NGUYỄN THỊ AN xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH các THUỐC KHÁNG HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG dược BẰNG LC MSMS và TLC

Tập hợp khả năng phân tách chất của sắc ký lỏng LC và khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ MS, phương pháp cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp trong phân tích trên nền mẫu phứ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ ĐỨC MƯỜ

NGUYỄN THỊ AN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC KHÁNG

HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-

MS/MS VÀ TLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ AN

Mã sinh viên : 1401004

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC KHÁNG

HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-

MS/MS VÀ TLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

2 Dược sĩ Phạm Thị Thanh Tuyền

Nơi thực hiện:

1 Viện Khoa học hình sự - Bộ Công An

2 Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị cán bộ, sự ủng hộ của gia đình và bạn bè

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS

Nguyễn Thị Kiều Anh và Dược sĩ Phạm Thị Thanh Tuyền, là những người trực tiếp

hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi xin được cảm ơn PGS.TS Nguyễn Xuân Trường và các anh chị cán bộ Trung

tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã hỗ trợ cho tôi về thiết

bị LC-MS/MS để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Công ty Cổ phần Traphaco đã giúp đỡ tôi trong quá trình tạo nền mẫu nghiên cứu, xin được cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị cán

bộ Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện về trang thiết bị, máy móc để

hỗ trợ tôi suốt trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo đại học cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy

dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm

và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 11 tháng 06 năm 2019

Nguyễn Thị An

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

1.1.1 Nhóm thuốc đối kháng thụ thể Histamin H1 3

1.1.2 Dược liệu và chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng 5

1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC 6

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

1.3.1 Phương pháp LC-MS/MS 9

1.3.2 Phương pháp TLC 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 14

2.1.1 Hóa chất – chất chuẩn 14

2.1.2 Máy móc – trang thiết bị 14

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 16

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 16

2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 17

2.2.4 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu được 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp LC-MS/MS 19

3.1.1 Xây dựng phương pháp LC-MS/MS 19

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 21

3.1.3 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS 22

3.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp TLC 28

3.2.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 28

3.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 29

3.2.3 Thẩm định phương pháp TLC 30

3.3 Ứng dụng phân tích trên mẫu thưc 33

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37

4.1 Tạo nền mẫu 37

4.2 Xây dựng phương pháp phân tích 37

4.2.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 37

4.2.2 Xây dựng phương pháp 38

4.2.3 Xử lý mẫu 39

4.3 Thẩm định phương pháp 39

4.3.1 Thẩm định phương pháp 39

4.3.2 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS 40

4.4 Ứng dụng 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

1 Phụ lục 1: Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của các chất phân tích

2 Phụ lục 2: Kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu

3 Phụ lục 3: Chế tạo nền mẫu và hình ảnh các nền mẫu

4 Phụ lục 4: Danh mục các chế phẩm đông dược được phân tích

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt

AOAC Association of Official

CLO Chlorpheniramin maleat

CYP Cyproheptadin hydroclorid

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC High Performance Thin Layer

Chromatography Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

ICH International Conference on

Harmonisation Hội nghị hòa hợp quốc tế

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

LOR Loratadin

PA Pure Analysis Tinh khiết phân tích

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

UHPLC Ultra High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu suất siêu cao

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng 5

Bảng 1 2 Một số nghiên cứu phân tích các thuốc kháng histamin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược 7

Bảng 2 1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 14

Bảng 3 1 Các thông số máy khối phổ 19

Bảng 3 2 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích 19

Bảng 3 3.Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient 20

Bảng 3 4.Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) 22

Bảng 3 5.Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất nghiên cứu 24

Bảng 3 6 Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày trên 3 nền mẫu (n=7) 26

Bảng 3 7 Kết quả độ đúng và độ chính xác khác ngày trên 3 nền mẫu (n=7) 26

Bảng 3 8 Kết quả LOD và LOQ trên 3 nền mẫu 28

Bảng 3 9 Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động TLC 29

Bảng 3 10 Kết quả định tính trên mẫu thực bằng LC-MS/MS và TLC 34

Bảng 3 11.Kết quả đánh đánh giá các mẫu thực dương tính bằng LC-MS/MS 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 10

Hình 1 2 Sơ đồ sự tạo thành ion dương trong ESI 10

Hình 1 3 Bộ phân tích tứ cực 11

Hình 1 4 Mô hình bộ phân tích tứ cực chập ba 11

Hình 3 1 Sắc ký đồ khảo sát điều kiện khối phổ và sắc ký LC-MS/MS 21

Hình 3 2.Quy trình xử lý mẫu 22

Hình 3 3 Sắc ký đồ độ đặc hiệu trên nền N1 24

Hình 3 4 Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD trên nền N3 27

Hình 3 5 Kết quả khảo sát tối ưu hệ 1 30

Hình 3 6 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp TLC 31

Hình 3 7 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của betamethason và dexamethason lên việc phát hiện CLO, CYP, LOR 32

Hình 3 8 Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện của phương pháp TLC 33

Hình 3 9 Kết quả phân tích mẫu thực bằng TLC 34

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị ứng ngày nay được coi là bệnh của cuộc sống hiện đại, đặc biệt trong bối cảnh

ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng Tỉ lệ mắc bệnh dị ứng và hen suyễn đang gia tăng trên toàn thế giới, đặc biệt là là các nước có thu nhập bình quân đầu người thấp và trung bình [28] Hơn nữa, sự phức tạp và mức độ nghiêm trọng của các bệnh dị ứng, bao gồm hen suyễn, tiếp tục gia tăng đặc biệt là ở trẻ em và thanh niên [28] Hiện trên thế giới có khoảng một tỉ người mắc dị ứng [32], trong đó có 300 triệu người bị hen suyễn,

400 triệu người viêm mũi dị ứng [28] Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc dị ứng là khoảng 20% dân

số cả nước [33] Nhóm thuốc được sử dụng phổ biến để điều trị dị ứng là nhóm kháng histamin Nhóm thuốc này có thể gây ra các tác dụng không mong muốn nghiêm trọng như: buồn ngủ, khô mắt, dị ứng, lệ thuộc thuốc [3] Đặc biệt khi được trộn lẫn vào các chế phẩm đông dược và dùng trong thời gian dài thì sẽ càng làm trầm trọng hơn các tác dụng không mong muốn Trong nhóm thuốc kháng histamin, thì các thuốc thuộc thế hệ

1 bên cạnh tác dụng điều trị dị ứng còn có tác dụng an thần, giúp người bệnh dễ chịu và ngủ ngon, do đó có nguy cơ trộn cao hơn thế hệ 2 Chlorpheniramin, cyproheptadin, và loratadin là 3 thuốc kháng histamin thế hệ 1 có liều dùng thấp, rẻ tiền, dễ mua, là lựa chọn đầu tay khi điều trị dị ứng nên có khả năng bị trộn trái phép cao trong chế phẩm đông dược

Sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng (TPCN) có nguồn gốc từ đông dược thay thế cho các chế phẩm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược đang là một xu thế phổ biến ở Việt Nam và trên thế giới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% người dân

ở các nước đang phát triển sử dụng thường xuyên các thuốc cổ truyền trong chăm sóc sức khỏe [20] Nhiều chế phẩm đông dược đã được đưa vào thị trường để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe của người dân, tuy nhiên, trong đó vẫn tồn tại nhiều chế phẩm pha trộn với tân dược [15], [20] Các tân dược được tìm thấy điển hình là thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid… [14], [21], [24], [30] Trong đó, đã có một số công bố về các thuốc chống dị ứng bao gồm nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 như chlorpheniramin, cetirizin, diphenylhydramin, loratadin… [21], [26], [29]

2

Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện tân dược trộn lẫn trong đông dược, chủ yếu thuộc các nhóm giảm đau chống viêm không steroid, hạ huyết áp, hạ đường máu, glucocorticoid [7], [8], [10], [11], nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu nào về việc trộn lẫn các tân dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 trong chế phẩm đông dược được công bố

Các phương pháp hay được sử dụng trong phát hiện tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) TLC có thể phân tích nhiều mẫu cùng một lúc, quy trình xử lý mẫu đơn giản, thường dùng trong giai đoạn sàng lọc Tuy nhiên những phương pháp trên vẫn còn hạn chế như có thể cho kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả Hiện nay, phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS) là một phương pháp phân tích hiện đại ở Việt Nam, đang từng bước được ứng dụng rộng rãi trong phân tích và kiểm nghiệm thuốc Tập hợp khả năng phân tách chất của sắc ký lỏng (LC) và khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ (MS), phương pháp cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp trong phân tích trên nền mẫu phức tạp như chế phẩm đông dược

Với mục đích góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Xây dựng phương pháp xác định các thuốc kháng histamin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS và TLC” Với mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid, loratadin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng rắn bằng LC-MS/MS và TLC

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định các dược chất trên trộn trái phép trong một số chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Nhóm thuốc đối kháng thụ thể Histamin H1

Trên lâm sàng thuốc kháng histamin H1 dùng để ngăn ngừa các biểu hiện dị ứng, ngăn ngừa chứng say tàu xe Vài thuốc kháng histamin H1 khác còn có thể dùng để điều trị ốm nghén, chúng có tác dụng chống nôn và chống dị ứng

Thuốc kháng histamin H1 có 2 thế hệ Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 như: chlorpheniramin, diphenhydramin thường có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương gây an thần, tuy nhiên mức độ tác dụng không giống nhau giữa các thuốc và các cá thể Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 2 như: loratadin, cyproheptadin hầu như không có tác dụng này

Tác dụng không mong muốn:

Thay đổi tuỳ theo từng cá thể, thường biểu hiện ức chế thần kinh (ngủ gà, khó chịu, giảm phản xạ, mệt), chóng mặt, thường gặp ở các thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 Tác dụng an thần trên gây nguy hiểm cho người sử dụng thuốc khi lái tàu, xe, làm việc trên cao, công việc cần sự tỉnh táo

Các kháng histamin H1 làm tăng tác dụng của rượu và các thuốc ức chế thần kinh trung ương, gây chóng mặt, mệt mỏi, mất sự phối hợp nhịp nhàng, ù tai, bồn chồn, tăng

co giật (động kinh) ở trẻ em Ở cùng liều điều trị, các thuốc thế hệ 2 ít gây tác dụng không mong muốn hơn

Các kháng histamin H1 thế hệ 1 còn có tác dụng kháng cholinergic nên gây khô miệng, họng và mũi Ngoài ra còn gây căng ngực, đau đầu Trên tiêu hóa, gây ăn kém ngon, nôn, buồn nôn, tiêu chảy…

1.1.1.1 Chlorpheniramin maleat

- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C16H19ClN2.C4H4O4 (M=390,9)

- Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần x 3-4 lần/ngày Tối đa 0,5 mg/kg/24 giờ [4]

5

- Liều dùng : Người lớn và trẻ em từ 12 tuổi trở lên : dùng 1 lần trong ngày, liều 10 mg [5]

1.1.2 Dược liệu và chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều các chế phẩm đông dược có số đăng ký có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa Chúng đa dạng về thành phần các loại dược liệu cũng như dạng bào chế (viên hoàn, thuốc bột, viên nang, cốm tan) Một số vị dược liệu và chế phẩm đông dược có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị

dị ứng, mề đay, mẩn ngứa theo ‘Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được Bộ Y tế ban hành’ do bộ trưởng Bộ y tế ban hành ngày 31/10/2016 được minh họa trong bảng dưới đây :

Bảng 1 1 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng

1 Kim ngân hoa Flos Lonicerae Hoa

2 Liên kiều Fructus Forsythiae Quả chín

3 Bồ công anh Herba Taraxaci Toàn cây

4 Thổ phục linh Smilax glabra Thân rễ

5 Phòng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae Rễ

6 Kinh giới Spica Elsholtziae Phần trên mặt đất

8 Ngưu bàng tử Fuctus Arctii Quả chín

10 Ké đầu ngựa Fructus Xanthii strumarii Quả

11 Đạm đậu xị Semen Sojae praeparata Hạt

12 Đơn lá đỏ Folium Excoecariae Lá

13 Hoàng bá Cortex Phellodendri Vỏ thân

14 Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii Thân rễ

15 Thuyền thoái Periostracum Cicadae Xác của con ve sầu

ở các nước đang phát triển sử dụng thường xuyên các thuốc cổ truyền trong chăm sóc sức khỏe [20] Tuy nhiên sự pha trộn tân dược vào trong các bài thuốc cổ truyền đang

là thách thức lớn cho các cơ quan quản lý thuốc khi có nhiều báo cáo về các rủi ro ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe do các chế phẩm từ đông dược được khẳng định là hoàn toàn tự nhiên gây ra Các tân dược được tìm thấy điển hình là thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid… [14], [21], [24], [30]

Nhóm thuốc kháng histamin H1 cũng được cho thấy là hay bị trộn vào các chế phẩm đông dược vì tác dụng chống dị ứng và tác dụng an thần của nó Một nghiên cứu

ở Mỹ chỉ ra rằng trong số 243/260 loại thuốc đông dược ở châu Á đã được thu thập từ các cửa hàng thảo dược bán lẻ ở California, có 17 loại (7%) chứa tân dược không được khai báo Trong đó, chlorpheniramin là 1 trong 4 loại tân dược không khai báo phổ biến nhất [27] Ở Trung Quốc, YE Lin-hu và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát 7 antihistamin bao gồm loratadin, diphenhydramin hydrochlorid, cyproheptadin hydrochlorid, cetirizin hydrochlorid, promethazin hydrochlorid, mizolastin, and chlorpheniramin maleat trên 9 loại chế phẩm thảo dược, kết quả đã xác định 4 mẫu chế phẩm đã bị lẫn với các antihistamin trên [29] Ở Hàn Quốc, Jung Yeon Kim và cộng sự

sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát trên 117 mẫu chế phẩm chăm sóc sức khỏe

và đã phát hiện 1 mẫu chứa diphenhydramin [26]

Các phương pháp phổ biến xác định các thuốc kháng histamin trộn trong chế phẩm đông dược đã tham khảo được tổng hợp trong bảng sau:

Trà thảo

dược

Chlorpheniramin UHPLC – MS/MS

Cột XBridge BEH C18 (100 mm x 2,1 mm;

3,5 μm) Pha động: acetonitril /0,1% acid formic (tt/tt)

Chiết mẫu bằng acetonitril, tinh chế theo quy trình

Pha động: 0,1% acid formic trong nước và 0,1% acid formic trong acetonitril Detector:

ESI-MS

Chiết mẫu bằng methanol, siêu

LC-MS/MS Cột Agilent Eclipse Plus C18 (2,1 mm × 50 mm; 3,5 μm）

Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút

Pha động: 0,1% acid formic trong nước và 0,1% acid formic trong acetonitril

Detector: ESI-MS

Chiết mẫu bằng methanol 80%, siêu âm 30 phút, ly tâm

LC-MS/MS Cột: Superspher 100 RP-18 (125 × 3 mm; 4 µm), cột bảo vệ:

Chiết mẫu bằng dung môi:

MeOH hoặc isopropanol :

[14]

8

Superspher 100 RP-18 (4 × 4 mm; 4 µm) Thể tích tiêm: 25 µl Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

Pha động: ACN và đệm amoni format 10

mM (pH 3,0) (gradient) Detector: ESI-MS

dichlormethan (1:9)

Tác động: Siêu

âm, lắc quay, ly tâm

Nhiệt độ sắc kí: 25 ˚C Pha động: ethyl acetat : ammoniac 28% trong nước (10:1)

Thể tích chấm: 10µl

Detector: DCBI-MS

Mẫu rắn: thêm dung môi EtOH, lắc tạo nhũ tương

Mẫu lỏng: đưa trực tiếp vào hệ sắc kí

Epinastin, Azelastin, Cyproheptadin, Hydroxyzin, Fexofeadin, Diphenhydramin, Levocetirizin, Cetrizin, Loratadin, Olopatadin,

UHPLC-Q/TOF-MS Cột: Waters ACQUITY® UPLC BEH C18 column (150×2.1mm, 1.7 μm)

Thể tích tiêm: 2µL Tốc độ dòng: 0.30 mL/phút

Pha động: 0,1% acid formic trong nước và 0,1% acid formic trong acetonitrile

Detector: Q/TOF – MS

Mẫu được thêm Na2CO3

pH=10, dịch thu được đem chiết lỏng lỏng với

ethylacetate

Lấy phần dịch thân dầu đem

cô cắn rồi hòa tan cắn vào hỗn hợp dung môi acid formic 0,1% : MeOH (1:1)

[25]

9

Dimemhydrinat, Acrivastin, Promethazin, Clemastin, Terfenadin, Ebastin

mm, 5 μm)

Pha động: 0,1% acid acetic trong nước và 0,1% acid acetic trong acetonitrile

Thể tích tiêm: 10 µl Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

Detector: IT/TOF-MS

Mẫu chiết bằng methanol, sau

đó dịch chiết đem đi chiết lỏng lỏng với acetonitrile chưa 1% acid formic

Tác động: ly tâm, lắc xoáy

Phân tích khối phổ có tính chọn lọc, độ nhạy, độ đặc hiệu cao Giới hạn phát hiện (LOD) có thể đến 10-14 gam Do vậy, phân tích khối phổ càng được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ như xác định các đồng vị, xác định công thức cấu tạo, định tính, định lượng các chất có trong dịch sinh học và trong các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên Đặc biệt dùng để phân tích hàm lượng vết trong mẫu có thành phần phức tạp [1], [9]

Phương pháp khối phổ là phương pháp phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỷ số giữa khối

Hình 1 2 Sơ đồ sự tạo thành ion dương trong ESI

3, Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Có nhiều bộ phận phân

Q3: bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện

Thiết bị khối phổ ba tứ cực gọi là máy khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

4, Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

Q1 Q2 Q3 Q0

12

5, Bộ phận ghi và xử lí số liệu (data system):

Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục

vụ xử lỹ dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng… Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm:

- SCAN: khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion

để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích

- SIM (Selected Ion Monitoring): trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

- SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring):

SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất , phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

Ưu điểm của phương pháp LC-MS/MS:

- Phát huy được thế mạnh của cả sắc ký lỏng (thời gian lưu) và khối phổ (phát hiện chất dựa vào tỷ số m/z) nên có tính đặc hiệu cao

- Trên nền mẫu có tính chất phức tạp như chế phẩm đông dược, LC-MS/MS là

kỹ thuật có độ nhạy vượt trội có khả năng loại bỏ được ảnh hưởng của nền mẫu

Hạn chế:

Giá thành cao, thiết bị phức tạp

1.3.2 Phương pháp TLC

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật sắc ký dùng để tách các chất trong hỗn hợp nhiều thành phần, được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó

đã có hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 - 30

µm, được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất, dày khoảng 250 µm trên giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex, trong đó được dùng phổ biến nhất là silica (SiO2) và nhôm oxyd

13

Pha động thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký Cơ chế tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế, tùy thuộc vào tính chất của hai pha Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2 - 3 dung môi Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn Các chất phân tích sẽ

di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng, có vị trí khác nhau trên bản mỏng Đại lượng đặc trưng cho mức

độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng

tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường di chuyển của pha động [1]

Rf = dR /dM

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf: có giá trị dao động giữa 0 và 1

Ưu điểm của TLC:

- Chi phí thấp, thiết bị đơn giản

- Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước khi cho các dung môi như lọc và khử khí, lượng tiêu thụ pha động thấp cho mỗi mẫu

Hạn chế của TLC:

Nền mẫu đông dược rất phức tạp, thành phần đa dạng, các thành phần trong dược liệu có thể xuất hiện tại vị trí phát hiện chất phân tích nên có thể xảy ra hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả khi phương pháp không đáp ứng về độ nhạy

Độ lặp lại của Rf thấp do thành phần pha động thay đổi khi tiến hành sắc ký đối với dung môi dễ bay hơi

14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất – chất chuẩn

Bảng 2 1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

STT Nguyên liệu Tiêu

Chuẩn VKNTTW SKS: WS.0317032.03 HL: 99,10%

2 Cyproheptadin

hydrochlorid

Chuẩn PTN

Chuẩn VKNTTW SKS: 0102126 HL: 100,64%

3 Loratadin Chuẩn

PTN

Chuẩn VKNTTW SKS: SKS 0108242 HL: 99,6%

Hóa

chất

4 Acetonitril HPLC Merck - Đức

2.1.2 Máy móc – trang thiết bị

- Bình khai triển sắc kí TLC CAMAG

- Bản mỏng silicgel GF254 của Merck – Đức

- Máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ LC/MS/MS: Triple Quadrupole BRUKER EVOQ Qube – Mỹ

Và các dụng cụ khác

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

* Mẫu thử: Các chế phẩm đông dược và thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào

chế viên nang cứng, viên hoàn, thuốc bột có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các trường hợp mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đang lưu hành tại Việt Nam

- Dạng bào chế: viên hoàn, viên nang cứng, thuốc bột

* Mẫu trắng: 3 nền mẫu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

được xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đã công bố Cả 3 nền mẫu được chế tạo tại Công ty Cổ phần Traphaco – Hà Nội

- Nền N1 (viên hoàn): Dựa vào bài thuốc cổ tryền Ngân kiều tán trong sách Ôn bệnh điều biện và Dược điển Việt Nam V, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều trị, gồm 9 loại dược liệu như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, bạc hà, đạm trúc diệp, kinh giới tuệ, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều, vê thành viên, bao màu, sấy khô, đóng gói

- Nền 2 (bột cốm): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Liên kiều bại độc tán trong sách Thương hàn toàn sinh tập gồm 14 loại dược liệu như sau: liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu, thêm tá dược tạo khối ẩm, xát hạt qua rây, sấy hạt, sửa hạt, đóng gói

- Nền 3 (viên nang): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Tiêu phong tán trong sách Y tông kim giám, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều trị, gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều tạo khối ẩm, rây qua rây tạo hạt, sấy hạt, thêm tá dược thích hợp, đóng nang

* Mẫu tự tạo: Mẫu trắng có thêm các chất phân tích với tỉ lệ nhất định

16

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

* LC-MS/MS: Dựa vào tính tan của các chất phân tích và một số nghiên cứu đã

công bố [6], [22], [26], [14], [19], [29] tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc hóa dược từ nền mẫu qua các bước sau:

- Khảo sát dung môi chiết: MeOH, EtOH, ACN, hỗn hợp MeOH : H2O theo các

tỉ lệ khác nhau

- Khảo sát thời gian siêu âm: 5 – 15 phút

Quy trình chiết xuất các đối tượng nghiên cứu đối với LC-MS/MS gồm các bước như sau:

- Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng 1/10 liều dùng vào ống falcon 50 ml, thêm chính xác 25 ml dung môi chiết, lắc đều

- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong pha loãng tới nồng

độ thích hợp bằng MeOH, lọc qua màng lọc 0,22 µm, tiến hành phân tích

* TLC: Dựa trên kết quả khảo sát dung môi chiết và thời gian siêu âm của phương

pháp LC-MS/MS, xây dựng quy trình chiết xuất các đối tượng nghiên cứu đối với TLC gồm các bước như sau:

- Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng ½ liều dùng vào ống falcon 50 ml, thêm chính xác 20 ml dung môi chiết, lắc đều

- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong pha loãng tới nồng

17

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa, ion mẹ, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định tính, định lượng Khảo sát, tìm điều kiện khối phổ phân tích đồng thời 3 chất nghiên cứu trên

- Khảo sát điều kiện sắc ký: Lựa chọn pha động, cột sắc ký, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng để có thể tách và phát hiện đồng thời các chất phân tích ở nồng

độ ng/ml, các pic nhỏ gọn, cân xứng, thời gian phân tích không quá dài

2.2.2.2 Xây dựng phương pháp TLC

- Pha tĩnh : sử dụng bản mỏng silicagel 60 GF254 với các kích thước khác nhau

- Pha động : Dựa vào các tài liệu và các nghiên cứu đã công bố, khảo sát các dung môi với tỷ lệ phù hợp đối với các thuốc nghiên cứu

+ Cloroform : MeOH : acid acetic : amoniac (9,5 : 0,5 : 0,1 : 0,1) [12]

+ Dung dịch acid acetic 1M : MeOH : ethyl acetat (20 : 30 : 50) [6]

+ Hexan : acetone : amoniac (5,5 : 4,5 : 0,5) [17]

- Thể tích chấm : 2 µl

- Bước sóng phát hiện : 254 nm

- Lựa chọn hệ dung môi tách riêng các chất, các vết gọn, rõ nét Sau đó, khảo sát

tỷ lệ thành phần pha động để có pha động tối ưu

2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích

2.2.3.1 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 [13] và ICH

2005 [23] trên 3 nền mẫu tự tạo chứa các chất phân tích với các chỉ tiêu :

18

2.2.4 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu được

- Áp dụng phương pháp TLC phát hiện CLO, CYP, LOR trong một số thuốc điều

trị hoặc thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng thu thập trên thị

trường

- Áp dụng phương pháp LC-MS/MS phát hiện CLO, CYP, LOR trong một số chế

phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng thu thập được

trên thị trường Dựa vào thời gian lưu, mảnh mẹ, hai mảnh con, tỷ lệ cường độ hai mảnh

con của mẫu thử so với mẫu chuẩn để xác định sự có mặt của chất phân tích (định tính)

Xác định nồng độ các chất phân tích trên (nếu có) trong các mẫu thử thu thập được dựa

vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của 3 chất phân tích (định lượng)

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu theo phương pháp

TLC được xác định bằng mắt thường dưới ánh đèn UV bước sóng 254 nm, kết quả theo

phương pháp LC-MS/MS xác định bằng phần mềm có sẵn trên thiết bị LC-MS/MS

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích dựa vào các hàm toán

học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Excel 2016 để tính kết quả trung

bình, độ lệch chuẩn (SD), phương sai, độ lệch chuẩn tương đối (RSD), độ thu hồi khi

xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp

19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp LC-MS/MS

3.1.1 Xây dựng phương pháp LC-MS/MS

3.1.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Với kỹ thuật ion hóa ESI ở chế độ ion dương, các ion mẹ thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+ hay thêm hai proton [M-2H]++ Từ ion mẹ đã xác định được, tiến hành bắn phá để lựa chọn các ion con dùng cho định tính và định lượng

Tiêm không qua cột vào hệ thống MS các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ 5 µg/ml để xác định ion mẹ và các ion con Các điều kiện phân mảnh ion, năng lượng bắn phá phân mảnh (CE) được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ Lựa chọn 2 ion con

có tín hiệu lớn, ổn định để định tính và định lượng, trong đó ion con có tín hiệu lớn và

ổn định hơn làm ion định lượng, ion con còn lại dùng để định tính Điều kiện khối phổ lựa chọn được trình bày trong các bảng sau:

Bảng 3 1 Các thông số máy khối phổ

Thông số Giá trị tối ưu (đơn vị)

Điện áp đầu phun 4500 V

Khí ion hóa 1 40 psi Nhiệt độ ion hóa 250C Khí ion hóa 2 45 psi

Bảng 3 2 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích

Tên chất Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) CE (eV) Tỷ lệ (%)

20

Nhận xét: từ bảng 3.1 và 3.2, xác định được điều kiện MS/MS để phân tích các chất CLO, CYP, LOR Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ của 3 chất phân tích đều ở dạng [M-H]+ có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z=M+1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất Từ đó, mỗi chất phân tích được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định tính Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo quy định của châu Âu (2002/657/EC) với số điểm nhận dạng (IP) là 4 (1 ion mẹ - 1 điểm và 2 ion con – mỗi ion 1,5 điểm) [16]

3.1.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Tiến hành khảo sát các điều kiện sau:

- Cột sắc ký: 2 loại cột là Cột Ultra II C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) và cột InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm)

- Pha động:

+ Thành phần: khảo sát 2 pha động:

MP1: Acid formic 0,1% /nước (A) và acetonitril (B) MP2: Acid formic 0,1% /nước (A) và acid formic 0,1% /acetonitril (B) + Tỷ lệ pha động: khảo sát chế độ đẳng dòng 50:50 (A:B) và các chế độ gradient sau:

Bảng 3 3.Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient

% A % B

Thời gian (phút)

21

- Thể tích tiêm mẫu: 2 µl

- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

- Thời gian phân tích: 12 phút

- Pha động: Kênh A: Acid formic 0,1% /nước

Kênh B: Acetonitril

- Chương trình pha động: Chế độ gradient 3: 0 → 7,5 phút: 15 → 75 % B; 7,5 → 8,5 phút: 75 → 15% B; 8,5 → 12 phút: 15 % B

- Các điều kiện khối phổ theo bảng 3.1 và 3.2

Sắc ký đồ của các chất phân tích ở điều kiện lựa chọn được trình bày trong hình 3.1

Hình 3 1 Sắc ký đồ khảo sát điều kiện khối phổ và sắc ký LC-MS/MS

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Chuẩn bị các mẫu như sau:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong MeOH bao gồm 3 chất CLO, CYP, LOR có nồng độ là 50 ng/ml

- Dung dịch mẫu tự tạo: xác định khối lượng trung bình của mỗi đơn vị nền mẫu, nghiền mịn và làm đồng nhất Cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng cho vào ống falcon 50 ml (0,51 g đối với nền N1; 0,15 g đối với nền N2; 0,33 g với nền N3) Thêm 100 µl dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp CLO, CYP, LOR có nồng độ 0,625 mg/ml vào nền mẫu, lắc nhẹ, để bay hơi dung môi ở điều kiện phòng Thêm chính xác 25ml dung môi chiết, lắc đều Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt độ phòng, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Gạn lấy phần dịch trong ở phía trên, pha loãng 50 lần bằng MeOH để các chất phân tích sau khi xử lý nồng độ mỗi chất

là 50ng/ml Lọc qua màng lọc 0,22 µm và tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS

Khảo sát điều kiện xử lý mẫu bao gồm:

22

- Khảo sát các dung môi chiết như sau: ethanol, methanol – nước (50:50), methanol – nước (70:30), methanol, acetonitril

- Thời gian siêu âm như sau: 5 phút, 10 phút, 15 phút

Mỗi quá trình được thực hiện lặp lại 3 lần Tính độ thu hồi dựa vào diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch thử so với dung dịch chuẩn

Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu để chiết được mẫu với hiệu suất cao, hạn chế tạp trong nền mẫu, nhanh chóng, tiết kiệm chi phí, và phù hợp với điều kiện phân tích

Sau quá trình khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu như sau:

Hình 3 2.Quy trình xử lý mẫu

3.1.3 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS

3.3.1.1 Độ phù hợp của hệ thống

Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm 3 chất CLO, CYP, LOR nồng

độ 50 ng/ml vào hệ thống LC-MS/MS Kết quả phân tích được trình bày ở bảng:

Bảng 3 4.Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6)

a) Thời gian lưu

Hoạt

Trung bình

RSD (%) CLO 3,31 3,31 3,32 3,33 3,32 3,33 3,32 0,27

CYP 4,95 4,96 4,98 4,98 4,98 4,99 4,97 0,30 LOR 5,86 5,86 5,88 5,88 5,88 5,89 5,88 0,21

RSD (%) CLO 2502381 2461180 2467740 2539688 2453072 2460853 2480819 1,36

CYP 639240 634256 634694 650903 649935 618237 637878 1,89

LOR 525189 575266 552556 561180 562834 549068 554349 3,06

Nhận xét: từ bảng 3.4 cho thấy RSD của thời gian lưu thấp (< 1%) và RSD của diện tích pic dao động trong khoảng 1,36 – 3,06 % tùy mỗi chất Như vậy hệ thống đáp ứng theo yêu cầu AOAC 2016 (RSD < 15% với mức nồng độ ≤ 100 ng/ml)

3.3.1.2 Độ đặc hiệu

Phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng cho chất phân tích có 1 ion mẹ (1 điểm)

và 2 ion con với mỗi chất (mỗi ion con 1,5 điểm), điều này phù hợp với quy định của Châu Âu (2002/657/EC) khi có ít nhất 4 điểm IP [16] So sánh thời gian lưu, ion mẹ, 2 ion con, tỷ lệ cường độ 2 ion con định tính và định lượng của mẫu thử so với mẫu chuẩn

để cho kết luận sự có mặt của các chất phân tích trong mẫu thử

Bên cạnh nhóm kháng histamin H1, nhóm glucocorticoid có cũng có tác dụng làm giảm các triệu chứng dị ứng Do đó, nhóm kháng histamin H1 có thể được trộn cùng với glucocorticoid trong các chế phẩm đông dược điều trị dị ứng Dexamethason và betamethason là 2 hoạt chất thuộc nhóm glucocorticoid được sử dụng phổ biến để chống

dị ứng, dễ mua và rẻ tiền, nên 2 chất này có khả năng bị trộn cao Do đó, trong đánh giá

độ đặc hiệu sẽ tiến hành phân tích mẫu có thêm dexamethason và betamethason, để đánh giá ảnh hưởng của 2 chất này đến khả năng xác định CLO, CYP, LOR

Chuẩn bị mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn như sau:

- Mẫu trắng: xử lý nền mẫu theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng

- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm dexamethason và betamethason có nồng độ 30ng/ml; 3 chất CLO, CYP, LOR có nồng độ 50 ng/ml

- Mẫu trắng thêm chuẩn: cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng cho vào ống falcon 50 ml (0,51 g đối với nền N1; 0,15 g đối với nền N2; 0,33 g đối với nền N3) Thêm 100 µl dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp có nồng độ gồm dexamethason và betamethason có nồng độ 0,375 mg/ml; 3 chất CLO, CYP, LOR nồng

độ 0,625 mg/ml vào nền mẫu Tiến hành xử lý mẫu như quy trình xử lí mẫu chung ở mục 3.1.2 Nồng độ các chất phân tích sau ki xử lý tương đương với mẫu chuẩn

lệ thu hồi nằm trong khoảng 80 – 110 % ở mức nồng độ ≤ 100 ppb và trong khoảng 60 – 115 % ở mức nồng độ ≤ 10 ppb)

3.3.1.4 Độ đúng và độ chính xác

Độ đúng và độ chính xác của phương pháp được tiến hành trên 3 nền mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ thấp, trung bình và cao Mỗi mức nồng độ tiến hành lặp lại 7 lần trên 1 nền mẫu để xác định độ đúng và độ chính xác trong ngày Độ đúng và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự như trên nhưng vào một ngày khác

Chuẩn bị dung dịch mẫu tự tạo: cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng cho vào ống falcon 50 ml (0,51 g đối với nền N1; 0,15 g đối với nền N2; 0,33 g đối với nền N3) Thêm chính xác một lượng chuẩn (dung dịch ) vào nền mẫu sao cho các chất phân tích sau khi xử lý ở 3 mức nồng độ 25 – 50 -75 ng/ml

Lượng chuẩn hỗn hợp thêm vào: tương ứng với 3 mức nồng độ thêm chuẩn, lượng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (có nồng độ là 0,625 mg/ml) được thêm vào nền mẫu lần lượt là 50 µl, 100 µl, 150 µl Xử lý mẫu theo quy trình chung ở mục 3.2 Tiến hành phân tích Kết quả được trình bày trong các bảng sau:

(ng)

H (%)

RSD (%)

m tìm lại

(ng)

H (%)

RSD (%)

m tìm lại

(ng)

H (%)

RSD (%)

*: lượng chuẩn trong 1 ml mẫu phân tích

Bảng 3 7 Kết quả độ đúng và độ chính xác khác ngày trên 3 nền mẫu (n=7)

(ng)

H (%) RSD

(%)

m tìm lại

(ng)

H (%)

RSD (%)

m tìm lại

(ng)

H (%)

RSD (%)

27

Nhận xét: từ bảng 3.6 và 3.7 cho thấy:

- Trên nền N1: tỷ lệ thu hồi trong ngày và khác ngày của các chất phân tích ở 3 mức nồng độ thêm chuẩn nằm trong khoảng 90,28 – 103,0 %, giá trị RSD dao động trong khoảng 1,76 – 6,50 %

- Trên nền N2: tỷ lệ thu hồi trong ngày và khác ngày của các chất phân tích ở 3 mức nồng độ thêm chuẩn nằm trong khoảng từ 90,82 – 104,0 %, giá trị RSD dao động trong khoảng 1,51 – 5,84 %

- Trên nền N3: tỷ lệ thu hồi trong ngày và khác ngày của các chất phân tích ở 3 mức nồng độ thêm chuẩn nằm trong khoảng từ 92,19 – 103,0 %, giá trị RSD dao động trong khoảng 2,40 – 5,89 %

Như vậy, phương pháp đã xây dựng cho độ đúng và độ chính xác trên cả 3 nền mẫu đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 (tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 80 – 110 % và RSD < 15 % ở mức nồng độ ≤ 100ppb)

3.3.1.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp bằng cách phân tích các chất ở nồng độ thấp dựa trên giá trị tỷ số tín hiệu/nhiễu nền (S/N)

Thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau vào nền mẫu và tiến hành chiết như quy trình xử lý mẫu chung ở mục 3.1.2 Nồng độ các chất phân tích sau khi xử lý như sau: 0,10 ng/ml; 0,15 ng/ml; 0,20 ng/ml; 0,25 ng/ml; 0,30 ng/ml; 0,35 ng/ml; 0,40 ng/ml; 0,50 ng/ml; 0,75 ng/ml; 1,0 ng/ml

Tiến hành phân tích trên cả 3 nền mẫu, nồng độ tại đó cho tỷ số tín hiệu/ nhiễu nền (S/N) = 3 là LOD và tỷ số tín hiệu/ nhiễu nền (S/N) = 10 là LOQ Kết quả phân tích LOD, LOQ của 3 chất phân tích được thể hiện bảng và minh họa ở hình sau:

Hình 3 4 Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD trên nền N3

LOD (ng/ml)

LOQ (ng/ml) S/N

LOD (ng/ml)

LOQ (ng/ml)

CLO 4 0,15 0,50 4 0,10 0,33 3 0,10 0,33

CYP 3 0,15 0,50 3 0,15 0,50 4 0,15 0,50

LOR 4 0,15 0,50 3 0,10 0,33 3 0,10 0,33 Nhận xét: từ bảng 3.8 cho thấy LOD và LOD rất thấp, thấp hơn nồng độ nhỏ nhất trong khoảng nồng độ tuyến tính, LOD từ 0,10 đến 0,15 ng/ml, LOQ từ 0,33 đến 0,50 ng/ml trên 3 nền mẫu

Từ các kết quả thẩm định thu được cho thấy: Phương pháp LC-MS/MS có độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp (từ 0,10 đến 0,15 ng/ml); có mối tương quan tuyến tính giữa đáp ứng và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát (hệ số tương quan R2 > 0,99); độ đúng (90,28 % - 104,0 %) và độ chính xác (RSD = 1,51 – 6,50 %) đáp ứng yêu cầu tỷ lệ thu hồi khoảng 80,0 – 100,0 % và RSD < 15 % ở mức nồng độ ≤

100 ppb Điều đó cho thấy phương pháp xây dựng có thể tin cậy để ứng dụng trong phân tích các mẫu trên thị trường

3.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp TLC

3.2.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Dựa trên kết quả điều kiện xử lý mẫu mục 3.1.2, tiến hành xây dựng quy trình xử

lý mẫu phân tích bằng phương pháp TLC như sau:

- Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng 1/2 liều dùng vào ống falcon 50ml, thêm chính xác 20ml MeOH, lắc đều

- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong pha loãng tới nồng

độ thích hợp bằng MeOH

- Lấy chính xác 10 ml dịch sau ly tâm đem cô nitơ đến cắn Hòa tan cắn bằng 1ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành phân tích bằng TLC

29

3.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích

Khảo sát hệ dung môi:

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn đơn CLO, CYP,LOR và chuẩn hỗn hợp 3 chất trong MeOH có nồng độ 1mg/ml Tiến hành khảo sát trên bản mỏng Silicagel gel GF254 (5x10cm) Thể tích chấm 2 µl, bước sóng phát hiện 254 nm, triển khai với các hệ dung môi:

Hệ 1 : Cloroform : MeOH : acid acetic : amoniac (9,5 : 0,5 : 0,1 : 0,1) [12]

Hệ 2 : Acid acetic 1M : MeOH : Ethyl Acetat (20 : 30 : 50) [6]

Hệ 3 : Hexan : acetone : amoniac (5,5 : 4,5 : 0,5) [17]

Kết quả được trình bày ở bảng :

Bảng 3 9 Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động TLC

Sắc kí đồ

Rf CLO : 0,14

CYP : 0,43 LOR : 0,89

CLO : 0,62 CYP : 0,78 LOR : 0,78

CLO : 0,90 CYP : 0,86 LOR : 0,58 Dựa vào kết quả khảo sát thu được, chọn hệ 1 để khảo sát tỷ lệ dung môi pha động Tiếp tục tiến hành thay đổi tỉ lệ thành phần hệ 1 để tìm pha động tối ưu nhất tách

3 chất CLO, CYP, LOR Khảo sát hệ cloroform : methanol : acid acetic : amoniac với tỉ

lệ thay đổi như sau :

Hệ 1.1 : 9,5 : 0,5 : 0,2 : 0,05

Hệ 1.2 : 9,5 : 0,5 : 0,05 : 0,2

Kết quả được trình bày ở hình sau :

30

Hình 3 5 Kết quả khảo sát tối ưu hệ 1

Nhận xét : hệ 1.1 : cloroform – methanol – acid acetic – amoniac (9,5 : 0,5 : 0,2 : 0,05) có khả năng tách các chất tốt, Rf các chất nằm trong khoảng 0,2 – 0,8

Từ các kết quả khảo sát, điều kiên TLC được lựa chọn là :

* Phân tích đồng thời 3 dung dịch:

- Mẫu chuẩn: Dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp CLO, CYP, LOR trong MeOH với nồng độ là 250 µg/ml

- Nền mẫu: Chuẩn bị dung dịch 3 nền mẫu tự tạo theo quy trình xử lý mẫu

- Nền mẫu thêm chuẩn: Thêm chuẩn vào các nền mẫu sao cho nồng độ các chuẩn

là 250 µg/ml và tiến hành theo quy trình xử lý mẫu

Kết quả sau khi chạy sắc ký được thể hiện trong hình:

31

Hình 3 6 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của phương pháp TLC

HHC: hỗn hợp chuẩn; N1C: nền 1 thêm chuẩn; N1P: nền 1 placebo; N2C: nền 2 thêm chuẩn; N2P: nền 2 placebo; N3C: nền 3 thêm chuẩn; N3P: nền 3 placebo

* Bên cạnh nhóm kháng histamin H1, nhóm glucocorticoid có cũng có tác dụng làm giảm các triệu chứng dị ứng Do đó, nhóm kháng histamin H1 có thể được trộn cùng với glucocorticoid trong các chế phẩm đông dược điều trị dị ứng Dexamethason và betamethason là 2 hoạt chất thuộc nhóm glucocorticoid được sử dụng phổ biến để chống

dị ứng, dễ mua và rẻ tiền, nên 2 chất này có khả năng bị trộn cao Do đó, trong đánh giá

độ đặc hiệu sẽ tiến hành phân tích mẫu có thêm dexamethason và betamethason, để đánh giá ảnh hưởng của 2 chất này đến khả năng xác định CLO, CYP, LOR

Phân tích đồng thời 4 dung dịch:

- Dung dịch chuẩn đơn của CLO, CYP, LOR có nồng độ 1mg/ml

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp của 5 chất CLO, CYP, LOR, dexamethason, betamethason có nồng độ 1mg/ml

Kết quả sau khi chạy sắc kí được thể hiện trong hình sau:

LOR →

CYP →

CLO →