VŨ THỊ TRANG NGHIÊN cứu TỔNG hợp dẫn CHẤT LAI hóa PACLITAXEL và DIHYDROARTEMISININ sử DỤNG cầu nối SUCCINYL PEG KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Chất mang polyme là một trong những cách tiếp cận phổ biến nhất hiện nay, nhiều tiền thuốc dựa trên polyme đã được tổng hợp để tăng khả năng hòa tan trong nước, tăng sinh khả dụng của th

SỬ DỤNG CẦU NỐI SUCCINYL-PEG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

SỬ DỤNG CẦU NỐI SUCCINYL-PEG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Nguyễn Văn Hải

Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghiệp Dược Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Hải và Ds

Lê Thiện Giáp, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền đạt, chỉ bảo

cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Đình Luyện và TS Nguyễn

Văn Giang đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên khích lệ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn

thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường cùng toàn thể các thầy

cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán

bộ thuộc phòng Hóa vô cơ, Hóa dược khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự Đại học quốc gia Hà Nội, các cán bộ Viện Thực phẩm chức năng, các cán bộ Phòng NMR Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

nhiên-Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, các anh chị, bạn bè, các em cùng nghiên cứu tại tổ Tổng hợp hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, đặc biệt cảm ơn sâu sắc tới bạn

Nguyễn Hương Quỳnh đã luôn ủng hộ, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quãng thời

gian vừa qua

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế nên khóa luận không tránh khỏi nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thị Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về paclitaxel và dihydroartemisinin 2

1.1.1 Tổng quan về PTX 2

1.1.2 Tổng quan về DHA 3

1.1.3 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng chống ung thư của PTX và DHA, ART 6

1.2 Các phản ứng kết hợp giữa PTX và DHA qua polyme 7

1.2.1 Polyethylen glycol (PEG) 7

1.2.2 Các polyme khác 11

1.2.3 Lựa chọn phương pháp tổng hợp 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Tổng hợp hóa học 16

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của chất tổng hợp được 16

2.3.3 Xác định cấu trúc của chất tổng hợp 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Kết quả thực nghiệm 18

3.1.1 Tổng hợp 2’,7-disuccinylpaclitaxel (1) 18

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất DHA-suc-PEG-OH (2) 21

3.1.3 Tổng hợp dẫn chất PTX-PEG-DHA (I) 24

3.2 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 25

3.2.1 Kết quả phân tích phổ của chất 1 25

3.2.2 Kết quả phân tích phổ của chất 2 28

3.2.3 Kết quả phân tích phổ của dẫn chất PTX-PEG-DHA 30

3.3 Bàn luận 32

3.3.1 Bàn luận về các phản ứng tổng hợp hóa học 32

3.3.2 Bàn luận về kết quả phân tích phổ 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear

Cmax Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương

HATU 1,3,3- tetramethyluronium hexaflourophosphat

HPMA N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamid

mL Mililit

MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

MultiarmPEG Nhiều cánh tay PEG

NHS N-hydroxysuccinimid

TPGS D--Tocopherol Polyethylen glycol Succinat

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng 19

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng 19

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol nguyên liệu đến phản ứng 20

Bảng 3.4 Ảnh hưởng bởi tác nhân đến hiệu suất phản ứng 22

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol artesunat và PEG đến hiệu suất phản ứng 22

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ khối lượng của chất 1 26

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của chất 1 26

Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của chất 1 27

Bảng 3.12 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của chất 2 28

Bảng 3.13 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của chất 2 29

Bảng 3.14 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của chất 2 29

Bảng 3.16 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của I 31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của artemisinin và dẫn xuất của nó 5

Hình 1.10 Cấu trúc của HPMA và liên hợp thuốc của nó 12

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp 2’,7-disuccinylpaclitaxel 18

Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất DHA-suc-PEG-OH 21

Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất PTX-PEG-DHA 24

Hình 3.7 Cơ chế phản ứng tạo 2 và I sử dụng DIC và DMAP 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là căn bệnh nguy hiểm đe dọa mạng sống, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Có nhiều con đường để tìm kiếm các thuốc điều trị ung thư mới nhưng hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên vẫn là một nguồn quan trọng Một trong những thuốc đầu tiên được tìm thấy phải kể đến là paclitaxel (PTX) Đó là một alkaloid tự nhiên có trong vỏ cây thông đỏ với một loạt tác dụng điều trị đáng kể chống lại ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư tuyến tụy và một vài loại ung thư khác [27] Hiện nay, các nhà nghiên cứu cũng quan tâm nhiều đến các thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc thiên nhiên dưới dạng dẫn xuất hoặc bán tổng hợp Nổi bật là dẫn xuất của artemisinin (phân lập từ cây Thanh cao hoa vàng) ngoài tác dụng điều trị sốt rét còn được chứng minh có khả năng chống tăng sinh và tiêu diệt tế bào ung thư điển hình là dihydroartemisinin (DHA) [23] Ngoài ra, hướng tổng hợp các hợp chất lai hóa cũng là cách tiếp cận mới đầy hứa hẹn nhằm thay đổi, phát triển các thuốc đã biết thành thuốc mới Các nghiên cứu cho thấy một hợp chất thuốc lai hóa (chứa nhiều thành phần hoạt tính) có thể làm tăng hiệu lực và trong một số trường hợp có thể tránh được sự kháng thuốc so với thuốc một thành phần [40]

Gần đây, một nghiên cứu phối hợp vật lý giữa PTX và DHA của Yi Chen và cộng

sự đã chứng minh DHA có tác dụng hiệp đồng tăng cường cùng PTX và sự phối hợp này làm tăng hiệu quả điều trị đồng thời giảm tác dụng phụ của PTX [8] Tuy nhiên, hoạt tính quan trọng của cả hai chất này bị hạn chế bởi độ hòa tan kém, độc tính cao và hiệu quả điều trị thấp Do đó, cần thiết phải phát triển hệ thống phân phối thuốc mới, nhằm mục tiêu khắc phục những hạn chế và cải thiện hiệu quả trong phương pháp điều trị ung thư Chất mang polyme là một trong những cách tiếp cận phổ biến nhất hiện nay, nhiều tiền thuốc dựa trên polyme đã được tổng hợp để tăng khả năng hòa tan trong nước, tăng sinh khả dụng của thuốc chống ung thư [11] và polyethylen glycol (PEG) là polyme được ứng dụng nhiều trong công nghệ dược phẩm với nhiều ưu điểm vượt trội Tuy nhiên, hiện nay, chưa có tài liệu nào công bố về việc lai hóa PTX và DHA sử dụng polyme bằng phương pháp hóa học

Dựa trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất lai hóa paclitaxel và dihydroartemisinin sử dụng cầu nối succinyl-PEG” với mục

tiêu sau: Tổng hợp được dẫn chất lai hóa paclitaxel và dihydroartemisinin sử dụng cầu nối succinyl-PEG ở quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về paclitaxel và dihydroartemisinin

1.1.1 Tổng quan về PTX

1.1.1.1 Tính chất lý hóa

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của paclitaxel

 Công thức phân tử: C47H51NO14

 Tên khoa học: 5,20-Epoxy-1,7-dihydroxy-9-oxotax-11-en-2,4,10,13-tetrayl

4,10-diacetat 2-benzoat 13-[(2R,3S)-3-(benzoylamino)-2-hydroxy-3-phenylpropa

noat] [6]

 Phân tử khối: 853,9 g/mol [29]

 Hình thức: Dạng tinh thể, màu trắng hoặc gần như trắng

 Độ tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, dicloromethan

và dễ tan trong methyl clorid [29]

 Góc quay cực: Dung dịch 10 mg/ml trong methanol có góc quay cực ở 20°C từ 49,0° đến -55,0° ở dạng khan [34]

-1.1.1.2 Tác dụng dược lý

 Dược động học

Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều được truyền vào tĩnh mạch và giảm theo đồ thị có 2 pha Tỷ lệ gắn với protein là 89% Ở giai đoạn ổn định thể tích phân bố là 5-6 lít/kg thể trọng (68-162 ml/m2) Thời gian bán thải là 6-13 giờ Sau khi truyền tĩnh mạch, có khoảng 2-13% lượng thuốc được thải qua nước tiểu dưới dạng ban đầu, như vậy ngoài thận còn có những con đường đào thải khác Trên động vật thí nghiệm, PTX được chuyển hóa tại gan Độ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/giờ/kg (hay 6,0 -15,6 lít/giờ/m2) [1]

 Cơ chế tác dụng

PTX ức chế sự tái cấu trúc bình thường của mạng ống vi thể rất quan trọng ở gian

kỳ của quá trình phân bào và cả với hoạt động của ty lạp thể PTX cũng gây tạo thành các cấu trúc bất thường trong các ống vi thể trong quá trình phân bào, kết quả là phá vỡ nhiễm sắc thể [1]

Dung môi để pha loãng thuốc có thể là: dung dịch Natri clorid 0,9%, dung dịch Glucose 5%, hỗn hợp dung dịch Natri clorid 0,9% và dung dịch Glucose 5% hoặc hỗn hợp dung dịch Glucose 5% và dung dịch Ringer Thuốc được pha vào một trong các dung dịch trên sao cho dịch truyền có nồng độ PTX là 0,3 -1,2 mg/mL [1]

 Chống chỉ định

Không dùng cho bệnh nhân quá mẫn với PTX hay với bất kì thành phần nào của chế phẩm, đặc biệt là quá mẫn với dầu cremophor EL

Không dùng cho người bệnh có số lượng bạch cầu trung tính < 1500 mm3 (1,5

109/lít) hoặc có biểu hiện rõ bệnh lý thần kinh vận động [1]

1.1.2 Tổng quan về DHA

1.1.2.1 Tính chất lý hóa

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của DHA

DHA là những tinh thể hình kim màu trắng, vị đắng, không mùi, rất ít tan trong nước

và trong dầu, tan tốt trong ethanol 96%, tan được trong các dung môi ether, cloroform Trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh, DHA bị thủy phân mạnh nhưng bền vững trong môi trường trung tính ngoài ra DHA cũng không bền với nhiệt [2]

Nhiệt độ nóng chảy: 145-150°C

 Tính chất hóa học

Cầu nối peroxid mang tính oxy hóa, có khả năng tạo gốc tự do khi tham gia phản ứng DHA dễ bị thủy phân mất hoạt tính do có nhóm chức lacton, tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và mức độ kiềm Nhóm –OH có thể tham gia phản ứng acyl hóa tạo dẫn chất dễ tan hơn [20]

1.1.2.2 Tác dụng dược lý

 Dược động học

Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm: DHA hấp thu qua đường uống, tỷ lệ liên kết với protein huyết tương là 50% Với liều uống là 20mg/kg kết quả cho thấy thời gian bán thải là 2,1 giờ và thải trừ hoàn toàn là 3,04 giờ DHA phân bố đến khắp các cơ quan, đặc biệt phân bố nhanh đến gan và tim DHA phân bố đến hồng cầu bị nhiễm

P.falciparum cao hơn so với hồng cầu bình thường DHA thải trừ nguyên dạng qua nước

tiểu (82,7%) và 1 phần qua phân Khi dùng DHA đồng thời với các thuốc khác có tỷ lệ liên kết với protein huyết tương cao nhận thấy độc tính không tăng lên

Nghiên cứu trên cơ thể người: DHA hấp thu qua đường uống với liều 1,1 mg và 2,2 mg/kg, nồng độ trong huyết tương cao nhất đạt được sau 1,33 giờ và t1/2 là 1,63-1,57 giờ [2]

 Tác dụng dược lý

Trước đây, DHA được biết đến là chất có tác dụng diệt ký sinh trùng sốt rét rất hiệu

quả đặc biệt là đối với ký sinh trùng P.falciparum khi dùng đơn độc hoặc dùng phối hợp

với một số thuốc như piperaquin có hiệu quả rất tốt DHA ít tan trong nước và sinh khả

dụng thấp khi dùng qua đường uống vì thuốc tan chậm và có thể bị phân hủy bởi dịch

dạ dày ruột Thời gian bán thải của DHA ngắn (34-90 phút) [39]

Trong những năm gần đây, DHA còn được biết đến với tác dụng diệt tế bào ung thư qua hai cơ chế Cơ chế thứ nhất là tạo ra các gốc tự do thông qua sự phân cắt đồng nhất của cầu endoperoxid yếu (R-O-O-R), cơ chế thứ hai thông qua sự phân chia dị hợp của cầu nối endoperoxid và nước, dẫn đến sự hình thành hydroperoxid hoặc gốc hydroxyl dựa trên phản ứng Fenton Hai cơ chế chống ung thư đều cho thấy tác dụng dược lý của DHA có liên quan và phụ thuộc vào nồng độ sắt trong cơ thể Các gốc tự do có thể oxy hóa lipid, gây tổn thương màng tế bào, protein và AND, gây ra sự tự chết của tế bào ung thư [35]

1.1.2.3 Triển vọng trong phát triển thuốc ung thư

DHA là một dẫn chất bán tổng hợp của artemisinin (ARN), một sesquiterpen lacton

có cầu nối peroxid nội đặc trưng, được phân lập từ cây Thanh cao hoa vàng (Artemisia annua L.) [20] Khử hóa artemisinin bằng NaBH4 trong methanol ở nhiệt độ thấp sẽ tạo

ra DHA mà rất ít ảnh hưởng đến nhóm peroxid DHA là hợp chất trung gian quan trọng

để tổng hợp ra nhiều dẫn xuất khác trong đó có artesunat (ART) [25]

ARN DHA ART

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của artemisinin và dẫn xuất của nó

ARN có hoạt tính cao và tác dụng nhanh với kí sinh trùng sốt rét [1] Tuy nhiên, việc

sử dụng ARN trong lâm sàng còn bộc lộ nhiều nhược điểm như khó tan trong cả nước

và dầu, độc với hệ thần kinh, dễ gây nhờn thuốc do thời gian bán hủy thấp Nhằm cải thiện độ hòa tan, các dẫn xuất của ARN đã được nghiên cứu bán tổng hợp [21] Artesunat được bán tổng hợp từ artemisinin qua giai đoạn trung gian là DHA Sau khi vào máu, ART bị chuyển thành dạng có hoạt tính là DHA rồi chuyển hóa tiếp thông qua enzym CYP3A4 và thải trừ qua nước tiểu Quá trình chuyển hóa và thải trừ diễn ra nhanh, do

đó hoạt tính của ART được xác định gián tiếp thông qua DHA

Gần đây, hoạt tính chống ung thư của artemisinin và dẫn xuất của nó đã được ghi

nhận qua thử nghiệm in vivo và in vitro Các nghiên cứu đã tập trung vào các dẫn xuất

có hoạt tính tốt nhất đó là DHA và ART Một nghiên cứu của Efferth thử nghiệm trên

55 dòng tế bào cho thấy ART hoạt động ức chế chống lại bệnh bạch cầu, khối u ác tính

và ung thư đại tràng, phổi, tuyến tiền liệt, vú, buồng trứng…[12] DHA cũng được chú

ý bởi tác dụng chống ung thư bạch cầu, ung thư xương và tế bào ung thư phổi [24] Ngoài ra, chúng còn phát huy tác dụng hiệp đồng khi phối hợp với các chất khác Sự kết hợp giữa DHA và caboplatin làm giảm đáng kể sự phát triển của ung thư buồng trứng so với chỉ dùng DHA [7] Sự kết hợp của DHA hoặc ART với gencitabin ức chế

sự phát triển của khối u cấy ghép HepG2 và Hep3B [19]

Do đó, dù sử dụng một mình hoặc kết hợp với các chất khác thì các hợp chất DHA hay ART đều là những chất đầy hứa hẹn cho hóa trị liệu ung thư trong tương lai

1.1.3 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng chống ung thư của PTX và DHA, ART

Năm 2014, Yi Chen và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng hiệp đồng của các dẫn xuất của artemisinin với paclitaxel cùng tác dụng tại đích kháng thể FOXM1 thông qua con đường truyền tin Raf/MEK/MAPK trong ung thư buồng trứng Mục đích của nghiên cứu này nhằm xác định dẫn xuất của artemisinin cụ thể là DHA có nâng cao được hiệu quả chống ung thư của PTX và cisplatinum trên các tế bào ung thư buồng trứng không Kết quả cho thấy, tác dụng của DHA gây độc tế bào với IC50 từ 1 M đến

2 M Nghiên cứu sự phối hợp thuốc đã chứng minh rằng DHA có tác dụng hiệp đồng tăng cường cùng với PTX (giá trị CI từ 0,6 đến 0,73) và có tác dụng hiệp đồng cộng cùng với cisplatinum (giá trị CI từ 0,98 đến 1,11) trên tế bào SKOV3 Ngoài ra liều thấp DHA (0,5M) làm tăng đáng kể tác dụng hiệp đồng tăng cường của sự kết hợp paclitaxel

và cisplatinum trên tế bào SKOV3 (giá trị CI từ 0,4 đến 0,83) [8]

Năm 2017, Trần Ngọc Bảo và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hiệp đồng và cải thiện hiệu quả điều trị ung thư vú của PTX và ART Hệ tiểu phân nano PTX-ART được bào chế bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương dầu/nước và tiến hành đánh giá trên ba tế bào MDAMB-231, MCF-7 và BT-474 với các tỉ lệ ART/PTX (kl/kl) thay đổi Tất cả các tỉ lệ kết hợp giữa ART và PTX đều có giá trị CI < 1, điều này chứng minh tác

dụng hiệp đồng khi phối hợp ART và PTX Ngoài ra, khi thử độc tính trên tế bào in vitro, hệ có tác dụng làm tăng độc tính trên cả 3 tế bào ung thư vú hơn so với mẫu nguyên

liệu [33]

1.2 Các phản ứng kết hợp giữa PTX và DHA qua polyme

Cơ chế hoạt động của thuốc chống ung thư hiện nay liên quan đến việc bắt giữ các

tế bào và nhanh chóng tiêu diệt tất cả các tế bào tăng sinh Sự tiêu diệt này bao gồm cả

tế bào không gây ung thư như tủy xương, hệ bạch huyết, hồng cầu và nang lông Vì thế, một trong những thách thức chính trong các phương pháp hóa trị hiện nay là thiếu chọn lọc trên các tế bào, gây độc tính trên cả tế bào khỏe mạnh Trên thực tế, trong hầu hết các trường hợp, chỉ một phần nhỏ thuốc sử dụng đến được vị trí khối u Để đạt được hiệu quả điều trị cần phải sử dụng liều cao và thường xuyên dẫn đến nhiều tác dụng không mong muốn Tuy nhiên, một khó khăn thường gặp khác là độ hòa tan trong nước kém, làm giảm sinh khả dụng Do đó, cần thiết phải phát triển hệ thống phân phối thuốc mới, nhắm mục tiêu để khắc phục những hạn chế và cải thiện hiệu quả trong phương pháp điều trị ung thư Chất mang polyme là một trong những cách tiếp cận phổ biến nhất Các tiền chất dựa trên polyme được tổng hợp để tăng khả năng hòa tan trong nước, tăng sinh khả dụng của thuốc chống ung thư Ngoài ra, phương pháp này khai thác tính chất đặc biệt của các khối u tạo điều kiện tích lũy trong nội mạc do đó cải thiện dược động học và tác dụng dược lý [11]

1.2.1 Polyethylen glycol (PEG)

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của PEG

Một trong những polyme được sử dụng phổ biến nhất trong tổng hợp là polyethylen glycol (PEG), đây là một hợp chất polyethe ứng dụng nhiều trong sản xuất công nghiệp

và y học PEG là một polyme trơ, hòa tan trong nước, không gây độc, không gây đáp ứng miễn dịch khi vào cơ thể, được tạo ra bằng cách kết nối nhiều tiểu đơn vị ethylen oxid PEG có thể dễ dàng liên kết cộng hóa trị với nhiều peptid, protein hoặc thuốc Ưu điểm của sự kết hợp PEG với thuốc là làm tăng độ hòa tan do đó làm tăng sinh khả dụng của thuốc [11] Tuy nhiên, PEG cũng có nhược điểm là hiệu quả mang thuốc kém do số lượng nhóm phản ứng còn hạn chế Mặc dù có những hạn chế này, PEG vẫn được sử dụng rộng rãi để cung cấp nhiều liệu pháp hóa học mới

1.2.1.1 Các phản ứng kết hợp giữa DHA (hoặc ART) với PEG

Dihydroartemisinin mặc dù đã được chứng minh có hoạt tính chống ung thư nhưng

nó vẫn tồn tại nhược điểm khả năng hòa tan kém dẫn đến sinh khả dụng thấp Năm 2014,

Lin Dai và cộng sự đã sử dụng PEG đa năng với nhiều nhóm chức (MultiarmPEG) và trọng lượng phân tử lớn (20kDa hoặc 40kDa) tổng hợp cùng với DHA, trong đó nhóm 10-hydroxyl của DHA liên kết với PEG- carboxylic thông qua tác nhân 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroclorid (EDC) và DMAP

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp MultiarmPEG-DHA

Kết quả cho thấy liên hợp này làm tăng đáng kể độ hòa tan của DHA, các xét nghiệm ghép ngoại lai trên khối u cho hiệu quả điều trị vượt trội của PEG-DHA so với tác dụng

ức chế phát triển khối u của DHA tự nhiên [9]

Cùng năm đó, Haijing Meng và cộng sự đã tổng hợp thành công liên kết ART-PEG thông qua quá trình este hóa ART và PEG, liên kết này dễ bị thủy phân bởi esterase, có nhiều trong tế bào chất Artesunat cũng có tiềm năng trong việc ức chế sự phát triển các

tế bào ung thư, nó gây độc với các tế bào ung thư hơn tế bào bình thường do nồng độ thuốc trong nội bào cao hơn hẳn nồng độ sắt tự do trong các tế bào ung thư Tuy nhiên, việc áp dụng ART bị hạn chế do thời gian lưu thông ngắn, tính thân nước kém, chuyển hóa nhanh và có nhiều tác dụng phụ Do đó các nhà nghiên cứu đã tìm ra cách thức phân phối thuốc để giảm độc tính của ART bằng cách liên hợp với PEG với khả năng hòa tan trong nước cao và thích ứng sinh học tốt Kết quả cho thấy liên kết làm giảm độc tính của ART thông qua việc giải phóng từ từ ART ra khỏi liên kết [30]

Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp ART-PEG

1.2.1.2 Các phản ứng kết hợp giữa PTX với PEG

PTX là một chất chống ung thư được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, tuy nhiên, nó cũng gặp phải nhiều hạn chế: độ hòa tan trong nước kém và cần liều tương đối cao hơn

để có hiệu lực so với các thuốc chống ung thư khác Để khắc phục những nhược điểm này, các phương pháp thay đổi công thức phân tử đã được phát triển bởi nhiều nhóm nghiên cứu từ khắp nơi trên thế giới:

- Một là tổng hợp các chất tương tự PTX bằng cách lai hóa với chất khác nhằm ngăn chặn các vị trí của PTX dùng trong trao đổi chất, khóa cấu trúc hoặc trực tiếp sửa đổi cấu trúc của nó

- Hai là đưa vào một tiền thuốc để có thể giải phóng nó sau khi đưa vào cơ thể Những tiền chất này bao gồm tiền chất phân tử nhỏ và tiền chất phân tử lớn Hầu hết các tiền chất phân tử nhỏ được thiết kế để cải thiện độ hòa tan trong nước của PTX Đối với tiền chất phân tử lớn, PTX được liên kết với polyme hoặc protein Chiến lược này làm tăng khả năng hướng đích của PTX bằng cách tăng tính thấm và hiệu ứng duy trì [31] PEG là một polyme phổ biến ứng dụng rộng rãi trong tổng hợp tiền thuốc của PTX với nhiều vai trò

 PEG là chất mang thuốc

Ban đầu, PEG là một polyme được sử dụng như một chất hỗ trợ hòa tan paclitaxel

Để có một tiền thuốc ổn định hơn, một loạt các liên hợp PEG-PTX đã được nghiên cứu tổng hợp Khi PTX liên hợp với PEG thông qua các miếng đệm acid amin, độ hòa tan được tăng cường đáng kể, tăng độc tính với tế bào và hoạt tính chống ung thư so với thuốc ban đầu [14]

Năm 1994-1996, Greenwald và cộng sự đã tiến hành tổng hợp PEG và PTX qua cầu nối methoxyacetat sử dụng DIC/DMAP Việc sử dụng PEG gắn với PTX không chỉ làm tăng độ hòa tan của taxol mà còn có khả năng kiểm soát giải phóng thuốc ở các thời điểm khác nhau [15,16]

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp PTX-PEG

 Copolyme PEG

Mặc dù PEG có tác dụng đối với các liên hợp PTX nhưng nó cũng có hạn chế do chỉ

có hai vị trí nạp thuốc ở mỗi đầu của polyme Điều này đã thúc đẩy sự hình thành và phát triển của copolyme PEG

Năm 2013, Gu và cộng sự đã sử dụng công nghệ nano để cung cấp paclitaxel Paclitaxel được liên kết với copolyme poly(ethylen glycol)-poly(acrylic acid) (PEG-PAA) thông qua liên kết acetal Tiền chất bị phân hủy phụ thuộc vào pH và do đó, paclitaxel có thể được giải phóng nhanh chóng Các hạt nano này cho thấy hoạt tính chống ung thư cao đối với các tế bào KB và HeLa (IC50 = 0,18 và 0,9 g PTX/mL tương ứng), cũng như với các tế bào A549 kháng PTX Hệ thống cho thấy hoạt động chống ung thư vượt trội đối với cả tế bào nhạy cảm và kháng thuốc với hàm lượng cao (42,8% paclitaxel) [17]

Hình 1.8 Hình minh họa về hệ thống nano PTX gắn với PEG-PAA qua cầu nối acetal

Bên cạnh khả năng mang thuốc thì copolyme có nhiều chức năng hơn PEG ban đầu

Năm 2011, Yu và cộng sự đã tổng hợp một liên hợp thuốc polylactide-g-paclitaxel – poly(ethylen glycol) Trong liên hợp này, paclitaxel được sử dụng như cầu nối giữa polymer phân hủy sinh học polylactide (PLA) và chuỗi ưa nước PEG Nghiên cứu thử

nghiệm in vitro cho thấy nhóm azid có thể bị thủy phân ở pH 5,5 nhanh hơn so với pH

7,4, trong khi liên kết este ổn định hơn ở pH 5,5, điều này chứng tỏ liên hợp có khả năng

giải phóng paclitaxel nhanh hơn trong các khối u [38]

 PEG liên kết các chất

Ngoài việc sử dụng PEG như một chất mang thuốc trực tiếp hay tạo copolyme, PEG cũng được sử dụng như một chất liên kết giữa PTX với chất mang Năm 2014, Bao và

cộng sự đã tổng hợp các tiền thuốc dựa trên D--Tocopherol Polyethylen glycol Succinat (TPGS) để thực hiện tác dụng hiệp đồng ức chế P-glycoprotein (P-gp)

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp các sản phẩm TPGS-PTX

Sự có mặt của P-gp có thể làm giảm nồng độ thuốc trong nội bào do đó hạn chế tác dụng gây độc tế bào của thuốc trên các khối u TPGS là một dẫn xuất của vitamin E và PEG 1000 Hệ thống phân phối thuốc dựa trên TPGS đã cho hiệu quả trong việc gây độc

tế bào ung thư cũng như kéo dài thời gian lưu thông và nâng cao hiệu quả điều trị Quan trọng hơn TPGS cho thấy khả năng khắc phục hiện tượng kháng thuốc trong việc ức chế P-gp Sản phẩm không chỉ cho hiệu quả hơn 91% so với paclitaxel mà còn làm tăng AUC và thời gian bán thải [5]

1.2.2 Các polyme khác

 N-(2-Hydroxypropyl) methacrylamide (HPMA)

HPMA cũng là một polyme phổ biến dùng tổng hợp tiền chất paclitaxel Giống như PEG, HPMA là một polyme hòa tan trong nước, không tương thích sinh học và không gây miễn dịch Etrych và cộng sự tổng hợp các liên hợp copolyme-paclitaxel của HPMA

được hình thành do phản ứng của chuỗi hydrazid với chuỗi carbonyl Thử nghiệm in vitro cho thấy liên hợp này có thể giải phóng paclitaxel ở pH 5 nhanh hơn so với pH 7

Hơn nữa, liên hợp này có tác dụng trên khối u tốt hơn so với paclitaxel đơn thuần trong ung thư biểu mô tuyến vú 4T1 [13]

Hình 1.10 Cấu trúc của HPMA và liên hợp thuốc của nó

 Hyaluronic acid (HA)

Liên hợp polyme sử dụng HA cũng được chú ý trong những năm gần đây bởi vì các

ưu điểm tương tự PEG hay HPMA Kumar và cộng sự đã tổng hợp DHA-HA thông qua

tác nhân EDC/DMAP và dung môi DMSO và kết quả thử độc tính in vitro cho thấy tác

dụng gây độc tế bào ung thư phổi của DHA-HA vượt trội so với DHA tự nhiên [22]

Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp liên hợp DHA-HA

HA cũng có tác dụng hiệp đồng với paclitaxel trong việc ức chế sự di căn ung thư phổi [37]

1.2.3 Lựa chọn phương pháp tổng hợp

Qua việc tìm hiểu các nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy được nhiều ưu điểm và triển vọng trong việc phối hợp hai thuốc PTX và DHA Các nghiên cứu này phối hợp dưới dạng vật lý và phân phối vào hệ nano hóa, tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn hạn chế

do nhược điểm của cả 2 hợp chất đều khó tan, gây trở ngại cho việc kết hợp trị liệu Vì thế chúng tôi đã hướng đến việc tổng hợp tạo tiền thuốc và sử dụng chất mang polyme làm liên kết Một trong các polyme phổ biến, PEG - chất lưỡng tính đại phân tử, được dùng làm tăng độ hòa tan của liên hợp các hợp chất kỵ nước tăng thời gian bán thải và tăng khả năng miễn dịch, dường như là yếu tố xuất sắc lựa chọn dựa vào rất nhiều các

nghiên cứu tạo tiền thuốc giữa PTX và PEG, giữa DHA và PEG Điều này đã nền tảng cho khóa luận của chúng tôi tiếp cận hướng nghiên cứu thiết kế, chọn PEG làm polyme liên kết thực hiện phản ứng tổng hợp dẫn chất gắn paclitaxel và dihydroartemisinin Khóa luận hy vọng sẽ tìm ra dẫn chất mới có tác dụng chống ung thư vượt trội so với hợp chất ban đầu

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị

Để thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ, thiết bị, dung môi

và hóa chất của Phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (xem Bảng 2.1 và Bảng 2.2) Ngoài ra, một số trang thiết

bị để xác định cấu trúc sẽ được đề cập riêng ở phần phương pháp nghiên cứu

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất

Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ, thiết bị

12 Máy cất quay chân không Buchi R210, R220 Thụy Sĩ

14 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV 500 MHz Mỹ

15 Máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR-670 Nhật

16 Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS Agilent 1290/6460 Mỹ

17 Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA Đức

- Tổng hợp liên hợp PEG và ART (2) [DHA-suc-PEG-OH]

- Tạo este từ chất 1 và 2 (I) [PTX-suc-PEG-suc-DHA]

2 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của chất tổng hợp được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

3 Xác định cấu trúc của chất tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ công hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

hơ trong buồng hơi iod

 Sử dụng các phương pháp cất, chiết lỏng – lỏng, kết tinh để tinh chế và thu sản phẩm

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của chất tổng hợp được

 Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với các điều kiện đã trình bày ở mục 2.3.1 Dựa vào đặc điểm hình thức của sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

 Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, thực hiện trên máy nhiệt độ nóng chảy Ez-Melt Dựa vào khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

2.3.3 Xác định cấu trúc của chất tổng hợp

Cấu trúc của chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon 13 (13C-NMR)

Phổ khối lượng (MS):

Được ghi trên máy đo phổ khối lượng tại Viện Thực Phẩm Chức Năng trên máy Bruker với chế độ đo ESI, tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Phổ hồng ngoại (IR):

Được ghi tại phòng Hóa Vô cơ, khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội (trên máy Shimadzu) và tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR):

Được ghi tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trên máy Bruker 500 MHz Ascend và trên máy Bruker Ascend TM 500 tại phòng thí nghiệm Hóa Dược – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia

Hà Nội, sử dụng dung môi DMSO

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả thực nghiệm

3.1.1 Tổng hợp 2’,7-disuccinylpaclitaxel (1)

Phản ứng thực hiện dựa trên tài liệu [10]: acyl hóa PTX với tác nhân anhydrid

succinic, tuy nhiên chúng tôi đã có sự thay đổi xúc tác của phản ứng: DMAP/DMF bằng

Khuấy hỗn hợp gồm 0,5 g (0,59 mmol) paclitaxel và anhydrid succinic trong 10 mL

pyridin trong bình cầu 1 cổ 50 mL, đun hồi lưu ở nhiệt độ khoảng từ 85-115ºC trong

thời gian từ 10-20 giờ Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi

cloroform : aceton = 6 : 4

 Xử lý phản ứng

Sau phản ứng, thêm vào hỗn hợp 70 mL dicloromethan (DCM), 10mL nước cất đã

làm lạnh, acid hóa pha nước về pH 1 bằng acid HCl 1 M Lắc bình chiết, tách thu pha

hữu cơ Rửa pha hữu cơ lại với nước lạnh (10 mL x 3 lần) đến pH trung tính, làm khan

bằng natri sulfat khan, lọc loại bỏ chất làm khan và cất quay loại bỏ dung môi DCM ở

40°C Tinh chế sản phẩm bằng cách kết tinh lại trong n-hexan nóng Sấy tủa ở nhiệt độ

60°C trong 3 giờ và cân thu sản phẩm

 Theo quy trình trên, chúng tôi thực hiện khảo sát phản ứng dựa trên các điều kiện

Kết quả được đánh giá và lựa chọn dựa trên mức độ tinh khiết của sản phẩm qua SKLM

và hiệu suất thu được của phản ứng

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng:

 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng

Tiến hành thực hiện phản ứng theo quy trình chung ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau trong thời gian là 16h, tỉ lệ mol PTX : anhydrid succinic là 1 : 40 Kết quả được thể hiện qua Bảng 3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng

STT Nhiệt độ (±2°C) Hiệu suất (%)

Nhận xét: Nhiệt độ càng cao, hiệu suất phản ứng càng tăng Tại nhiệt độ 115°C cho

hiệu suất cao nhất, đồng thời quan sát không thấy vết phụ trên SKLM nên chúng tôi lựa chọn thực hiện phản ứng ở 115°C

 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Tiến hành phản ứng theo quy trình chung ở các khoảng thời gian khác nhau ở 115°C, tỉ

lệ mol nguyên liệu là 1 : 40 Kết quả được thể hiện qua Bảng 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng

STT Thời gian (giờ) Hiệu suất (%)

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy khi tăng thời gian thì hiệu suất phản ứng tăng

lên, nhưng khi thời gian càng tăng phản ứng sinh ra nhiều tạp, sản phẩm thu được không tinh khiết, gây khó khăn cho quá trình tinh chế sản phẩm Ở khoảng thời gian 16-20 giờ, hiệu suất tăng không đáng kể, đồng thời ở 20 giờ, sản phẩm có màu hơi vàng, không trắng như ban đầu nữa Vì vậy chúng tôi lựa chọn thời gian phản ứng là 16 giờ là tối ưu

để đạt hiệu suất cao và đảm bảo chất lượng sản phẩm

 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol PTX : anhydrid succinic

Khảo sát tỉ lệ mol nguyên liệu tham gia phản ứng PTX : anhydrid succinic trong điều kiện nhiệt độ 115°C, thời gian là 16 giờ

Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.3

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol nguyên liệu đến phản ứng

STT Tỉ lệ mol Theo dõi sắc ký lớp mỏng Hiệu suất (%)

Nhận xét: Kết quả theo dõi trên sắc ký lớp mỏng sau khi hơ trên đèn cồn cho thấy tại

tỉ lệ PTX : anhydrid succinic thấp thì hiệu suất thấp Ở tỉ lệ 1 : 40 thì nguyên liệu gần như đã hết và sản phẩm tạo thành có vết đậm và không bị tách vết còn ở tỉ lệ 1 : 60 thì hiệu suất tăng không đáng kể đồng thời bắt đầu xuất hiện tạp trên SKLM nên chúng tôi chọn tỉ lệ tối ưu là 1 : 40 để thực hiện phản ứng

 Như vậy, qua việc tiến hành khảo sát các yếu tố, chúng tôi đã tìm ra được điều kiện tối ưu cho phản ứng để đạt được hiệu suất tốt nhất như sau: tỉ lệ mol PTX : anhydrid succinic là 1 : 40, nhiệt độ phản ứng là 115°C trong thời gian là 16 giờ

Kết quả:

 Cảm quan sản phẩm: Bột kết tinh màu trắng, không mùi

 Khối lượng: 0,53 g

 Hiệu suất: 85,9 % (theo tài liệu [9] là 68%)

 Sắc ký lớp mỏng Rf = 0,38 (hệ dung môi cloroform : aceton = 4 : 6); 0,2 (hệ dung môi cloroform : aceton = 6 : 4)

 Nhiệt độ nóng chảy: 154,0-155,0°C

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất DHA-suc-PEG-OH (2)

Theo tài liệu [30], tác giả đã thực hiện tổng hợp dẫn chất này với các yếu tố tham gia phản ứng cụ thể là: nguyên liệu ART, PEG 750, tác nhân là 1,3,3- tetramethyluronium hexaflourophosphat (HATU) và dung môi là DCM

Tuy nhiên, trong thực nghiệm, chúng tôi đã có sự thay đổi các yếu tố trên: nguyên liệu PEG 400, tác nhân là carbodiimid và dung môi CHCl3

 Xử lý phản ứng:

Sau phản ứng, chiết dung dịch với nước nhiều lần, thêm 0,1 mL HCl 1M vào hỗn hợp phản ứng đến pH = 5-6, chiết lấy pha hữu cơ (3 lần) Rửa lại pha hữu cơ với nước (20 mL x 3 lần), NaHCO3 (5 mL x 3 lần) đến pH = 8-9, H2O (20 mL x 3 lần) đến pH trung tính Làm khan dịch chiết hữu cơ bằng natri sulfat khan, lọc loại bỏ chất làm khan

và cất quay loại dung môi CHCl3 thu được sản phẩm

 Theo quy trình trên, chúng tôi thực hiện khảo sát phản ứng dựa trên các điều kiện sau:

- Tác nhân phản ứng

- Tỉ lệ mol ART : PEG

- Lượng dung môi tham gia phản ứng

Kết quả được đánh giá và lựa chọn dựa trên mức độ tinh khiết của sản phẩm qua sắc

ký lớp mỏng (SKLM) và hiệu suất thu được của phản ứng

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng:

 Ảnh hưởng bởi tác nhân phản ứng

Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng 2 tác nhân là N,N’-dicyclohexylcarbodiimid (DCC) và N,N’ diisopropyl carbodiimid (DIC) tới hiệu suất của phản ứng với lượng dung môi là 300 mL CHCl3,tỉ lệ mol ART : PEG là 1 : 5,0

Kết quả được thể hiện qua Bảng 3.4

Bảng 3.4 Ảnh hưởng bởi tác nhân đến hiệu suất phản ứng

Nhận xét: Theo Bảng 3.4 nhận thấy sử dụng tác nhân là DIC có hiệu suất cao hơn

Trong quá trình thực hiện phản ứng với DCC có sinh ra một sản phẩm phụ là dicyclohexylurea (DCU), sản phẩm này tan kém trong CHCl3 làm cho quá trình tinh chế gặp khó khăn hơn và không đầy đủ [30] và làm giảm hiệu suất của phản ứng nên chúng tôi chọn DIC làm tác nhân cho phản ứng este hóa này

 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol artesunat và PEG

Chúng tôi tiến hành khảo sát tỉ lệ mol nguyên liệu tham gia phản ứng trong điều kiện sử dụng tác nhân DIC, lượng dung môi là 300 mL

Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.5

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ mol artesunat và PEG đến hiệu suất phản ứng

1 1 : 1,0 Vết sản phẩm nhạt hơn, vết nguyên liệu

Nhận xét: Chúng tôi thấy rằng khi tỉ lệ mol ART : PEG tăng lên thì vết sản phẩm

trên sắc ký cũng đậm lên, đồng thời thực nghiệm cho thấy hiệu suất cũng tăng lên tuy nhiên khi tỉ lệ tăng trên 1 : 5,0 thì SKLM xuất hiện tạp, nhiều vết hơn, hiệu suất tăng không đáng kể Vì vậy chúng tôi lựa chọn tỉ lệ tối ưu cho ART : PEG là 1 : 5,0

 Ảnh hưởng của lượng dung môi tham gia phản ứng

Chúng tôi lựa chọn dung môi phản ứng là CHCl3 và thực hiện khảo sát với tác nhân DIC và tỉ lệ mol nguyên liệu là 1 : 5,0 lượng dung môi là 300 mL Kết quả khảo sát thể hiện ở Bảng 3.6

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dung môi đến phản ứng

STT Lượng dung môi (mL) Hiệu suất (%)

Nhận xét: Kết quả bảng trên cùng thực nghiệm cho thấy khi thực hiện phản ứng với

lượng dung môi ít thì phản ứng có hiệu suất thấp Khi tăng lượng dung môi lên 500 mL thì hiệu suất thay đổi không đáng kể tuy nhiên do dung môi độc hại và dùng sẽ tốn kém, khó khăn cho quá trình tinh chế nên chúng tôi quyết định chọn lượng dung môi phản ứng là 300 mL

 Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, chúng tôi chọn được điều kiện tối ưu thực hiện phản ứng cho hiệu suất cao với 300 mL dung môi CHCl3, tác nhân là DIC, tỉ lệ mol artesunat : PEG là 1 : 5,0

3.1.3 Tổng hợp dẫn chất PTX-PEG-DHA (I)

Sơ đồ phản ứng:

Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất PTX-PEG-DHA

Cách tiến hành:

Trong bình cầu 500 mL, hòa tan 1,3 g (1,2 mmol) 2’,7-disuccinylpaclitaxel (1) trong

hỗn hợp gồm 0,5 mL pyridin, 0,30 g (2,5 mmol) DMAP và 200 mL CHCl3 Thêm 0,38

g (3,0 mmol) DIC vào Dung dịch được khuấy ở 0°C trong 30 phút tránh ánh sáng Đưa dung dịch về nhiệt độ phòng rồi đổ khối phản ứng vào bình cầu 2 cổ chứa 2,0 g (2,5

mmol) ART-PEG (2) trong 100 mL CHCl3 Khuấy hỗn hợp trong 72 giờ

Sau phản ứng, chiết dung dịch với nước lạnh (20 mL x 3 lần), thêm acid HCl 1M vào hỗn hợp đến pH = 5-6 (0,5 mL x 3 lần), chiết lấy pha hữu cơ Rửa pha hữu cơ lại với nước (20 mL x 3 lần), NaHCO3 (10 mL x 3 lần) đến pH 8-9, H2O (20 mLx 3 lần) đến pH trung tính Làm khan dịch chiết hữu cơ bằng Na2SO4 khan, lọc, cất quay loại

dung môi thu sản phẩm Tinh chế sản phẩm trong n-pentan

3.2 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

Để khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được, tiến hành phân tích dữ liệu phổi khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR)

3.2.1 Kết quả phân tích phổ của chất 1

Hình 3.4 Công thức cấu tạo của chất 1

3.2.1.1 Phổ khối lượng (MS)

Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) của chất 1 được trình bày ở Bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ khối lượng của chất 1

C55H59NO20 1054,06

[M+H]+

1054,37 (100%) 1055,36 (59%)

[M+H]+

[M-H]1052,35 (100%) 1053,36 (59,5%)

[M-H]- 1052,4 1053,2

2

Nhận xét: Kết quả phân tích phổ khối lượng cho thấy chất tổng hợp được có pic ion

phân tử phù hợp với khối lượng phân tử dự kiến

3.2.1.2 Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ IR của chất 1 được trình bày trong phụ lục 3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại

được trình bày trong Bảng 3.8 như sau:

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của chất 1

Nhận xét: Phổ hồng ngoại của chất 1 chứa các dải hấp thụ phù hợp với dao động hóa

trị của các liên kết đặc trưng trong CTCT dự kiến của chất này

3.2.1.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của chất 1 được trình bày trong bảng

sau:

Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của chất 1

Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phụ lục

Chú thích: Độ dịch chuyển hóa học (δ) được lấy theo giá trị trung bình (ppm); s: singlet; d:

doublet; dd: doublet doublet; m: multiplet; t: triplet; brs: broad

Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 được tóm tắt như sau:

Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của chất 1

Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C Phụ lục

Chú thích: δ: độ dịch chuyển hóa học (ppm)

Nhận xét: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất 1 có các tín hiệu phù hợp với các

proton và các nguyên tử carbon có mặt trong CTCT dự kiến của chất này

3.2.2 Kết quả phân tích phổ của chất 2

Hình 3.5 Công thức cấu tạo của chất 2

3.2.2.1 Phổ khối lượng (MS)

CTPT chung: ART-O(CH2CH2O)nCH2CH2OH với n = 7-9

Bảng 3.11 Kết quả phân tích phổ khối lượng chất 2

Giá trị n CTPT KLPT(đvC) m/z lý thuyết m/z thực tế Phụ lục

7 C35H60O16 736,39

[M+Na]+ : 759,38 (100%) 760,38 (38%)

[M+Na]+ : 759,13 760,12

6

8 C37H64O17 780,41

[M+Na]+ : 803,40 (100%) 804,41 (40%)

[M+Na]+ : 803,15 804,28

9 C39H68O18 824,44

[M+Na]+ : 847,43 (100%) 848,43 (42%)

[M+Na]+ : 847,06 848,17

3.2.2.2 Phổ hồng ngoại (IR)

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của chất 2 được trình bày ở bảng 3.12

Bảng 3.12 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của chất 2

Nhận xét: Phổ hồng ngoại của chất 2 chứa các dải hấp thụ phù hợp với các dao động

của các liên kết đặc trưng trong CTCT dự kiến

3.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Kết quả phổ 1H-NMR của chất 2 đo trong dung môi DMSO được ghi lại ở bảng 3.13

Bảng 3.13 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của chất 2

Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phụ lục

Chú thích: Độ dịch chuyển hóa học (δ) được lấy theo giá trị trung bình (ppm); s: singlet; d:

doublet; dd: doublet doublet; m: multiplet; t: triplet; brs: broad

Kết quả đo phổ 13C-NMR của chất 2 được trình bày trong bảng 3.14 như sau:

Bảng 3.14 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của chất 2

Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C Phụ lục

Chú thích: δ: độ dịch chuyển hóa học (ppm)

Nhận xét: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất 2 có các tín hiệu phù hợp với các

proton và các nguyên tử carbon có mặt trong CTCT dự kiến của chất này

3.2.3 Kết quả phân tích phổ của dẫn chất PTX-PEG-DHA

Hoặc

3.2.3.1 Phổ khối lượng (MS)

CTPT chung là DHA-suc-O(CH2CH2O)nCH2CH2O-suc-PTX (I) gồm 2 sản phẩm 3,4 Kết quả phân tích phổ khối lượng sản phẩm 3 và 4 thể hiện trong phụ lục 10 và trình

bày trong bảng 3.15 như sau:

Bảng 3.15 Kết quả phân tích phổ khối lượng của I

Với n = 8:

1816,95

[M+H]+ 1816,78 (100%), 1817,77 (99%)

[M+H]+

Nhận xét: Trên phổ khối lượng xuất hiện pic ion phân tử có giá trị m/z phù hợp với

khối lượng phân tử của chất dự kiến

3.2.3.2 Phổ hồng ngoại (IR)

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại IR của sản phẩm cuối I được trình bày ở bảng 3.16

Bảng 3.16 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của I

Nhận xét: Trên phổ IR xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho các liên kết xuất

hiện trong hợp chất tổng hợp được

Chú thích: Độ dịch chuyển hóa học (δ) được lấy theo giá trị trung bình (ppm); s: singlet; d:

doublet; dd: doublet doublet; m: multiplet; t: triplet; brs: broad