NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG IN VIVO của VIÊN nén BERBERIN GIẢI PHÓNG tại đại TRÀNG bào CHẾ BẰNG kĩ THUẬT BAO KHÔ KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

Các mô hình thử giải phóng in vitro đã được áp dụng cho viên giải phóng tại đại tràng .... Về viên nén berberin clorid giải phóng tại đại tràng, trong nước đã có tác giả nghiên cứu bào c

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG

IN VIVO CỦA VIÊN NÉN BERBERIN

GIẢI PHÓNG TẠI ĐẠI TRÀNG BÀO CHẾ BẰNG KĨ THUẬT BAO KHÔ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG

Mã sinh viên: 1401455

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG

IN VIVO CỦA VIÊN NÉN BERBERIN

GIẢI PHÓNG TẠI ĐẠI TRÀNG BÀO CHẾ BẰNG KĨ THUẬT BAO KHÔ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn

Văn Lâm, người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể thầy cô giáo và cán bộ trong trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo, trang bị cho tôi nhiều kiến thức cùng kinh nghiệm quý báu và thực sự đó là những hành trang giúp tôi thêm vững bước trên con đường sắp tới của mình

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất tới gia đình, người thân, bạn bè, những người đã luôn chỉ bảo, động viên, chăm sóc, luôn sát cánh bên tôi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi những lúc khó khăn, để tôi có được như ngày hôm nay

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức bản thân có hạn, khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Nhung

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Berberin clorid 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Nguồn gốc 2

1.1.3 Tính chất 2

1.1.4 Tác dụng dược lí 2

1.1.5 Chế phẩm và hàm lượng 3

1.2 Thuốc giải phóng tại đại tràng 4

1.1.1 Đặc điểm của đại tràng liên quan tới thiết kế hệ đưa thuốc 4

1.2.2 Mục đích đưa thuốc vào đại tràng 5

1.2.3 Các cơ chế kiểm soát giải phóng được áp dụng trong bào chế các thuốc giải phóng tại đại tràng 5

1.3 Pectin và các đặc điểm phù hợp với dạng thuốc giải phóng tại đại tràng 7

1.4 Các mô hình thử giải phóng in vitro đã được áp dụng cho viên giải phóng tại đại tràng 8

1.4.1 Mô hình thử giải phóng in vitro dựa trên cơ sở phụ thuộc pH 8

1.4.2 Mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH sử dụng enzyme đại tràng 10

1.4.3 Mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH bổ sung dịch đại tràng động vật 11

1.5 Giải phẫu bệnh ex vivo 12

1.6 Theo dõi và đánh giá giải phóng in vivo thuốc giải phóng tại đại tràng 12

1.6.1 Hình ảnh X-quang 12

1.6.2 Đo độ tắt gamma 14

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Thiết bị 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp định lượng 17

2.3.2 Phương pháp bào chế viên nhân 19

2.3.3 Phương pháp bao viên 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 Xây dựng đường chuẩn 27

3.2 Định lượng dược chất trong viên nhân không có chất cản quang 28

3.3 Ảnh hưởng của chất cản quang khi thêm vào viên nhân 29

3.3.1 Ảnh hưởng của chất cản quang đến định lượng 29

3.3.2 Ảnh hưởng của chất cản quang đến khả năng giải phóng in vitro của viên nhân 32

3.4 Đánh giá khả năng giải phóng in vitro của viên bao berberin clorid 33

3.5 Đánh giá khả năng giải phóng in vivo của viên bao berberin clorid 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BBR Berberin clorid

BP British Pharmacopoeia (Dược điển Anh)

HPLC High performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu năng cao) HPMC Hydroxy propyl methyl cellulose

Tlag Thời gian tiềm tàng

UV-Vis Ultraviolet- Visible (Tử ngoại- Khả kiến)

USP United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số biệt dược chứa berberin thường gặp trên thị trường 3

Bảng 1.2 Môi trường được sử dụng trong mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH 9 Bảng 1.3 Tốc độ khuấy trong mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH 10 Bảng 1.4 Thể tích môi trường sử dụng trong mô hình thử giải phóng in vitro dựa trên cơ

sở phụ thuộc pH 10

Bảng 1.5 Enzyme sử dụng trong mô hình thử giải phóng in vitro dựa trên cơ sở phụ

thuộc pH sử dụng enzyme đại tràng 10Bảng 1.6 Mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH bổ sung dịch đại tràng động vật 11Bảng 1.7 Các thí nghiệm xác định vị trí thuốc viên trong đường tiêu hóa sử dụng chụp X-quang 13Bảng 1.8 Các thí nghiệm xác định vị trí thuốc viên trong đường tiêu hóa sử dụng đo độ tắt gamma 14Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu 16Bảng 2.2 Công thức bào chế viên nhân 19Bảng 3.1 Độ hấp thụ của BBR với các nồng độ khác nhau ở các môi trường khác nhau 27Bảng 3.2 Bảng kết quả định lượng dược chất trong viên nhân không có chất cản quang 28Bảng 3.3 Bảng so sánh kết quả đo quang mẫu chuẩn 29Bảng 3.4 Bảng kết quả định lượng dược chất trong viên nhân không có chất cản quang bằng phương pháp đo quang 30Bảng 3.5 Kết quả xác định độ thu hồi 30Bảng 3.6 Bảng kết quả định lượng dược chất trong viên nhân không có chất cản quang bằng phương pháp HPLC 31Bảng 3.8 Khả năng giải phóng dược chất của viên nhân trong môi trường pH 6.8 32

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của berberin clorid 2Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ BBR trong các môi trường mà

độ hấp thụ tại bước sóng 345nm 27Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng dược chất của viên nhân trong môi trường

pH 6.8 32

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng in vitro của viên bao berberin clorid có

bột bao tỉ lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,0 33

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn khả năng giải phóng in vitro của viên bao berberin clorid có

bột bao tỉ lệ Pectin: CaHPO4 = 100: 1,5 34Hình 3.5 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 1 uống viên bao berberin clorid có bột bao tỉ

lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,0 35Hình 3.6 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 2 uống viên bao berberin clorid có bột bao tỉ

lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,0 35Hình 3.7 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 3 uống viên bao berberin clorid có bột bao tỉ

lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,0 36Hình 3.8 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 4 uống viên bao berberin clorid có bột bao tỉ

lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,0 37Hình 3.9 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 5 uống viên bao berberin clorid có bột bao tỉ

lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,0 37Hình 3.10 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 6 uống viên bao berberin clorid có bột bao

tỉ lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,0 38Hình 3.11 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 2 uống viên bao berberin clorid có bột bao

tỉ lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,5 39Hình 3.12 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 3 uống viên bao berberin clorid có bột bao

tỉ lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,5 39Hình 3.13 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 4 uống viên bao berberin clorid có bột bao

tỉ lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,5 40

Hình 3.14 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 5 uống viên bao berberin clorid có bột bao

tỉ lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,5 41Hình 3.15 Hình ảnh chụp X-quang trên NTN 2 uống viên bao berberin clorid có bột bao

tỉ lệ Pectin: CaHPO4 = 100:1,5 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin clorid là một hoạt chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên thường được

sử dụng để điều trị bệnh viêm đại tràng Với đa phần các thuốc điều trị viêm đại tràng đều

ở dạng viên nén quy ước, gây tác dụng toàn thân, chỉ một lượng nhỏ thuốc tới được đại tràng Do đó, để đạt được nồng độ thuốc điều trị đại tràng cần đưa một lượng thuốc lớn trong thời gian dài, điều này gây tác dụng không mong muốn Nhằm khắc phục những nhược điểm này và nâng cao hiệu quả điều trị, viên nén berberin clorid giải phóng tại đại tràng là dạng bào chế được quan tâm nghiên cứu

Về viên nén berberin clorid giải phóng tại đại tràng, trong nước đã có tác giả nghiên cứu bào chế sử dụng Pectin và Pectin kết hợp với muối calci làm màng bao tại đại tràng Trong đó, dược sĩ Bùi Thị Kim Oanh đã bào chế ra viên bao đạt được Tlag(môi trường

không có enzyme) = 8,2 ± 0,6 giờ Tiếp nối đề tài trên, đề tài “Nghiên cứu đánh giá khả

năng giải phóng in vivo của viên nén berberin giải phóng tại đại tràng bào chế bằng kĩ thuật bao khô” được thực hiện với mục tiêu:

1 Bào chế được viên bao Berberin clorid giải phóng tại đại tràng có thêm chất cản quang

2 Đánh giá được khả năng giải phóng dược chất in vivo bằng phương pháp chụp X-quang

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Berberin clorid

1.1.1 Công thức hóa học

- Công thức hóa học:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của berberin clorid

- Tên khoa học: 5,6-dihydro-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a-azoniaindeno(5,6-a) anthracen clorid dihydrat [1]

1.1.2 Nguồn gốc

Berberin là một alkaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin Berberin có thể dễ dàng chiết xuất từ thực vật hoặc tổng hợp hóa học, thường có trong rễ, thân rễ, vỏ cây những cây thuộc chi Berberis, Hydratis candensis, Coptis với hàm lượng 1,5-3% và chiếm ít nhất 82%

so với alkaloid toàn phần [1]

Dạng dược dụng: Berbein clorid, Berberin sulfat

1.1.3 Tính chất

Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng Tan trong nước nóng, khó tan trong ethanol, khó tan trong chloroform, không tan trong ether Độ tan trong nước phụ thuộc pH, độ tan cao nhất khi pH~7 [1]

1.1.4 Tác dụng dược lí

Berberin clorid có tính chất kháng sinh và bởi tính an toàn của nó với con người, berberin đã được sử dụng để điều trị bệnh tiêu chảy hàng thập kỉ nay

Gần đây trong một số nghiên cứu, berbein clorid có tác dụng điều trị các bệnh mạn tính như đái tháo đường, giảm cholesterol và triglyceride, viêm khớp đặc biệt là viêm đại tràng Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy, berberin đã được chứng minh có tác dụng tốt trên nhiều bênh tim mạch như: huyết áp, cường tim, chống loạn nhịp, phòng ngừa huyết khối tĩnh mạch [24], [44]

1.1.5 Chế phẩm và hàm lượng

Các dạng bào chế thường gặp trên thị trường chứa berberin là viên nén, viên nang, viên bao phim, viên bao đường Tuy nhiên chưa có dạng bào chế giải phóng tại đại tràng

Bảng 1.1 Một số biệt dược chứa berberin thường gặp trên thị trường

Tên biệt dược Dạng bào chế Hàm lượng Nhà sản xuất

Asterasick Viên nang 100mg Công ty cổ phần Traphaco

Antesik Viên nang 50mg Công ty cổ phần Dược TW

Berberin Viên nén bao

50mg Công ty cổ phần Dược & thiết bị vật

tư Y tế Thanh Hóa

1.2 Thuốc giải phóng tại đại tràng

1.1.1 Đặc điểm của đại tràng liên quan tới thiết kế hệ đưa thuốc

1.2.1.1 Giải phẫu đại tràng

Đại tràng dài khoảng 1,5m khác nhau ở mỗi người và giới tính, dài bằng khoảng ¼ ruột non nhưng tiết diện lại lớn hơn ruột non Đại tràng gồm 4 phần là đại tràng lên, đại tràng ngang, đại tràng xuống, đại tràng xích ma [10]

1.2.1.2 Môi trường đại tràng

Thể tích dịch đại tràng

Thể tích dịch đại tràng được tính toán nằm trong khoảng 1- 44ml, với thể tích trung bình chỉ 13ml do đại tràng có khả năng hấp thu nước lớn Do khối lượng dịch đại tràng thấp này, việc hòa tan thuốc từ các dạng bào chế trở nên khó khăn và có thể ảnh hưởng đến sinh khả dụng của thuốc [10]

Độ nhớt dịch đại tràng

Thể tích giảm làm dịch đại tràng đặc nhớt hơn nhiều so với đoạn trên của ống tiêu hóa gây khó khăn cho quá trình giải phóng và hấp thu những dược chất có độ tan kém Độ nhớt cũng ảnh hưởng đến sự xâm nhập của thuốc vào vi khuẩn gây bệnh trong ruột kết Khả năng di chuyển của vi khuẩn trong ruột kết đã được chứng minh là phụ thuộc vào độ nhớt của nội dung đại tràng [10]

pH

Ở người, giá trị pH đường tiêu hóa rất biến động: pH từ dạ dày (1-2) có thể tăng lên đến 7,5 ở ruột non, lên đến 7-8 ở hồi tràng xa và cuối cùng giảm xuống 6-6,5 ở đại tràng lên Tại đại tràng, pH tăng từ địa tràng lên là 6,4 ± 0,6; ở đại tràng ngang là 6,6 ± 0,8 và ở đại tràng xuống là 7,0 ± 0,7 [10]

Vi khuẩn

Các vi khuẩn cư trú trong đường tiêu hóa của con người tạo thành hệ vi sinh vật phong phú, đặc biệt là đại tràng với số lượng 1011-1012CFU bao gồm chủ yếu các vi khuẩn

kị khí như: bifidobacteria, eubacteria, enterobacteria, enterococci… Các vi khuẩn này

sinh ra enzyme để lên men các cơ chất không hoặc ít bị phân hủy ở ruột non như

carbohydrat (tinh bột ); di và trisaccharid (cellobiose, lactulose…) và pollysaccharid (pectin, inulin…) [14]

1.2.2 Mục đích đưa thuốc vào đại tràng

Nghiên cứu thuốc giải phóng ở đại tràng nhằm những mục đích sau:

- Điều trị tại chỗ các bệnh lí đại tràng: táo bón, bệnh viêm đại tràng, ung thư đại tràng, lị amip,… Do điều trị trực tiếp tại các vị trí bệnh nên có thể giảm liều dùng thuốc và giảm tác dụng không mong muốn toàn thân

- Nâng cao sinh khả dụng theo đường uống của thuốc dễ bị phân hủy ở dạ dày và ruột non như: peptid, protein, oligonucleotide và acid nucleic; các thuốc chuyển hóa bước 1 qua gan nhiều do không phải đi vào chu trình gan-ruột, khi được hấp thu tại cuối trực tràng thuốc

đi thẳng vào vòng tuần hoàn chung, một phần không qua gan

- Lợi dụng thời gian trễ khi thuốc đến đại tràng để điều trị bệnh mãn tính theo nhịp từng ngày như bệnh hen suyễn, đau thắt ngực, viêm khớp

Tuy nhiên, để thuốc tiếp cận được đến đại tràng gặp rất nhiều khó khăn Một viên thuốc dạng uống phải đi qua toàn bộ đường tiêu hóa trên để tới vị trí đích với đặc điểm sinh lí học vô cùng phức tạp: về sự biến thiên giá trị pH, thể tích chất lỏng, thời gian vận chuyển cũng biến đổi nhiều

Việc giải phóng thuốc đòi hỏi thuốc phải được hòa tan khi đến đại tràng, nhưng lượng dịch trong đại tràng ít hơn và nhớt hơn ở trên đường tiêu hóa trên, pH trung tính có thể là các yếu tố gây hạn chế tỷ lệ hấp thu của những thuốc ít hoặc không hòa tan Ngoài

ra sự tương tác không đặc hiệu của thuốc với các chất trong đại tràng như dư lượng thức

ăn, chất tiết đường ruột, chất nhầy, chất phân có thể ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng hoạt động của thuốc

1.2.3 Các cơ chế kiểm soát giải phóng được áp dụng trong bào chế các thuốc giải phóng tại đại tràng

Phân loại thuốc giải phóng tại đại tràng:

a) Hệ giải phóng thuốc phụ thuộc pH

Hệ giải phóng thuốc phụ thuốc pH nhằm giải phóng thuốc đặc hiệu tại đại tràng lợi dụng sự biến thiên pH ở đường tiêu hóa Muốn đưa thuốc tới vị trí đại tràng, tá dược thường được sử dụng là các polymer có độ tan phụ thuộc pH để kiểm soát giải phóng [10], [34]

b) Hệ giải phóng thuốc phụ thuộc thời gian

Hệ giải phóng tại đại tràng phụ thuộc thời gian dựa trên thời gian vận chuyển của thuốc qua các phần khác nhau của đường tiêu hóa Hệ giải phóng thuốc tại đại tràng phụ thuộc thời gian sử dụng các polymer trì hoãn giải phóng ở đường tiêu hóa trên trong vòng khoảng 5h, sau đó sẽ bị hòa tan giải phóng dược chất tại đại tràng [10], [34]

c) Hệ phụ thuộc áp suất

Là hệ kiểm soát giải phóng dựa trên sự thay đổi áp suất giữa các phần trong đường tiêu hóa Theo kết quả nghiên cứu nhu động, nhu động đại tràng mạnh hơn nhu động ruột non Hệ giải phóng thuốc tại đại tràng phụ thuộc áp suất sử dụng polymer chịu được áp lực

ở đường tiêu hóa trên nhưng nhạy cảm với áp lực tăng trong đại tràng để giải phóng thuốc [34]

d) Hệ giải phóng thuốc phụ thuộc hệ vi sinh vật

Đại tràng gồm hơn 400 loài vi sinh vật khác nhau bao gồm cả hiếu khí và kị khí Những enzyme vi khuẩn đại tràng này tạo ra một loạt các phản ứng, bao gồm sự trao đổi chất của các thuốc hay các phân tử sinh học khác (acid mật), khử hoạt tính của các chất chuyển hóa gây hại như sự lên men của carbohydrat và protein [14]

Các polysaccharide như chitosan, guar gum, pectin… thường hay được sử dụng với công dụng kiểm soát giải phóng trong các dạng thuốc điều trị đại tràng Các polysaccharide này có khả năng đề kháng với enzyme dạ dày và ruột ngăn giải phóng dược chất sớm, nhưng được chuyển hóa bởi các vi sinh vật trong đại tràng tạo ra pha giải phóng nhanh tức thời

Các hệ giải phóng thuốc tại đại tràng nói trên đều là hệ đưa thuốc đến đại tràng Bên cạnh đó hệ đưa thuốc nhắm đích nhờ nano hoặc vi tiểu phân ngoài đưa thuốc đến đại tràng còn có thể đưa thuốc đến tế bào Nano và vi hạt là một bước tiến quan trọng trong việc tìm

ra các loại thuốc điều trị hướng đích, hướng đích chủ động tới các tế bào đặc hiệu bằng các

chất mang hoặc thụ động tới các mô bằng những thay đổi sinh lí học các hàng rào của khối

u rắn hoặc các mô viêm [10]

1.3 Pectin và các đặc điểm phù hợp với dạng thuốc giải phóng tại đại tràng

Cấu tạo: Giống như nhiều polysaccharide tự nhiên, pectin không đồng nhất về cấu

trúc hóa học và trọng lượng phân tử Pectin chứa một lượng lớn (d-galacturonic acid) liên kết qua 1,4- glycoside Pectin cũng chứa đường trung tính như đường l-ramhama ở mạch nhánh hoặc gắn với chuỗi chính [41]

Nguồn gốc: Pectin chiếm khoảng một phần ba chất khô của thành tế bào của thực

vật bậc cao Nồng độ pectin cao nhất được tìm thấy trong lớp màng giữa của thành tế bào Mặc dù pectin xảy ra phổ biến ở hầu hết các mô thực vật, số lượng nguồn có thể được sử dụng để sản xuất pectin thương mại bị hạn chế Hiện nay, pectin thương mại hầu như chỉ được chiết xuất từ bưởi, táo hoặc vỏ trái cây họ cam quýt (như cam, chanh và chanh), cả hai sản phẩm phụ từ sản xuất nước ép Các nguồn thay thế bao gồm chất thải củ cải đường

từ sản xuất đường, chất thải xoài, đầu hướng dương, cây họ đậu, chuối, bắp cải, cà rốt và

vỏ bưởi [41]

Với các ưu điểm: sẵn có, rẻ tiền, an toàn, trong bào chế, pectin được ứng dụng rộng rãi vào các dạng thuốc phát hành có kiểm soát, giải phóng tại đại tràng, kết dính niêm mạc… Đặc biệt khả năng phân hủy sinh học cao bởi các enzyme: pectinase, beta-

galactosidase,… và các vi sinh vật: bifidobacteria, eubacteria, enterobacteria,

enterococci có sẵn trong đại tràng nên pectin có triển vọng lớn trong các dạng thuốc giải

phóng tại đại tràng [41]

Một số nghiên cứu về ứng dụng của pectin trong dạng thuốc giải phóng tại đại tràng:

Nguyễn Thị Hồng Thúy và cộng sự (2016) đã nghiên cứu bào chế viên nén

Berberin clorid giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp bao bồi từ bột pectin Pectin LM

102 kết hợp với HPMC với tỷ lệ khác nhau làm thành phần bột bao, khảo sát thành phần

dịch bao là các loại chất dẻo khác nhau Tiến hành thử nghiệm in vitro bằng cách thử hòa

tan, kết quả cho thấy công thức với tỷ lệ pectin: HPMC = 2:1 làm bột bao, kết hợp với chất hóa dẻo là glycerin được lựa chọn, bước đầu làm công thức tối ưu nhất đạt được mục tiêu

đề ra Khối lượng lớp vỏ bao cũng có ảnh hưởng quang trọng tới khả năng kiểm soát giải

phóng của viên bao Tỷ lệ lớp vỏ bao kiểm soát 250% so với khối lượng viên nhân được lựa chọn [6]

Lê Nguyễn Thành Nam và cộng sự (2018) đã nghiên cứu bào chế viên nén

Berberin clorid giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp bao bồi từ bột pectin Bào chế được viên berberin clorid có Tlag 5-6 giờ Bước đầu chọn được công thức bao viên với các thành phần như sau: bột bao: pectin (10% Talc so với khối lượng Pectin); Chất hóa dẻo: nước (60% so với khối lượng bột bao); Tỷ lệ lớp vỏ bao: 300% so với khối lượng viên nhân Xác định được Tlag và vị trí viên placebo trong đường tiêu hóa [3]

Nguyễn Thu Quỳnh và cộng sự (2012) nghiên cứu bào chế viên nén metronidazole

giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp bao dập với tá dược bao là pectin Kết quả nghiên cứu cho thấy tăng tỷ lệ pectin, lớp vỏ bao dày lên thì thời gian tiềm tàng tăng nhưng không nhiều và khó kéo dài đến 5 giờ để viên đến được đại tràng Khi kết hợp với HPMC

để bao viên, thời gian tiềm tàng của viên tăng lên đáng kể Công thức vỏ bao kết hợp pectin

và HPMC K100M tỉ lệ 1:1, tỉ lệ lớp vỏ bao viên nhân 350% có Tlag bằng 10 giờ, đạt yêu cầu đề ra với viên nén giải phóng tại đại tràng [5]

Sujata P Sawarkar và cộng sự (2015) nghiên cứu bào chế viên 5-aminosalicylic

acid giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp bao dập với tá dược bao là pectin và HPMC E5 Công thức đã được chứng minh là có hiệu quả hơn trong việc giảm viêm trong các mô hình chuột viêm đại tràng do hóa chất khi so sánh với tiền thuốc sulfasalazine đặc hiệu đại tràng cũng như 5-ASA thông thường dùng đường uống [36]

1.4 Các mô hình thử giải phóng in vitro đã được áp dụng cho viên giải phóng tại đại

tràng

Do đặc điểm sinh lí đại tràng có nhiều điểm khác biệt với các phần trên của ống tiêu

hóa nên mô hình thử giải phóng in vitro có một số điểm cải tiến so với phương pháp thử

hòa tan dạng thuốc rắn quy ước Chưa có sự thống nhất trong cách thử hòa tan viên giải phóng tại đại tràng Dưới đây là các loại mô hình thử giải phóng:

1.4.1 Mô hình thử giải phóng in vitro dựa trên cơ sở phụ thuộc pH

Ba môi trường thường được sử dụng: môi trường dạ dày, ruột non, đại tràng tương ứng pH 1,2; 7,4; 6,8 Thời gian của mỗi giai đoạn tương tự thời gian lưu giữ thuốc trong

đường tiêu hóa: dạ dày 2 giờ; ruột non 3 giờ Tốc độ khuấy có thể thay đổi 100 vòng/phút;

75 vòng/phút; 50 vòng/phút Thể tích môi trường thử cũng thay đổi ở từng môi trường và thường là 900ml

Bảng 1.2 Môi trường được sử dụng trong mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH

pH 1,2 pH

6,4

pH 7,2

pH 1,2 pH

4,6

Bảng 1.3 Tốc độ khuấy trong mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH

1.4.2 Mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH sử dụng enzyme đại tràng

Mô hình thử giải phóng in vitro sử dụng cũng tương tự mô hình thử giải phóng in

vitro phụ thuộc pH sử dụng enzyme đại tràng Sự thay đổi là môi trường mô phỏng dịch

đại tràng có các enzyme: galactomanase, pectinase…

Bảng 1.5 Enzyme sử dụng trong mô hình thử giải phóng in vitro dựa trên cơ sở phụ

thuộc pH sử dụng enzyme đại tràng

Loại enzyme Galactomannanase [21], [17]

Pectinase [22], [6], [2], [30]

beta-galactosidase [38]

Sau 5h [21], [17], [6], [23]

Thời điểm cho

enzyme

Nồng độ enzyme 9,68 U / L [21]

1.4.3 Mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH bổ sung dịch đại tràng động vật

Khi sử dụng mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH bổ sung dịch đại tràng

động vật, điều kiện thử thay đổi, thể tích thử thường giảm đi nhiều so với mô hình thử phụ thuộc pH

Bảng 1.6 Mô hình thử giải phóng in vitro phụ thuộc pH bổ sung dịch đại tràng động vật

Sinha và

cộng sự

(2005) [40]

02h: 150ml pH 1,2 25h: 200ml pH 6,8 524h: 200ml pH 6,8 có bổ sung dịch manh tràng chuột 4%

+Cốc 250ml đặt trong thiết bị thử hòa tan

Hawei và

cộng sự

(2008) [43]

02h: 150ml pH 1,2 25h: 200ml pH 6,8 524h: 200ml pH 6,8 có bổ sung dịch manh tràng chuột với nồng độ 4% có sục khí CO2

để suy trì tình trạng hiếm khí

+ tốc độ 100 vòng/phút + Thiết bị kiểu cánh khuấy

Lei Jin và

cộng sự

(2016) [22]

02h: 900ml pH 1,2 25h: 900ml dung dịch pH 6,8

Từ 5h: 100ml pH 6,8 có bổ sung dịch manh tràng chuột với nồng độ 4%

+ Tốc độ: 100 vòng/phút + Thiết bị kiểu giỏ quay

Từ các tài liệu tham khảo trên ta thấy, chưa có sự thống nhất trong cách thử hòa tan viên giải phóng tại đại tràng Vì vậy việc xây dựng điều kiện thử hòa tan phù hợp là cần thiết để phản ánh sự vận chuyển của viên giải phóng tại đại tràng trong đường tiêu hóa

Thuốc giải phóng tại đại tràng là thuốc kiểm soát giải phóng, do đó nếu không có quy định cụ thể thì ít nhất phải thử hòa tan trong 2 môi trường: 2 giờ đầu trong môi trường HCl 0,1N pH 1,2; sau đó chuyển sang hệ đệm phosphat 6,8 và thử giải phóng đến khi giải phóng 90% dược chất

Thông số hòa tan thuốc giải phóng tại đại tràng thường tính theo T10, T50, T90 (tương ứng thời điểm thuốc giải phóng 10, 50, 90% dược chất) Trong đó T10 là quan trọng nhất vì đây chính là Tlag của hệ, tiêu chí đặc trưng nhất của thuốc giải phóng tại đại tràng Trong thời gian đó dạng thuốc không giải phóng quá 10% dược chất vào môi trường hòa tan

1.5 Giải phẫu bệnh ex vivo

Thử trên động vật thí nghiệm (thường là chuột) Gây viêm đại tràng động vật thử, đánh giá, so sánh mức độ tổn thương và myeloperoxidase (MPO) của động vật thử và động vật đối chứng sau dùng thuốc

Hong Zhou và cộng sự (2018) đã lựa chọn mô hình chuột viêm đại tràng do TNBS để

đánh giá công thức mới của budesonide về tổn thương đại tràng Chuột SD đực được gây viêm đại tràng bằng cách: sau khi gây mê bằng ether nhẹ, chuột được đặt ống thông 8 cm

và TNBS hòa tan trong ethanol (40% v/v) được truyền vào đại tràng (100 mg/kg) từ từ trong tổng thể tích 0,5 mL Vào ngày thứ 8, tất cả các con vật bị giết, đại tràng đã được cắt

bỏ, và một đoạn 10 cm của đại tràng xa đến trực tràng được cắt bỏ và rửa sạch trong nước muối lạnh băng Đánh giá mức độ tổn thương và myeloperoxidase (MPO) [48]

1.6 Theo dõi và đánh giá giải phóng in vivo thuốc giải phóng tại đại tràng

Quá trình vận chuyển giải phóng dược chất của thuốc giải phóng tại đại tràng có thể được theo dõi bằng một số phương pháp sau:

1.6.1 Hình ảnh X-quang

Thử trên người tình nguyện khỏe mạnh hoặc động vật thí nghiệm (thường là chó) Cho người thử hoặc động vật thử uống mẫu có thêm chất cản quang, sau đó chụp X-quang

để theo dõi vị trí và thời điểm giải phóng dược chất của thuốc sau khi uống

Các thí nghiệm xác định vị trí thuốc viên trong đường tiêu hóa đã sử dụng:

Bảng 1.7 Các thí nghiệm xác định vị trí thuốc viên trong đường tiêu hóa sử dụng

5-Gande S ,Rao

YM (2011) [16]

Tiến hành xác định vị trí và Tlag của viên nổi ma trận Baclofen bào chế theo phương pháp tạo hạt ướt, sử dụng chất cản quang BaSO4 Hình ảnh X quang ở sáu tình nguyện viên khỏe mạnh ở người cho thấy thời gian duy trì trung bình của thuốc là 5,50 ± 0,7 giờ cho công thức được chọn

1.6.2 Đo độ tắt gamma

Đồng vị phóng xạ (hay dùng Techtinium) được phối hợp với dược chất trong hệ, sau đó cho động vật hoặc người tình nguyện uống sau đó chụp ảnh dạng thuốc trong đường tiêu hóa

Bảng 1.8 Các thí nghiệm xác định vị trí thuốc viên trong đường tiêu hóa sử dụng đo độ

5-6 người khỏe mạnh tình nguyện, kết quả cho thấy viên còn nguyên vẹn khi đi qua môi trường dạ dày, ruột non, bắt đầu tan rã ở đại tràng với

Ngoài ra còn 1 số phương pháp chụp hình ảnh khác như chụp huỳnh quang, chụp

CT, chụp PET, chụp MRI… Các phương pháp này có thể cho hình ảnh ba chiều tuy nhiên, chi phí cao, không phù hợp với điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam

Bên cạnh các công cụ hình ảnh, một số nghiên cứu đánh giá in vivo bằng cách xác

định nồng độ dược chất trong huyết tương và dịch đại tràng

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Nguồn gốc và tiêu chuẩn của nguyên liệu dùng trong nghiên cứu được tóm tắt trong bảng:

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị

Máy xác định độ ẩm nhanh Precica

Cân kỹ thuật SATORIUS TE212 (Đức)

Cân phân tích SATORIUS BP212 (Đức)

Máy dập viên tâm sai ERWEKA

Máy đo độ cứng ERWEKA TBH

Máy đo pH INOLAB

Máy thử độ hòa tan ERWEKA – DT600

Máy đo quang UV-Vis

Máy siêu âm Ultrasonic LC60H

Nồi bao truyền thống

Tủ sấy BINDER, HERAUES

Máy chụp X-quang cố định cao tần AS 500-RS 500mA-125kV

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Bào chế viên bao Berberin clorid giải phóng tại đại tràng có thêm chất cản quang

- Đánh giá khả năng giải phóng của viên có chất cản quang

+ Kiểm tra ảnh hưởng của chất cản quang đến định lượng

+ Đánh giá khả năng giải phóng in vitro trên viên có chất cản quang

- Thử khả năng giải phóng in vivo viên bao có chất cản quang

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng

2.3.1.1 Định lượng dược chất

Bằng phương pháp đo quang

Tiến hành xây dựng đường chuẩn:

- Cân chính xác 0,02 gam berberin clorid cho vào bình định mức 100ml Thêm khoảng 80ml dung dịch môi trường (nước; pH 1,2; pH 6,8) siêu âm cho tan hoàn toàn Thêm dung dịch môi trường tương ứng vừa đủ vạch 100ml, lắc đều

- Pha loãng thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 µg/ml trong nước cất

- Đo độ hấp thụ của các dung dịch này ở bước sóng 345nm Mẫu trắng là dung dịch môi trường tương ứng

Từ kết quả thu được, xây dựng phương trình hồi quy thực nghiệm, vẽ đồ thị biểu thị sự tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ berberin clorid trong các môi trường khác nhau

2.3.1.2 Ảnh hưởng của chất cản quang đến kết quả định lượng

Chuẩn bị các mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn như sau:

- Mẫu trắng: nước cất

- Mẫu chuẩn 1: Berberin clorid chuẩn (C=5µg/ml)

- Mẫu chuẩn 2: Berberin clorid chuẩn (C=5µg/ml) có thêm tá dược trong viên nhân với nồng độ tương đương với nồng độ cao nhất trong dịch đã xử lí đem đo quang

Đem đo độ hấp thụ của các dung dịch mẫu chuẩn 1, mẫu chuẩn 2 ở bước sóng 345nm

2.3.1.3 Xác định tỉ lệ thu hồi

Tỉ lệ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại chất phân tích sau quá trình xử lí mẫu Tỷ lệ thu hồi được xác định bằng cách so sánh đáp ứng các mẫu chuẩn thêm vào nền mẫu và xử lí mẫu với nồng độ thực của chất chuẩn tinh khiết không qua xử lí mẫu tiến hành trên 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao

- Cách tiến hành: Hòa tan viên trong 200ml nước cất Đem lọc qua giấy lọc thô

- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 0,05g berberin clorid vào bình định mức 50ml Thêm khoảng 40ml nước cất, siêu âm cho tan hoàn toàn Thêm nước cất vừa đủ vạch 50ml, lắc đều

- Mẫu thử 1: Hút chính xác 1ml dịch lọc pha loãng với nước cất trong bình định mức 100ml

- Mẫu thử 2: Hút chính xác 1ml dịch lọc và 1ml dung dịch chuẩn gốc pha loãng với nước cất trong bình định mức 100ml

- Mẫu thử 3: Hút chính xác 1ml dịch lọc và 2ml dung dịch chuẩn gốc pha loãng với nước cất trong bình định mức 100ml

- Mẫu thử 4: Hút chính xác 1ml dịch lọc và 5ml dung dịch chuẩn gốc pha loãng với nước cất trong bình định mức 100ml

- Mẫu trắng: nước cất

Tiến hành đo độ hấp thụ của các mẫu ở bước sóng 345nm

Tính độ thu hồi theo công thức:

R% = 𝐶𝑚+𝑐−𝐶𝑚

𝐶 𝑐 × 100%

Trong đó: R%: độ thu hồi (%); Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn;

Cm:Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử; Cc: Nồng độ chuẩn thêm lí thuyết

Theo tiêu chuẩn của hội đồng Châu Âu về độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau, Nếu hàm lượng >0.0001%, độ thu hồi chấp nhận trong khoảng 80-110%

2.3.2 Phương pháp bào chế viên nhân

2.3.2.1 Công thức viên nhân

Chuẩn bị các nguyên liệu bào chế viên nhân theo công thức sau:

Bảng 2.2 Công thức bào chế viên nhân

Nguyên liệu Không có chất cản quang (mg) Có chất cản quang (mg)

Trong đó, công thức viên nhân không có chất cản quang bào chế theo công thức tối

ưu được xây dựng từ đề tài “Nghiên cứu bào chế viên nén berberin clorid giải phóng tại đại tràng bằng phương pháp bao bồi từ pectin” của DS Nguyễn Thị Hồng Thúy Công thức

viên nhân có chất cản quang giữ nguyên các thành phần so với công thức viên nhân không

có chất cản quang, có thêm BaSO4 và xenetic

2.3.2.2 Sơ đồ bào chế viên nhân

Viên nhân berberin clorid được bào chế bằng phương pháp tạo hạt ướt

60oC/24h Sửa qua rây 1,0 mm