minh tính xác

thực về hoá học và độ tinh khiết của nó

+ Xác định chất lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn được tiến hành bởi chương trình đánh giá hợp tác giữa các phòng thí nghiệm độc lập dựa theo quy trình phân tích đã

được xây dựng

- Các chất chuẩn dược liệu

+ Xác định hoạt chất chính có tác dụng dược lý trong dược liệu

+ Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế hoạt chất chính trong dược

liệu

+ Sau đó tiến hành các bước thiết lập như chất chuẩn hóa dược

1.9 Tình hình thiết lập chất chuẩn trên thế giới và tại Việt Nam

1.9.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn trên thế giới

Trên thế giới việc nghiên cứu và phân phối chất chuẩn chủ yếu phát triển mạnh ở các nước có nền công nghiệp dược phẩm tiên tiến như Anh, Mỹ, Đức, Nhật Bản, Trung Quốc Các chất chuẩn được thiết lập bằng con đường tổng hợp hóa học hoặc điều chế từ nguồn nguyên liệu dược liệu Danh mục chất chuẩn chủ yếu là các chất chuẩn hóa học, chuẩn hợp chất tự nhiên còn hạn chế và thậm chí là chưa có Gần đây, do xu hướng và nhu cầu phát triển thuốc từ thiên nhiên, Trung Quốc đã nghiên cứu phát triển nguồn chất chuẩn thiên nhiên để cung cấp cho công tác nghiên cứu và kiểm nghiệm dược liệu

Các chất chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS), Dược điển Châu Âu (EPRS), Dược điển Quốc tế (ICRS) và chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm độc lập trên thế giới Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương –

Bộ Y tế là thành viên chính thức đánh giá, thiết lập chất chuẩn ASEAN

1.9.2 Tình hình thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu Ba kích

Hiện nay, trên thế giới đã có một số đơn vị đã thiết lập được chất chuẩn chiết được

từ dược liệu Ba kích Tuy nhiên, các chất chuẩn này được bán giá tương đối cao và thời gian vận chuyển về Việt Nam mất nhiều thời gian, gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm Tại Việt Nam, chưa có đơn vị nào thiết lập cũng như cung cấp những chất chuẩn này, do đó, cần phải chiết xuất, phân lập những chất đặc trưng từ dược liệu Ba kích để thiết lập chuẩn cung cấp cho hệ thống kiểm nghiệm trên toàn quốc là nhu cầu mang tính cấp bách trong tình hình quản lý chất lượng dược liệu và thuốc từ dược liệu hiện nay

Bảng 1.2 Một số chất chuẩn chiết từ dược liệu Ba kích

TT Tên hoạt chất Hàm lượng Nhà cung cấp Giá thành

TT Tên hoạt chất Hàm lượng Nhà cung cấp Giá thành

Primary RS Chromadex Lọ 5mg: 235 USD

3 Asperulosidic

acid

≥ 90,0% ELSD)

(LC/MS-Sigma - Aldrich

Lọ 1mg: 278 SGD

4 Asperulosid ≥ 95,0%

(LC/MS-ELSD)

Sigma - Aldrich

Lọ 1mg: 278 SGD

1.10 Phương pháp thiết lập chất chuẩn

1.10.1 Thiết lập, bảo quản chất chuẩn theo hướng dẫn của WHO và ASEAN

1.10.1.1 Lựa chọn nguyên liệu

Nguyên liệu làm chất chuẩn phải đồng nhất và ổn định Độ tinh khiết đối với chất chuẩn phụ thuộc vào loại nguyên liệu làm chất chuẩn Đối với hợp chất là hóa chất tổng hợp, yêu cầu độ tinh khiết không dưới 99,0% Đối với các hợp chất chiết từ dược liệu, yêu cầu độ tinh khiết không dưới 95,0%

1.10.1.2 Xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu

Các phương pháp hóa lý được sử dụng để đánh giá chất lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn phải phản ánh được đúng tính chất của chất đó, có độ chính xác và độ lặp lại

Các phương pháp phân tích được sử dụng để định tính là các phương pháp có khả năng chứng minh được các tính chất đặc trưng của mẫu là đúng như: đo phổ IR, HPLC,

đo điểm chảy… [28]

Các phương pháp xác định độ tinh khiết:

+ Sắc ký: Các phương pháp này dựa trên sự chia tách sắc ký, rất phù hợp cho việc phát hiện và xác định các tạp chất có trong nguyên liệu Trong đó, các phương pháp HPLC rất thuận lợi cho mục đích xác định tạp chất liên quan [1],[28]

+ Điểm chảy: Điểm chảy càng gọn càng gần với giá trị thực [1],[28]

Dù bất cứ phương pháp nào được sử dụng để đánh giá các nguyên liệu thiết lập chuẩn thì điều cơ bản nhất là hàm lượng của các tạp chất phải được xác định

Các phương pháp phân tích được sử dụng để định lượng: Phương pháp HPLC là phương pháp thường được dùng trong định lượng hoạt chất Hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử được tính toán dựa trên diện tích pic của mẫu thử (dung dịch thử), diện tích pic

mẫu chuẩn (dung dịch chuẩn) đã biết trước nồng độ trong cùng điều kiện phân tích [1],[28]

Đóng gói trong Glove-box kiểm soát được độ ẩm và nhiệt độ

Các bước trong quá trình đóng gói phải kiểm soát chặt chẽ tránh nhiễm chéo, tạp, sai nhãn…

Lượng chất chuẩn đóng trong một lọ phải đủ cho 1 lần kiểm tra và chỉ sử dụng một lần

1.10.1.4 Bảo quản

Điều kiện bảo quản ở nhiệt độ thông thường khoảng 2oC - 8oC với đồ bao gói ngăn được sự hấp phụ ẩm, tránh ánh sáng là phù hợp cho các chất đối chiếu hóa học Các lọ chất chuẩn không được mở cho đến khi cân bằng về nhiệt độ phòng thí nghiệm để ngăn quá trình hấp phụ ẩm

1.10.1.5 Hồ sơ chất chuẩn

Các thông tin kèm theo chất chuẩn:

- Thông tin trên nhãn: Tên chất chuẩn, phân loại chất chuẩn, khối lượng đóng (mg)/lọ, tên đơn vị thiết lập, số kiểm soát, điều kiện bảo quản

- Thông tin trên chứng chỉ phân tích: Tên chất chuẩn, phân loại chất chuẩn, mục đích sử dụng, số kiểm soát, mô tả, các kết quả phân tích, hướng dẫn sử dụng, điều kiện bảo quản, đơn vị thiết lập chuẩn, thời gian thiết lập, thời hạn kiểm tra định kỳ

- Các dữ liệu phân tích được ghi trong các chứng chỉ nên ngắn gọn, rõ ràng và cần thiết cho mục đích sử dụng trong phép thử định tính và định lượng

1.10.2 Yêu cầu của nội dung quy trình phân tích theo quy định của Asean

Để đảm bảo sự thống nhất, việc xây dựng quy trình phân tích phải đảm bảo các yêu cầu khoa học:

- Đưa ra phương pháp đánh giá phù hợp với mục đích sử dụng

- Phù hợp với các điều kiện thiết bị, dung môi hóa chất, chất đối chiếu của đơn vị

kiểm nghiệm

- Quy trình phải ổn định, đảm bảo độ tái lặp giữa các phòng thí nghiệm

- Quy trình phân tích phải đảm bảo đánh giá được đúng chất lượng của nguyên liệu

dự kiến thiết lập chất đối chiếu, thể hiện qua các tiêu chuẩn: Định tính, xác định độ

tinh khiết, nước/hàm ẩm và định lượng

Chuẩn bị chất chuẩn gốc và nguyên liệu cần thiết lập

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nystose được chiết xuất, phân lập từ dược liệu rễ Ba kích (Radix Morinda officnalis How.), là sản phẩm của đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morinda officinalis)" - đề

tài thuộc "Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020" do PGS TS Trần Việt Hùng làm chủ nhiệm đề tài

Một số dược liệu Ba kích thu hái tại Việt Nam: Đối tượng nghiên cứu bao gồm 5 mẫu dược liệu Ba kích được thu hái tại 5 địa điểm khác nhau được mã hóa như sau:

Bảng 2.1 Một số dược liệu Ba kích thu hái tại Việt Nam

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử

Hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu đề tài đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA) và loại tinh khiết dùng cho HPLC

Bảng 2 2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

6 Acid trichloacetic (TCA) Merck Tinh khiết phân tích

TT Tên dung môi, hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

Chất chuẩn: Nystose (C24H42O21); số kiểm soát BCBT3105; hàm lượng: 99,6% (HPLC); nơi sản xuất: Sigma – Aldrich

2.2.2 Trang thiết bị

Danh mục thiết bị nghiên cứu được trình bày tại bảng 2.3

Bảng 2 3 Danh mục thiết bị thực hiện đề tài

1 Buồng thổi khí sạch

2 Hệ thống máy Realtime PCR StepOnePlus

3 Máy li tâm lạnh Mikro-200R

4 Máy soi gel UV-VIS 312

5 Máy điện di gel Labnet

6 Tủ ấm CO2 T305-F

7 Nồi hấp Tomy

8 Máy Vortex Genie 2

9 Thiết bị chiết soklech

10 Phân lập và tinh chế: Sử dụng sắc ký cột thấm qua gel còn gọi là sắc ký rây

phân tử (Size exclusion chromatography SEC, GPC)

11 Bộ cô quay chân không Buchi, Thụy sĩ

12 Bộ hứng mẫu tự động

13 Sắc ký điều chế: Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) điều chế: SHIMADZU LC 10 AT VP, detector PDA và UV-VIS

14 Máy đo năng suất quay cực BELLINGHAM STANLAY P20 Polarimeter

15 Máy đo điểm nóng chảy BUCHI 535 Melting point

16 Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV – VIS HITACHI UV 3210; Hitachi U

3900

17 Máy quang phổ hồng ngoại: THERMO NICOLET NEXUS 670 FTIR;

18 Sắc ký lỏng khối phổ: THERMO – FINNIGAN LCQ ADVANTAGE MAX

19 Sắc ký khí khối phổ: AGILENT TECHNOLOGIES 6890

20 Máy đo phổ cộng hưởng từ nhân BRUKER AM500 FT-NMR Spectrometer (Tại Viện khoa học hàn lâm)

TT Tên thiết bị

+ Cột Ultra C18, 5µm; 4,6 x 250mm

22 Buồng đóng ống chuẩn: GLOVE BOX

23 Cân phân tích Mettler Toledo

24 Tủ sấy MEMMERT UL 40

25 Máy phân tích nhiệt trọng lực TGA/DSC 1 Mettler Toledo

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Lựa chọn phương pháp:

Định tính và định lượng nystose bằng phương pháp HPLC - ELSD dựa theo dược

điển Trung Quốc 2015, chuyên mục Morindae Officinalis Radix [30]

2.3.1.1 Định tính

Phương pháp HPLC - ELSD: Điều kiện sắc ký như phần định lượng

2.3.1.2 Định lượng

a, Điều kiện sắc ký

- Cột Phenomenex Germini RP18 (250 x 4,6mm; 5µm) hoặc cột tương đương

- Pha động: Methanol - Nước, tỉ lệ (3:97)

- Detector: ELSD, nhiệt độ 90oC, gain 6, áp suất 3,5bar

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/min

- Thể tích tiêm: 10 µl

b, Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1mg/ml trong pha động Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn lần lượt có nồng độ là: 0,1mg/ml; 0,2mg/ml; 0,4mg/ml; 0,6mg/ml; 0,8mg/ml

- Dung dịch thử: Pha dung dịch thử (nguyên liệu nystose) trong pha động có nồng độ khoảng 0,4mg/ml

* Với mẫu dược liệu:

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu (qua rây 250 µm) vào bình nón nút mài, thêm khoảng 40ml pha động Đun hồi lưu trong cách thủy 30 phút,

để nguội, chuyển sang bình định mức 50ml, tráng rửa bình nón, chuyển vào bình định mức, thêm pha động vừa đủ 50ml Lắc đều, lọc qua màng 0,45 µm được dung dịch

tiêm sắc ký

c, Tiến hành

- Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung

dịch chuẩn nystose có nồng độ khoảng 0,4 mg/ml, phép thử chỉ có giá trị khi: Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và logarit diện tích pic nystose trong 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không được lớn hơn 2,0 % Số đĩa lý thuyết tính theo pic nystose không ít hơn 2000

- Tiêm riêng biệt 10 l dung dịch dãy chuẩn và 10 l dung dịch thử vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, ghi thời gian lưu và diện tích của các pic nystose Xây dựng đường hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa logarit (ln) của nồng độ (mg/ml) và logarit (ln) của diện tích pic nystose chuẩn

- Hàm lượng (%) nystose (C24H42O41), tính theo dược liệu khô kiệt được tính theo công thức:

𝑋 (%) = 𝑒(ln 𝑆−𝑏)/𝑎× 50

𝑚 ×

100(100 − 𝐴) ×

1001000

- Hàm lượng (%) nguyên liệu nystose nguyên trạng (C24H42O41), được tính theo công thức:

𝑋 (%) = 𝑒(ln 𝑆−𝑏)/𝑎× 25

𝑚 ×

1001000

Trong đó:

- S: Diện tích pic nystose trên sắc ký đồ của dung dịch thử

- a,b: là hệ số góc và hệ số chắn trong phương trình hồi qui tuyến tính

(y = ax + b) của nystose thu được từ đường chuẩn

- m: Khối lượng cân mẫu thử (g)

- A: Độ ẩm của chế phẩm (%)

2.3.1.3 Mất khối lượng do làm khô

Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng

- Tổng tạp = Tổng hàm lượng từng tạp

Ghi chú: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử tạp, pic tạp được xác định bằng cách loại

bỏ những pic trùng với pic nystose và pic xuất hiện trên sắc ký đồ của mẫu trắng

2.3.2 Kiểm tra phương pháp

Kiểm tra phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên các chỉ tiêu sau:

Bảng 2 4 Các chỉ tiêu kiểm tra phương pháp

Độ thích hợp của

hệ thống

Hiệu lực phân tách của cột Số đĩa lý thuyết (N) ≥ 2.000

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và logarit diện tích pic nystose trong các lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn

Tiêm mẫu trắng vào hệ thống HPLC trong cùng điều kiện

Sắc ký đồ mẫu trắng không được có pic trùng thời gian lưu với pic nystose

Độ tuyến tính

Hệ số góc của đường hồi quy Kết quả thực nghiệm

Hệ số intercept (chắn) của đường

Độ lặp lại Xác định hàm lượng nystose có trong mẫu thử ≥ 95,0%

Chỉ tiêu Cách xác định/ đánh giá Giới hạn chấp nhận

2.3.3 Kiểm tra nguyên liệu nystose trước khi tinh chế

Định lượng: Phương pháp HPLC, detector ELSD

2.3.4 Quy trình tinh chế nystose

Tinh chế nystose sử dụng các phương pháp sắc ký cột cổ điển kết hợp với sắc ký lỏng điều chế và khối phổ MS để phát hiện sớm các phân đoạn có chứa nystose

2.3.4.1 Điều chế nystose

Theo nghiên cứu của đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có

tác dụng sinh học của rễ Ba kích Việt Nam (Radix Morinda officinalis) có quy trình

điều chế nystose như sau:

Phần củ cây ba kích được phơi khô và xay nhỏ được ngâm chiết với metanol (3 lần) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Phần bã sau khi ngâm chiết với methanol ở trên được đun hồi lưu với nước trong 3 giờ Dịch chiết nước được lọc qua cột diaion HP-20 rửa giải bằng hệ dung môi gradient methanol: nước (0→100% metanol) thu được 3 phân đoạn B1-B3 Phân đoạn B2 giải hấp bằng 25% methanol được lọc qua cột than hoạt tính, rửa bằng nước cất rồi giải hấp lần lượt bằng cồn 10% và 20% Dịch 20% cồn được gom lại, cất loại dung môi rồi chạy sắc ký cột sephadex LH20 giải hấp bằng nước-methanol 10:1 (v/v) thu được 4 phân đoạn Các phân đoạn được kiểm tra bằng

MS xác định phân đoạn có chứa Nystose là MO11.2 Phân đoạn MO11.2 được tinh chế trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi iso propanol-ethanol-nước 3:2:1 (v/v/v)

Dịch rửa giải được bổ sung thêm ethanol (1/5 thể tích) rồi để kết tinh qua đêm ở 4 oC

Lọc rửa kết tinh thu được hợp chất nystose, kiểm tra trên hệ thống sắc ký LC-MS

* Tinh chế trên cột sephadex LH20: tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi và thời gian rửa giải, nguyên liệu nystose thô được hòa tan trong cồn 20% chạy trên HPLC với điều kiện chạy như sau: Pha động sử dụng hệ dung môi: MeOH/H2O với gradient được thiết lập như sau:

+ Lượng mẫu bơm: 100 µL

+ Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút

+ Thời gian phân tích: 10 phút

Kết quả điều chế trên cột sephadex LH20 với gradient lần 2 thu được nystose đạt độ tinh khiết cao hơn Như vậy, chọn pha động sử dụng hệ dung môi: MeOH/H2O với gradient được thiết lập như sau:

* Tinh chế trên cột sắc ký silicagel, với hệ dung môi iso propanol-ethanol-nước 3:2:1 (v/v/v) Dịch rửa giải được bổ sung thêm ethanol (1/5 thể tích)

2.3.4.2 Đánh giá nguyên liệu nystose sau khi tinh chế

Chất sau khi tinh chế được gộp lại và trộn đều để đồng nhất nguyên liệu Tiến hành định lượng nystose bằng phương pháp HPLC - ELSD

2.3.5 Xác định cấu trúc, nhận dạng nguyên liệu nystose sau khi tinh chế

Sử dụng các phương pháp:

- Phổ NMR

- Đo điểm chảy

- Phổ MS

2.3.6 Thiết lập chất chuẩn nystose

- Xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn nystose, tham khảo:

+ ISO guide 35 - 2005;

+ ISO guide 13528;

+ ASEAN Guidelines for the establishment, handling, storage and use of Reference Substances - 2007;

+ WHO General guidelines for the establishment, maintenance and distribution

of chemical reference substances - 2006;

+ Dược điển Mỹ;

+ Dược điển Châu Âu;

+ Dược điển Anh;

+ Dược điển Việt Nam

- Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, kiểm tra chất lượng nguyên liệu theo quy tiêu chuẩn chất lượng đã xây dựng [13]

+ Định tính: HPLC - ELSD

+ Đo điểm chảy

+ Mất khối lượng do làm khô: Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng

+ Tạp chất liên quan: Phương pháp HPLC đã được kiểm tra sự phù hợp của phương pháp

+ Định lượng: Phương pháp HPLC đã được kiểm tra sự phù hợp của phương pháp, tiến hành song song với chất chuẩn

- Đóng lọ: Nguyên liệu sau khi đánh giá đạt yêu cầu về chất lượng được đóng lọ (20 mg/lọ) Sử dụng buồng đóng chuẩn (Glove - box) nhằm giám sát điều kiện đóng gói, chống nhiễm chéo để đảm bảo độ ổn định của chuẩn phòng thí nghiệm Dán nhãn có ghi tên hoạt chất và đánh số thứ tự cho từng lọ

- Đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng:

Số lọ n lấy kiểm tra độ đồng nhất chỉ tiêu hàm lượng của một lô sản xuất được tính theo công thức sau:

(với p là tổng số túi) Lấy mỗi túi x lọ theo thứ tự cách đều

Tiến hành xác định hàm lượng (tính theo nguyên trạng) của hoạt chất trong từng lọ, sử dụng phương pháp phân tích trong tiêu chuẩn đã xây dựng được, mỗi lọ mẫu thử cân 01 mẫu thử, mỗi mẫu thử đo 1 lần;

+ Lô sản xuất được coi là đồng nhất khi giá trị RSD của kết quả hàm lượng giữa các lọ được kiểm tra ≤ 1,0 %  điều kiện đóng gói ổn định, mẫu nguyên liệu đóng trong các lọ là đồng nhất

0,94 0,76 0,64 0,56 0,51

8

9

10

r 11 Loại bỏ xn nếu (xn - xn-1)/ (xn - x2) > r11 hoặc loại bỏ x1 nếu (x2 - x1)/ (xn-1 - x1) > r11

0,55 0,51 0,48

11

12

13

r 21 Loại bỏ xn nếu (xn - xn-2)/ (xn - x2) > r21 hoặc loại bỏ x1 nếu (x3 - x1)/ (xn-1 - x1) > r21

0,58 0,55 0,52

0,55 0,53 0,51 0,49 0,48 0,46 0,45

2.3.7.3 Đánh giá kết quả phân tích của 2 KNV

- Có 2 KNV tham gia đánh giá liên PTN: Áp dụng student t-test cho hai tập hợp mẫu có phương sai không bằng nhau (independence sample T-test hay T-test two sample assuming unequal variances trong phần mềm excel)

Biện luận: So sánh Ftn và Ftc hoặc Ttn với Ttc (xác suất 95%)

- Nếu Ftn < Ftc (p - 1; E - p): Phương pháp phân tích có độ lặp lại trong từng KNV và

có độ tái lặp giữa các KNV → Kết quả phân tích của các KNV giống nhau

- Nếu Ftn > Ftc ( p -1; E - p): Phương pháp phân tích có độ lặp lại trong từng KNV nhưng không có độ tái lặp giữa các KNV → Xem xét kết quả, có thể đề nghị KNV có giá trị độ lệch chuẩn (S) lớn tiến hành lại thực nghiệm

2.3.7.4 Tập hợp kết quả của 2 KNV, tính kết quả công bố trến chứng chỉ

n

i i

x n

% 100





X

S RSD





i i

x n

X

1

1

%100





X S RSD

2.3.7.5 Tính độ không đảm bảo đo mở rộng của kết quả công bố trên chứng chỉ

Kết quả công bố trên chứng chỉ phân tích là giá trị trung bình từ tập hợp các kết

quả phân tích với số phép thử n ≥ 10, do đó độ không đảm bảo đo của giá trị này được

tính theo loại A, với hệ số phủ k = 2 ở mức tin cậy 95%

2

x n

S

S

F  (quy ước: Đặt giá trị phương sai lớn ở tử số)

với các bậc tự do fA = nA-1; fB = nB -1

- Nếu Ftn ≤ F (0,05; fA; fB): Sự khác nhau giữa hai phương sai không có ý nghĩa

thống kê, hai phương pháp phân tích có độ lặp lại giống nhau;

- Nếu Ftn > F (0,05; fA; fB): Sự khác nhau giữa hai phương sai có ý nghĩa thống

kê, phương pháp phân tích có phương sai nhỏ có độ lặp lại tốt hơn

Bước 2: So sánh hai giá trị trung bình - test t:

* Trường hợp sự khác nhau giữa hai phương sai không có ý nghĩa thống kê:

Lập phương sai chung để tính ttn:

* Đánh giá kết quả: Tra bảng Student - Fischer ở xác suất ngẫu nhiên P = 95%

- Nếu ttn ≤ t 0,05;f : Hai trung bình cộng khác nhau không có ý nghĩa thống kê;

 n n 

S

X X t

B A chung

B A tn

1 1

X X t

B B A A

B A

2

2 2

2 2

n S

n S n S

B A

B B A

A

B B A A f

S n S n S

B A

B B A A

chung