NGHIÊN CỨU TINH CHẾ TERAZOSIN LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Định lượng sản phẩm tinh chế bằng phương pháp HPLC theo Thường quy kỹ thuật thiết lập chất chuẩn terazosin hydroclorid của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương .... Định tính nguyên liệu te

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày nội dung đề tài của mình, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người trong thời gian qua đã luôn hỗ trợ, động viên để tôi có thể hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp này

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới NCS ThS Đỗ Thị Thanh Thủy – giảng viên Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội, người

thầy đã trực tiếp hướng dẫn, luôn tận tình chỉ bảo và cho tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này Sự dìu dắt và tâm huyết của cô luôn là tấm gương sáng cho tôi trên con đường nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã luôn giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn nhóm nghiên cứu thuộc Bộ môn Hóa Dược, đặc biệt là bạn Đoàn Thị Lâm Oanh đã luôn giúp đỡ, chia sẻ khó khăn và khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Hà Nội, ngày 12 tháng 01 năm 2019

Sinh viên

Lê Trần Tiến

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về terazosin 2

1.1.1 Terazosin hydroclorid (TEZ.HCl) 2

1.1.2 Tác dụng và chỉ định của terazosin 2

1.1.3 Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường 3

1.1.4 Các tạp chất của terazosin 4

1.2 Phương pháp tổng hợp terazosin tại Việt Nam 5

1.3 Một số phương pháp kiểm nghiệm terazosin có sử dụng chất chuẩn terazosin 6

1.3.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu terazosin hydroclorid theo USP 40 6

1.3.2 Kiểm nghiệm nguyên liệu terazosin theo BP 2017 8

1.3.3 Kiểm nghiệm viên nén terazosin theo USP 40 8

1.4 Một số phương pháp tinh chế các hợp chất hữu cơ 9

1.4.1 Phương pháp chưng cất 9

1.4.2 Phương pháp kết tinh 10

1.4.3 Phương pháp chiết 10

1.4.4 Phương pháp thăng hoa 10

1.4.5 Phương pháp sắc ký cột 10

1.5 Một số phương pháp hóa lý sử dụng trong đề tài 11

1.5.1 Sắc ký lớp mỏng 11

1.5.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

1.5.3 Đo nhiệt độ nóng chảy 11

1.5.4 Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) 12

1.5.5 Quang phổ hồng ngoại (IR) 12

1.5.6 Khối phổ (MS) 12

1.5.7 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 12

1.6 Tình hình thiết lập chất chuẩn terazosin trong nước và trên thế giới 13

1.6.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn terazosin trên thế giới 13

1.6.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 14

2.1.1 Các hóa chất, chất chuẩn 14

2.1.2 Thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Sắc ký cột 16

2.3.2 Các phương pháp phổ 16

2.3.3 Phương pháp hóa học 16

2.3.4 Sắc ký lớp mỏng 16

2.3.5 Đo nhiệt độ nóng chảy 17

2.3.6 Phân tích nhiệt trọng lượng 17

2.3.7 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 17

2.3.8 Xác định độ hòa tan của viên nén terazosin theo USP 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Tinh chế nguyên liệu terazosin 19

3.1.1 Kiểm tra nguyên liệu trước tinh chế 19

3.1.2 Tiến hành tinh chế nguyên liệu terazosin bằng sắc ký cột 20

3.2 Khẳng định cấu trúc của sản phẩm 22

3.2.1 Phổ IR của sản phẩm 22

3.2.2 Phổ khối của sản phẩm 23

3.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm 24

3.2.4 Định tính HCl kết hợp theo USP 40 28

3.3 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế 28

3.3.1 Đo nhiệt độ nóng chảy 28

3.3.2 Xác định độ ẩm 28

3.3.3 Xác định độ tinh khiết bằng TLC 29

3.4 Định lượng sản phẩm tinh chế bằng phương pháp HPLC theo Thường quy

kỹ thuật thiết lập chất chuẩn terazosin hydroclorid của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương 30

3.4.1 Điều kiện sắc ký 30

3.4.2 Các dung dịch gốc và các dung dịch tiêm sắc ký 30

3.4.3 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký 31

3.4.4 Định lượng 31

3.5 Ứng dụng sản phẩm để kiểm nghiệm một số chỉ tiêu của viên nén terazosin

theo USP 40 32

3.5.1 Thông tin mẫu 32

3.5.2 Định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC 32

3.5.3 Xác định độ hòa tan 36

3.6 Bàn luận 38

3.6.1 Về khảo sát hệ dung môi rửa giải khi triển khai sắc ký cột 38

3.6.2 Về quá trình triển khai sắc ký cột 38

3.6.3 Về kiểm tra cấu trúc của sản phẩm tinh chế 39

3.6.4 Về đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm 40

3.6.5 Về định lượng sản phẩm 41

3.6.6 Về sử dụng sản phẩm để kiểm nghiệm một số chỉ tiêu của viên nén terazosin theo USP 40 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BP (British Pharmacopoeia) Dược điển Anh

BPH (Benign prostate hyperplasia) Phì đại lành tính tiền liệt tuyến

FDA (Food and Drug Administration) Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm

Hoa Kỳ HDL (high density lipoprotein) Lipoprotein tỉ trọng cao

HPLC (High performance liquid

IAT (Impurity A of terazosin) Tạp chất A của terazosin

IBT (Impurity B of terazosin) Tạp chất B của terazosin

ICT (Impurity C of terazosin) Tạp chất C của terazosin

LDL (low density lipoprotein) Lipoprotein tỉ trọng thấp

RSD (Relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối

TLC (Thin layer chromatography) Sắc ký lớp mỏng

USP (United State Pharmacopoeia) Dược điển Mỹ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường 4

Bảng 1.2 Công thức cấu tạo các tạp chất của terazosin theo USP 40 5

Bảng 3.1 Kết quả xác định tạp chất trong TEZ thô bằng TLC 20

Bảng 3.2 Hiệu suất tinh chế TEZ thô bằng sắc ký cột 22

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của TEZ 23

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR 25

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR 26

Bảng 3.6 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của terazosin tinh chế 28

Bảng 3.7 Kết quả đo hàm ẩm của terazosin tinh chế 28

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký định lượng sản phẩm 31 Bảng 3.9 Hàm lượng TEZ.HCl trong sản phẩm tinh chế 32

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký định tính, định lượng viên nén TEZ 34

Bảng 3.11 Hàm lượng TEZ trong mẫu viên nén 36

Bảng 3.12 Kết quả thử độ hòa tan mẫu viên nén terazosab 1 mg 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của terazosin hydroclorid 2

Hình 1.2 Một số biệt dược chứa terazosin trên thị trường 4

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp TEZ.HCl 6

Hình 3.1 Các chất chuẩn, tạp chuẩn của USP 14

Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC đánh giá terazosin thô 20

Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC khảo sát các phân đoạn trong quá trình tinh chế terazosin bằng sắc ký cột 22

Hình 3.4 Phổ IR của TEZ 23

Hình 3.5 Phổ MS của terazosin hydroclorid 24

Hình 3.6 Phổ 1H-NMR của terazosin 24

Hình 3.7 Phổ 13C-NMR của terazosin 25

Hình 3.8 Phổ HMBC của TEZ.HCl 27

Hình 3.9 Phổ HSQC của TEZ.HCl 27

Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC của sản phẩm tinh chế 29

Hình 3.11 Sắc ký đồ HPLC dung dịch phân giải 34

Hình 3.12 Sắc ký đồ dùng định tính thành phẩm chứa terazosin bằng HPLC 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Phì đại lành tính tiền liệt tuyến (benign prostate hyperplasia – BPH) là một bệnh thường gặp ở nam giới tuổi trung niên Ở các nước phát triển, đi kèm với tuổi thọ tăng thì BPH ngày càng phổ biến, trở thành gánh nặng cho cá nhân và cho toàn xã hội [9] Theo Tổ chức Y tế Thế giới, trên 50% nam giới độ tuổi từ 60 - 70 bị phì đại lành tính tiền liệt tuyến Tỷ lệ này tăng lên tới 85 - 88% ở những người 80 tuổi trở lên [6] Một số biểu hiện chính của bệnh là giảm tốc độ dòng nước tiểu, buồn đi tiểu nhiều lần… gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh Nếu không điều trị và phát hiện kịp thời, bệnh có thể gây một số biến chứng tại đường tiết niệu như nhiễm khuẩn, viêm đường tiết niệu Việc cắt bỏ tuyến tiền liệt – một tuyến đóng vai trò quan trọng trong điều hòa một số chức năng của nam giới được xem như giải pháp cuối cùng, do tiềm ẩn nhiều rủi ro và nguy cơ Vì vậy, lựa chọn điều trị nội khoa bằng thuốc được ưu tiên sử dụng trên phần lớn bệnh nhân

Terazosin là một thuốc ức chế chọn lọc receptor α1-adrenergic [10], làm giãn cơ trơn

cổ bàng quang và tiền liệt tuyến, nhờ đó cải thiện rõ ràng các triệu chứng của phì đại lành tính tiền liệt tuyến Mặt khác, với việc làm giảm sự co thắt mạch máu, terazosin còn có tác dụng hạ huyết áp [28], [42] Do đó thuốc được chỉ định và có hiệu quả tốt với những bệnh nhân BPH có mắc kèm cao huyết áp – vốn chiếm một tỷ lệ lớn trong những bệnh nhân cao tuổi [12], [14], [15], [19], [21], [26], [37]

Để kiểm soát chất lượng nguyên liệu cũng như các thành phẩm có chứa terazosin, dược điển Mỹ và một số dược điển khác đều yêu cầu một số chỉ tiêu chất lượng quan trọng có sử dụng chất chuẩn terazosin [38], [39] Việc tiến hành kiểm nghiệm hoạt chất này gặp nhiều khó khăn do phụ thuộc vào chất chuẩn đặt mua ở nước ngoài với giá thành cao và thời gian đặt hàng lâu Vì vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu tinh chế terazosin làm nguyên liệu thiết lập chuẩn và bước đầu ứng dụng trong kiểm nghiệm” với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp tinh chế terazosin làm nguyên liệu thiết lập chuẩn

2 Ứng dụng sản phẩm tinh chế trong kiểm nghiệm một số chỉ tiêu chất lượng đối với viên nén terazosin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về terazosin

1.1.1 Terazosin hydroclorid (TEZ.HCl)

- Công thức phân tử: C19H25N5O4.HCl

- Công thức cấu tạo: Hình 1.1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của terazosin hydroclorid

- Khối lượng phân tử: 423,89 g/mol

- Tên khoa học: 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-(tetrahydro-2- furoyl)piperazin hydroclorid

- Dạng dược dụng: dạng muối hydroclorid khan, có công thức phân tử

C19H25N5O4.HCl (423,89 g/mol) và dạng muối hydroclorid ngậm nước có công thức phân tử C19H25N5O4.HCl.2H2O (459,92 g/mol) [39]

- Tính chất: tinh thể màu trắng, không mùi Ít tan trong nước và methanol, không tan trong ethanol 96% và aceton [17], [20], [39]

1.1.2 Tác dụng và chỉ định của terazosin

1.1.2.1 Tác dụng

Terazosin có tác dụng ức chế thụ thể α1-adrenergic ở hậu synap, trong đó chủ yếu là các thụ thể α1 nằm ở cơ trơn cổ bàng quang và tiền liệt tuyến [32], làm giãn cơ trơn mạch máu, giãn cơ trơn bàng quang, hạ huyết áp… Cụ thể, terazosin làm giảm trương lực cơ trơn tiền liệt tuyến nên cải thiện một số tình trạng tắc của phì đại lành tính tiền liệt tuyến như: giảm tốc độ dòng nước tiểu, tăng lượng nước tiểu giữ lại bàng quang gây cảm giác đi tiểu chưa hết và buồn tiểu nhiều lần [15] So với finasterid là một thuốc thuộc nhóm 5α-reductase có tác dụng làm giảm kích thước của tuyến tiền liệt – cũng được sử dụng trong điều trị BPH thì terazosin có khả năng cải thiện các triệu chứng kể trên nhanh chóng hơn [30]

Tác dụng làm giảm sự co thắt mạch máu, giảm đồng thời cả huyết áp tâm thu và huyết

áp tâm trương mà không gây phản xạ nhịp nhanh của terazosin được ứng dụng để duy

trì tác dụng hạ huyết áp trên các bệnh nhân mắc kèm một số bệnh như phì đại lành tính tiền liệt tuyến, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (COPD), suy tim tắc nghẽn, bệnh mạch máu ngoại vi…[23] Mặt khác, với ưu điểm làm giảm cholesterol toàn phần, LDL, triglycerid và làm tăng HDL so với một số thuốc điều trị tăng huyết áp khác [31], terazosin an toàn và hiệu quả để điều trị lâu dài trong tăng huyết áp nhẹ đến trung bình [23]

Theo một số nghiên cứu, terazosin có tác dụng tích cực đến sự ức chế phát triển ung thư tiền liệt tuyến [27], [35], [40] Kết quả nghiên cứu cho thấy với liều 25 µM, terazosin

ức chế sự phát triển và xâm lấn của các tế bào ung thư tiền liệt tuyến do ngăn chặn sự gắn của các tế bào này với collagen và gelatin [24]

1.1.2.2 Dược động học

Terazosin liên kết mạnh với protein huyết tương (90 - 94%), đạt sinh khả dụng 54% (với liều 4 mg) đến 59% (với liều 10 mg) Thuốc có thời gian bán thải 15 giờ, tác dụng đến 24 giờ nên có thể dùng 1 lần trong ngày Terazosin chuyển hóa chủ yếu ở gan bởi enzym CYP3A4 và bài tiết chủ yếu qua phân (63%) [25]

1.1.2.3 Chỉ định

Terazosin được FDA phê duyệt để điều trị tăng huyết áp từ năm 1987 [35] Dạng uống được chỉ định để điều trị đơn độc hoặc phối hợp trong các trường hợp tăng huyết

áp nhẹ và vừa, đặc biệt là các trường hợp tăng huyết áp tâm trương [21], [22]

Theo một thống kê chưa đầy đủ, có khoảng 80% bệnh nhân phì đại lành tính tiền liệt tuyến có mắc kèm tăng huyết áp Với tác dụng cải thiện các triệu chứng tắc nghẽn của BPH [16], [18], [28], [29], terazosin là một lựa chọn được ưu tiên trong điều trị BPH có kèm tăng huyếp áp do có rất ít các thuốc trong nhóm chẹn thụ thể α1-adrenergic được chỉ định để điều trị đồng thời tăng huyết áp và phì đại lành tính tiền liệt tuyến [15], [33], [34], [37], [41]

1.1.3 Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường

Trên thế giới, biệt dược Hytrin® được Abbott lần đầu tiên đưa ra thị trường với dược chất terazosin hydroclorid dihydrat Sau khi Hytrin® hết hạn bảo hộ bản quyền vào năm

1996, các dạng generic của terazosin lần lượt được các hãng dược phẩm sản xuất, phổ biến là dạng viên nén với các hàm lượng 1, 2, 5, 10 mg (Bảng 1.1) [43]

Bảng 1.1 Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường

STT Tên biệt dược Hàm lượng

(mg) Hãng sản xuất

Nước lưu hành

Mỹ, Australia, Malaysia, Thái Lan,…

2 Terazosin EG® 5, 10

n.v

Eurogenerics s.a

Bỉ

với tạp chất C theo BP; tạp chất B theo USP tương ứng với tạp chất B theo BP và tạp chất C theo USP tương ứng với tạp chất E theo BP [39]

Bảng 1.2 Công thức cấu tạo các tạp chất của terazosin theo USP 40

Tên tạp chất

theo USP

Tên tạp chất tương ứng theo

1.2 Phương pháp tổng hợp terazosin tại Việt Nam

Quy trình tổng hợp terazosin hydroclorid lần đầu được công bố tại Việt Nam vào năm

2011 trong đề tài cấp sở Khoa học Công nghệ Hà Nội “Nghiên cứu quy trình công

nghệ tổng hợp terazosin hydroclorid làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị tăng huyết áp và phì đại lành tính tiền liệt tuyến”, được thực hiện bởi Nguyễn Hải Nam và

cộng sự [7] Sơ đồ tổng hợp được triển khai như sau:

Hóa chất và điều kiện: a) CH 3 OH, H 2 SO 4 , 25-35°C/ 4 giờ, hiệu suất 98,7%; b) Piperazin, 5% acid acetic khan/ dioxan, hồi lưu 12 giờ, hiệu suất 88,0%; c) dioxan, hồi lưu 12 giờ, hiệu suất 71,6%; d)

HCl/ EtOH, TEA, ethyl acetat, 60-65°C, hiệu suất 94,6%

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng tổng hợp TEZ.HCl

1.3 Một số phương pháp kiểm nghiệm terazosin có sử dụng chất chuẩn terazosin

1.3.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu terazosin hydroclorid theo USP 40

1.3.1.1 Định tính nguyên liệu terazosin bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại

 Tiến hành:

Sử dụng kĩ thuật tạo viên nén KBr: nghiền 1 mg đến 2 mg chất thử với 300 mg đến

400 mg bột mịn kali bromid (IR) đã sấy khô và rải đều trong một khuôn thích hợp Nén khuôn có hỗn hợp tới áp suất khoảng 800 MPa trong điều kiện chân không Chuẩn bị chất thử và chất đối chiếu theo cùng một quy trình và ghi phổ từ 3800 cm-1 đến 650

cm-1 (2,6 m đến 15 m)

 Đánh giá kết quả: Phổ IR của mẫu thử phải tương tự với mẫu chuẩn

1.3.1.2 Định tính, định lượng nguyên liệu terazosin bằng phương pháp HPLC

- Pha động: hỗn hợp đệm citrat pH 3,2 và acetonitril tỷ lệ 1685:315 (Dung dịch

đệm citrat pH 3,2: hòa tan 12,0 g natri citrat dihydrat và 28,5 g acid citric trong 2 lít

nước Điều chỉnh tới pH 3,2 ± 0,1 bằng acid citric khan hoặc natri citrat nếu cần)

- Thời gian chạy: 45 phút

Định tính: dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương tự thời gian lưu của

pic terazosin trong dung dịch chuẩn

Định lượng: hàm lượng terazosin trong nguyên liệu được tính dựa trên nồng độ và

diện tích pic terazosin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử Yêu cầu hàm lượng TEZ.HCl trong nguyên liệu phải từ 98,0% - 102,0% tính theo chế phẩm khan

1.3.1.3 Xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu terazosin

- Pha động: hỗn hợp ACN và dung dịch đệm citrat pH 3,2 với tỉ lệ 315:1685

- Thời gian chạy: 60 phút

 Các dung dịch tiêm sắc ký:

Mẫu trắng: pha động

Dung dịch chuẩn: dung dịch hỗn hợp có chứa khoảng 2,5 µg/ml TEZ chuẩn, 2,0

µg/ml IAT chuẩn, 2,0 µg/ml IBT chuẩn và 2,0 µg/ml ICT chuẩn

Dung dịch thử: dung dịch chứa TEZ nguyên liệu với nồng độ 0,5 mg/ml

 Đánh giá kết quả

Yêu cầu về mẫu trắng: trong khoảng thời gian chạy sắc ký không có pic nào xuất

hiện

Yêu cầu trong mẫu nguyên liệu:

1.3.2 Kiểm nghiệm nguyên liệu terazosin theo BP 2017

Chuyên luận về terazosin trong BP 2017 có chỉ tiêu định tính bằng đo phổ IR sử dụng chất chuẩn terazosin hydroclorid

 Tiến hành:

Sử dụng kĩ thuật tạo viên nén KBr Chuẩn bị chất thử và chất đối chiếu theo cùng một quy trình và ghi phổ từ 4000 cm-1 đến 650 cm-1 (2,5 m đến 15,5 m) trong những điều kiện như nhau

 Đánh giá kết quả:

Yêu cầu phổ IR của mẫu thử phải tương tự với mẫu chuẩn

1.3.3 Kiểm nghiệm viên nén terazosin theo USP 40

1.3.3.1 Định tính viên nén terazosin bằng phương pháp đo UV

 Chuẩn bị các dung dịch:

- Dung môi pha mẫu: acid hydrocloric 0,1 N

- Dung dịch chuẩn: là dung dịch chuẩn TEZ.HCl trong dung môi pha mẫu có nồng

- Pha động: ACN và nước tỉ lệ (7:3) Thêm acid acetic băng với tỉ lệ 10,00 ml/l Lọc qua màng lọc 0,45 µm Thêm diethylamin với tỷ lệ 0,20 ml/l

- Dung môi pha mẫu: thêm 0,85 ml HCl đặc vào 1 lít methanol rồi pha với nước với tỉ lệ 2:3

- Thời gian chạy: tối thiểu 2 lần thời gian lưu của pic terazosin

 Các dung dịch tiêm sắc ký:

- Dung dịch thử tính thích hợp của hệ thống sắc ký: là dung dịch chứa TEZ chuẩn

nồng độ 0,055 mg/ml và naproxen chuẩn nồng độ 0,05 mg/ml trong dung môi pha mẫu

- Dung dịch chuẩn: là dung dịch TEZ chuẩn trong dung môi pha mẫu có nồng độ

khoảng 0,055 mg/ml

- Dung dịch thử: là dung dịch pha từ bột viên trong dung môi pha mẫu có nồng độ

terazosin khoảng 0,05 mg/ml

 Đánh giá kết quả:

Định tính: dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương tự thời gian lưu của

pic terazosin trong dung dịch chuẩn

Định lượng: hàm lượng terazosin trong viên nén được tính dựa trên nồng độ và

diện tích pic terazosin thu được trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử Yêu cầu: hàm lượng TEZ trong viên nén nằm trong khoảng 90,0% - 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn, tính theo dạng base

1.4 Một số phương pháp tinh chế các hợp chất hữu cơ

1.4.1 Phương pháp chưng cất

Phương pháp chưng cất được dùng để tinh chế các hợp chất hữu cơ dạng lỏng Chưng cất là quá trình chuyển chất lỏng thành thể hơi rồi ngưng tụ lại thành thể lỏng Phương pháp này thường dùng để tách biệt (tinh chế) các chất có nhiệt độ sôi khác nhau ra khỏi hỗn hợp của nó Có nhiều phương pháp chưng cất khác nhau tùy thuộc vào tính chất của hỗn hợp chất lỏng

- Với các chất có nhiệt độ sôi xa nhau thường chọn phương pháp cất đơn hay cất thường

- Với các chất có nhiệt độ sôi gần nhau thường chọn phương pháp chưng cất phân đoạn

- Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước dùng để tách biệt các chất trong hỗn hợp, trong đó có một chất không tan trong nước và dễ bay hơi với hơi nước Thông

thường phương pháp này được lựa chọn khi thỏa mãn các điều kiện trên và không thực hiện được với hai phương pháp trên

Các phương pháp chưng cất trên có thể tiến hành ở áp suất bình thường hoặc ở áp suất thấp tùy vào đặc điểm tính chất của hỗn hợp chưng cất

1.4.2 Phương pháp kết tinh

Phương pháp kết tinh (kết tinh lại) là phương pháp tinh chế dựa trên tính bão hòa của chất rắn cần tinh chế khi đun nóng trong dung môi thích hợp, loại bỏ tạp chất và chất kết tinh trở lại khi làm lạnh

Quá trình kết tinh lại gồm các giai đoạn: hòa tan mẫu chất rắn không tinh khiết trong dung môi thích hợp; lọc nóng dung dịch trên để loại bỏ các tạp chất không tan; làm lạnh dung dịch hoặc đuổi bớt dung môi để tạo dung dịch bão hòa và gây mầm kết tinh; làm khô tinh thể Quá trình trên có thể thực hiện lại nhiều lần để thu được chất tinh khiết

1.4.4 Phương pháp thăng hoa

Trong phương pháp thăng hoa để tinh chế chất, chất rắn được chuyển thành hơi rồi ngưng tụ lại thành rắn, không qua trạng thái lỏng Có thể tiến hành thăng hoa ở áp suất thường hoặc ở áp suất thấp bằng một số dụng cụ chuyên dụng Phương pháp này yêu cầu chất cần tinh chế và các chất phụ phải có tính bay hơi khác nhau nhiều Ưu điểm của phương pháp là độ tinh khiết của sản phẩm thu được tương đối cao và có thể áp dụng với một lượng nhỏ chất

1.4.5 Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột là một kỹ thuật rất hiệu quả để tách các hợp chất có cấu tạo và tính chất gần giống nhau trong một hỗn hợp Hỗn hợp các chất được đi qua một ống thủy tinh thẳng đứng, bên trong có nhồi hạt pha tĩnh Các thành phần khác nhau của mẫu được phân tách riêng biệt do tương tác của hỗn hợp với pha tĩnh và pha động Các chất đi ra

được thu lại thành từng phần nhỏ hay phân đoạn nhỏ ở đầu dưới của cột Pha động là một hỗn hợp các dung môi với tỉ lệ xác định Pha tĩnh thường dùng là silica, alumina hoặc sephadex được nhồi trong cột, trong đó silica được sử dụng phổ biến hơn Có hai loại silica gel là silica gel pha thuận (gồm Si có đính các nhóm -OH) và silica gel pha đảo (gồm Si có đính các dây alkan R) Silica gel pha thuận thường được sử dụng nhiều hơn do giá thành rẻ Trong quá trình chạy cột sắc ký sử dụng pha tĩnh là silica gel pha thuận, các hợp chất phân cực sẽ tương tác với silica gel mạnh hơn so với các hợp chất không phân cực nên sẽ đi ra khỏi cột (hoặc được rửa giải) sau các hợp chất không phân cực

1.5 Một số phương pháp hóa lý sử dụng trong đề tài

1.5.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (thin-layer chromatography - TLC) là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ

lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu

tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc [1], [3]

1.5.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography - HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao qua một cột sắc ký, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu Detector tạo ra tín hiệu

tỷ lệ với lượng mẫu thành phần đi ra từ cột, do đó cho phép phân tích định lượng của những thành phần trong mẫu [1], [3]

1.5.3 Đo nhiệt độ nóng chảy

Đối với một chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học quan trọng để kiểm tra mức độ tinh khiết của một chất Các chất khác nhau có nhiệt độ nóng chảy khác nhau Nếu một chất kết tinh có điểm chảy gần với lý thuyết chứng tỏ sản phẩm đã tương

đối tinh khiết và ngược lại Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy thường dùng để xác định độ tinh khiết của chất

1.5.4 Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA)

TGA là phương pháp phân tích dựa trên việc ghi lại liên tục sự thay đổi khối lượng mẫu trong quá trình gia nhiệt hoặc làm lạnh theo một chương trình cho trước Kết quả ghi lại có thể là một đồ thị thay đổi khối lượng theo nhiệt độ hoặc thời gian Phép đo TGA nhằm xác định: khối lượng bị mất trong quá trình chuyển pha; khối lượng bị mất theo thời gian và theo nhiệt độ do quá trình khử nước hoặc phân ly TGA thường được ứng dụng trong việc xác định hàm ẩm của chất

1.5.5 Quang phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi qua một lớp chất thử ở các số sóng khác nhau Thông thường vùng bức xạ hồng ngoại được

sử dụng là 600 đến 4000 cm-1 Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR Nhiều nhóm chức có các dải hấp phụ đặc trưng, là cơ sở để phân tích cấu trúc bằng IR Trong kiểm nghiệm thuốc, phương pháp quang phổ hồng ngoại chủ yếu được ứng dụng trong định tính các hợp chất hữu cơ [2], [3]

1.5.7 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Nguyên lý chung của NMR là sự cộng hưởng các tần số khác nhau của các hạt nhân

từ 1H và 13C dưới tác dụng của từ trường Các tần số cộng hưởng khác nhau được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học Phổ cộng hưởng proton 1H-NMR và phổ cộng hưởng carbon 13C-NMR cho biết số nguyên tử hydro và số nguyên tử carbon các bậc Với các hợp chất có cấu trúc phức tạp, việc sử dụng thêm các phổ NMR hai chiều giúp việc giải phổ dễ dàng hơn: HSQC cho thông tin về tương quan một nối giữa proton và carbon, HMBC cho thông tin về tương quan hai, ba và bốn nối giữa proton và carbon Từ các

thông tin cộng hưởng từ, có thể dựng lại cấu trục khung phân tử hữu cơ chưa biết một cách chính xác [2]

1.6 Tình hình thiết lập chất chuẩn terazosin trong nước và trên thế giới

1.6.1 Tình hình thiết lập chất chuẩn terazosin trên thế giới

Theo hiểu biết của nhóm nghiên cứu qua các tài liệu tham khảo, cho đến thời điểm thực hiện, chỉ có một số quy trình tổng hợp terazosin được công bố mà chưa có một đề tài hay nghiên cứu nào công bố chi tiết quy trình tinh chế và thiết lập chất chuẩn terazosin dùng trong kiểm nghiệm Trên thế giới, chất chuẩn terazosin hydroclorid được Hội đồng Dược điển Mỹ và một số công ty như Sigma – Aldrich… thiết lập và bán với giá thành cao (khoảng 250$ cho 200 mg) [44] Trong chuyên luận về TEZ của các dược điển có

sử dụng chất chuẩn terazosin hydroclorid để kiểm nghiệm một số chỉ tiêu quan trọng như: định tính nguyên liệu TEZ theo BP; định tính, định lượng, xác định tạp chất liên quan của nguyên liệu TEZ theo USP… Ngoài ra, một số nghiên cứu như xác định đồng thời terazosin và các thuốc cùng nhóm –zosin khác cũng có sử dụng chất chuẩn terazosin hydroclorid [13], [36]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam cho đến thời điểm hiện tại, chưa có một nghiên cứu nào công bố quy

trình thiết lập chất chuẩn terazosin Một số công bố như “Nghiên cứu quy trình tổng

hợp terazosin hydroclorid” hay “Đánh giá chất lượng nguyên liệu terazosin hydroclorid tổng hợp tại Việt Nam” làm nguyên liệu sản xuất thuốc đều sử dụng chất

đối chiếu TEZ.HCl nhập từ nước ngoài với giá thành cao và thời gian đặt mua tương đối lâu [5], [8] Do vậy, việc thiết lập được chất chuẩn terazosin trong nước nhằm góp phần chủ động hơn trong công tác kiểm nghiệm nguyên liệu cũng như các thành phẩm chứa terazosin

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

- Naproxen của hãng Sigma-Aldrich: Lô SLBV2253, hàm lượng 99,6%

TEZ chuẩn IAT chuẩn IBT chuẩn ICT chuẩn

Hình 3.1 Các chất chuẩn, tạp chuẩn của USP

- Các hóa chất, dung môi tinh khiết phân tích và loại dùng cho HPLC của hãng Sigma-Aldrich, Merck (Đức):

- Cân kỹ thuật Ohaus PA512 độ chính xác 0,01 g (Trung Quốc)

- Cân phân tích METTLER TOLEDO MS105 có độ chính xác 0,01 mg (Thụy Sĩ)

- Máy cất quay chân không Buchi R201 (Thụy Sĩ)

- Máy siêu âm Bandelin RK 106 (Đức)

- Đèn soi tử ngoại UV-VIS Vilber Lourmat (Pháp)

- Máy đo khối phổ LTQ ORBITRAP XLTM (Mỹ)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500MHz Ascend (Đức)

- Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR Affinity-1S (Nhật)

- Máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP 3 Stuart (Anh)

- Máy phân tích nhiệt trọng lượng Labsys TG 1600, SETARAM

- Máy HPLC SHIMADZU diode array UV-VIS SPD- M20A

- Cột sắc ký dùng cho HPLC Supelco C8 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

- Tủ sấy chân không WOV-70 (Hàn Quốc)

- Cột thủy tinh dùng cho sắc ký: chiều dài 40 cm, đường kính 2,5 cm

- Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck (Đức)

- Silica gel 60 (0,063-0,200 mm) dùng cho sắc ký cột (Merck)

- Các dụng cụ thủy tinh cần thiết

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp tinh chế terazosin ở quy mô phòng thí nghiệm bằng sắc ký cột

- Khẳng định cấu trúc của sản phẩm thu được bằng phương pháp hóa học và các phương pháp phổ

- Xác định độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, phân tích nhiệt trọng lượng và sắc ký lớp mỏng

- Xác định hàm lượng của sản phẩm tinh chế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Ứng dụng sản phẩm tinh chế trong kiểm nghiệm một số chỉ tiêu: định tính, định lượng, xác định độ hòa tan của viên nén terazosin theo USP 40

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sắc ký cột

Phương pháp sắc ký cột được sử dụng để tinh chế nguyên liệu terazosin, sử dụng cột sắc ký có chiều dài 40 cm, đường kính 2,5 cm; silica gel 60 (0,063-0,200 mm) dùng cho sắc kí cột; hệ dung môi pha động là diclorometan - aceton - methanol với các tỷ lệ khác nhau

2.3.2 Các phương pháp phổ

Các phương pháp phổ được sử dụng để khẳng định cấu trúc của sản phẩm tinh chế

- Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) bằng kĩ thuật tạo viên nén KBr: được ghi tại khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên trên máy Shimadzu FTIR Afinity-1S

- Phương pháp đo phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ LTQ ORBITRAP XL tại khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên, dung môi methanol

- Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: được ghi trên máy Bruker Ascend

500 MHz tại khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên, dung môi DMSO-d 6

- Hệ 1: diclorometan - ethyl acetat - triethylamin - dung dịch amoniac 25%, tỷ lệ 4:2:1:4, lắc kỹ và gạn lấy pha dung môi hữu cơ

- Hệ 2: cloroform - aceton - triethylamin - dung dịch amoniac 25%, tỷ lệ 8:8:1:10, lắc

kỹ và gạn lấy pha dung môi hữu cơ

- Hệ 3: cloroform - ethyl acetat - triethylamin - dung dịch amoniac 25%, tỷ lệ 2:3:1:5, lắc kỹ và gạn lấy pha dung môi hữu cơ

Phát hiện vết bằng soi đèn UV với các bước sóng 254 nm và 312 nm

2.3.5 Đo nhiệt độ nóng chảy

Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy được dùng để kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế, sử dụng máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP 3 Stuart với tốc độ gia nhiệt 0,2°C/giây

2.3.6 Phân tích nhiệt trọng lượng

Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng được dùng để kiểm tra độ ẩm của sản phẩm tinh chế, sử dụng máy Labsys TG 1600, SETARAM với tốc độ dòng khí bảo vệ 2,5 lít/giờ, tốc độ gia nhiệt là 2°C/phút, duy trì nhiệt độ 105°C trong 4 giờ Lượng mẫu thử khoảng 10 mg

2.3.7 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.3.7.1 Ứng dụng xác định hàm lượng của sản phẩm tinh chế

Phương pháp HPLC theo “Thường quy kỹ thuật thiết lập chất chuẩn terazosin

hydroclorid” của VKNTTW được dùng để xác định hàm lượng của sản phẩm tinh chế

[11] với các điều kiện sắc ký như sau:

2.3.7.2 Ứng dụng định tính, định lượng viên nén terazosin theo USP

Phương pháp HPLC theo USP 40 được dùng để định tính, định lượng viên nén Terazosab® 1 mg với các điều kiện sắc ký như sau:

2.3.8 Xác định độ hòa tan của viên nén terazosin theo USP

Phương pháp xác định độ hòa tan dùng để đánh giá độ hòa tan của viên nén Terazosab® 1 mg với các điều kiện hòa tan như sau:

Xác định hàm lượng hoạt chất hòa tan bằng phương pháp đo UV ở bước sóng 254

nm, cuvet 1 cm, mẫu trắng là nước

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tinh chế nguyên liệu terazosin

3.1.1 Kiểm tra nguyên liệu trước tinh chế

Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của nguyên liệu TEZ thô bằng TLC với các điều kiện sau:

- Hệ dung môi khai triển sắc ký: diclorometan - ethyl acetat - triethylamin - dung dịch amoniac 25% với tỷ lệ 4:2:1:4, lắc kỹ và gạn lấy lớp dung môi hữu cơ làm dung môi khai triển

- Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck đã được hoạt hóa ở 110°C trong 1 giờ

- Dung dịch thử: hòa tan TEZ thô trong methanol để được dung dịch có nồng độ 10 mg/ml (100%)

- Dung dịch đối chiếu TEZ: hút chính xác 1 ml dung dịch thử pha loãng với methanol thành 20 ml Hút 1 ml dung dịch này pha loãng với methanol trong bình định mức 50

ml thu được dung dịch đối chiếu có nồng độ 0,01 mg/ml (0,1% so với dung dịch thử)

- Dung dịch IAT chuẩn: hòa tan tạp chuẩn A của terazosin theo USP trong methanol

để được nồng độ 0,03 mg/ml (0,3% so với dung dịch thử)

- Dung dịch IBT chuẩn: hòa tan tạp chuẩn B của terazosin theo USP trong methanol

để được nồng độ 0,01 mg/ml (0,1% so với dung dịch thử)

- Dung dịch ICT chuẩn: hòa tan tạp chuẩn C của terazosin theo USP trong methanol

để được nồng độ 0,04 mg/ml (0,4% so với dung dịch thử)

- Chấm đồng lượng 20 µl dung dịch thử, dung dịch đối chiếu TEZ, dung dịch IAT chuẩn, dung dịch IBT chuẩn và dung dịch ICT chuẩn lên cùng một bản mỏng

- Tiến hành khai triển sắc ký Phát hiện các vết bằng soi đèn UV ở hai bước sóng 254

nm và 312 nm Kết quả: trên sắc ký đồ của mẫu TEZ thô phát hiện được các vết: terazosin, hai vết tạp A và C tương ứng với các vết tạp chuẩn A và C Ngoài ra trên sắc

ký đồ còn phát hiện một số vết tạp không định danh, được thể hiện Hình 3.2 và Bảng 3.1

Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC đánh giá terazosin thô Bảng 3.1 Kết quả xác định tạp chất trong TEZ thô bằng TLC

Vết Rf So sánh với vết đối chiếu

Nhận xét: Từ sắc ký đồ có thể kết luận hàm lượng tạp A, tạp C và các tạp khác không

định danh trong TEZ thô đều vượt quá hàm lượng cho phép khi so sánh với các vết đối chiếu tương ứng (theo yêu cầu của chuyên luận về nguyên liệu terazosin trong USP 40, hàm lượng tạp chất A trong nguyên liệu ≤ 0,3%, hàm lượng tạp chất C trong nguyên liệu ≤ 0,4% và hàm lượng các tạp chất khác trong nguyên liệu ≤ 0,1%)

Kết luận: Như vậy nguyên liệu TEZ thô cần được tinh chế để thu được TEZ tinh

khiết theo yêu cầu của chuyên luận trong dược điển

3.1.2 Tiến hành tinh chế nguyên liệu terazosin bằng sắc ký cột

Qua quá trình khảo sát, phương pháp tinh chế terazosin thô được xây dựng gồm các bước sau:

3.1.2.1 Chuẩn bị cột sắc ký

Cột sắc ký được làm bằng thủy tinh, có đường kính 2,5 cm và chiều dài 40 cm, được lắp thẳng đứng trên giá đỡ Phía dưới cột có van để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi

Cân khoảng 50 g silica gel 60 (0,063-0,200 mm) dùng cho sắc ký cột, hoạt hóa ở 110°C trong 3 giờ Để nguội, chuyển silica gel và dung môi rửa giải diclorometan - aceton - methanol tỉ lệ (8:8:1) lên cột, tiếp tục cho dung môi chảy qua với tốc độ 30 giọt/phút để rửa hệ thống

3.1.2.2 Đưa mẫu lên cột

Cân 1 g terazosin thô vào cốc có mỏ, thêm khoảng 20 ml hỗn hợp dung môi rửa giải diclorometan - aceton - methanol tỉ lệ (8:8:1), siêu âm 10 phút, thêm 5 g silica gel đã hoạt hóa vào hỗn hợp, khuấy cho phân tán đều Chuyển từ từ hỗn hợp này lên cột, đặt một miếng bông nhỏ đã tẩm ướt bằng dung môi rửa giải lên trên cùng để tránh xáo trộn khi bổ sung dung môi

3.1.2.3 Tiến hành rửa giải

Triển khai sắc ký cột với hỗn hợp dung môi rửa giải là diclorometan - aceton - methanol ở các tỉ lệ (8:8:1), (8:12:1) và (8:12:2) Tốc độ chảy là 30 giọt/phút

Hứng dịch rửa giải lần lượt vào các ống nghiệm được đánh số Kiểm tra xác định thành phần dịch rửa giải trong các ống nghiệm bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng với

hệ dung môi khai triển được chuẩn bị bằng cách trộn đều hỗn hợp diclorometan - ethyl acetat - triethylamin - dung dịch amoniac 25% (tỷ lệ 4:2:1:4) - lắc kỹ và gạn lấy phần dung môi hữu cơ Thể tích chấm dịch rửa giải là 100 µl Gộp các phần dịch cho sắc kí

đồ giống nhau, mỗi phần được gọi là một phân đoạn Kết quả thể hiện ở Hình 3.3:

Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC khảo sát các phân đoạn trong quá trình tinh chế terazosin

Bảng 3.2 Hiệu suất tinh chế TEZ thô bằng sắc ký cột

m trước tinh chế (g) m sau tinh chế (g) Hiệu suất (%)

Hình 3.4 Phổ IR của TEZ Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của TEZ

Công thức cấu tạo Nhóm chức Số sóng (cm -1 )

Nhận xét: Kết quả trên phổ IR có thể nhận diện sự có mặt của một số nhóm chức như

-NH2, -CH2, C=O, -CH3O, C-C vòng thơm, C-H vòng thơm có trong công thức phân tử của TEZ, thông qua các giá trị của dải hấp thụ

3.2.2 Phổ khối của sản phẩm

Phổ khối phân giải cao của sản phẩm được đo bằng máy khối phổ LTQ ORBITRAP

XL với dung môi hòa tan mẫu là methanol, cho pic [M+H]+ = 388,1993 phù hợp với công thức phân tử C19H25N5O4 của TEZ (Hình 3.5 và Phụ lục 2)

Hình 3.5 Phổ MS của terazosin hydroclorid 3.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm

Tiến hành đo phổ 1H-MNR, 13C-NMR, HSQC, HMBC của terazosin bằng máy đo

phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker sử dụng dung môi là DMSO-d 6

3.2.3.1 Kết quả đo phổ 1 H-MNR của terazosin

Kết quả đo phổ 1H-MNR của terazosin được thể hiện ở Hình 3.6, Bảng 3.4 và Phụ lục 3

Hình 3.6 Phổ 1 H-NMR của terazosin

3,84 (s, 3H, H17) 3,87(s, 3H, H18) 3,89-3,96 (m, 2H, H12) 4,73-4,76 (m, 1H, H20) 7,60 (s, 1H, H8)

7,76 (s, 1H, H5) 8,67 (s, 1H, NH) 8,94 (s, 1H, NH) 12,42 (s, 1H, NH)

Ghi chú: δ: độ chuyển dịch hóa học (ppm); s: singlet, vạch đơn; m: multiplet, đa vạch

Hình 3.7 Phổ 13 C-NMR của terazosin

3.2.3.2 Kết quả đo phổ 13 C-MNR của terazosin

Kết quả đo phổ 13C-MNR của terazosin được thể hiện ở Hình 3.7, Bảng 3.5 và Phụ lục 4

Ghi chú: δ: độ chuyển dịch hóa học (ppm)

Vị trí của proton và cacbon cũng được khẳng định chắc chắn bằng phổ HSQC và HMBC (Hình 3.8, Hình 3.9, Phụ lục 5, Phụ lục 6)

Hình 3.8 Phổ HMBC của TEZ.HCl

Hình 3.9 Phổ HSQC của TEZ.HCl

Kết luận: Các phương pháp phổ đã đồng thời khẳng định cấu trúc của sản phẩm thu

được phù hợp với cấu trúc terazosin hydroclorid theo lý thuyết

3.3 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế

3.3.1 Đo nhiệt độ nóng chảy

Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của terazosin tinh chế bằng máy xác định nhiệt độ nóng chảy SMP 3 Stuart Tốc độ gia nhiệt đặt 0,2°C/giây Tiến hành đo 3 lần, thu được kết quả ở Bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của terazosin tinh chế

Lần đo Nhiệt độ nóng chảy (°C)

Bảng 3.7 Kết quả đo hàm ẩm của terazosin tinh chế

3.3.3 Xác định độ tinh khiết bằng TLC

- Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck đã được hoạt hóa ở 110°C trong 1 giờ

- Các hệ dung môi khai triển: sử dụng 3 hệ dung môi khai triển như ở phần phương pháp

nghiên cứu, mục 2.3.4 Sắc ký lớp mỏng

- Dung dịch chấm sắc ký:

Dung dịch thử: hòa tan 50 mg terazosin tinh chế trong bình định mức 5 ml bằng

methanol (nồng độ 10 mg/ml)

Dung dịch đối chiếu terazosin: được pha loãng từ dung dịch thử trong methanol để

được nồng độ 0,01 mg/ml (0,1% so với dung dịch thử)

Các dung dịch tạp A, B, C chuẩn được hòa tan từ tạp chuẩn A, B, C của terazosin

theo USP trong methanol với nồng độ lần lượt là 0,03 mg/ml (0,3% so với dung dịch thử); 0,01 mg/ml (0,1% so với dung dịch thử) và 0,04 mg/ml (0,4% so với dung dịch thử)

Chấm riêng biệt trên cùng một bản mỏng đồng lượng 20 µl theo thứ tự: dung dịch thử, dung dịch đối chiếu terazosin, dung dịch tạp A chuẩn, dung dịch tạp B chuẩn và dung dịch tạp C chuẩn

Khai triển sắc kí trong điều kiện nhiệt độ không đổi Phát hiện các vết bằng soi đèn

UV ở hai bước sóng 254 nm và 312 nm Kết quả thể hiện ở Hình 3.10:

Hình 3.10 Sắc ký đồ TLC của sản phẩm tinh chế A) Hệ 1: diclorometan - ethyl acetat - triethylamin - dung dịch amoniac 25% (4:2:1:4), lắc kỹ và gạn

lấy pha dung môi hữu cơ làm dung môi khai triển B) Hệ 2: cloroform - aceton - triethylamin - dung dịch amoniac 25% (8:8:1:10), lắc kỹ và gạn lấy pha dung môi hữu cơ làm dung môi khai triển C) Hệ

3: cloroform - ethyl acetat - triethylamin - dung dịch amoniac 25% (2:3:1:5), lắc kỹ và gạn lấy pha

dung môi hữu cơ làm dung môi khai triển

Nhận xét: Trên sắc ký đồ TLC của sản phẩm tinh chế của cả 3 hệ dung môi khai triển

khác nhau khi phát hiện ở hai bước sóng 254 nm và 312 nm đều không nhận thấy các vết tạp Vết dung dịch đối chiếu có thể quan sát dễ dàng Hệ số Rf của vết terazosin khi khai triển bằng các hệ dung môi lần lượt là 0,44 (hệ 1); 0,66 (hệ 2) và 0,33 (hệ 3) Như vậy có thể sơ bộ đánh giá sản phẩm thu được sau quá trình tinh chế là tinh khiết

3.4 Định lượng sản phẩm tinh chế bằng phương pháp HPLC theo Thường quy kỹ thuật thiết lập chất chuẩn terazosin hydroclorid của Viện Kiểm nghiệm thuốc

- Pha động: Hỗn hợp đệm citrat pH 3,2 và ACN tỷ lệ 1685:315

- Yêu cầu tính thích hợp của hệ thống: Số đĩa lý thuyết không nhỏ hơn 12000; hệ

số kéo đuôi không nhỏ hơn 0,9 và không quá 1,3; độ lệch chuẩn tương đối không quá 0,9%

3.4.2 Các dung dịch gốc và các dung dịch tiêm sắc ký

- Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan khoảng 25 mg TEZ.HCl chuẩn của USP trong 50 ml

pha động

- Dung dịch thử gốc: Hòa tan khoảng 25 mg sản phẩm tinh chế trong 50 ml pha động

- Mẫu trắng: pha động

- Dung dịch chuẩn: hút 10 ml dung dịch chuẩn gốc pha trong 50 ml pha động Hút

10 ml dung dịch này pha trong 100 ml pha động để được dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 10 µg/ml

- Dung dịch thử: hút 10 ml dung dịch thử gốc pha trong 50 ml pha động Hút 10 ml

dung dịch này pha trong 100 ml pha động để được dung dịch thử có nồng độ khoảng 10 µg/ml

3.4.3 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên và ghi lại kết quả về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lỹ thuyết và

hệ số đối xứng Kết quả tính thích hợp của hệ thống sắc ký được thể hiện ở Bảng 3.8

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký định lượng sản phẩm

TT Thời gian lưu

(phút)

Diện tích pic (mAU.s)

Số đĩa lý thuyết

Hệ số đối xứng

3.4.4 Định lượng

Tiêm dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký Hàm lượng của sản phẩm được tính toán dựa trên hàm lượng chất chuẩn TEZ.HCl của USP, khối lượng và diện tích pic terazosin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử Thử 1, 2, 3 được tính toán dựa trên chuẩn 1; thử 4, 5, 6 được tính toán dựa trên chuẩn 2

Hàm lượng TEZ (%) = thö chuÈn chuÈn

thö chuÈn