NGUYỄN HỮU SƠN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HOÁ SINH CỦA CAO CHIẾT SAPONIN LÁ CHÈ ĐẮNG (Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN GÂY BỆNH ALZHEIMER

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ---***--- NGUYỄN HỮU SƠN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HOÁ SINH CỦA CAO CHIẾT SAPONIN LÁ CHÈ ĐẮNG Ilex kudingcha C.J.Tseng TRÊN MÔ

(Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MÔ HÌNH

RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN GÂY BỆNH

ALZHEIMER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-*** -

NGUYỄN HỮU SƠN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ HOÁ SINH CỦA CAO CHIẾT SAPONIN LÁ CHÈ ĐẮNG

(Ilex kudingcha C.J.Tseng) TRÊN MÔ HÌNH

RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN GÂY BỆNH

ALZHEIMER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Phạm Thị Nguyệt Hằng

2 PGS.TS Nguyễn Thị Lập

Nơi thực hiện:

1 Viện Dược liệu

2 Bộ môn Hoá sinh

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Phạm Thị Nguyệt Hằng,

trưởng khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu Cô là người đã trực tiếp hướng dẫn

em trong quá trình nghiên cứu khoa học tại khoa, luôn bên cạnh động viên cổ vũ tôi, dìu dắt em thực hiện tốt khoá luận này

Tiếp đến, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lập, bộ

môn Hóa sinh – trường Đại học Dược Hà Nội Cô đã cho em cơ hội được nghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lời khuyên quý báu, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị tại khoa Dược lý – Sinh hóa – Viện Dược liệu đã giúp đỡ, hướng dẫn em về kỹ thuật cũng như tạo điều kiện

để em có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm tại khoa

Nhân dịp này, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho

em trong thời gian em học tập tại trường

Cuối cùng, em xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè

đã luôn bên em, ủng hộ và động viên em, là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi em gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Hữu Sơn

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: cây Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) 2

1.1.1 Tên gọi – Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố 2

1.1.3 Thành phần hoá học 3

1.1.4 Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây chè đắng 4

1.2 Tổng quan về bệnh Alzheimer 6

1.2.1 Sơ lược bệnh Alzheimer 6

1.2.2 Dịch tễ 7

1.2.3 Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di chuyền học 7

1.2.4 Yếu tố nguy cơ và bảo vệ 8

1.2.5 Cơ chế bệnh sinh 9

1.2.6 Một số mô hình nghiên cứu 12

1.3 Tổng quan về ruồi giấm chuyển gen 15

1.3.1 Tên gọi, vị trí phân loại 15

1.3.2 Đặc điểm 15

1.3.3 Ưu điểm sử dụng ruồi giấm trong phòng thí nghiệm 15

1.3.4 Hệ thống GAL4/UAS 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị: 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Động vật thí nghiệm 19

2.1.3 Dụng cụ, hoá chất nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang bệnh Alzheimer được cung cấp bởi Viện Công nghệ Kyoto 21

2.2.2 Đánh giá tác dụng của cao chiết saponin từ lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm gây bệnh Alzheimer bằng thử nghiệm hành vi 22

2.2.3 Tìm hiểu cơ chế của cao saponin từ chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) thông qua mức độ biểu hiện của protein APP 30

2.3 Xử lý thống kê 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Đánh giá tác dụng của cao chiết saponin lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer bằng thử nghiệm hành vi 35

3.1.1 Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm 35

3.1.2 Đánh giá khả năng nhớ mùi của ruồi giấm trưởng thành 37

3.1.3 Đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành 40

3.2 Tìm hiểu cơ chế tác dụng của cây chè đắng Ilex kudingcha C.J.Tseng thông qua việc đánh giá mức độ biểu hiện của protein tiền chất amyloid (Amyloid precusor protein –APP) trong não ruồi giấm 41

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 45

4.1 Về mô hình nghiên cứu 45

4.1.1 Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer 45

4.1.2 Về căn cứ để lựa chọn mức liều 2 mg/ml và 4 mg/ml 46

4.1.3 Về việc lựa chọn Amyloid precusor protein 46

4.2 Về kết quả nghiên cứu 47

4.2.1 Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm 47

4.2.2 Đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm 48

4.2.3 Đánh giá khả năng sống sót ruồi giấm trưởng thành 49

4.2.4 Tìm hiểu cơ chế tác dụng của cao chiết lá chè đắng Ilex kudingcha C.J.Tseng thông qua việc đánh giá mức độ biểu hiện của protein tiền chất amyloid APP 49 4.2.5 Về mức liều của cao chiết saponin lá chè đắng: 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Viết tắt Viết đầy đủ theo Tiếng

Anh Viết đầy đủ theo Tiếng Việt

1 AA Alzheimer's Association Hiệp hội Alzheimer

2 AchE Acetylcholin esterase Acetylcholin esterase

Amyloid precursor protein Protein tiền chất amyloid

8 ATCI Acetylthiocholin iodid Acetylthiocholin iodid

12 HRP Horseradish peroxidase

Enzym Horseradish peroxidase

14 NG 108-15

Neuroblastoma x glyoma hybrid cell, 108CC15

Tế bào lai giữa u nguyên bào thần kinh và glyoma (một trong các khối u não phổ biến)

Olfactory bulbectomized Phẫu thuật loại bỏ vùng khứu

giác

17 PVDF Polyvinyllidene difluoride Polyvinyllidene difluoride

18 ROS Reactive oxygen species Gốc oxy hoá tự do

19 SDS Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate

20

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis

Điện di polyacrylamide với

SDS

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 1 1: Hình ảnh cây chè đắng và búp chè đắng khô (Ilex kudingcha C J Tseng) 3

Hình 1 2: Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào[46] 10

Hình 1 3 : Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) 15

Hình 1 4: Hệ thống biểu hiện GAL4/UAS với UAS-hAPP 17

Hình 2 1: Thiết kế nghiên cứu 18

Hình 2 2: Mô hình kiểm tra trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm 29

Hình 3 1: Tốc độ di chuyển của ấu trùng 35

Hình 3 2: Điểm leo trèo trung bình của các lô ruồi sau khi nở được 3 ngày, 7 ngày và 10 ngày 37

Hình 3 3: Giá trị PREFAM khi AM kết hợp với phần thưởng 38

Hình 3 4: Giá trị PREFOCT khi OCT kết hợp với phần thưởng 39

Hình 3 5: Chỉ số học tập (LI scores) 40

Hình 3 6: Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ sống sót của ruồi theo ngày 41

Hình 3 7: Sự biểu hiện của protein tiền chất amyloid theo cường độ tín hiệu hoá phát quang thu được 42

Hình 3 8: Tỉ lệ hAPP/beta-actin ở các lô ruồi 43

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Alzheimer (Alzheimer's disease hay AD) hay đơn giản là Alzheimer là một chứng mất trí phổ biến nhất Chứng mất trí ảnh hưởng xấu tới chức năng nhận thức và khả năng hoạt động hàng ngày Điều nguy hiểm là các triệu chứng của sa sút trí tuệ tiến triển một cách âm thầm và ngày càng trở nên tồi tệ hơn theo năm tháng Người bệnh phải được chăm sóc bởi những người thân trong gia đình Đây quả thực là những áp lực rất lớn về mặt xã hội, tâm lý, sức khỏe, kinh tế đối với cuộc sống của những người chăm sóc Ở các nước phát triển, Alzheimer là một trong những bệnh tốn kém nhất cho xã hội

do đó tìm ra các loại thuốc mới hoặc các chiến lược phát triển thuốc mới giúp ngăn ngừa, điều trị chứng mất trí có hiệu quả và an toàn là vô cùng cần thiết

Chè Đắng có tên khoa học là Ilex kudingcha C.J.Tseng (IK) (Ilex latifolia) là

loài cây thân gỗ sống lâu năm mọc trên các vùng núi đá vôi ở Việt Nam, phân bố chủ yếu ở một số tỉnh như Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình và Ninh Bình Trong y học cổ truyền Việt Nam, Chè đắng được sử dụng làm vị thuốc để loại bỏ các độc tố, kháng khuẩn, giảm cơn khát và ho, ngứa mắt, mắt đỏ, đặc biệt là để tăng cường sự tập trung và cải thiện trí nhớ Triterpenoid, axit phenolic, flavonoid và tinh dầu là những chất chính của Chè đắng và các thành phần này có tác dụng bảo vệ hệ thống mạch máu, điều hòa quá trình chuyển hóa lipid, và có tác dụng chống oxy hoá, hạ đường huyết và

ức chế khối u [31] Trong một nghiên cứu của tác giả Kim và các cộng sự đã chỉ ra rằng Chè đắng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh tại các điểm thiếu máu cục

bộ ở chuột nhắt [25] Hơn nữa, cũng có các nghiên cứu cho tác dụng bảo vệ thần kinh chống lại protein amyloid β (Aβ)- yếu tố gây suy giảm trí nhớ và yếu tố gây độc tế bào thần kinh vỏ não trên chuột [26] Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng của cây chè đắng trên bệnh Alzheimer

Vì những lý do trên, đề tài được thực hiện với mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết saponin lá Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer

2 Nghiên cứu cơ chế hoá sinh giúp cải thiện trí nhớ của cao chiết saponin lá Chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: cây Chè đắng (Ilex kudingcha

C.J.Tseng)

1.1.1 Tên gọi – Vị trí phân loại

Ở Việt Nam, tên khoa học của cây CĐ mọc ở vùng núi đá vôi thuộc tỉnh Cao Bằng

và một số địa phương khác là Ilex kudingcha C J Tseng (với tên đồng nghĩa là Ilex kaushue S Y Hu) Tên Việt Nam là chè đắng ( tiếng Tày-Nùng gọi là “Ché khôm”, khổ đinh trà [2] Chi Ilex thuộc họ Nhựa ruồi hay họ Bùi hay Trâm bùi (Aquifoliaceae, tên khác là Ilicaceae), bộ Celetrales phân lớp Rosidae (phân lớp Hoa hồng), ngành Ngọc Lan

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố

Cây thân gỗ, cao 6-20m, đường kính thân từ 20-60cm, có cây đường kính cao tới 1,2m (hình 1.1) Cành thô, màu nâu xám, không có lông, cành non hình trụ có nhiều gờ nhỏ Lá đơn mọc cách, mép lá có răng cưa nhỏ và tù Phiến lá hình bầu dục đến thuôn hoặc hình mác ngược Ở cây trưởng thành lá thường dài 12-17cm, rộng 5-6cm Mặt trên của lá màu lục sẫm và láng bóng, mặt dưới màu lục nhạt, cả hai mặt đều không có lông

Lá vò trong tay có mùi thơm mát, hơi hắc của tinh dầu Hoa màu trắng ngà, đơn tính khác gốc

Cây CĐ là loại cây mọc tự nhiên, phân bố tản mạn ở một số địa phương miền núi phía bắc nước ta như Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình, Ninh Bình, trong đó, Cao Bằng là địa phương được xác định có 6/12 huyện có mật độ phát triển của cây CĐ cao, chiếm 32% diện tích toàn tỉnh

đắng

Ở Việt Nam, đã phát hiện trong lá CĐ thu hái tại Cao Bằng cũng có saponin triterpenoid tương tự như lá CĐ ở Trung Quốc Ngoài ra, còn có flavonoid, β-caroten, polysaccharid, coumarin, acid hữu cơ, acid amin [5], [3], [4]

4

1.1.4 Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây chè đắng

1.1.4.1 Sơ lược về lịch sử sử dụng cây chè đắng làm thuốc

Cây CĐ (Ilex kudingcha C.J Tseng) đã được sử dụng làm thuốc và nước uống ở

miền nam Trung Quốc từ cách đây 2000 năm [20] Theo kinh nghiệm, lá CĐ được sử dụng trong nhân dân để làm thuốc kích thích hệ thần kinh trung ương, tăng cường trí nhớ; thuốc tăng lực, kích thích tiêu hóa, kéo dài tuổi thọ Ngoài ra, lá CĐ còn được sử dụng để giải độc, trị đau đầu, viêm mũi, viêm họng, viêm phế quản,

Trong vài năm qua, CĐ đã được coi là một loại đồ uống dành cho người ăn kiêng

và đang trở nên phổ biến với những cái tên như trà làm đẹp giảm béo, trà lâu năm, trà xanh, trà và trà thanh đạm và đã được báo cáo về chất chống oxy hóa rõ ràng, chống viêm, chuyển hóa lipid, bảo vệ gan và chống ung thư [31]

Uống chè đắng thường xuyên như một loại trà thảo dược có vai trò tích cực trong ngăn ngừa và điều trị các bệnh tim mạch, bệnh mạch não, tiểu đường, viêm họng và ung thư, đặc biệt là các vấn đề liên quan đến xơ cứng động mạch, cao huyết áp, chóng mặt, mất ngủ, đánh trống ngực, đau tức ngực do các bệnh tim mạch [55] CĐ có hoạt tính sinh học trên chuyển hóa lipid, chống oxy hóa, ức chế khối u, có tác dụng hạ đường huyết, và bảo vệ hệ thống tim mạch tương tự như trà xanh và [32]

1.1.4.2 Các nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về thành phần hóa học, độc tính, tác dụng trên thần kinh

Nghiên cứu của tác giả Trần Thị Diệu Anh (2009) [1] đã phân lập và xác định được cấu trúc 4 saponin triterpenoid pentacyclic, 2 flavonoid Đây là những hợp chất saponin

và flavonoid lần đầu được phân lập và xác định cấu trúc hóa học từ lá CĐ thu hái tại Cao Bằng Saponin CĐ và cao nước CĐ có độc tính cấp thấp và được xếp vào loại chế phẩm không xác định được LD50 Về độc tính bán trường diễn, cả 2 chế phẩm saponin

và cao nước CĐ đều không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, tạo máu của thỏ, tế bào gan, cầu thận và ống thận trong giới hạn bình thường Saponin CĐ không ảnh hưởng đến sự phát triển của cơ quan sinh dục và khả năng thụ tinh của chuột cống trắng đực Đối với tác dụng tăng cường khả năng học tập và ghi nhớ: Saponin CĐ có tác dụng rút ngắn 8,57% số ngày học tập phản xạ có điều kiện và kéo dài 69,14% thời gian duy trì phản xạ đã học được so với lô chuột đối chứng

5

1.1.4.3 Các nghiên cứu trên thế giới

Tác dụng trên lipid và lipoprotein huyết tương

Những kết quả nghiên cứu trên chó thực nghiệm cho thấy dịch chiết lá cây CĐ có tác dụng hạ huyết áp (HA) rõ rệt Mức độ hạ HA từ từ, thời gian và mức độ hạ HA phụ thuộc vào liều lượng, liều càng cao tác dụng càng mạnh Dịch chiết lá CĐ có tác dụng làm hạ cholesterol máu, mức độ hạ cholesterol phụ thuộc vào liều lượng thuốc [41]

Tác dụng bảo vệ hệ mạch

Cao nước của I kudingcha làm tăng sự chảy của dòng máu trong động mạch vành

trên tim lợn cô lập và làm tăng dòng máu động mạch não trên thỏ được gây mê, kéo dài thời gian sống sót của chuột trong tình trạng thiếu oxy và bảo vệ chuột do thiếu máu cơ tim gây bởi pituitrin Các tác dụng này có lợi trong phòng ngừa và điều trị các bệnh mạch vành và đau thắt ngực [56]

Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh

Kim và cộng sự đã báo cáo rằng CĐ bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột nhắt CĐ làm giảm đáng kể MCAO/tái tưới máu gây ra do phù nề, thiếu máu thần kinh và chết tế bào não Sự suy giảm glutathion và quá trình peroxy hóa lipid gây ra bởi MCAO/tái tưới máu đã được ức chế khi dùng CĐ CĐ làm ức chế đáng kể sự tăng phosphoryl hóa MAPKs, COX-2 và protein gây chết tế bào theo chương trình ở chuột Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột của CĐ có thể do tác dụng ngăn chặn sự chết tế bào, là kết quả của tác dụng chống oxy hóa và tác dụng chống viêm của

nó [25]

Hơn thế nữa, dược liệu chè đắng I.latifolia đã được báo cáo là có tác dụng bảo vệ

thần kinh chống lại suy giảm trí nhớ gây ra bởi protein amyloid β (Aβ) ở chuột Tác dụng bảo vệ thần kinh của dịch chiết ethanol của CĐ chống lại sự suy giảm trí nhớ gây bởi Aβ ở chuột và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh vỏ não chuột Sự suy giảm trí nhớ ở chuột được gây ra bởi tiêm trong não thất 15 nmol Aβ (25-35) và đánh giá bằng thử nghiệm né tránh thụ động và thử nghiệm mê lộ nước Morris Dùng CĐ trong thời gian dài (25/100 mg/kg, p.o) giúp ngăn chặn đáng kể tác hại gây suy giảm trí nhớ gây ra bởi

6

Aβ (25-35) CĐ cũng ngăn chặn sự suy giảm nồng độ glutathion, sự tăng peroxy hóa lipid, sự biểu hiện của phosphoryl hóa tau (p-tau) và sự thay đổi trong quá trình chết tế bào theo chương trình liên quan đến protein trong suy giảm trí nhớ ở não chuột Ủ các

tế bào thần kinh vỏ não nuôi cấy với 10 μM Aβ (25-35) trong 36 giờ gây chết tế bào thần kinh Tác động gây chết các tế bào thần kinh, làm tăng nồng độ Ca2+ nội bào, tạo

ra các phản ứng oxy hóa và biểu hiện của các protein gây chết tế bào theo chương trình gây ra bởi Aβ (25-35) trên các tế bào thần kinh bị ức chế bởi CĐ ở nồng độ 1-50 μg/ml) Những kết quả này cho thấy CĐ có thể có vai trò trong cải thiện suy giảm nhận thức liên quan đến bệnh Alzheimer Cơ chế có thể do ức chế sự chết tế bào liên quan đến hoạt tính chống oxy hóa và ức chế sự phosphoryl hóa protein tau [26]

Cơ chế bảo vệ thần kinh của chè đắng chống lại độc tính gây ra bởi protein amyloid

β (Aβ) là do ức chế sự chết tế bào thần kinh gây bởi stress oxy hóa và sự phosphoryl hóa protein tau Vì mất vùng khứu giác (olfactory bulbectomized - OBX) cũng gây tăng mức Aβ [26] nên có thể xem xét cơ chế ức chế sự chết tế bào của chè đắng có thể góp phần làm giảm chứng mất trí ở chuột OBX CĐ có thể ngăn ngừa ảnh hưởng của glutamat gây tổn thương tế bào thần kinh bằng cách ức chế sự gia tăng nồng độ Ca2+, các ROS và con đường gây chết tế bào theo chương trình Ngoài ra, tác dụng ngăn chặn tổn thương não gây ra do thiếu máu cục bộ có thể liên quan đến các hoạt động chống kích thích và chống oxy hóa của các hoạt chất CQA trong CĐ (3,4-Dicaffeoylquinic acid (diCQA), 3,5-diCQA, và 3,5-diCQA methyl ester)

1.2 Tổng quan về bệnh Alzheimer

1.2.1 Sơ lược bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer (Alzheimer disease –AD) là một chứng mất trí phổ biến nhất,

được phát hiện lần đầu tiên năm 1906 bởi bác sĩ tâm thần và thần kinh học người Đức Alois Alzheimer ((1864-1915)

Vào ngày 3 tháng 11 năm 1906, Alois Alzheimer đã báo cáo một bệnh nặng đặc biệt của vỏ não ở một phụ nữ 50 tuổi ở Tây Nam Đức Ông đã theo dõi từ khi cô mắc chứng hoang tưởng, giấc ngủ tiến triển và rối loạn trí nhớ, gây hấn và bối rối, cho đến khi cô qua đời 5 năm sau đó Báo cáo của ông ghi nhận các mảng đặc biệt và các rối

sa sút trí tuệ do mạch máu lại cao hơn nữ [6]

Theo số liệu thống kê của Hiệp hội Alzheimer thế giới 2015, tỷ lệ mắc Alzheimer tăng dần theo tuổi, từ khoảng 5% của người dưới 75 tuổi lên đến 40-50% của người sau

85 tuổi Bệnh Alzheimer luôn đi kèm với một khoản ngân sách điều trị khổng lồ và một gánh nặng về thể chất cũng như tinh thần lên bệnh nhân và người thân của họ [6], [36], [44]

Dân tộc: Các dân tộc khác nhau có tỷ lệ mắc bệnh cũng khác nhau Người da trắng

ít mắc bệnh hơn người Mỹ gốc Phi hoặc Tây Ban Nha Người châu Á cũng ít mắc bệnh hơn những người ở nơi khác Một số quan điểm còn cho rằng bệnh chịu ảnh hưởng của yếu tố môi trường [6], [44]

Tăng huyết áp tâm thu và tăng cholesterol máu sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer hơn những người bình thường [6]

Hội chứng Down: Người bị hội chứng này sẽ bị Alzheimer khi sống đến 40 tuổi

và những bà mẹ sinh con bị Down sẽ có nguy cơ cao bị Alzheimer [6]

1.2.3 Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di chuyền học

Nguyên nhân chính xác của bệnh Alzheimer còn chưa nghiên cứu được, nhưng một số yếu tố di truyền và môi trường được xác định gây ra bệnh Alzheimer chiếm khoảng dưới 1% số trường hợp Các trường hợp Alzheimer khởi phát sớm có liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể số 1, 14 hoặc 21, trong đó đa số các trường hợp do đột biến một gen sản xuất perseniline 1 trên nhiễm sắc thể 14 Ngoài ra còn có perseniline 2 có cấu trúc tương tự perseniline 1 được sản xuất bởi gen trên nhiễm sắc thể số 1 Cả 2 protein này đều mã hóa cho protein màng tế bào tham gia quá trình hình thành protein

8

tiền chất amyloid (APP) Các nhà khoa học đã xác định được hơn 160 đột biến trong các gen perseniline làm giảm hoạt động của γ-secretase, hình thành Aβ APP được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể số 21 và chỉ số ít trường hợp khởi phát sớm liên quan đến đột biến gen mã hóa cho APP [12]

Các trường hợp Alzheimer khởi phát muộn chủ yếu liên quan đến Apolipoprotein

E (ApoE) Có 3 loại ApoE là ApoE2, ApoE3, ApoE4 trong đó ApoE4 đóng vai trò nhiều trong Alzheimer khởi phát muộn thông qua kết hợp với các yếu tố nguy cơ khác như bất thường ty lạp thể, rối loạn chức năng thành tế bào và tiêu thụ glucose kém Nguy cơ mắc bệnh Alzheimer cao gấp 3 lần ở người có 1 ApoE4 và cao gấp 12 lần ở người có 2 ApoE4 so với người không có ApoE [8], [12]

Ngoài các nguyên nhân trên, còn một số yếu tố khác dẫn đến hình thành Alzheimer:

Yếu tố nhiễm độc nhôm: tình trạng nhiễm độc nhôm dường như có liên quan đến

sự tăng lắng đọng protein Aβ và số lượng các đám rối sợi thần kinh trung ương não bệnh nhân Alzheimer [6]

Yếu tố nhiễm trùng (virus chậm) giống như bệnh creutzfeld-Jakob [6]

Các rối loạn chuyển hóa: phản ứng oxy hóa quá mức dẫn đến tăng các gốc tự do Các gốc tự do này được cho là có liên quan đến sự kết hợp và tăng lắng đọng protein

Aβ gây chết tế bào thần kinh Sự giảm lưu lượng máu não, rối loạn sinh tổng hợp các yếu tố dinh dưỡng thần kinh cũng được giả định là có vai trò trong cơ chế gây bệnh Alzheimer [6]

1.2.4 Yếu tố nguy cơ và bảo vệ

1.2.4.1 Yếu tố nguy cơ

Tuổi là yếu tố nguy cơ rất lớn với bệnh Alzheimer Ở người trên 60 tuổi, cả tỷ lệ mắc chung và tỷ lệ mới mắc bệnh Alzheimer cứ sau 5 năm lại tăng lên gấp đôi: Ở nhóm tuổi 65-69 số người bị bệnh là 2%, ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40% [6] Tiền sử gia đình có người bị bệnh Alzheimer: Các thành viên trong gia đình này

có thể mang những biến đổi di truyền đã được xác định rõ (ở nhiễm sắc thể 21, 14,1 )

9

hoặc mang các kiểu gen làm tăng cơ địa dễ bị bệnh như ApoE4 Tần số xuất hiện bệnh

là 50% trong số con các bệnh nhân Alzheimer [6]

Bệnh mạch máu não gồm nhồi máu xuất huyết (hemorrhagic infarcts), nhồi máu thiếu máu (ischemic infarcts), viêm mạch máu (vasculopathies) và thay đổi chất trắng (white matter changes) làm tăng nguy cơ sa sút trí tuệ

Tăng huyết áp (40-60 tuổi) làm tăng nguy cơ suy giảm nhận thức giai đoạn cuối Tuy nhiên, tuổi càng cao nguy cơ này càng giảm

Đái tháo đường typ II tăng gần gấp đôi nguy cơ Alzheimer

Cân nặng cơ thể quá cao hoặc quá thấp đều làm tăng nguy cơ suy giảm nhận thức

và Alzheimer

Nồng độ lipid máu, hội chứng chuyển hóa, hút thuốc lá và chấn thương sọ não

có thể làm tăng hoặc giảm nguy cơ sa sút trí tuệ với các bằng chứng ở nhiều nghiên cứu khác nhau [44]

1.2.4.2 Yếu tố bảo vệ

Chế độ ăn nhiều rau, cá, ít thịt với dầu oliu là nguồn cung cấp chất béo chính cùng lượng vừa phải rượu vang làm giảm nguy cơ mắc Alzheimer và sa sút trí tuệ Ngoài ra, việc cung cấp caroten, vitamin C, vitamin E làm giảm nguy cơ suy giảm nhận thức vẫn còn nhiều tranh cãi

Tập thể dục có thể làm giảm nguy cơ suy giảm nhận thức hoặc không ảnh hưởng

cơ chế không hoàn toàn giống nhau giữa các bệnh nhân Tuy nhiên, người ta đã đưa ra

1 giả thuyết để liên kết vai trò của tất cả các thành tố cơ bản trong bệnh nguyên, đó là giả thuyết Beta amyloid (hình 1.2) [6]

10

Giả thuyết Beta amyloid:

Hình 1 2: Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào[46]

β - amyloid peptid (βAP) là những sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa bao gồm 36-43 acid amin, βAP42 ít phổ biến hơn so với các βAP nhưng lại dễ bị kết tụ

và hình thành mảng bám Sự mất cân bằng giữa sản xuất, thanh thải của các peptid làm cho các βAP dư thừa tích lũy và kết tụ lại gây độc cho tế bào Giả thuyết chỉ ra sự tích

tụ β-amyloid peptid (βAP) được coi là độc tố làm ngăn cản quá trình cân bằng ion calci,

ức chế chức năng của một số enzyme và khả năng sử dụng glucose của tế bào thần kinh đồng thời kích hoạt sự chết theo chương trình (apoptosis) [48], [14] Người ta vẫn chưa biết chính xác sự biến đổi trong việc sản xuất βAP đến mức độ nào thì gây ra suy giảm trí nhớ

Sự hình thành mảng bám amyloid

Các APP gen mã hóa cho một protein gọi là protein tiền thân amyloid Protein này được tìm thấy trong nhiều mô và cơ quan, bao gồm não và tủy sống (hệ thần kinh trung ương)

11

Hơn 50 đột biến khác nhau trong gen APP có thể gây ra bệnh Alzheimer khởi

phát sớm, bắt đầu trước tuổi 65 Những đột biến này chịu trách nhiệm cho ít hơn 10 phần trăm của tất cả các trường hợp khởi phát sớm

Biến đổi APP phổ biến nhất thay đổi một trong các amino acids của protein tiền thân amyloid Đột biến này thay thế amino acid valine bằng amino acid isoleucine ở vị

trí protein 717 (viết bằng Val717Ile hoặc V717I) Các đột biến trong gen APP có thể

dẫn đến tăng lượng amyloid β peptide hoặc tạo ra một dạng peptide dài hơn và dính hơn Khi những mảnh protein này được giải phóng khỏi tế bào, chúng có thể tích tụ trong não và tạo thành các khối gọi là mảng amyloid Những mảng này là đặc trưng của bệnh Alzheimer Sự tích tụ các mảng amyloid β peptide và amyloid độc hại có thể dẫn đến cái chết của tế bào thần kinh và các dấu hiệu và triệu chứng tiến triển của chứng rối loạn này

Mảng bám amyloid là sự phân giải của protein tiền thân amyloid (amyloid precursor protein – APP) một glycoprotein xuyên màng, chức năng chưa rõ APP gồm

770 acid amin, protein này biểu hiện trong nhiều mô nhưng đặc biệt trong các khớp thần kinh cuả các neuron APP bị phân cắt bởi 3 enzym: α, βvà γ secretase Trước hết, APP

bị cắt cạnh tranh bởi α và β-secretase Nhiều nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa làm giảm hoạt tính của α-secretase, làm tăng cường biểu hiện và kích hoạt β-secretase Con đường α-secretase tạo ra sAPPα, các sAPPα hòa tan này liên quan đến sự dẫn truyền thần kinh bình thường ở synap và C83 Con đường β-secretase sinh ra sAPPβ và C99 Các sản phẩm C83 và C99 này bị cắt một lần nữa nhờ γ-secretase (γ-secretase là một phức hợp đa enzyme có chứa preseniline 1,2 Đột biến preseniline được tìm thấy ở bệnh nhân Alzheimer sớm có tính chất gia đình) Riêng với C99 dưới tác dụng của γ-secretase

sẽ tạo thành hai phân đoạn không hòa tan Amyloid β 40 (βAP40) và Amyloid β 42 (βAP42) βAP42 có tính chất độc hơn và nhiều hơn βAP40 Các monomer này trải qua một sự thay đổi đáng kể về cấu hình ở nồng độ cao để hình thành cấu trúc bậc ba của dạng monomer Những monomer này sau đó kết hợp lại thành các oligomer (là dimer hoặc trimer), chúng dường như là các chất độc thần kinh, không hòa tan xung quanh các

tế bào thần kinh và dần dần thành các mảng beta amyloid (hình 1.2) [7]

Giả thuyết cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác

12

Rối loạn chức năng và thoái hóa tế bào lan tỏa dẫn đến một loạt các khiếm khuyết

dẫn truyền thần kinh, trong đó, các bất thường trên hệ cholinergic là nổi bật nhất Sự mất hoạt động của hệ cholinergic tương quan thuận với mức độ nghiêm trọng của bệnh Alzheimer Vào giai đoạn muộn của bệnh Alzheimer, số lượng các tế bào thần kinh cholinergic và số lượng các thụ thể nicotinic trong vùng hải mã và vỏ não giảm xuống Thụ thể nicotinic trước synap có vai trò kiểm soát việc giải phóng của acetylcholin, cũng như các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng khác cho bộ nhớ và tâm trạng, bao gồm: glutamat, serotonin và norepinephrin Giả thuyết cholinergic lý giải việc mất tế bào cholinergic là nguyên nhân suy giảm nhận thức trong bệnh Alzheimer, do đó, việc tăng chức năng hệ cholinergic có thể cải thiện triệu chứng mất trí nhớ [48], [14]

1.2.6 Một số mô hình nghiên cứu

Mô hình sàng lọc đầu tiên phải kể đến là nghiên cứu các chất có tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase Đây là mô hình đơn giản, dễ làm và ít tốn kém

Về nguyên tắc có thể định lượng acetylcholin (ACh) và acetylcholinesterase (AChE) thông qua trung gian enzym cholin oxidase xúc tác các phản ứng ACh sẽ bị enzym AChE chuyển thành cholin, sau đó nó bị cholin oxidase oxy hóa chuyển thành betain và H2O2 Dưới sự xúc tác của horseradish peroxidase (HRP), H2O2 phản ứng với thuốc thử 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tạo chất có màu hồng Đo cường độ huỳnh quang ở 563 nm Cường độ huỳnh quang của 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tỷ lệ thuận với nồng độ ACh và AChE Từ đó có thể định lượng được nồng độ ACh và hoạt tính của AChE Hoặc có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt tính của enzym AChE ex vivo theo nguyên tắc của Ellman và cộng sự: cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân bởi AChE tạo thành thiocholin và acid acetic Thiocholin thu được cho phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) tạo ra accid 5-thio-2-nitro benzoic (RS) có màu vàng,

có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 412 nm Chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến hành định lượng hoạt tính enzym AChE theo phương pháp của tác giả Ellman và cộng

sự Có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt tính của AChE in vitro với nguyên tắc tiến hành theo phương pháp của Ellman và cộng sự nhưng sử dụng AChE có sẵn [11], [17]

Hệ thống tế bào, như các dòng tế bào thần kinh (NG 108-15) hoặc tế bào thần kinh

vỏ não được nuôi cấy nguyên phát cũng được sử dụng để đánh giá thuốc điều trị Alzheimer, bằng cách gây độc các tế bào này bởi protein beta-amyloid hoặc glutamat,

13

sử dụng mẫu nghiên cứu để bảo vệ tế bào thần kinh đó, định lượng lượng tế bào sống sót [22], [26], [28], [29] Thuốc điều trị Alzheimer sẽ được sử dụng để ngăn chặn hoặc làm giảm bớt độc tính của protein beta-amyloid hoặc glutamat trên tế bào thần kinh NG 108-15 nuôi cấy, có khả năng phục hồi tổn thương hoặc làm tăng khả năng sống sót của

tế bào thần kinh

Trên mô hình động vật, người ta sử dụng một số loại chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer như chuột Tg2576, PSAPP (hiện nay đang được sử dụng trên thế giới) Nghiên cứu trên mô hình động vật chuyển gen mang bệnh ở người là cần thiết để hiểu

rõ về cơ chế phân tử và thúc đẩy nghiên cứu tiền lâm sàng Bệnh Alzheimer đã được gây trên mô hình chuột chuyển gen thế hệ đầu tiên (Tg), trên chuột chuyển gen này có

sự biểu hiện quá mức của protein có liên quan đến bệnh Alzheimer có tính chất gia đình,

hoặc sử dụng mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 là APP mang đột biến protein tiền thân amyloid (APP), hoặc đột biến cả APP và presenilin (PS) Các chủng chuột chuyển

gen này thể hiện bệnh lý Alzheimer nhưng mô hình biểu hiện quá mức có thể dẫn tới các kiểu hình bổ sung không liên quan đến Alzheimer Mô hình chuột chuyển gen thế

hệ thứ 2 APP chứa các trình tự gen người và đột biến gen APP nội sinh trên lâm sàng

Những chuột này cho thấy sự tích tụ β-amyloid không có kiểu hình liên quan đến biểu hiện quá mức nhưng chưa phải là biểu hiện Alzheimer trên lâm sàng của người [45], [27]

Một số mô hình gây mất trí nhớ cho chuột bằng hóa chất như tiêm scopolamin bằng đường phúc mạc, hoặc truyền colchicin vào não chuột cống cũng được sử dụng [15], [37], [51], [54]

Bên cạnh đó, các mô hình phẫu thuật gây mất trí nhớ cho chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Mô hình gây mất trí nhớ do thiếu máu não cục

bộ (ischemia induced learning and memory deficit) bằng cách thắt 2 động mạch cảnh đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút máu đuôi chuột đã được giáo sư Kinzo Matsumoto sử dụng để nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer từ năm 2000 [29] Trong

mô hình này, chuột sẽ được gây mê, sau đó bộc lộ 2 động mạch cảnh một cách cẩn thận, thắt 2 động mạch cảnh này bằng chỉ kẹp động mạch trong 30 phút, đồng thời lấy máu đuôi chuột trong quá trình gây thiếu máu cục bộ Đây cũng là mô hình đã triển khai thành công tại Viện Dược liệu

14

Một mô hình mới cũng được sử dụng hiện nay là mô hình gây suy giảm học và nhớ trên chuột mất vùng khứu giác (learning and memory deficit in olfactory bulbectomized mice) của giáo sư Kinzo Matsumoto áp dụng từ năm 2011 [29] Chuột được gây mê và cố định trên hệ thống định vị chuột Sau đó, rạch da bộc lộ phần hộp sọ bao phủ vùng khứu giác (OBX) rồi khoan thủng 1 lỗ đường kính 1 mm, phá hủy vùng khứu giác của chuột, lấp đầy vùng này bằng bọt cầm máu gelatin Chuột sau khi bị loại

bỏ vùng khứu giác sẽ bị suy giảm khả năng học tập và trí nhớ

Mô hình ruồi giấm: Ruồi giấm có tên khoa học là Drosophila melanogaster, đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen, và nó cho thấy có hơn 70% gen tương đồng với bộ gen của người [24], [23] Với ưu thế vòng đời ngắn, dễ nuôi trong phòng thí nghiệm và

có thể cung cấp số lượng nhiều trong cùng một thời điểm, do đó ruồi giấm là nguồn gen thuận lợi cho việc nghiên cứu bệnh liên quan đến yếu tố di truyền cũng như có tiềm năng trở thành mô hình kinh tế cho những nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc thuốc [18], [49]

Nhận thức được tính cần thiết của việc nghiên cứu bệnh, tạo mô hình để nghiên cứu, cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu và sử dụng ruồi giấm làm mô hình nghiên cứu bệnh trên người trong đó có bệnh thoái hóa thần kinh, ví dụ như công

bố của nhóm nghiên cứu Parsa Kazemi-Esfarjani, Seymour Benzer trong việc ức chế độc tính của polyglutamine trên mô hình ruồi giấm [24], [23] Nhóm tác giả của John

M Warrick (năm 2005) thì ứng dụng mô hình tương tự cho nghiên cứu tác dụng ức chế polyglutamine của Ataxin-3 [52] Nhóm Botella và cộng sự năm 2009 và 2011 đã dùng ruồi giấm làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson [19] Các nhà nghiên cứu Nhật Bản, nhóm tác giả Hideya Mizuno (năm 2011) cũng đã dùng mô hình ruồi giấm chuyển gen alpha-synuclein làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson và các yếu tố liên quan Nhóm tác giả Masamitsu Yamaguchi (2017) và một số nhóm nghiên cứu khác đã dùng mô hình ruồi giấm đột biến gen ATP binding cassette subfamily A member 13 (ABCA13) làm

mô hình nghiên cứu bệnh tự kỷ [47], [50]

Hiện nay trên thế giới có ba trung tâm lưu giữ đầy đủ nguồn gen ruồi giấm là Mỹ,

Ấn độ và Nhật bản, là những cơ sở luôn sẵn sàng cung cấp trao đổi nguồn gen sẵn có cho các nhà nghiên cứu ở bất kỳ đâu trên thế giới, cần nhấn mạnh hơn là hầu hết các trường y-dược lớn tại Nhật bản, Châu âu và Mỹ đều có các phòng thí nghiệm dùng mô

15

hình ruồi giấm trong nghiên cứu y sinh Ở Việt Nam, chưa có một nghiên cứu nào đi sâu vào mức độ phân tử về bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh tự kỷ, Parkinson, bệnh Alzheimer, và Huntington cũng như chưa có phòng thí ngiệm nào tạo lập được các mô hình động vật chuyển gen để nghiên cứu bệnh và sàng lọc thuốc Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tỷ lệ mắc bệnh biểu hiện lâm sàng và các biến chứng của bệnh

1.3 Tổng quan về ruồi giấm chuyển gen

1.3.1 Tên gọi, vị trí phân loại

Drosophila melanogaster là một loài ruồi trong họ Drosophilidae, phân bố ở tất cả các

châu lục, bao gồm cả các đảo.[35]

Hình 1 3 : Ruồi giấm (Drosophila melanogaster)

1.3.2 Đặc điểm

Ruồi giấm có màu vàng nâu và có các vòng đen ngang bụng Con cái trưởng thành dài khoảng 2.5mm, con đực nhỏ hơn một chút với lưng tối hơn Con đực dễ dàng phân biệt được với con cái dựa trên sự khác biệt về màu sắc, với một mảng đen khác biệt ở bụng

1.3.3 Ưu điểm sử dụng ruồi giấm trong phòng thí nghiệm

D melanogaster là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng để phân tích

di truyền Tất cả các sinh vật đều sử dụng hệ thống di truyền phổ biến; do đó, hiểu được các quá trình như phiên mã và sao chép ở ruồi giấm giúp hiểu được các quá trình này ở các sinh vật nhân chuẩn khác, bao gồm cả con người Có nhiều lý do để ruồi giấm là

một lựa chọn phổ biến trong nghiên cứu Thứ nhất, Sử dụng ruồi giấm nghiên cứu sẽ ít

16

vấp phải các vấn đề liên quan tới đạo đức trong nghiên cứu y sinh học hơn là tiến hành

thử nghiệm lên các động vật bậc cao hơn hay động vật có vú như khỉ Thứ hai, ruồi giấm

có vòng đời ngắn nên cho phép tạo ra một lượng lớn ruồi giấm trong một thời gian ngắn Một phôi xuất hiện trong vòng 24 giờ sau khi thụ tinh trứng Phôi này sau đó trải qua ba giai đoạn ấu trùng khác nhau cuối cùng trưởng thành thành một con ruồi giấm trưởng thành Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành chỉ mất 10 ngày kể từ khi thụ tinh Ruồi cái có thể tạo ra tới 1500 trứng trong suốt cuộc đời của nó do đó cung cấp một

lượng ruồi giấm mới liên tục cho các nghiên cứu di truyền Thứ ba, ruồi giấm có kích thước nhỏ nên tốn ít diện tích, nguyên vật liệu để nuôi dưỡng cũng như thí nghiệm Thứ

tư, ruồi giấm có hệ gen đơn giản: Yếu tố di truyền cũng làm cho loài ruồi này trở thành

một sinh vật mẫu lý tưởng D.melanogaster chỉ có bốn cặp nhiễm sắc thể so với 23 cặp

ở người Sự đơn giản này là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những

sinh vật đầu tiên được sử dụng trong các nghiên cứu di truyền Thứ năm, đặc điểm giải phẫu: D.melanogaster có các đặc điểm giải phẫu (như cánh và mắt) cho phép dễ dàng

mô tả đặc điểm Những dấu hiệu di truyền có thể dễ dàng xác định dưới kính hiển vi (như mắt đỏ, cánh cong,…) Các hành vi như ăn, giao phối và ngủ được quan sát thấy

ở người cũng được nhìn thấy ở Drosophila Do đó, ảnh hưởng có thể có của di truyền đến hành vi của con người cũng có thể được đánh giá thông qua ruồi giấm [38]

1.3.4 Hệ thống GAL4/UAS

Hệ thống GAL4-UAS là một phương pháp sinh hóa được sử dụng để nghiên cứu

biểu hiện và chức năng gen trong các sinh vật như ruồi giấm Nó cũng đã được điều chỉnh để nghiên cứu các chức năng liên kết hóa học trong nuôi cấy tế bào trong ống nghiệm Nó được phát triển bởi Hitoshi Kakidani [21] và Mark Ptashne,và Nicholas Webster và Pierre Chambon vào năm 1988 [53] , sau đó được Andrea Brand và Norbert Perrimon điều chỉnh vào năm 1993 [10] và được coi là một kỹ thuật tốt để nghiên cứu

sự biểu hiện của gen [13] Hệ thống này có hai phần: gen GAL4 , mã hóa protein hoạt hóa phiên mã GAL4 và UAS (Chuỗi kích hoạt ngược dòng )

Đối với nghiên cứu ở Drosophila, gen GAL4 được đặt dưới sự kiểm soát của một promoter hoặc gen điều khiển, trong khi UAS kiểm soát biểu hiện của gen mục tiêu

GAL4 sau đó chỉ được biểu hiện trong các tế bào nơi gen điều khiển của nó được kích

hoạt [21], [10], [13] Bên cạnh đó, GAL4 chỉ kích hoạt phiên mã gen khi có UAS GAL4

17

và UAS rất hữu ích để nghiên cứu biểu hiện gen ở ruồi giấm vì chúng không biểu hiện

ở cơ thể bình thường và biểu hiện của chúng không can thiệp vào các quá trình khác

trong tế bào Ví dụ về hệ thống biểu hiện GAL4/UAS trên mô hình ruồi giấm chuyển gen

hAPP được thể hiện ở hình 1.4

Hình 1 4: Hệ thống biểu hiện GAL4/UAS với UAS-hAPP

Trong dự án FIRST “Hợp tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ngăn ngữa/ hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng” do TS Phạm Thị

Nguyệt Hằng làm chủ nhiệm với mục tiêu ứng dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Alzheimer để sàng lọc dược liệu GS Masamitsu Yamaguchi, Giám đốc trung tâm ruồi giấm, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản là một trong những thành viên của dự án, đã cung cấp một số chủng ruồi giấm chuyển gen phục vụ công tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng hỗ trợ/ điều trị bệnh Alzheimer

18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu: Thiết kế nghiên cứu được mô tả ở Hình 2.1

Đánh giá khả năng di chuyển (bò) của ấu trùng ruồi giấm

Đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành

Đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm

Đánh giá khả năng trèo của ruồi giấm trưởng thành

Nghiên cứu tác dụng và bước đầu tìm hiểu cơ chế của lá chè đắng (Ilex

kudingcha C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh

Alzheimer

Đánh giá tác dụng của cao saponin lá chè đắng (Ilex kudingcha

C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm mang bệnh Alzheimer

Đánh giá tác dụng dựa trên thử nghiệm hành vi của ruồi giấm

Tìm hiểu cơ chế của cao saponin lá chè đắng (Ilex kudingcha

C.J.Tseng) thông qua mức độ biểu hiện của protein APP

Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm

Hình 2 1: Thiết kế nghiên cứu

19

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị:

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cao chiết saponin lá chè đắng (CĐ) Lá CĐ dùng trong nghiên cứu này được thu thập tại tỉnh Cao Bằng, Việt Nam, được giám định đúng tên

khoa học là Ilex kudingcha C.J.Tseng bởi Khoa tài nguyên – Viện Dược liệu

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Trong các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng 2 dòng ruồi giấm (Drosophila

melanogaster) mang phức hợp gen Elav-GFP (hay còn gọi là Elav, Elav-GAL4) và hAPP (hay còn gọi là hAPP, hAPP64385) Trong đó Elav là chủng ruồi hoang dại bình

Uas-thường mang gen GAL4 ở nhiễm sắc thể thứ 3 Ngoài mắt đỏ do được gắn thêm gen

GAL4, chủng ruồi Elav có tập tính sinh hoạt cũng như các đặc điểm sinh học tương tự

ruồi bình thường HAPP là ruồi giấm chuyển gen hAPP với mã số 64385 mang bệnh Alzheimer do Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản cung cấp

Ruồi giấm được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 25±1oC với chu kỳ sáng - tối 12 giờ (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ)

2.1.3 Dụng cụ, hoá chất nghiên cứu

 Hóa chất, thuốc thử:

Bảng 2 1: Hoá chất

8 Kháng thể sơ cấp và thứ cấp của

beta-actin

Invitrogen, Mỹ

1 Bút lông để thu ấu trùng Nhật Bản, Trung Quốc

3 Chai, ống thủy tinh để

đựng thức ăn, nuôi ấu trùng

21

12 Máy nghiền đồng thể Velp-Italia

16 Ống thủy tinh chia vạch

(ống climbing)

Việt Nam

18 Thiết bị chuyển màng Bio-Rad, Mỹ

20 Một số dụng cụ, thiết bị

khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen hAPP mang bệnh Alzheimer được cung cấp bởi Viện Công nghệ Kyoto

Bước 1: Chuẩn bị chủng hAPP 64385 mang gen APP ở nhiễm sắc thể thứ 2

và chủng Elav mang gen GAL4 ở nhiễm sắc thể thứ 3

Bước 2: Bắt ruồi chưa qua giao phối (Virgin female) từ 3-6h sau khi kén

nở (càng sớm càng dễ phân biệt con cái) Gây mê ruồi trong ống nuôi bằng ether Chọn những con cái có một chấm đen đặc trưng ở bụng trên (mecunium) của chủng Elav hoặc hAPP Chuyển sang một ống mới ghi rõ nhãn và ngày chuyển

Bước 3: Bắt con đực của chủng hAPP hoặc Elav chuyển sang một ống mới Bước 4: Cho lai với tỷ lệ 3:7 hoặc 1:1 (đực cái) Đây là đời P

22

Bước 5: Ống chứa P sẽ được nuôi trong 3-4 ngày (Thời gian tuỳ vào số

lượng ấu trùng cần có thể 5-7 ngày nhưng phải dưới 8 ngày) Sau đó được chuyển sang ống mới để tránh lẫn giữa P và F1

Bước 6: P được nuôi tiếp tục như bước 5-6 để tạo F1 F1 được sử dụng cho

thí nghiệm

Thực hiện phép lai giữa ruồi giấm đực đã được chuyển gen hAPP gây bệnh Alzheimer với ruồi cái (chưa qua giao phối) chủng hoang dại (Elavae) trong môi trường thức ăn có bổ sung cao chiết saponin lá CĐ với nồng độ 2mg/ml và 4mg/ml Ruồi được thay ống thức ăn 3 ngày/lần để đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đẩy đủ cho tới khi làm thì nghiệm

Tất cả các ruồi mang gen nghiên cứu được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ

25 ± 1 ° C với chu kì 12 giờ sáng – 12 giờ tối (sáng từ 07 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm đánh giá hành vi được thực hiện trong giai đoạn sáng từ 9 giờ đến 18 giờ

2.2.2 Đánh giá tác dụng của cao chiết saponin từ lá chè đắng (Ilex kudingcha

C.J.Tseng) trên mô hình ruồi giấm gây bệnh Alzheimer bằng thử nghiệm hành vi

2.2.2.1 Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm

a Đánh giá khả năng di chuyển (bò) của ấu trùng ruồi giấm

Dựa trên nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự năm 2012 [40], chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm với mục tiêu đánh giá sự khả năng cải thiện vận động của cao chiết saponin lá chè đắng trên ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer

Ruồi giấm được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 20 con (10 đực, 10 cái):

Lô 1 (Chứng sinh lý): 10 ruồi đực Elav-GFP, 10 ruồi cái Elav-GFP, được ăn thức

ăn bình thường

Lô 2 (Chứng bệnh lý): 10 ruồi đực Uas-hAPP, 10 ruồi cái Elav-GFP, được ăn thức

ăn bình thường

Lô 3 (Chè đắng 2): 10 ruồi đực Uas-hAPP, 10 ruồi cái Elav-GFP, được ăn thức ăn

có pha thêm cao saponin lá chè đắng với nồng độ 2 mg/ml

23

Lô 4 (Chè đắng 4): 10 ruồi đực Uas-hAPP, 10 ruồi cái Elav-GFP, được ăn thức ăn

có pha thêm cao saponin lá chè đắng với nồng độ 4 mg/ml

Lấy ấu trùng khoảng 5 ngày tuổi là thế hệ F1 của phép lai trên, tiến hành thử nghiệm với các bước:

Phần 1: Chuẩn bị đĩa

 Chuẩn bị đĩa petri đường kính 10-12 cm, làm sạch

Đổ thạch Agar 1.5% lên đĩa, bề mặt láng đều, để ráo nước trước khi tiến hành thí nghiệm

Phần 2: Chuẩn bị ấu trùng

 Thu ấu trùng bậc 3 (khoảng 5 ngày tuổi), ấu trùng đực, nằm bên trong môi trường thức ăn, cách bề mặt môi trường khoảng 1-2 cm, các ấu trùng đang bò ổn định, kích thước lớn đều nhau

Lưu ý: Không thu ấu trùng yếu do mật độ ấu trùng quá đông, môi trường quá cứng

không phù hợp cho phát triển, tránh tổn thương đến ấu trùng trong quá trình bắt

Phần 3: Tiến hành thử nghiệm

 Sau khi thu ấu trùng, giữ ẩm trên khăn giấy tẩm PBS 1X

 Chuẩn bị máy quay, đặt song song camera với bề mặt đĩa, tránh rung lắc trong suốt quá trình quay

 Chuẩn bị thước scale; giấy tối màu, ít phản quang, đặt bên dưới đĩa agar

 Chuyển ấu trùng lên đĩa agar, 4-6 cá thể ấu trùng/lần quay, bắt đầu quay, khung hình đề nghị 640*480, 30 khung hình /giây

 Bắt đầu quay khi ấu trùng bắt đầu di chuyển để hạn chế việc di chuyển ra rìa đĩa

 Dừng quay sau khoảng 1 phút

Phần 4: Xử lý kết quả

 Xử lý dữ liệu bằng phần mềm ImageJ để thu được tốc độ trung bình của ấu trùng sau đó xử lý thống kê bằng SPSS Kết quả được tính theo trung vị, tứ phân vị

24

Tiêu chí đánh giá: Đánh giá thông qua tốc độ di chuyển hay quãng đường di chuyển của ấu trùng trong 45 giây Thiết kế mô hình thành công khi tốc độ di chuyển của ấu trung ở lô bệnh lý thấp hơn lô sinh lý với sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê Các

lô thuốc có tác dụng cải thiện khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm gây bệnh Alzheimer khi tốc độ di chuyển của lô thuốc cao hơn lô bệnh lý với sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê

b Đánh giá khả năng trèo của ruồi giấm trưởng thành

Dựa trên hai nghiên cứu của tác giả Liu Quan Feng [33] và cộng sự công bố năm

2015, và nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự công bố năm năm 2012 [40], chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo của ruồi giấm trưởng thành với mục đích đánh giá tác dụng cải thiện khả năng vận động của cao chiết lá chè đắng trên mô hình ruồi giấm chuyển gen gây bệnh Alzheimer

Thời gian thích hợp để làm thí nghiệm khả năng leo trèo của ruồi giấm trưởng thành là vào buổi sáng (hoặc trễ nhất là trước 14h) Vì vào buổi sáng và buổi trưa khả năng leo trèo của ruồi là tốt nhất và ổn định nhất Ngoài ra, cần tuân thủ nghiêm ngặt về không gian và thời gian, có nghĩa là toàn bộ quá trình làm thí nghiệm chỉ diễn ra tại 1 địa điểm xác định và tại 1 thời gian nhất định (vì đây là thí nghiệm bò ngược chiều trọng lực, mà trọng lực tại mỗi địa điểm khác nhau vào những khoảng thời gian khác nhau là khác nhau – tránh sai số) [40] Ví dụ: Chỉ làm thí nghiệm vào lúc 8h sáng tại cùng 1 vị trí đó mà thôi Thí nghiệm được tiến hành vào ngày thứ 3, 7 và 10 sau khi ruồi nở Ruồi giấm được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 20 con (10 đực, 10 cái):

Lô 1 (Chứng bệnh lý): 10 ruồi đực Uas-hAPP, 10 ruồi cái Elav-GFP, được ăn thức

ăn bình thường

Lô 2 (Chè đắng 2): 10 ruồi đực Uas-hAPP, 10 ruồi cái Elav-GFP, được ăn thức ăn

có pha thêm cao saponin lá chè đắng với nồng độ 2 mg/ml

Lô 3 (Chè đắng 4): 10 ruồi đực Uas-hAPP, 10 ruồi cái Elav-GFP, được ăn thức ăn

có pha thêm cao saponin lá chè đắng với nồng độ 4 mg/ml

Lấy ruồi giấm thế hệ F1 của phép lai trên, tiên hành thử nghiệm ở các ngày thứ 3,

7, 10 sau khi nở với các bước: