ĐỖ THỊ PHƯƠNG CHI NGHIÊN cứu ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG và TÍNH CHẤT LƯU BIẾN của KEM CAPSAICIN

Đồng thời, với dạng bào chế là nhũ tương, nghiên cứu về độ ổn định hóa lý thông qua đánh giá tính chất lưu biến của kem cũng là yếu tố cần quan tâm.. Nghiên cứu phân hủy dược chất bởi qu

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, Ban giám hiệu trường Đại Học Dược

Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt 5 năm học tập tại

trường Đại học Dược Hà Nội

Em xin chân thành cảm ơn NCS Nguyễn Đức Cường, Th.S Nguyễn Cảnh

Hưng đã chỉ bảo và hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn tất cả các anh chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Bào Chế trường Đại học Dược Hà Nội, các em sinh viên K70, K71 đã luôn giúp đỡ trong quá trình làm khóa luận

Xin cảm ơn chương trình “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng” đã tài trợ cho nghiên cứu đề tài

“Nghiên cứu bào chế cream và miếng dán giảm đau tại chỗ chứa capsaicinoid từ Ớt

Em xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019 Sinh viên

Đỗ Thị Phương Chi

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Thông tin về dược chất 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Tính chất lý hóa 2

1.1.3 Tác dụng dược lý 2

1.1.4 Chỉ định 3

1.1.5 Một số chế phẩm chứa CAP trên thị trường 3

1.2 Tổng quan về độ ổn định 4

1.2.1 Một số con đường phân hủy hóa học của dược chất 4

1.2.2 Một số biện pháp làm giảm sự phân hủy thuốc 5

1.3 Lưu biến và ứng dụng của lưu biến 7

1.3.1 Giới thiệu về lưu biến học 7

1.3.2 Một số đại lượng dùng trong lưu biến 7

1.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính lưu biến 10

1.4 Một số nghiên cứu về dược chất và các dạng bào chế chứa dược chất 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 14

2.1.1 Nguyên vật liệu 14

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 15

2.1.3 Động vật thí nghiệm 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Nghiên cứu tiền công thức 16

2.2.2 Nghiên cứu bào chế và đánh giá kem chứa CAP 16

2.2.3 Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tiền công thức 16

2.3.2 Phương pháp bào chế 20

2.3.3 Phương pháp đánh giá 22

2.3.4 Xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Nghiên cứu tiền công thức 27

3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng CAP bằng HPLC 27

3.1.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định của CAP 30

3.1.3 Phương pháp xác định nhiệt độ chuyển dạng của CAP 32

3.2 Thiết kế thí nghiệm 33

3.2.1 Khảo sát thành phần công thức kem CAP 33

3.2.2 Thiết kế thí nghiệm 35

3.2.3 Kết quả đánh giá các biến đầu ra 36

3.2.4 Xử lý kết quả bảng thiết kế thí nghiệm 40

3.2.5 Tối ưu hóa công thức 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

5 NaEDTA Dinatri edetat

9 PBS Dung dịch muối đệm phosphat (phosphate

buffered saline)

12 TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất

DANH MỤC CÁC BẢNG

ảng 2.1 Nguyên liệu và các hóa chất nghiên cứu 14

ảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu 15

ảng 2.3 Thành phần công thức khảo sát 20

ảng 3.1 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CAP 27

ảng 3.2 Độ lặp lại của phương pháp HPLC 28

ảng 3.3 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CAP 28

ảng 3.4 Độ lặp lại của phương pháp HPLC 29

ảng 3.5 Phần trăm CAP còn lại theo thời gian 30

ảng 3.6 Phần trăm CAP còn lại theo thời gian trong các dung dịch H2O2 chứa các chất chống oxy hóa, hiệp đồng chống oxy hóa 31

ảng 3.7 Khảo sát giới hạn dưới của công thức kem nền 33

ảng 3.8 Khảo khát giới hạn trên của công thức kem nền 33

ảng 3.9 Khảo sát giới hạn dưới của kem chứa dược chất 34

ảng 3.10 Khảo sát giới hạn trên của kem chứa dược chất 35

ảng 3.11 Các biến đầu vào 36

ảng 3.12 Kết quả các biến đầu ra của của 17 công thức 40

ảng 3.13 Hệ số hồi quy ảnh hưởng của các biến đầu vào đến biến đầu ra 41

ảng 3.14 Kết quả tối ưu hóa công thức 43

ảng 3.15 Điểm trung bình mức độ kích ứng da (n=3) 44

ảng 4.1 Thành phần và khối lượng của kem CAP tối ưu 45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của CAP 2

Hình 1.2 Mô hình 2 tấm ván 8

Hình 1.3 Hình minh họa độ biến dạng trượt 8

Hình 1.4 Đường cong độ nhớt trượt của mẫu 11

Hình 1.5 Đồ thị biểu diễn G’ và G’’ theo ứng suất 11

Hình 1.6 Các chu kì tăng giảm nhiệt độ 12

Hình 1.7 Mối quan hệ giữa giá trị tanδ và nhiệt độ ở mẫu ổn định (mẫu 1) 12

Hình 1.8 Mối quan hệ giữa giá trị tanδ và nhiệt độ ở mẫu không ổn định (mẫu 2) 13

Hình 2.1 Sơ đồ bào chế 21

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CAP 27

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CAP 29

Hình 3.3 Phần trăm CAP còn lại trong dung dịch H2O2 3% theo thời gian 30

Hình 3.4 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định của CAP 31

Hình 3.5 Nhiệt độ chuyển dạng của a) CAP và b) cao ớt chứa CAP 32

Hình 3.6 Hàm lượng CAP giải phóng theo thời gian (μg.cm-2) 36

Hình 3.7 Đường cong độ nhớt của công thức N15 37

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn G’, G’’ theo ứng suất trượt 38

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn G’, G’’ theo tần số dao động 38

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn độ ổn định qua 3 chu kì nhiệt độ của mẫu N1 39

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn độ ổn định qua 3 chu kì nhiệt độ của công thức N5 39

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa hệ số hồi quy và các biến đầu ra 41

Hình 3.13 Ảnh hưởng của biến đầu vào lên tốc độ giải phóng CAP 42

Hình 3.14 Ảnh hưởng của các biến đầu vào đến khả năng lưu giữ trên da của CAP 42

Hình 3.15 Ảnh hưởng của các biến đầu vào đến độ ổn định của kem 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc dược liệu để dự phòng và điều trị bệnh ngày càng tăng Nhiều hợp chất từ tự nhiên đã được nghiên cứu, chiết xuất, phân lập và đánh giá tác dụng sinh học Capsaicinoid là một hỗn hợp các alcaloid được

chiết từ quả Ớt (Capsicum spp) Trong đó, capsaicin (CAP) là thành phần chính có

nhiều tác dụng sinh học, một trong những tác dụng đó là tác dụng giảm đau tại chỗ nên

đã được sử dụng trong điều trị một số triệu chứng như đau cơ, đau đầu, đau sau phẫu thuật Đặc biệt, với cơ chế tác dụng lên các thụ thể vaniloid đặc hiệu như TRPV1,

CAP có tác dụng tốt trong các trường hợp đau, viêm không đáp ứng với thuốc giảm đau truyền thống

Kem chứa CAP là một trong những chế phẩm được chỉ định ở những bệnh nhân điều trị viêm khớp Năm 1998, hãng ioglan đã đưa ra thị trường nước Anh một chế phẩm có chứa CAP bào chế dưới dạng kem bôi dùng để giảm đau trong viêm xương khớp Từ đó đến nay, kem chứa CAP được sản xuất tương đối nhiều ở nước ngoài Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ nào về kem này ở trong nước

Để phát huy tác dụng, CAP phải gắn được vào thụ thể TRPV1 ở da, do đó 2 yếu

tố cần nghiên cứu kỹ khi bào chế kem chứa CAP là khả năng giải phóng CAP ra khỏi kem và mức độ lưu giữ thuốc trên da Đồng thời, với dạng bào chế là nhũ tương, nghiên cứu về độ ổn định hóa lý thông qua đánh giá tính chất lưu biến của kem cũng là yếu tố cần quan tâm

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

đánh giá khả năng giải phóng và tính chất lưu biến của kem capsaicin” với các

mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu bào chế được kem capsaicin 0,075% từ cao ớt

2 Đánh giá được khả năng giải phóng, lưu giữ trên da và tính chất lưu biến của kem capsaicin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Thông tin về dược chất

1.1.1 Công thức hóa học

Capsaicin là 1 alcaloid được chiết ra từ quả ớt:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của CAP

- Độ tan trong nước: 0,0013g/100mL; tan trong alcol, ete, benzen [26]

- Dễ bị oxy hóa do cấu trúc có nhóm –OH phenol [10]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Tác dụng giảm đau

CAP được nghiên cứu rất nhiều trên mô hình dược lý thực nghiệm in vivo và in

vitro cho đau nửa đầu, ho mạn tính, đái tháo đường và đặc biệt là giảm đau thần kinh

ngoại vi [19] CAP được chứng minh có tác dụng giảm đau trong viêm bàng quang, viêm xương khớp (như viêm khớp gối và viêm khớp dạng thấp), đau dây thần kinh sau khi nhiễm Herpes, đau dây thần kinh ngoại vi do tiểu đường, [19]

Cơ chế giảm đau:

CAP có thể liên kết với thụ thể TRPV1 chủ yếu có trong các nơ-ron cảm giác [19]

Khi CAP gắn với TRPV1 sẽ làm tăng nồng độ calci nội bào, gây ra sự giải phóng các peptid dẫn truyền thần kinh như chất P và các peptid liên quan đến gen calci

(CGRP) Do đó, khi tiếp xúc với da, CAP có tác dụng giảm đau do giảm chất P dẫn đến làm giảm độ nhạy của nơ-ron cảm giác [1], [19]

Chất P là một neuropeptid chủ yếu tham gia dẫn truyền các xung động đau từ ngoại vi đến hệ thần kinh trung ương Chất P còn được giải phóng vào các mô khớp, tại đó nó hoạt hóa các chất trung gian của phản ứng viêm liên quan đến bệnh sinh của viêm khớp dạng thấp CAP làm cho da và khớp mất cảm giác đau bằng cách làm giảm

và ngăn ngừa sự tái tích lũy chất P tại các tế bào thần kinh cảm giác ngoại vi Tác dụng giảm đau của CAP không xuất hiện ngay mà tùy thuộc vào loại đau, sẽ có sau khi bắt đầu dùng thuốc khoảng 1 – 2 tuần với viêm khớp, 2 – 4 tuần với đau dây thần kinh, 4 –

6 tuần với đau dây thần kinh ở đầu và cổ Tác dụng giảm đau được duy trì khi nào CAP còn được dùng đều đặn Nếu ngừng CAP mà đau lại, có thể tiếp tục bôi lại Dùng CAP trong cả 2 trường hợp đau thần kinh và đau cơ xương mãn tính đều có kết quả giảm đau trung bình, tuy nhiên, đối với những người bệnh không đáp ứng hoặc không dung nạp với các điều trị khác, điều trị CAP có thể có ích CAP là liệu pháp tốt đối với những triệu chứng đau sợi cơ tiên phát [1], [8]

1.1.4 Chỉ định

Thuốc được chỉ định điều trị trong các bệnh như:

Giảm đau tại chỗ do viêm dây thần kinh sau nhiễm Herpes zoster (bệnh Zona) (dùng khi tổn thương đã lành), viêm dây thần kinh ở người bệnh đái tháo đường, do thoái hóa xương khớp, viêm khớp dạng thấp, viêm khớp mãn tính Các trường hợp đau

có nguồn gốc thần kinh khác như hội chứng đau sau phẫu thuật, phẫu thuật cắt bỏ vú, hội chứng loạn dưỡng phản xạ giao cảm (hỏa thống), đau dây thần kinh mãn tính mà không đáp ứng với các liệu pháp điều trị khác Thuốc còn được dùng điều trị chứng ngứa do tiếp xúc nguồn nước hoặc do thẩm tách máu, ngứa trong bệnh vảy nến [1]

1.1.5 Một số chế phẩm chứa CAP trên thị trường

- Kem bôi Zacin 0,025% (Anh) điều trị đau liên quan đến viêm xương khớp

- Kem bôi Axsain 0,075% (Anh) giảm các triệu chứng đau thần kinh do nhiễm Herpes Zoster, kiểm soát các triệu chứng viêm đa dây thần kinh ngoại biên do đái tháo đường

- Kem bôi Zostrix HP 0,075% (Canada) kiểm soát các triệu chứng đau thần kinh do tiểu đường, đau thần kinh sau nhiễm Herpes Zoster sau khi các tổn thương da hở đã lành

ưu tiên sử dụng Tương tự, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd (0,1 – 1 M) thường ưu tiên sử dụng trong các phản ứng thủy phân bởi base Với các dược chất ít tan trong nước, có thể sử dụng đồng dung môi để hoà tan dược chất Nghiên cứu thủy phân thường được tiến hành ngay ở nhiệt độ thường [21]

Đa số các dược chất dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm sẽ bền vững trong môi trường hơi acid Một số ion kim loại, đặc biệt là các ion hóa trị II như Zn2+

cơ chế chuyển electron để tạo thành các ion phản ứng [21]

Trong quá trình nghiên cứu, hydroperoxyd chủ yếu được sử dụng để oxy hóa dược chất Tuy nhiên các chất oxy hóa khác như ion kim loại hoặc oxy cũng được sử dụng Nồng độ hydroperoxyd dùng cho phản ứng oxy hóa dược chất là 3 – 30% Nghiên cứu phân hủy dược chất bởi quá trình oxy hóa nên được bắt đầu bằng cách cho dược chất tiếp xúc với dung dịch hydroperoxyd 3% trong 6 giờ tại nhiệt độ phòng Nếu sự phân hủy được quan sát là không đủ, thời gian tiếp xúc nên được tăng lên 24 giờ Nếu sự phân hủy vẫn không đủ, nồng độ hydroperoxyd có thể tăng từ 10 – 30% Tuy nhiên, trong trường hợp dược chất bị phân hủy quá mức, nên sử dụng dung dịch hydroperoxyd 1% [21]

1.2.1.3 Quang hóa

Thử độ ổn định quang hóa của thuốc được tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng lên độ ổn định hóa lý của thuốc Trong quang phân hóa, ánh sáng UV hoặc huỳnh quang tạo ra sản phẩm phân hủy chính của thuốc Điều kiện thử độ ổn định quang hóa được tiến hành theo hướng dẫn của ICH Dược chất hoặc thành phẩm sẽ chịu một ánh sáng tối thiểu 1.2 triệu lux.h và 200W.h/m2 Hầu hết bước sóng ánh sáng được sử dụng nằm trong khoảng 300 – 800 nm để bắt đầu sự phân hủy quang hóa Các dung dịch dược chất sẽ tiếp xúc với bức xạ UV trong 4 ngày để nghiên cứu độ ổn định quang hóa Sự phân hủy quang hóa cũng có thể được tiến hành dưới ánh sáng mặt trời Các dung dịch dược chất được tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong 4 ngày và sản phẩm phân hủy sẽ được theo dõi [21]

Nói chung, các dược chất hấp thu ánh sáng ở bước sóng dưới 280 nm chưa đủ năng lượng để phân hủy dưới ánh sáng ngoài trời Các thuốc hấp thu tối đa ở bước sóng trên 400 nm có đủ năng lượng để phân hủy ở điều kiện ánh sáng trong phòng và ngoài trời [2]

1.2.1.4 Phân hủy nhiệt

Nhiệt độ tăng làm tăng tốc độ của một phản ứng hóa học, do đó ở nhiệt độ cao các chất hóa học sẽ bị phân hủy nhiều hơn Các loại thuốc như vitamin, peptid, rất nhạy cảm với nhiệt độ Phân hủy bởi nhiệt xảy ra thông qua nhiều cơ chế, cụ thể như nhiệt phân, thủy phân, khử carboxyl hóa, đồng phân hóa, trùng hợp [21]

Nghiên cứu phân hủy nhiệt tiến hành ở 40 – 80oC Đa số các nghiên cứu được thực hiện ở 70oC tại độ ẩm thấp hoặc cao trong 1 – 2 tháng Nhiệt độ lớn hơn 80oC có thể không tạo ra con đường phân hủy dự đoán Cả phương pháp nhiệt khô và nhiệt ẩm được thực hiện cho sự phân hủy dược chất rắn, trong khi đó, chỉ phương pháp nhiệt khô được áp dụng cho dược chất dạng lỏng Nghiên cứu độ ổn định nhiệt cũng có thể được thực hiện ở nhiệt độ cao trong khoảng thời gian ngắn hơn [21]

1.2.2 Một số biện pháp làm giảm sự phân hủy thuốc

1.2.2.1 Các biện pháp bảo vệ thuốc khỏi sự phân hủy oxy hóa

 Tránh ánh sáng: Thuốc nhạy cảm với sự oxy hóa nên đóng trong lọ màu hổ phách hoặc trong bao bì đóng gói cấp 2 ngăn cản ánh sáng xuyên qua lọ và tiếp xúc với thuốc [4]

 Loại bỏ tạp nhiễm kim loại nặng: Biện pháp hiệu quả nhất để loại bỏ tạp nhiễm kim loại nặng là bổ sung thêm các chất tạo phức chelat Chất tạo phức chelat phổ biến nhất là acid ethylendiaminetetraacetic (EDTA) [4]

 Tránh nhiệt độ cao: Nhiệt độ cao trên nhiệt độ thường (30o

C) nên tránh trong quá trình bảo quản và sử dụng thuốc nhạy cảm với oxy hóa Do nhiệt độ cao có thể gây phân hủy cấp tốc chất chống oxy hóa có trong công thức [4]

 Sử dụng chất chống oxy hóa: Kết hợp chất chống oxy hóa vào trong công thức

để bảo vệ thuốc tránh khỏi sự phân hủy oxy hóa Chất chống oxy hóa hoạt động theo một trong ba cơ chế khác nhau như sau [4]:

a) Oxy hóa thay thế cho dược chất do có thế oxy hóa chuẩn (Eo) cao hơn, ví dụ: các chất chống oxy hóa tan trong nước như natri bisulfit, acid ascorbic

b) Nhận các gốc tự do và ngăn chặn phản ứng chuỗi tự do, ví dụ: các các chất chống oxy hóa không tan trong nước như propyl gallat và butylat hydroxytoluen

 Lựa chọn dung môi

Dung môi có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự ổn định ánh sáng của thuốc trong các công thức dược phẩm Tốc độ phân hủy quang hóa có thể bị ảnh hưởng bởi độ

phân cực và độ nhớt của dung môi Việc lựa chọn một dung môi thích hợp hoặc kết hợp dung môi có thể cải thiện độ ổn định ánh sáng của một loại thuốc cụ thể [3]

 Một số biện pháp khác đươc sử dụng như: lựa chọn pH, tạo phức, tạo liposom, tạo cyclodextrin, [3]

1.2.2.3 Một số biện pháp khác

 Các biện pháp bảo vệ thuốc khỏi sự thủy phân [25]

- Đối với dạng bào chế lỏng: lựa chọn pH tối ưu; sử dụng hệ đệm thích hợp; tạo hỗn dịch giảm độ tan của dược chất trong dung dịch và qua đó làm giảm tốc độ phân hủy chung; thay thế một phần hoặc toàn bộ nước bằng dung môi protic, aprotic lưỡng cực hoặc dung môi hữu cơ tinh khiết; sử dụng chất diện hoạt thích hợp;

- Đối với dạng bào chế rắn: lựa chọn tá dược hàm ẩm thấp; lựa chọn dạng bào chế, ví dụ thuốc dạng kết tinh chống thủy phân tốt hơn, ; đóng gói thích hợp,

có sử dụng chất hút ẩm;

 Đối với thuốc bị phân hủy bởi nhiệt: kiểm soát nhiệt độ trong quá trình bào chế,

1.3 Lưu biến và ứng dụng của lưu biến

1.3.1 Giới thiệu về lưu biến học

Lưu biến học là khoa học nghiên cứu sự biến dạng và sự chảy Các thí nghiệm lưu biến không chỉ thể hiện trạng thái chảy của chất lỏng mà còn thể hiện trạng thái biến dạng của chất rắn Một chất rắn đàn hồi lý tưởng sẽ biến dạng đàn hồi theo định luật Hook Một chất lỏng lý tưởng sẽ chảy và tuân theo định luật Newton về chất lỏng Trạng thái của tất cả các vật liệu trên thực tế dựa vào sự phối hợp của cả phần nhớt và phần đàn hồi và được coi là có tính nhớt đàn hồi (viscoelastic) [13]

Hai chế độ thường dùng để đánh giá tính chất lưu biến là chế độ trượt liên tục

và chế độ đo dao động [13]

1.3.2 Một số đại lượng dùng trong lưu biến

Mô hình 2 tấm ván được sử dụng để định nghĩa một số đại lượng trong lưu biến Tấm trên với diện tích A, chuyển động bởi lực F theo phương ngang với tốc độ v Tấm dưới đứng yên (v = 0) Khoảng cách giữa 2 tấm là h, mẫu được trượt ở khoảng trống giữa 2 tấm này

Hình 1.2 Mô hình 2 tấm ván

1.3.2.1 Khái niệm ứng suất trượt

Lực F tác dụng lên tấm ván phía trên được phân bố trên một diện tích A Để phản ánh chính xác tác động của ngoại lực lên khối vật liệu, sử dụng đại lượng ứng suất trượt là độ lớn của lực tác dụng có phương song song với bề mặt được tác động trên một đơn vị diện tích Do đó, công thức tính ứng suất trượt là:

τ = Trong đó: τ là ứng suất trượt (N/m2)

F là lực tác dụng (N)

A là diện tích bề mặt tác dụng (m2)

1.3.2.2 Khái niệm mức độ biến dạng trượt

Hình 1.3 Hình minh họa độ biến dạng trƣợt

Sau một khoảng thời gian dt, dưới tác động của ứng suất trượt trên bề mặt khối vật liệu, các lớp chất lỏng sẽ di chuyển cùng phương với ứng suất trượt Gọi s là quãng đường di chuyển tối đa của lớp trên cùng

Với một vật liệu có độ dày h không đổi, s càng lớn thì mức độ biến dạng so với thời điểm ban đầu sau khoảng thời gian dt càng lớn Mặt khác, nếu 2 khối vật liệu bị biến dạng và có cùng s, khối vật liệu nào có bề dày lớn hơn sẽ có mức độ biến dạng nhỏ hơn và ngược lại

Để so sánh mức độ biến dạng của các khối chất lỏng khác nhau, sử dụng thông

số mức độ biến dạng trượt:

γ = γ: không có thứ nguyên

1.3.2.3 Khái niệm tốc độ trượt

Khi chịu tác động của cùng một ứng suất trượt, các loại vật liệu có độ nhớt khác nhau cần một khoảng thời gian khác nhau để đạt được cùng một mức độ biến dạng trượt Các vật liệu có độ nhớt cao cần khoảng thời gian dài hơn và các vật liệu có độ nhớt thấp cần khoảng thời gian ngắn hơn Hay, tốc độ biến dạng của các vật liệu nhớt hơn sẽ chậm hơn và ngược lại

Để so sánh tốc độ biến dạng của 2 khối vật liệu trong cùng một khoảng thời gian, ta có khái niệm tốc độ trượt Tốc độ trượt được tính như sau:

̇ =

Trong đó: ̇ là tốc độ trượt (1/s)

dγ là mức độ biến dạng sau khoảng thời gian dt

1.3.2.4 Độ nhớt trượt

Độ nhớt của một ứng suất trượt nhất định bằng tỉ số giữa giá trị ứng suất trượt

và tốc độ trượt tương ứng Công thức tính độ nhớt trượt:

η =

̇ Trong đó: η là độ nhớt trượt (Pa.s)

τ là ứng suất trượt (Pa)

̇ là tốc độ trượt (1/s)

1.3.2.5 Mô đun nhớt G’’, mô đun đàn hồi G’ và tanδ

Trong chế độ đo dao động ta thu được 2 thông số đáp ứng là mô đun đàn hồi G’

và mô đun nhớt G’’ Mô đun đàn hồi G’ đại diện cho tính đàn hồi của vật liệu, mô đun nhớt G’’ đại diện cho tính nhớt của vật liệu

Khi tiến hành ở chế độ đo dao động, vật liệu chịu tác động bởi các dao động có tần số nhất định gây ra ứng suất dao động lan truyền theo kiểu sóng hình sin Khi đó, ứng suất trượt và biến dạng trượt được biểu diễn dưới dạng hàm sin với cùng tần số nhưng lệch nhau một góc δ

Tanδ được tính là tỉ số giữa mô đun nhớt G’’ và mô đun đàn hồi G’ của biến dạng nhớt - đàn hồi, cho biết độ mạnh yếu giữa các thành phần trong cấu trúc bên trong vật liệu Công thức tính như sau:

Tanδ =

(0 ≤ Tanδ ≤ ∞ do 0 ≤ δ ≤ 90o) Chất rắn đàn hồi lý tưởng có δ = 0, tanδ = 0 do G’ lớn hơn rất nhiều so với G’’ Ngược lại, chất lỏng nhớt lý tưởng có δ = 90o

, tanδ = ∞ do G’’ lớn hơn rất nhiều so với G’ Nếu vật liệu có tính nhớt và đàn hồi tương đương nhau thì δ = 45o, tanδ = 1 do G’

= G’’

1.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính lưu biến

1.3.3.1 Ứng dụng chế độ trượt liên tục (flow sweep)

 Xác định độ nhớt trượt

Để xác định độ nhớt trượt, thiết bị đo lưu biến sẽ áp dụng một tốc độ trượt biết trước lên mẫu và đo giá trị ứng suất trượt tạo ra cho mẫu hoặc tác động một ứng suất trượt biết trước lên mẫu và đo tốc độ trượt tạo ra cho mẫu Sau khi đo được giá trị ứng suất trượt hoặc tốc độ trượt sẽ tính được độ nhớt trượt [13]

Ứng dụng của việc xác định độ nhớt trượt là để kiểm tra đặc tính biến dạng chảy lỏng (shear-thinning) hoặc biến dạng đông đặc (shear-thickening) của mẫu [13]

 Vật liệu biến dạng chảy lỏng có giá trị độ nhớt trượt giảm dần khi tăng tốc độ trượt hoặc ứng suất trượt

 Vật liệu biến dạng đông đặc có giá trị độ nhớt trượt tăng dần khi tăng tốc độ trượt hoặc ứng suất trượt

Hình 1.4 Đường cong độ nhớt trượt của mẫu

1.3.3.2 Ứng dụng chế độ đo dao động (Oscillation test)

Chế độ đo dao động thường được thực hiện trong vùng nhớt - đàn hồi tuyến tính (LVR) là khoảng ứng suất mà tại đó giá trị mô đun đàn hồi G’ và mô đun nhớt G’’ gần như không đổi

Hình 1.5 Đồ thị biểu diễn G’ và G’’ theo ứng suất

Ưu điểm của chế độ đo dao động này là mẫu không bị phá hủy cấu trúc khi tiến hành thí nghiệm trong vùng LVR

Kem bôi da thường tiếp xúc với các nhiệt độ thay đổi, ví dụ mùa hè và mùa đông nhiệt độ trái ngược nhau Vì vậy cần tiến hành đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ ổn định của mẫu Thực hiện chế độ đo dao động có thể khảo sát độ ổn định của mẫu thông qua chu trình nhiệt - lạnh [9]

Phép đo được thực hiện như sau: Tiến hành lặp lại các chu kì tăng dần nhiệt độ sau đó giảm dần nhiệt độ rồi lại tăng dần nhiệt độ, (mẫu được khảo sát trong khoảng nhiệt độ phù hợp), ngoài thông số nhiệt độ thay đổi các thông số khác (ứng suất trượt, tần số dao động) giữ tại giá trị trong vùng nhớt - đàn hồi tuyến tính (các giá trị này được khảo sát trước khi tiến hành thực hiện phép đo khảo sát độ ổn định) Ví dụ: khảo sát độ ổn định của mẫu theo nhiệt độ bằng cách tăng dần nhiệt độ của mẫu từ 25o

C lên

50oC, sau đó giảm từ từ nhiệt độ của mẫu từ 50o

C về -10oC, sau đó tiếp tục tăng dần nhiệt độ từ -10oC lên 50oC, tiếp tục như thế một vài chu kì [9]

Hình 1.6 Các chu kì tăng giảm nhiệt độ

Sau khi tiến hành khảo sát mẫu qua các chu kì tăng giảm nhiệt độ (chu kì nhiệt - lạnh), thông số đáp ứng thu được để khảo sát độ ổn định của mẫu theo nhiệt độ là giá trị tanδ Nếu giá trị tanδ qua các chu kì là không thay đổi thì mẫu được xem là ổn định trong khoảng nhiệt độ khảo sát Ngược lại nếu giá trị tanδ thay đổi quá nhiều qua các chu kì thì mẫu được xem là không ổn định trong khoảng nhiệt độ khảo sát

Ví dụ: 2 mẫu kem được khảo sát trong cùng khoảng nhiệt độ -10oC đến 50o

C thu được kết quả như 2 hình bên dưới Mẫu 1 thể hiện là mẫu ổn định trong khoảng nhiệt độ khảo sát trong khi đó mẫu 2 lại thể hiện là không ổn định trong khoảng nhiệt

Hình 1.8 Mối quan hệ giữa giá trị tanδ và nhiệt độ ở mẫu không ổn định (mẫu 2)

1.4 Một số nghiên cứu về capsaicin và các dạng bào chế chứa capsaicin

Alankar Shrivastava và cộng sự (2011) đã nghiên cứu độ ổn của CAP bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo Nghiên cứu đánh giá sự phân hủy của CAP do thủy phân trong môi trường NaOH 0,1N; môi trường HCl 0,5N giữ trong tối 4 giờ; đánh giá sự phân hủy oxy hóa bằng cách cho CAP tiếp xúc với chất oxy hóa là dung dịch hydroperoxyd 4% giữ trong tối 2 giờ; đánh giá sự phân hủy quang hóa bằng cách giữ trong buồng UV 12 giờ; đánh giá sự phân hủy bởi nhiệt ẩm bằng cách để trong nồi cách thủy 100oC trong 2 giờ, bởi nhiệt khô bằng cách giữ trong lò nóng

100oC trong 2 giờ Kết quả thu được như sau: CAP bị thủy phân trong môi trường HCl 0,5N; bền vững trong môi trường kiềm; bền với ánh sáng UV, bền với nhiệt khô, nhiệt

ẩm và bị phân hủy trong môi trường có chất oxy hóa [22]

Effionora Anwar và cộng sự (2014) đã bào chế và đánh giá gel và emulgel chứa

ớt chiết (Capsicum frutescens L.) Capsaicinoid được chiết từ ớt bằng phương pháp hồi

lưu và hàm lượng được xác định Capsaicinoid được sử dụng như một dược chất trong trong công thức gel và emulgel Sự thấm của CAP từ mỗi dạng bào chế được đánh giá bằng cách sử dụng tế bào khuếch tán Franz với da bụng của chuột Spraque-Dawley làm màng Kết quả nghiên cứu thể hiện: hàm lượng capsaicinoid trong ớt chiết là 1,93

± 0,2%, lượng thấm tích lũy của capsaicinoid từ gel và emulgel lần lượt là 153,11 ± 2,42 μg.cm-² và 321,22 ± 4,67 μg.cm-2

; phần trăm capsaicinoid đã thấm từ gel và emulgel lần lượt là 19,39 ± 0,31% và 40,69 ± 0,59%; tốc độ thấm capsaicinoid từ gel

và emulgel lần lượt là 11,26 ± 0,20 μg.cm-2.h-1 và 24,28 ± 0,52 μg.cm-2.h-1 [6]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Nguyên liệu và các hóa chất nghiên cứu

Đại học Dược Hà Nội

TCCS

2 Capsaicin Fluca

(chứa 61,1% capsaicin)

(số lô: LRAA2843)

Sigma Aldrich – Mỹ USP 36

6 Glycerin monostearate Gattefossf – Pháp TCNSX

27 Nước cất Trường ĐH Dược Hà Nội TCCS

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu

3 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent HP 1260 Mỹ

4 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao XBridgeTM

8 Hệ thống thử giải phóng bằng tế bào khuếch tán

Franz

Mỹ

9 Máy quét nhiệt vi sai Mettler – Toledo DSC1 Mỹ

10 Máy đo lưu biến Discovery Hybrid Rheometer

HR-1

Mỹ

12 Máy đồng nhất Unidrive X10000 Homogenizer

Drive

Đức

14 Màng lọc cellulose acetat kích thước 0,2μm và 0,45

μm

Việt nam

15 Bể điều nhiệt WISD DAIHAN Sicentific Hàn Quốc

16 Tủ lạnh, tủ sấy, các dụng cụ thủy tinh

2.1.3 Động vật thí nghiệm

- Thỏ trắng giống đực, trưởng thành, khỏe mạnh, cân nặng khoảng 2 – 2,6 kg nhận từ bộ môn Dược lý – Trường Đại học Dược Hà Nội, nuôi trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, có kiểm soát

- Chuột nhắt trắng giống đực, khỏe mạnh, cân nặng khoảng 20 – 30 g nhận từ bộ môn Dược lý – Trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu tiền công thức

- Thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp định lượng CAP bằng HPLC

- Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định của CAP

- Phương pháp xác định nhiệt độ chuyển dạng của CAP

2.2.2 Nghiên cứu bào chế và đánh giá kem chứa CAP

- Nghiên cứu bào chế kem CAP 0,075% từ cao ớt

- Nghiên cứu đánh giá khả năng giải phóng của CAP qua màng thẩm tích

- Nghiên cứu đánh giá khả năng lưu giữ của CAP trên da chuột

- Nghiên cứu đánh giá tính chất lưu biến của kem CAP

- Nghiên cứu đánh giá khả năng gây kích ứng của kem tối ưu

2.2.3 Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa công thức

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tiền công thức

2.3.1.1 Phương pháp định lượng CAP bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

a Phương pháp định lượng CAP trong cao dược liệu và các mẫu nghiên cứu độ ổn định bằng HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được xây dựng để định lượng dược chất trong các mẫu cao và các mẫu theo dõi độ ổn định

 Điều kiện sắc ký:

Qua tài liệu tham khảo [17], lựa chọn điều kiện sắc ký như sau:

Cột XBridgeTM phenysilyl silicagel (25 cm x 6,4 mm x 5 m)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 225 nm

Pha động là acid phosphoric 0,1% - acetonitril (60:40) (tt/tt)

Tốc độ dòng 1,2 ml/phút

Nhiệt độ cột 30oC

Thể tích tiêm mẫu 20 μl

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 12,5 mg CAP Fluca

(chứa 61,1% CAP), hòa tan bằng methanol trong bình định mức 25 ml thu được dung dịch gốc có nồng độ 500 μg/ml (ứng với 305,5 μg/ml CAP)

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Hút chính xác 1, 2, 3, 4, 5 ml dung dịch chuẩn

gốc cho vào bình định mức 10 ml Sau đó bổ sung vừa đủ bằng methanol thu được các dung dịch chuẩn CAP Fluca với nồng độ 50, 100, 150, 200, 250 μg/ml (lần lượt ứng với 30,55 μg/ml; 61,1 μg/ml; 91,65 μg/ml; 122,2 μg/ml; 152,75 μg/ml CAP)

 Đánh giá các chỉ tiêu

Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp định lượng bằng HPLC, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu dưới đây:

 Độ tuyến tính: tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn theo thứ tự nồng độ tăng dần

Lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ CAP với hệ số tương quan R ≥ 0,995

 Độ lặp lại: tiến hành thẩm định độ lặp lại trên nồng độ 150 μg/ml CAP Fluca

(ứng với 91,65 μg/ml CAP) Tiêm lặp lại 6 mẫu với một nồng độ Độ lặp lại được xác định thông qua giá trị RSD Yêu cầu RSD < 2%

b Phương pháp định lượng CAP giải phóng từ kem bằng HPLC

Do CAP trong các mẫu kem đem thử giải phóng qua màng thẩm tích và thử lưu giữ trên da chuột có hàm lượng thấp, định lượng bằng HPLC sử dùng detector quang phổ tử ngoại không phát hiện được nên nghiên cứu tiến hành định lượng bằng HPLC với detector huỳnh quang như sau:

 Điều kiện sắc ký:

Qua tài liệu tham khảo [7], [17], [24], lưa chọn điều kiện sắc kí như sau:

Cột XBridgeTM phenysilyl silicagel (25 cm x 4,6 mm x 5 μm)

Detector huỳnh quang ở bước sóng kích thích và phát xạ là 280 nm, 310 nm Pha động: acid phosphoric 0.1% - acetonitril (60:40) (tt/tt)

Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

Nhiệt độ cột: 30oC

Thể tích tiêm: 20 μl

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc (A): Cân chính xác khoảng 25 mg CAP Fluca

(61.1% CAP), hòa tan bằng methanol trong bình định mức 10 ml thu được dung dịch

có nồng độ 2500 μg/ml (ứng với 1527,5 μg/ml CAP)

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch A hút 1 ml cho vào bình định

mức 50 ml Sau khi bổ sung đủ thể tích bằng methanol thu được dung dịch chuẩn CAP Fluca với nồng độ 50 μg/ml (S1)

Hút chính xác lần lượt 1, 2, 4, 5 ml S1 cho vào bình định mức 10 ml, thêm vừa

đủ methanol Lần lượt ta có các dung dịch chuẩn CAP Fluca S2 đến S5 tương ứng với nồng độ 5, 10, 20, 25 μg/ml (ứng với 3,055 μg/ml; 6,11 μg/ml; 12,22 μg/ml; 15,275 μg/ml CAP)

Hút chính xác 2 ml S2 cho vào bình định mức 10 ml, thêm vừa đủ methanol là được dung dịch chuẩn S6 với nồng độ 1 μg/ml (ứng với 0,611 μg/ml CAP)

 Đánh giá các chỉ tiêu

Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp định lượng bằng HPLC, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu dưới đây:

 Độ tuyến tính: tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn theo thứ tự nồng độ tăng dần

Lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ CAP với hệ số tương quan R ≥ 0,995

 Độ lặp lại: tiến hành thẩm định độ lặp lại trên nồng độ 20 μg/ml CAP Fluca

(ứng với 12,22 μg/ml CAP) Tiêm lặp lại 6 mẫu với một nồng độ Độ lặp lại

được xác định thông qua giá trị RSD Yêu cầu RSD < 2%

2.3.1.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định của CAP

Nhận thấy trong cấu trúc của CAP có chứa nhóm chức có khả năng bị oxy hóa

là nhóm -OH phenol, hơn nữa trong mạch nhánh của phân tử còn có một nhóm amid,

là nơi có thể xảy ra nhất cho sự tấn công của các gốc tự do [10] Nhưng rất ít nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá độ ổn định của dược chất này Alankar Shrivastava và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu độ ổn định của CAP, định lượng bằng phương pháp HPLC nhưng chưa đánh giá ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định của CAP Vì vậy, nghiên cứu tiến hành đánh giá sự phân hủy của CAP trong môi trường oxy hóa và ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến độ ổn định của CAP

 Nghiên cứu động học quá trình oxy hóa của CAP

Chuẩn bị dung dịch chuẩn CAP Fluca (A): Cân chính xác khoảng 25 mg CAP Fluca, hòa tan bằng methanol trong bình định mức 25ml thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 1 mg/ml

Chuẩn bị dung dịch thử chứa H2O2 3%: Phối hợp dung dung dịch chuẩn ở trên với dung dịch H2O2 3% vào bình định mức

Dung dịch thử trong bình định mức được bọc kín bằng parafilm, bên ngoài bọc giấy bạc để ở nhiệt độ phòng [21], tránh ánh sáng Sau các khoảng thời gian (0, 7, 14,

21, 28, 42 ngày), hút mẫu đem bổ sung thể tích bằng methanol để thu được dung dịch thử chứa 0,2 mg/ml CAP Fluca và H2O2 0,6% Định lượng hàm lượng dược chất còn lại trong mẫu bằng phương pháp HPLC với detetor quang phổ tử ngoại

 Xây dựng phương pháp đánh giá ảnh hưởng các chất chống oxy hóa đến độ ổn

định của CAP

Chuẩn bị 5 mẫu dung dịch thử: Ban đầu tất cả các mẫu được phối hợp dung dịch chuẩn A với dung dịch H2O2 3% Sau đó mẫu 1 thêm chất hiệp đồng chống oxy hóa natri edetat (NaEDTA) 0,5% Mẫu 2, 3, 4 thêm các chất chống oxy hóa bản chất thân nước: natri metabisulfit 0,5%, D,L-methionin 0,5%, natri hydrosulfit 0,5% Mẫu

5 thêm chất chống oxy hóa bản chất thân dầu butylat hydroxytoluen (BHT) 0,5% Bổ sung thể tích bằng methanol để thu được các dung dịch thử chứa 0,2 mg/ml CAP Fluca; H2O2 0,6%; các chất chống oxy hóa và hiệp đồng chống oxy hóa 0,1%

Tất cả các dung dịch thử đựng trong bình định mức được bọc kín bằng parafilm, bên ngoài bọc giấy bạc để ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sau các khoảng thời gian (0, 14, 28, 42, 56 ngày), định lượng hàm lượng dược chất còn lại trong các mẫu bằng phương pháp HPLC

2.3.1.3 Phương pháp xác định nhiệt độ chuyển dạng của CAP

Tiến hành xác định nhiệt độ chuyển dạng (nhiệt độ bắt đầu nóng chảy – Tm) và nhiệt độ nóng chảy hoàn toàn (Tf) của 2 mẫu là mẫu CAP Fluca chuẩn và mẫu cao ớt chứa CAP trên thiết bị quét nhiệt lượng vi sai DSC Mettler Toledo

Cách tiến hành: Với mỗi mẫu, cân 1 lượng mẫu khoảng 7 – 10 mg, cho vào đĩa nhôm có nắp đục lỗ Dùng thiết bị dập để hàn kín và đưa vào buồng máy Sử dụng một đĩa nhôm trắng để làm mẫu so sánh và nắp được đục 2 lỗ để phân biệt Dùng kẹp đưa 2

đĩa nhôm vào buồng gia nhiệt của thiết bị Khoảng gia nhiệt từ 30 – 100o

C, tốc độ dòng khí nitơ là 50 ml/phút, tốc độ gia nhiệt 10oC/phút [16] Kết quả được xử lý trên phần mềm STARe Software

 Sơ đồ bào chế:

Hình 2.1 Sơ đồ bào chế

a Khảo sát sơ bộ công thức kem nền (chưa có dược chất)

3 thành phần trong công thức cần khảo sát tỉ lệ gồm tỉ lệ CDH (%), tỉ lệ IPM (%) và tỉ lệ pha dầu (%) (các thành phần còn lại như trên bảng 2.3)

Khảo sát giới hạn trên và giới hạn dưới của 3 thành phần theo quy trình bào chế trên Các công thức kem sau mỗi khảo sát đạt thể chất bán rắn sẽ được chấp nhận

b Khảo sát công thức kem chứa CAP

Khi đưa cao ớt có chứa CAP vào kem nền đã khảo sát ở trên, thể chất của kem

sẽ bị thay đổi do trong thành phần cao có chứa thêm dung môi chiết xuất nên nghiên cứu cần tiến hành khảo sát lại khoảng giới hạn của 3 thành phần (IPM, pha dầu, CDH) trong công thức Các công thức kem sau mỗi khảo sát đạt thể chất bán rắn sẽ được chấp nhận

Chuẩn bị pha dầu Chuẩn bị pha

C

Trong 120s sử dụng máy đồng nhất

Đóng lọ

Nhiệt độ khoảng

5-10oC, có khuấy Phối hợp từ từ kết hợp khuấy

2.3.2.2 Thiết kế thí nghiệm

 Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 với các khai báo ban đầu:

- Biến đầu vào: tỉ lệ pha dầu (X1), tỉ lệ CDH (X2), tỉ lệ IPM (X3)

- Biến đầu ra: khả năng giải phóng dược chất qua màng thẩm tích tính theo thông lượng giải phóng J (Y1), khả năng lưu giữ dược chất trên da chuột (Y2),

độ ổn định của kem đánh giá qua đặc tính lưu biến tính theo hệ số KTB (trình bày ở mục 2.3.3.3) (Y3)

 Tiến hành thiết kế thí nghiệm chọn mô hình hợp tử tại tâm

2.3.3 Phương pháp đánh giá

2.3.3.1 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng CAP từ kem qua màng thẩm tích

Tham khảo tài liệu [23], kết hợp với sự phù hợp của điều kiện thiết bị tại phòng thí nghiệm, hàm lượng CAP giải phóng qua màng thẩm tích được đánh giá với điều kiện như sau:

 Điều kiện thử:

- Thiết bị: bình khuếch tán Franz

- Bình khuếch tán có thể tích V = 7ml và diện tích thử 1,767cm2

- Môi trường khuếch tán: hỗn hợp đệm PBS pH = 7,4 và ethanol (tỉ lệ 1:1)

- Màng khuếch tán: màng thẩm tích có kích thước lỗ màng 12000 – 14000 Da

Lượng CAP giải phóng từ hệ qua một đơn vị diện tích, sau khoảng thời gian t giờ (t = 1, 2, 4, 6, 8, 24 giờ) tính theo công thức:

Xt =

x (V1 x Sk + V2 x ∑ t-1)

Trong đó:

- Xt là lượng CAP giải phóng qua 1 đơn vị diện tích (μg/cm2)

- Sc, Sk (k là thứ tự các thời điểm lấy mẫu, k = 1, 2, 3, 4, 5, 6) lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại các thời điểm 1, 2, 4, 6, 8 và 24 giờ (LU.s)

- Cc là nồng độ dung dịch chuẩn (μg/ml)

- V1 là thể tích môi trường có trong ngăn nhận (ml)

- V2 là thể tích môi trường lấy tại các thời điểm t (ml)

- Sm là diện tích màng thẩm tích đem thử giải phóng (cm2)

Vẽ đồ thị tương quan giữa lượng CAP giải phóng qua 1 đơn vị diện tích (Xt) và thời gian Thông lượng khuếch tán J (μg.cm-2.h-1) được xác định bằng cách hồi quy tuyến tính Xt sau khi giải phóng đạt đến cân bằng

2.3.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng lưu giữ của kem CAP trên da chuột

Qua tham khảo tài liệu [18], [23], kết hợp với sự phù hợp của thiết bị phòng thí nghiệm, lượng CAP lưu giữ trên da sau 8 giờ được tiến hành như sau:

Phần diện tích da sau khi thử 8 giờ trên thiết bị Franz được lấy ra Sau đó bề mặt da được rửa sạch bằng nước muối sinh lý (3 lần) để loại bỏ lượng thuốc còn lưu lại trên bề mặt da Cắt nhỏ phần da (thành các mẩu nhỏ hình vuông kích thước 1 x 1 mm) rồi đem ngâm trong vừa đủ 10 ml methanol, lắc xoáy trong 60 giây Sau khi ngâm 24 giờ, tiến hành siêu âm trong vòng 30 phút Gạn lấy phần dung dịch ở trên đem ly tâm trên máy ly tâm lạnh với tốc độ 15000 vòng/phút trong 15 phút Phần dịch thu được đem lọc qua màng cellulose 0,45μm và đem định lượng bằng HPLC với detector huỳnh quang bằng phương pháp so sánh với dung dịch chuẩn CAP Fluca trong methanol có nồng độ 10 μg/ml

Lượng CAP lưu giữ trên 1 đơn vị diện tích da được tính theo công thức:

Xd =

x 10 Trong đó:

- Xd là lượng CAP còn lưu giữ trên 1 đơn vị diện tích da (μg/cm2)

- Sc, St lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử (LU.s)

- Cc là nồng độ của dung dịch chuẩn (μg/ml)

- Sm là diện tích da (cm2)

2.3.3.3 Phương pháp đánh giá đặc tính lưu biến của kem CAP

 Điều kiện đo lưu biến:

Tiến hành các phép đo lưu biến bằng máy đo lưu biến DISCOVERY HR-1 rheometer, mô hình sử dụng là côn-đĩa (côn nghiêng 4o1’08”, đường kính đĩa 40mm, đĩa có khả năng điều nhiệt)

Các mẫu đo được để ổn định ở nhiệt độ thực hiện phép đo trong khoảng 120 giây để loại bỏ ngoại lực tác động từ việc đưa mẫu lên đĩa đồng thời giúp mẫu đồng đều về nhiệt Lượng mẫu cần dùng cho mỗi phép đo lưu biến với mô hình côn – đĩa là rất nhỏ (khoảng 1,2 – 1,5 g) Sau mỗi lần đo, vệ sinh dụng cụ và thay mẫu mới lên đĩa

 Cách đưa mẫu lên đĩa:

Cho 1 lượng nhỏ mẫu vào chính giữa đĩa, hạ côn xuống sao cho mẫu bao phủ hết bề mặt côn Sau đó dùng mica vét sạch lượng mẫu thừa xung quanh côn rồi tiến hành các phép đo lưu biến

b Chế độ đo dao động

So với chế độ trượt liên tục, ưu điểm của chế độ đo dao động là mẫu được tiến hành trong vùng LVR Trong vùng này, mẫu sẽ không bị phá hủy cấu trúc khi tiến hành thí nghiệm

Chế độ đo dao động được sử dụng trong trường hợp này để đánh giá độ ổn định của các công thức kem thông qua chu trình nhiệt - lạnh

Cách tiến hành: Để đảm bảo cấu trúc mẫu không bị phá hủy, cần lựa chọn tần

số dao động và ứng suất trượt phù hợp

 Sử dụng phép đo quét biên độ dao động với ứng suất trượt dao động trong khoảng 0,001 – 100 Pa ở nhiệt độ 25oC để lựa chọn 1 giá trị ứng suất trượt trong vùng LVR

 Sử dụng phép đo quét tần số dao động với tần số dao động trong khoảng 0,1 –

100 rad/s ở nhiệt độ 25oC để lựa chọn 1 giá trị tần số trong vùng LVR

Đánh giá độ ổn định của các công thức kem: Sử dụng phép đo quét nhiệt độ dao động, với các thông số ứng suất trượt và tần số dao động được cài đặt ở giá trị nằm trong vùng LVR, kết hợp với sự phù hợp của thiết bị trong phòng thí nghiệm, tiến hành đánh giá độ ổn định của kem qua 3 chu kì nhiệt độ với tốc độ gia nhiệt 3o

C/phút

 Chu kì 1: nhiệt độ tăng dần từ 10 – 40oC

 Chu kì 2: nhiệt độ giảm dần từ 40 – 10oC

 Chu kì 3: nhiệt độ tăng dần từ 10 – 40oC

Kem được cho là ổn định nếu sau các chu kì giá trị tanδ tại mỗi nhiệt độ (so sánh 3 chu kì với nhau) là không khác nhau quá nhiều Giả sử tại nhiệt độ 10oC ta thu được 3 giá trị tanδ ứng với 3 chu kì Hệ số K10 được tính như sau:

K10 = ((tanδ10)max – (tanδ10)min)2

Tương tự tính K13, K16, K19, K22, K25, K40 Sau khi tính được giá trị K tại mỗi nhiệt độ, ta tính giá trị trung bình của giá trị K sau 1 dải nhiệt độ (kí hiệu là KTB):

KTB = ∑

Trong đó Kt là giá trị K tại mỗi nhiệt độ Giá trị KTB càng nhỏ càng thể hiện kem ổn định qua chu trình nhiệt - lạnh

2.3.3.4 Đánh giá khả năng gây kích ứng của kem tối ưu

Tham khảo tài liệu [11], [15] kết hợp với sự phù hợp phòng thí nghiệm, quá trình đánh giá khả năng gây kích ứng của kem CAP trên da thỏ thực hiện như sau:

- Điều kiện nuôi

Trước thí nghiệm một tuần thỏ được đem về nuôi tại chuồng nuôi của bộ môn Dược lực, điều kiện nhiệt độ 20 ± 3°C và độ ẩm 50 – 60%, có đèn chiếu sáng Cho ăn giống chế độ nuôi trong phòng thí nghiệm và không giới hạn lượng nước uống

- Chuẩn bị động vật thử nghiệm

Tiến hành thử nghiệm với ba con thỏ trắng, giống đực Khoảng 24 giờ trước khi làm thí nghiệm, lông ở vùng lưng của động vật được cạo sạch, cẩn thận tránh xước da

và chỉ sử dụng những vùng da toàn vẹn, lành lặn không có tổn thương Vùng da thỏ được chia thành 3 khu vực thí nghiệm như sau:

 Vùng A: Vùng dùng để bôi mẫu kem CAP

 Vùng : Vùng dùng để bôi cao ớt chứa CAP

 Vùng C: Vùng không bôi làm mẫu chứng

- Tiến hành

Lấy chính xác khoảng 0,5 g mỗi mẫu bôi lên các vùng da nhỏ (khoảng 6cm2), dùng một miếng gạc đậy lại và giữ cố định bằng băng dính y tế Theo dõi để đảm bảo động vật thí nghiệm không tiếp xúc hoặc nuốt phải mẫu khi đang thử nghiệm

Khoảng thời gian phơi nhiễm với mẫu: 4 giờ Sau khi kết thúc phơi nhiễm, băng dính và gạc được gỡ bỏ, các vị trí thí nghiệm được lau sạch mẫu bằng nước cất và vải mềm

- Quan sát lâm sàng và phân loại các phản ứng da

Tất cả đông vật thí nghiệm phải được kiểm tra các dấu hiệu ban đỏ và phù nề Kết quả được ghi ở phút thứ 60 và sau đó là 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi loại bỏ các miếng gạc Nếu có tổn thương mà không phân biệt được là kích ứng hay ăn mòn thì tiến hành quan sát đến 14 ngày để xác định khả năng hồi phục

Ngoài việc kiểm tra kích ứng, tất cả các dấu hiệu bất thường cũng được ghi lại

và báo cáo

Theo tài liệu hướng dẫn của OECD 404 [15] và ISO 10993-10-2010 [11], các

phản ứng da được ghi lại và tính điểm theo bảng ở PHỤ LỤC 4

2.3.4 Xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 và phần mềm MODDE 8.0

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu tiền công thức

3.1.1 Thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp định lượng CAP bằng HPLC

3.1.1.1 Định lượng CAP trong các mẫu cao và mẫu nghiên cứu độ ổn định

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector quang phổ tử ngoại được xây dựng để định lượng dược chất trong các mẫu cao và các mẫu theo dõi

độ ổn định Kết quả đánh giá các chỉ tiêu độ tuyến tính, độ lặp lại như sau:

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CAP

Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ từ 30,55 đến 152,75 μg/ml,

đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ CAP là một đường tuyến tính có phương trình hồi quy là y = 19,435x + 42,74; hệ số tương quan R = 0,9997 > 0,995 Như vậy trong khoảng nồng độ này, diện tích pic phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ CAP

b Độ lặp lại

y = 19,435x + 42,74

R = 0,9997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Thẩm định độ lặp lại của phương pháp trên nồng độ 91,65 μg/ml Tiến hành tiêm lặp lại 6 mẫu với nồng độ này, kết quả thể hiện như sau:

Bảng 3.2 Độ lặp lại của phương pháp HPLC

Nhận xét: Nhìn vào bảng 3.2 ta thấy độ lặp lại của phương pháp có RSD < 2%,

đáp ứng được yêu cầu của phương pháp phân tích

Kết luận: Sau khi tiến hành định lượng CAP bằng HPLC với detector quang

phổ tử ngoại cho thấy độ tin cậy của phương pháp khi đánh giá 2 chỉ tiêu độ tuyến tính

và độ lặp lại Do đó có thể áp dụng phương pháp này để định lượng CAP trong các mẫu cao và các mẫu theo dõi độ ổn định

 Kết quả của mẫu cao sau khi định lượng bằng phương pháp HPLC với detector quang phổ tử ngoại là khoảng 2%

3.1.1.2 Định lượng CAP trong các mẫu thử giải phóng và lưu giữ của kem

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector huỳnh quang được xây dựng để định lượng dược chất trong các mẫu thử giải phóng và lưu giữ của kem

Kết quả đánh giá các chỉ tiêu độ tuyến tính, độ lặp lại như sau: