PHÙNG THỊ HOA NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT CAO đặc GIÀU FLAVONOID từ vỏ hạt đậu XANH KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh .... DANH MỤC CÁC BẢNG 1.1 Cấu trúc hóa học của một số flavonoid trong vỏ hạ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

NGUYỄN THU HẰNG (Trưởng bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội),

với tôi cô không chỉ là người thầy, người luôn giành thời gian, tâm huyết để tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên và khích lệ tôi trong suốt khoảng thời gian tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp này mà cô còn là người truyền cảm hứng cho tôi trong suốt quá trình làm việc tại bộ môn

Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến:

NCS.ThS Nguyễn Đình Dũng người đã luôn ở bên hướng dẫn, giúp đỡ và động

viên tôi để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

DS Nguyễn Văn Phương là người động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

làm đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Dược liệu - Trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành đề tài

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân yêu trong gia đình tôi, các anh chị, các bạn và các em sinh viên làm đề tài tại Bộ môn Dược liệu đã luôn ủng hộ, cổ vũ và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Phùng Thị Hoa

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Vigna radiata (L.) Wilczek 2

1.2 Thành phần hóa học của vỏ hạt đậu xanh 3

1.3 Tác dụng sinh học của vỏ hạt đậu xanh 5

1.4 Công dụng 8

1.5 Chiết xuất flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh 8

1.6 Tổng quan về cao thuốc từ dược liệu 9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng, nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 11

2.1.1 Nguyên liệu 11

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 11

2.1.3 Hóa chất 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh 19

3.2 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh và lựa chọn điều kiện chiết xuất 31

3.3 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh ……… 36

3.3.1 Mô tả 36

3.3.2 Độ đồng nhất 36

3.3.3 pH 37

3.3.4 Định tính 38

3.3.5 Mất khối lượng do làm khô 40

3.3.6 Định lượng 41

3.4 Bàn luận 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống

RSD (%) độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Cấu trúc hóa học của một số flavonoid trong vỏ hạt đậu xanh 4

3.3 Kết quả khảo sát độ tuyến tính và khoảng xác định của phương pháp

3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của isovitexin 27

3.8 Kết quả xác định giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ

3.9 Thiết kế thí nghiệm khảo sát nồng độ ethanol và thời gian chiết xuất 32

3.10 Tỉ lệ cao thu được và hàm lượng isovitexin và vitexin trong các mẫu

cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh theo dung môi và thời gian chiết xuất 33 3.11 Thiết kế thí nghiệm khảo sát số lần chiết xuất và nhiệt độ chiết xuất 34

3.12 Tỉ lệ cao thu được và hàm lượng isovitexin và vitexin trong các mẫu

cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh theo số lần chiết và nhiệt độ chiết 35 3.13 Kết quả xác định pH của 5 mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh 37

3.14 Kết quả định tính thành phần hóa học của các mẫu cao chiết từ vỏ

3.15 Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của các mẫu cao chiết

3.16 Kết quả định lượng isovitexin và vitexin trong các mẫu cao chiết từ

Đường hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ

và diện tích pic của isovitexin trong khoảng nồng độ từ 5 µg/ml -

150 µg/ml

26

3.5

Đường hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ

và diện tích pic của vitexin trong khoảng nồng độ từ 5 µg/ml – 150

µg/ml

26

3.6 Ảnh chụp các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanhquan sát dưới kính

3.7 Ảnh chụp sắc ký đồ cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh quan sát ở bước

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đậu xanh là loại lương thực khá gần gũi và quen thuộc với nhân dân ta Ngoài giá trị về dinh dưỡng, đậu xanh còn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian ở dạng toàn hạt hoặc vỏ hạt để làm thuốc chữa bệnh Hạt đậu xanh để chữa sốt nóng, phiền khát, phù thũng, tả lỵ, mụn nhọt sưng tấy, loét miệng lưỡi, các trường hợp ngộ độc [3] Vỏ hạt đậu xanh có tác dụng giải nhiệt, tiêu độc tốt hơn so với hai lá mầm Tác giả Nguyễn Đình Dũng và cộng sự đã công bố thành phần chủ yếu của vỏ hạt đậu xanh là flavonoid, trong

đó flavonoid chính là isovitexin và vitexin [5] Flavonoid chiết từ vỏ hạt đậu xanh có tác dụng bảo vệ tim mạch, bảo vệ tế bào gan, bảo vệ cơ thể chống phóng xạ [7] và chống đột biến [26], chống u thực nghiệm [14] Dịch chiết vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế

emzym xanthin oxidase in vitro [13] Bên cạnh đó, vỏ hạt đậu xanh là dược liệu rẻ tiền,

dễ kiếm và là dư phẩm của quá trình sản xuất đậu xanh tách vỏ Do đó, vỏ hạt đậu xanh được đánh giá là nguồn nguyên liệu giàu flavonoid để nghiên cứu phát triển thuốc điều trị Tác giả Trần Vân Hiền đã xây dựng quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh [16], tuy nhiên quy trình này còn nhược điểm là sử dụng dung môi hữu cơ độc hại Do

đó, việc xây dựng quy trình chiết xuất cao đặc giàu flavonoid sử dụng dung môi an toàn, thân thiện với môi trường để phát triển thuốc điều trị từ vỏ hạt đậu xanh là cần thiết

Vì vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất cao đặc giàu

flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu sau:

1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu flavonoid

từ vỏ hạt đậu xanh và lựa chọn điều kiện chiết xuất

2 Sơ bộ đánh giá một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Cây đậu xanh có tên khoa học là Vigna radiata (L.) Wilczek, họ Đậu (Fabaceae)

[41]

Tên đồng nghĩa: Phaseolus radiatus Lour non L; Phaseolus mungo Gagnep non

L; Phaseolus aureus Roxb.; Vigna aureus (Roxb.) Hepper; Vigna aurea Khôi; Vigna

aurea Roxb; Azukia radiata (L.) Ohwi, Cadelium radiatum (L.) S.Y.Hu, Phaseolus

aureus Wall., Phaseolus abysissinicus Savi, Phaseolus aureus Zuccagni, Vigna aureus

Piper [25], [3]

Tên nước ngoài: Green gram, Mung bean (Anh); Haricot mungo (Pháp); Xi dou,

Xiao dou (Trung Quốc); Fundou, Bundou (Nhật) [39]

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009 [33], chi Vigna thuộc Họ đậu

(Fabaceae), Bộ đậu (Fabales) Phân lớp hoa hồng (Rosidae), Lớp ngọc lan

(Magnoliopsida), Ngành ngọc lan (Magnoliophyta, Giới thực vật (Plantae)

1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Vigna radiata (L.) Wilczek

Cây thảo sống hàng năm, mọc đứng, ít phân

nhánh, cao từ 50- 60 cm thân và cành hơi có rãnh và

phủ đầy lông mềm Lá kép mọc so le gồm 3 lá chét,

hình trái xoan tam giác, gốc tròn đầu nhọn, mặt trên

màu lục sẫm, mặt dưới màu nhạt, gân 3 tỏa từ gốc,

cuống dài 10-15 cm Cụm hoa nhiều màu vàng hoặc

màu lục mọc thành chùm ở kẽ lá, đài hình chuông

ngắn, bộ nhị 9+1 Quả hình trụ mảnh, có lông trên bề

mặt Hạt hình trụ ngắn, rốn hạt màu trắng hình elip dài

(Hình 1.1) Mùa ra hoa: 3-5, mùa ra quả: 6-8

Đậu xanh được trồng ở khắp các nước nhiệt

đới và cận nhiệt đới châu Á và các châu khác trên

thế giới Ở Việt Nam, cây cũng được trồng phổ biến ở khắp nơi

Hình 1.1 Ảnh chụp cây đậu xanh

(Vigna radiata (L.) Wilczek)

1.2 Thành phần hóa học của vỏ hạt đậu xanh

Thành phần hóa học của vỏ hạt đậu xanh gồm có flavonoid, tanin, acid hữu cơ, đường khử, polysaccharid, trong đó thành phần chính là flavonoid [30]

Năm 1998, theo tác giả Trần Vân Hiền và cộng sự [17], hàm lượng flavonoid toàn phần trong vỏ hạt đậu xanh là 0,8%, định lượng bằng HPLC cho thấy 2 flavonoid chính trong vỏ hạt đậu xanh là isovitexin (9,5%) và vitexin (90,5%)

Năm 2014, từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat vỏ hạt đậu xanh, tác giả Nguyễn Thu Hằng đã phân lập và nhận dạng được hai flavonoid là quercitrin và vitexin [12]

Năm 2017, Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự đã phân lập được luteolin, taxifolin và catechin từ vỏ hạt đậu xanh [11]

Năm 2017, Phạm Thị Thu Hằng và cộng sự đã phân lập được vitexin, isovitexin, luteolin, taxifolin và catechin từ vỏ hạt đậu xanh [14]

Năm 2018, Nguyễn Đình Dũng và cộng sự đã định lượng flavonoid trong vỏ hạt đậu xanh bằng HPLC cho thấy thành phần chính trong vỏ hạt đậu xanh là isovitexin và vitexin [5]

Cấu trúc hóa học của một số flavonoid trong vỏ hạt đậu xanh được trình bày ởbảng

Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học của một số flavonoid trong vỏ hạt đậu xanh

1.3 Tác dụng sinh học của vỏ hạt đậu xanh

1.3.1 Tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thu Hằng và cộng sự [13], dịch chiết

ethanol toàn phần và các phân đoạn ethyl acetat, cloroform, n-hexan từ vỏ hạt đậu xanh đều thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro (p<0,05) Ở 3 nồng độ thí nghiệm

(100 μg/ml; 50 μg/ml và 10 μg/ml), tỷ lệ phần trăm ức chế so với nhóm chứng (I%) của dịch chiết ethanol toàn phần tương ứng là 52,96%; 37,89%; 10,08%; trong đó phân đoạn dịch chiết ethyl acetat có tác dụng ức chế mạnh và rõ rệt (p<0,01) với I% tương ứng là 79,86%; 67,02%; 47,68% Định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy phân đoạn này có thành phần chính là flavonoid

1.3.2 Tác dụng ức chế tyrosinase in vitro

Theo kết quả nghiên cứu của Yang Yao và cộng sự [41], dịch chiết ethanol 70%

và các phân đoạn dịch chiết ethyl acetat, cloroform, n-butanol của vỏ hạt đậu xanh đều thể hiện tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro Nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase của dịch chiết ethyl acetat, n-buthanol, ethanol 70%, cloroform lần lượt là

82,7 mg/ml; 207,4 mg/ml; > 500 mg/ml; > 500 mg/ml Từ đó thấy rằng dịch chiết ethyl acetat có tác dụng ức chế mạnh nhất

Tiếp đó, nghiên cứu tiến hành phân lập hai flavonoid là isovitexin và vitexin từ

dịch chiết ethyl acetat vỏ hạt đậu xanh và đánh giá khả năng ức chế tyrosinase in vitro

so với arbutin - một chất ức chế tyrosinase Kết quả cho thấy IC50 của 2 hợp chất isovitexin và vitexin lần lượt là 6,3 mg/ml; 5,6 mg/ml; IC50 của arbutin là 2,0 mg/ml

1.3.3 Tác dụng hạ đường huyết

Tác giả Yang-Hee Jang và cộng sự [43] đã tiến hành so sánh khả năng hạ đường

huyết thông qua con đường ức chế hoạt tính enzym α- glucosidase in vitro của dịch chiết

vỏ hạt đậu xanh với ethanol 95% và chất đối chứng acarbose Kết quả cho thấy dịch chiết vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh hơn so với acarbose với I% tương ứng là 48,6% và 35,1% ở liều 0,5 mg/ml

Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng tiến hành đánh giá tác dụng của dịch chiết ethanol 95% vỏ hạt đậu xanh đối với quá trình kiểm soát đường huyết và tình trạng kháng insulin trên chuột bị tiểu đường typ 2 được thực hiện như sau:

Chia chuột làm 2 lô:

Lô 1: Ăn theo chế độ ăn kiêng: 39,8% bột bắp; 20% casein; 13,2% bột bắp cải

dextrinized; sucrose 10%; dầu đậu tương 7%; alphacel 5%; hỗn hợp khoáng chất 3,5%;

1% vitamin tổng hợp; 0,3% L-cystein; 0,25% cholin bitartrat và 0,0014% t-butyl

hydroquinon

Lô 2: Chế độ ăn kiêng giống lô 1 và bổ sung 1% dịch chiết ethanol 95% vỏ hạt đậu

xanh thay cho bột bắp trong vòng 7 tuần

Kết quả, nồng độ HbA1c và glucose trong máu ở lô 2 (6,81±0,19% và 344,8±16,2 mg/dL) thấp hơn rõ rệt so với lô 1 (8,07±0,29% và 481,6±22,0 mg/dL); p < 0,01

1.3.4 Tác dụng bảo vệ cơ thể chống phóng xạ

Flavonoid chiết từ vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế khá mạnh các phản ứng peroxy hóa lipid trong gan, lách, ruột non chuột nhắt trắng sau chiếu xạ liều 7 Gy, và giảm tổn thương rõ rệt ở các cơ quan này cả về đại thể lẫn vi thể [7], [8] Flavonoid vỏ hạt đậu xanh còn có tác dụng bảo vệ tế bào nội mạc động vật bò và nguyên bào sợi được gây tổn thương bằng H2O2 hoặc hệ thống tạo gốc tự do Hypoxanthin/Xanthin oxidase

Trên lâm sàng, viên nang vitexin với liều 400mg/ngày x 60 ngày có tác dụng thanh

nhiệt, giảm triệu chứng nhiệt, cân bằng lại tình trạng oxy hóa - chống oxy hóa đối với bệnh nhân ung thư vú sau xạ trị [19], đồng thời còn giúp phục hồi sự đáp ứng chuyển dạng của tế bào lympho ở máu ngoại vi của những bệnh nhân này [21], [23]

1.3.5 Tác dụng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào

Hỗn hợp flavonoid chiết xuất từ vỏ hạt đậu xanh có tác dụng ức chế phản ứng peroxy hóa lipid màng tế bào gan trong dịch nghiền đồng thể Tác dụng ức chế tương quan tuyến tính với nồng độ flavonoid [8]

Đối với tế bào lympho người (in vitro) cho thấy khi tăng nồng độ flavonoid trong

hỗn hợp dịch nghiền đồng thể tế bào lympho người thì nồng độ MDA (malonyl dialdehyd) - sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid các màng sinh học giảm rất nhanh [8]

1.3.6 Tác dụng bảo vệ tế bào gan

Tác giả Liu và cộng sự [38] đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của dịch chiết ethanol 75% vỏ hạt đậu xanh và 2 flavonoid chính được phân lập từ dịch chiết này là isovitexin và vitexin thông qua nồng độ enzym ALT (alanin transaminase), AST (aspartat transaminase) trong máu, nồng độ MDA (malonyl dialdehyd) và SOD (superoxid dismutase) Nghiên cứu thực hiện trên mô hình gây tổn thương gan chuột

bằng ethanol 56% in vivo cho kết quả: Tại liều tương ứng với 13 mg/kg isovitexin, 15

mg/kg vitexin và 1,28 g dịch chiết ethanol 75% của vỏ hạt đậu xanh, có tác dụng làm giảm nồng độ ALT, AST, MDA và làm tăng SOD bảo vệ tế bào gan qua sự ức chế tích

tụ lipid ở gan và duy trì tình trạng chống oxy hóa Hơn nữa, khi nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của dịch chiết ethanol 75% và 2 flavonoid chính cho thấy isovitexin

và vitexin là các thành phần có liên quan đến tác dụng bảo vệ tế bào gan [38]

Một nghiên cứu khác trên chuột của Watnanabe và cộng sự [35] cho thấy protein phân lập từ đậu xanh có thể đóng vai trò ngăn ngừa sự tiến triển của bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu bằng cách làm giảm tích tụ lipid ở gan

1.3.7 Tác dụng chống viêm

Theo tác giả Inhae Kang và cộng sự [37], dịch chiết ethanol 80% vỏ hạt đậu xanh làm giảm sự phát sinh phản ứng viêm, các đại thực bào kết hợp với mô mỡ đã liên quan đến quá trình viêm mạn tính, viêm mô mức thấp ở mô mỡ trong bệnh béo phì, nguyên nhân là liên quan đến sự đề kháng insulin Đặc biệt, TNF-α tiết ra bởi các tế bào đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm, IL-6 có tác dụng gây viêm và chống viêm được tiết ra bởi các tế bào T và các đại thực bào, MCP-1 là một cytokin viêm và nó ảnh hưởng đến béo phì và khả năng kháng insulin Nghiên cứu này đã phát hiện ra các cytokine viêm như IL-6 và MCP-1 (protein hóa ứng động tế bào đơn nhân-1) đã giảm đáng kể sau khi điều trị bằng vitexin trong 14 ngày

dụng hạn chế việc xuất hiện các đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể ở chuột bị nhiễm monitor liều nhỏ dài ngày [26]

1.3.9 Tác dụng điều trị tại chỗ tổn thương bỏng trên thực nghiệm

Flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh có tác dụng làm se khô vết bỏng, kích thích liền sẹo, kháng khuẩn tốt hơn dung dịch berberin 1% trên thỏ thí nghiệm [6]

1.3.10 Tác dụng chống u thực nghiệm

Dùng tác nhân benzo[a]pyren và dầu Ba đậu theo phương pháp của Ramanathan

R để gây khối u thực nghiệm trên chuột nhắt trắng Theo dõi sự xuất hiện và phát triển của khối u, so sánh kết quả của nhóm chứng và nhóm thử cho thấy flavonoid vitexin chiết từ vỏ hạt đậu xanh với liều 150 mg/kg /ngày dùng đường uống và bôi trên da 7 ngày trước khi gây u thực nghiệm, sau đó cho chuột uống trong 13 tuần tiếp theo đã thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành và phát triển khối u trên da rõ rệt [14]

Ngoài giá trị về dinh dưỡng, đậu xanh còn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian ở dạng toàn hạt hoặc vỏ hạt để làm thuốc chữa bệnh Hạt đậu xanh để chữa sốt nóng, phiền khát, phù thũng, tả lỵ, mụn nhọt sưng tấy, loét miệng lưỡi, các trường hợp ngộ độc [30] Vỏ hạt đậu xanh có tác dụng giải nhiệt, tiêu độc tốt hơn so với hai lá mầm

[29]

Quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh được tác giả Trần Vân Hiền và cộng sự đề xuất tại Giải pháp hữu ích số 2-0000387 công bố ngày 26/04/2006 [16] gồm các bước như sau:

- Tán vỏ hạt đậu xanh sau khi đã được loại bỏ tạp chất và rửa sạch sấy khô, tiếp đó rây qua rây số 28; làm ẩm bột thu được bằng cồn 80-85% theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2 giờ, chiết bằng thiết bị chiết hồi lưu có gia nhiệt ở nhiệt độ 100°C trong thời gian 6 giờ, công đoạn này được lặp lại 3 lần; thu gom toàn bộ dịch chiết cồn rồi cất thu hồi dung môi trong điều kiện nhiệt độ thấp (từ 60 đến 70°C), áp suất giảm cho đến khi thu được cao lỏng chứa 25-30% hàm ẩm

- Chiết cao lỏng thu được bằng dung môi hữu cơ là xăng trắng hoặc n- hexan để loại các chất không mong muốn như clorophyl, gôm, pectin, chất béo , công đoạn này được lặp lại ba lần, thu được dịch chiết nằm ở pha dưới

- Cô đặc dịch chiết thu được cho đến khi xuất hiện chất kết tủa; hỗn hợp được làm lạnh xuống nhiệt độ nằm trong khoảng từ 2 đến 8°C trong thời gian 24 giờ, sau đó lọc để thu được chất kết tủa dạng bột nhão; rửa sạch chất kết tủa này bằng aceton theo tỷ lệ 1:2 (2-

3 lần) để thu được kết tủa màu vàng sáng; sấy khô cho đến khi bay hết hơi dung môi để thu được phần chiết thành phẩm dưới dạng bột

Định nghĩa

Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp [2]

Cao thuốc được chia làm 3 loại:

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng, trong

đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không

có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc [2]

Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không

quá 20 % [2]

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được

có độ ẩm lớn hơn 5 % [2]

Yêu cầu chất lượng

Đạt các yêu cầu theo quy định trong chuyên luận riêng và đạt các yêu cầu chung sau đây:

Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều chế cao

[2]

Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô

tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ [2]

Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác):

Cao đặc không quá 20% [2]

Cao khô không quá 5% [2]

Hàm lượng cồn: Đạt từ 90 % đến 110 % lượng ethanol ghi trên nhãn (áp dụng cho

cao lỏng và cao đặc) [2]

Kim loại nặng: Không được quá 20 phần triệu nếu không có chỉ dẫn khác [2] Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 10.14 - Xác định dung môi tồn dư) [2]

Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 12.17- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật) [2]

Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu qui định trong Dược điển Việt Nam V

(Phụ lục 13.6-Thử giới hạn nhiễm khuẩn) [2]

Bảo quản

Cao thuốc được đựng trong bao bì kín, để nơi khô, mát, tránh ánh sáng, nhiệt độ

ít thay đổi

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

Hạt đậu xanh giống ĐX208 được cung

cấp bởi một số đơn vị cung cấp giống cây

trồng thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn (Bộ NN & PTNT) Hạt đậu xanh

được đem về trồng tại Viện nghiên cứu Ngô -

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam từ

ngày 10/3/2016 đến ngày 5/5/2016 Mẫu

nghiên cứu trong thời kỳ ra hoa đã được ép

tiêu bản và lưu giữ tại Bảo tàng Thực vật -

Khoa Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội với

số hiệu tiêu bản là NDD002 Mẫu đã được PGS.TS Trần Văn Ơn giám định tên khoa

học là Vigna radiata (L.) R Wilczek, họ Đậu (Fabaceae)

Hạt đậu xanh được tách lấy vỏ, bảo quản trong túi nilon để nghiên cứu

Định lượng hàm lượng isovitexin và vitexin trong vỏ hạt đậu xanh của các mẫu nghiên cứu bằng HPLC [5], kết quả hàm lượng isovitexin là 5,85 mg/g và hàm lượng vitexin là 6,81 mg/g

Hình 2.1 Ảnh chụp mẫu dược liệu vỏ hạt đậu xanh nghiên cứu

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu 10 Avp với detector

UV, cột sắc ký Phenomenex C18, 150 x 4,6 mm, 5 µm và bảo vệ cột cùng loại

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck)

- Các thuốc thử vô cơ: Thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendorff, thuốc thử Bouchardat, amoniac đặc, dung dịch HCl 10%, dung dịch NaOH 10%, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch Pb(CH3COO)2 10%, Na2CO3, thuốc thử Fehling, H2SO4 đặc

- Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng isovitexin và vitexin

trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Nội dung 2: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu

flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh và lựa chọn điều kiện chiết xuất

- Nội dung 3: Khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh

2.3.1 Quy trình chiết xuất dự kiến

Dự kiến các bước thực hiện chính của quy trình chiết xuất và điều chế cao đặc từ vỏ hạt đậu xanh như sau:

Hạt đậu xanh được tách lấy vỏ, đem sấy khô, xay thành bột, rây qua rây có kích thước mắt rây 1000 lấy phần bột lọt qua rây để chiết xuất

Cân chính xác 15g bột vỏ hạt đậu xanh cho vào bình cầu, thấm ẩm dược liệu bằng dung môi chiết xuất trong 15 phút Thêm dung môi và tiến hành chiết xuất lần 1, lọc thu lấy dịch chiết Tiến hành chiết như trên vài lần Gộp dịch lọc qua các lần chiết xuất thu được dịch chiết ethanol Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch chiết cô đặc Phân tán đều dịch chiết cô đặc trong nước nóng, siêu âm 15 phút, lọc nóng thu được

dịch chiết nước Dịch chiết nước được đem cô cách thủy cho đến khi thu được sản phẩm cao đặc (mất khối lượng do làm khô dưới 20%)

2.3.2 Phương pháp định lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu

 Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ

Hiện nay chưa có tài liệu chính thức nào đưa ra các yêu cầu về các giới hạn thông

số để đánh giá kỹ thuật định lượng, nên khóa luận chỉ xác định các thông số trên và đưa

ra cùng với giới hạn chấp nhận khi thẩm định kết quả định lượng theo hướng dẫn của AOAC [27]

và diện tích pic của các lần sắc ký Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một

mẫu biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD ≤ 2% theo hướng dẫn của AOAC [27]

Ngoài ra, sự phù hợp của hệ thống còn thể hiện ở tính chọn lọc Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác)

Trong HPLC, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc kí đồ thu được từ mẫu trắng và các mẫu thử, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn các pic tạp

Tiến hành: Tiêm lần lượt mẫu trắng và dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ

* Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất phân tích (x) trong khoảng xác định, được biểu thị

bằng phương trình hồi quy Y = ax+b với hệ số tương quan R

Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) và cần thực hiện tối thiểu với 6 nồng độ khác nhau

Tiến hành sắc ký các dãy dung dịch chuẩn, ghi lại các sắc ký đồ và xác định diện tích pic Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và diện tích pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu

Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính R phải đạt yêu cầu:

0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [27]

* Độ lặp lại

Độ lặp của một phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích

Tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại

nhiều lần rồi lấy giá trị trung bình Độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các kết quả phân tích (hàm lượng hoạt chất)

Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo hướng dẫn của AOAC

là RSD ≤ 2,7% nếu hàm lượng trong khoảng 1 – 10 % và RSD ≤ 3,7% nếu hàm lượng trong khoảng 0,1 – 1 % [27]

Công thức tính tỉ lệ thu hồi:

Tỉ lệ thu hồi (%) =

Lượng chất tìm thấy – Lượng chất có sẵn

x 100% Lượng chất thêm vào

Yêu cầu: Theo tiêu chuẩn của AOAC, tỷ lệ thu hồi trong khoảng 97 - 103% nếu

hàm lượng thu hồi trong khoảng 1 - 10%; là 95 - 105% nếu hàm lượng trong khoảng 0,1

- 1% [27]

* Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện về mặt định tính

LOQ là lượng chất thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp

LOD, LOQ có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo (diện tích pic)

Công thức tính giá trị LOD [27]: LOD = 3,3×SD/a

Công thức tính giá trị LOQ [27]: LOQ= 10×SD/a

Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn của diện tích pic

a: Độ dốc của đường chuẩn

2.3.3 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc

giàu flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh

Các yếu tố khảo sát: dung môi chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, số lần chiết xuất, thời

gian chiết xuất

Trong đó:

mc: khối lượng cao thu được

mdl: khối lượng dược liệu ban đầu

Ac: hàm ẩm của cao

Adl: hàm ẩm của dược liệu

Từ kết quả khảo sát lựa chọn các điều kiện thích hợp để chiết xuất cao đặc giàu flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh

2.3.4 Phương pháp khảo sát một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ vỏ hạt đậu

Định tính các nhóm hợp chất trong các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh bằng các

phản ứng hóa học thường quy theo phương pháp ở tài liệu [24] và [28]

Định tính các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh bằng sắc ký lớp mỏng theo phương

pháp ghi trong Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 5.4) [2], sử dụng chất chuẩn đối chiếu là

isovitexin và vitexin

2.3.4.5 Mất khối lượng do làm khô

Xác định mất khối lượng do làm khô của các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh theo

phương pháp quy định trong Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.6) [2]

 Tính độ lệch chuẩn tương đối

Ghi chú: RSD: Độ lệch chuẩn tương đối

S: Độ lệch chuẩn

X: Giá trị trung bình

Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất: thể hiện mối tương quan giữa diện tích

pic sắc ký và nồng độ chất phân tích y = ax + b, sử dụng phần mềm Microsoft Excel để

xử lý và vẽ đồ thị

X X X

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh

Xác định hàm lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Thực hiện quy trình chiết xuất theo các bước dự kiến ở mục 2.3.1 với các điều kiện

2 như trên Gộp dịch lọc qua các lần chiết xuất thu được dịch chiết ethanol Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch chiết cô đặc Phân tán đều dịch chiết cô đặc trong nước nóng, tỷ lệ dịch chiết : nước nóng = 1 : 2 (ml/ml), siêu âm 15 phút, lọc nóng thu được dịch chiết nước Dịch chiết nước được đem cô cách thủy cho đến khi thu được sản phẩm cao đặc (mất khối lượng do làm khô dưới 20%)

 Chuẩn bị mẫu

Mẫu trắng: Lấy chính xác 25 ml acetonitril cho vào bình định mức 50 ml rồi

thêm nước cất vừa đủ đến vạch

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,015 g mẫu thử cho vào bình định mức

20ml Thêm 5ml pha động, siêu âm 15 phút, để nguội rồi thêm dung môi vừa đủ tới vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Dung dịch chuẩn: Các dung dịch chuẩn isovitexin, vitexin được pha như sau: Cân

chính xác khoảng 25 mg chất chuẩn cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml pha động, lắc đều cho tan, thêm pha động vừa đủ 25 ml lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc C0 Pha dung dịch chuẩn có nồng độ từ 5 µg/ml - 150 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc C0 theo tỷ lệ tương ứng ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Cách pha dãy các dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Gồm 5 ml dung dịch chuẩn isovitexin 50 µg/ml với 5

ml dung dịch chuẩn vitexin 50 µg/ml pha trong bình định mức 10 ml

Dung dịch thử thêm chuẩn: Gồm 5 ml dung dịch chuẩn isovitexin 50 µg/ml với

5 ml dung dịch chuẩn vitexin 50 µg/ml và thêm dung dịch thử đã pha ở trên vừa đủ trong bình định mức 50 ml

Dung dịch thẩm định độ đúng: Cân chính xác khoảng 0,015 g mẫu thử cho vào

bình định mức 20 ml, thêm chính xác dung dịch chuẩn gốc (dùng micropipet) tương đương khoảng 500 µg; 1100 µg; 1800 µg isovitexin và 360 µg; 1100 µg; 1800 µg vitexin vào bình rồi tiến hành xử lý mẫu như dung dịch thử

 Xây dựng phương pháp định lượng

Xây dựng phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện sắc ký như sau:

- Pha động: Pha trong bình định mức 500ml, gồm 325ml acid orthophosphoric

0,1% trong nước, thêm methanol vừa đủ tới vạch, lắc đều, lọc bằng máy lọc hút chân không

- Cột sắc ký: Phenomenex C18; 150 x 4,6 mm; 5 µm

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 20µl

- Nhiệt độ cột: 250C

- Detector UV: Lần lượt tiến hành quét phố hấp thụ UV- Vis của dung dịch chuẩn

isovitexin, dung dịch chuẩn vitexin và dung dịch chuẩn hỗn hợp từ đó lựa chọn bước sóng phát hiện thích hợp

Kết quả phổ UV-Vis của dung dịch chuẩn vitexin, dung dịch chuẩn isovitexin và

dung dịch chuẩn hỗn hợp được trình bày tương ứng ở hình 3.1

A Dung dịch chuẩn isovitexin

B Dung dịch chuẩn vitexin

C Dung dịch chuẩn hỗn hợp Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-Vis của isovitexin, vitexin và dung dịch chuẩn hỗn hợp

Nhận xét: Từ sắc ký đồ ở hình 3.2 cho thấy, tại bước sóng 335 nm sắc kí đồ của 2

chất có độ phân giải tối ưu, hình ảnh 2 pic tách nhau hoàn toàn, đường nền không lẫn tạp Vì vậy, chọn bước sóng 335 nm là bước sóng phát hiện để định lượng

 Thẩm định phương pháp định lượng

- Độ đặc hiệu

Tiến hành tiêm lần lượt dung dịch mẫu trắng, dung dịch mẫu chuẩn isovitexin 50 µg/ml, dung dịch mẫu chuẩn vitexin 50 µg/ml, dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch mẫu

thử vào hệ thống sắc ký Hình ảnh các sắc ký đồ được trình bày ở hình 3.3

Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp định lượng

Nhận xét: Với chương trình sắc ký đã chọn, trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, pic

của isovitexin và vitexin thu được cân xứng (hệ số bất đối AF ≈ 1,0), thời gian lưu ổn định, 2 pic tách nhau hoàn toàn Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử xuất hiện 2 pic

có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của isovitexin và vitexin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu trắng không có pic nào có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của isovitexin và vitexin Vì vậy, phương pháp xây dựng đạt yêu cầu

về độ đặc hiệu của hệ thống

- Sự phù hợp của hệ thống

Thực hiện tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp Tiến hành sắc ký, ghi lại sắc

ký đồ và xác định thời gian lưu, diện tích pic Kết quả thời gian lưu và diện tích pic được

trình bày ở bảng 3.2, hình ảnh sắc ký đồ được trình bày ở Phụ lục 4

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát sự phù hợp của hệ thống

Thời gian lưu

Diện tích Pic (µAU.s)

Thời gian lưu

Diện tích Pic (µAU.s)

 Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic của vitexin lần lượt là 0,102% và 0,045% đều ≤ 2%, đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC [27] Điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh

- Độ tuyến tính và khoảng xác định

Tiến hành tiêm sắc ký dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ biến thiên từ 5 µg/ml

-150 µg/ml đã chuẩn bị theo bảng 3.1 ở mục 3.1 Ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích

pic Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện

tích pic Kết quả được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ tuyến tính và khoảng xác định của phương pháp định

Nồng độ (µg/ml)

Diện tích Pic (µAU.s)

Đồ thị biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của isovitexin trong

khoảng nồng độ khảo sát được trình bày ở hình 3.4

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích pic và nồng độ isovitexin có

sự tương quan tuyến tính chặt chẽ với hệ số xác định R2 = 0,9999 nằm trong khoảng giới

hạn 0,99 ≤ R2 ≤ 1

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 71883x - 23952 (*)

Trong đó: y: Diện tích pic (µAU.s)

x: Nồng độ dung dịch isovitexin chuẩn (µg/ml)

Hình 3.4 Đường hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

pic của isovitexin trong khoảng nồng độ từ 5 µg/ml - 150 µg/ml

Đồ thị biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của vitexin trong

khoảng nồng độ khảo sát được trình bày ở hình 3.5

Hình 3.5 Đường hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

pic của vitexin trong khoảng nồng độ từ 5 µg/ml - 150 µg/ml

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích pic và nồng độ vitexin có sự

tương quan tuyến tính chặt chẽ với hệ số xác định R2 = 0,9998 nằm trong khoảng giới

hạn 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [27]

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 58054x + 53538 (**)

Trong đó: y: Diện tích pic (µAU.s)

x: Nồng độ dung dịch vitexin chuẩn (µg/ml)

y = 71883x - 23952 R² = 0.9999

0 20 40 60 80 100

0 20 40 60 80 100

- Độ lặp lại

Pha 6 dung dịch thử theo các bước ở mục 3.1 rồi tiến hành sắc ký Tính toán nồng

độ isovitexin và vitexin theo phương trình (*) và (**) Hàm lượng isovitexin và vitexin trong sản phẩm được tính theo công thức (***)

X (mg/g) =

(St + b) × V × 100

(***)

a × mcân × ( 100 - A%) × 1000Trong đó: X: Hàm lượng (mg/g)

St: Diện tích pic của mẫu thử (µAU.s)

b: hằng số hồi quy của đường chuẩn

V: thể tích pha mẫu thử (ml)

a: hệ số góc của đường chuẩn

mcân: khối lượng cân (g)

A%: Hàm ẩm của mẫu E80

Diện tích Pic (µAU.s)

Hàm lượng (mg/g)

Khối lượng (g)

Diện tích Pic (µAU.s)

Hàm lượng (mg/g)

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy

- Giá trị RSD (%) của hàm lượng isovitexin trong dung dịch thử ngày đầu là 1,17%

≤ 2,7%, đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC [27]

- Giá trị RSD (%) của hàm lượng isovitexin trong dung dịch thử khác ngày là: 0,804 ≤ 2,7%, đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC [27]

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ lặp lại của vitexin

STT

Khối lượng (g)

Diện tích Pic (µAU.s)

Hàm lượng (mg/g)

Khối lượng (g)

Diện tích Pic (µAU.s)

Hàm lượng (mg/g)

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy:

- Giá trị RSD (%) của hàm lượng vitexin trong dung dịch thử ngày đầu là 1,05%

≤ 2,7%, đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC [27]

- Giá trị RSD (%) của hàm lượng vitexin trong dung dịch thử khác ngày là 0,80%

≤ 2,7%, đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC [27]

Như vậy, phương pháp định lượng đã xây dựng có độ lặp lại tốt đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC [27]

- Độ đúng

Tiến hành pha dung dịch thử theo các bước ở mục 3.1, tại mỗi nồng độ pha 3 dung dịch thử, tính giá trị % tìm lại của chất chuẩn Độ đúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm lượng của chất đối chiếu tìm được so với chất đối chiếu thêm vào

Kết quả khảo sát độ đúng của isovitexin, vitexin và hình ảnh sắc ký đồ được trình

Diện tích pic (µAU.s)

Lượng

có sẵn (µg)

Lượng thêm vào (µg)

Lượng tìm thấy (µg)

% Thu hồi

%TB tìm lại

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy, với phương pháp đã xây dựng ở 3 nồng

độ khác nhau, % tìm lại chất chuẩn isovitexin nằm trong khoảng 97% - 105% Như vậy phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu về độ đúng theo hướng dẫn của AOAC [27]

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng của vitexin

Diện tích pic (µAU.s)

Hàm lượng

có sẵn (µg/ml)

Hàm lượng thêm vào (µg/ml)

Hàm Lượng tìm thấy (µg/ml)

% Thu hồi

%TB tìm lại

Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, với phương pháp đã xây dựng ở 3 nồng độ

khác nhau, % tìm lại chất chuẩn vitexin nằm trong khoảng 95% - 105% Như vậy, phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu về độ đúng theo hướng dẫn của AOAC [27]

- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Pha loãng dung dịch chuẩn C1 (5 µg/ml) được chuẩn bị theo bảng 3.2 và tiến

hành sắc ký đến khi trên sắc ký đồ đáp ứng của isovitexin và vitexin còn phân biệt rõ ràng so với nhiễu đường nền Chuẩn bị 10 dung dịch chuẩn có nồng độ tương đương và tiến hành sắc ký, tính độ lệch chuẩn của diện tích pic Kết quả giới hạn LOD, LOQ và

hình ảnh sắc ký đồ được trình bày ở bảng 3.8 và phụ lục 8

Bảng 3.8 Kết quả xác định giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ của

Nhận xét: Kết quả từ bảng 3.8 cho thấy phương pháp xây dựng có giới hạn phát

hiện LOD của isovitexin là 0,022 µg/ml và của vitexin là 0,021 µg/ml; giới hạn định lượng LOQ của isovitexin là 0,066 µg/ml và của vitexin là 0,063 µg/ml

Từ các kết quả thẩm định cho thấy phương pháp định lượng đã xây dựng đảm bảo yêu cầu về độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại, độ phù hợp của hệ thống, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng và có thể áp dụng để

định lượng isovitexin và vitexin trong cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh

giàu flavonoid từ vỏ hạt đậu xanh và lựa chọn điều kiện chiết xuất

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết xuất và thời gian chiết xuất

Tiến hành chiết xuất các mẫu cao theo các bước dự kiến ở mục 2.3.1 với các điều

kiện cụ thể như sau:

- Các yếu tố thay đổi để khảo sát:

 Nồng độ ethanol: Chiết hồi lưu bằng ethanol với các nồng độ tương ứng là 0%; 40%; 70%; 80%, 90%

 Thời gian mỗi lần chiết: 1 giờ; 2 giờ; 3 giờ

Thiết kế thí nghiệm khảo sát nồng độ ethanol và thời gian chiết xuất được trình

Thực hiện các thí nghiệm thiết kế ở bảng 3.9 thu được các mẫu cao tương ứng

Tuy nhiên các mẫu cao chiết bằng EtOH 90% cho tỷ lệ cao thu được nhỏ không đủ để định lượng HPLC

Tiến hành tính tỉ lệ cao thu được và định lượng isovitexin và vitexin trong các

mẫu cao còn lại bằng HPLC thu được kết quả được trình bày ở bảng 3.10

 Hàm lượng isovitexin trong các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh trong khoảng từ 23,73- 112,82 mg/g, trong đó mẫu cao có hàm lượng isovitexin cao nhất là E803

(112,82 mg/g)

 Hàm lượng vitexin trong các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh trong khoảng từ 41,73-144,34mg/g, trong đó mẫu cao có hàm lượng cao nhất là E80

3 (144,34 mg/g)

 Tỷ lệ cao thu được của các mẫu cao chiết từ vỏ hạt đậu xanh trong khoảng từ 9,05

- 15,31%, trong đó mẫu cao E70

3 có hiệu xuất cao nhất là 16,30%

 Mẫu cao có tỉ lệ cao thu được lớn nhất là E70

3 Tuy nhiên ở điều kiện này tổng hàm lượng isovitexin và vitexin là 120,08% thấp hơn so với mẫu cao E80

3 Từ đó lựa chọn nồng độ ethanol 80%, thời gian mỗi lần chiết 3 giờ để tiến hành khảo sát các yếu tố tiếp theo