BỘ y tế TRƯỜNG đại học dược hà nội lý THỊ vân ANH 1401026 ĐÁNH GIÁ tác DỤNG

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÝ THỊ VÂN ANH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM TRÊN MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA HAI LOÀI STEPHANIA LOUR... BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÝ THỊ VÂN ANH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM TRÊN

MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM VÀ ĐỘC

TÍNH CẤP CỦA HAI LOÀI STEPHANIA

LOUR Ở VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÝ THỊ VÂN ANH

1401026

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM TRÊN

MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM VÀ ĐỘC

TÍNH CẤP CỦA HAI LOÀI STEPHANIA

LOUR Ở VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn : 1.PGS.TS Nguyễn Thùy Dương

2.NCS Hoàng Văn Thủy

Nơi thực hiện : Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI - 2019

Lời cảm ơn

Để có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất tới các thầy cô giáo, gia đình, anh chị, bạn bè và những người đã giúp đỡ, ủng hộ em trong thời gian vừa qua

Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn

Thùy Dương – Phó trưởng bộ môn Dược lực và NCS Hoàng Văn Thủy, những người

thầy kính mến đã tận tình chỉ bảo em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài Cảm ơn thầy cô vì ngoài những kiến thức chuyên môn em còn được dạy kĩ năng thực nghiệm và phương pháp làm việc khoa học, hiệu quả và trung thực

Em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo tại bộ môn Dược lực đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, tạo điều kiện cho em được học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cám ơn chân thành tới thầy Đinh Đại Độ, chị Nguyễn Thị Thủy, chị Đinh Thị Kiều Giang, Ths Lê Thiên Kim cùng các anh chị KTV, các bạn sinh

viên nghiên cứu tại bộ môn Dược lực đã giúp đỡ em trong quá trình hoàn thành khóa luận Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới những người thầy, cô đã dạy dỗ em trong suốt năm năm học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội, cám ơn các thầy cô vì sự tận tâm với nghề, luôn là tấm gương sáng cả về lối sống và đạo đức nghề nghiệp đối với sinh viên chúng em

Cuối cùng xin gửi lời cám ơn tới những người bạn đã luôn sát cánh, sẻ chia trong mọi hoàn cảnh, cám ơn gia đình thân yêu đã luôn bên con trong suốt cuộc đời

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2019 Sinh viên

Lý Thị Vân Anh

MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan chi Stephania Lour 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Stephania Lour 4

1.1.4 Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Stephania Lour 5

1.2 Thông tin về hai loài Bình vôi nghiên cứu 8

1.2.1 Thông tin về loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang 8

Đặc điểm thực vật và phân bố 8

Thành phần hóa học của loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang 9

Tác dụng sinh học của loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang 9

1.2.2 Thông tin về loài Stephania venosa Bl Spreng 10

Đặc điểm thực vật và phân bố 10

Thành phần hóa học của loài Stephania venosa BL Spreng 10

Tác dụng sinh học của loài Stephania venosa Bl Spreng 11

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu và hóa chất, thiết bị 14

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 14

2.1.2 Động vật thí nghiệm 15

2.1.3 Hóa chất và thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 15

Hóa chất 15

Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau 17

Đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi 17

Đánh giá tác dụng giảm đau trung ương 18

2.3.2 Đánh giá tác dụng chống viêm 19

Đánh giá tác dụng chống viêm cấp 20

Đánh giá tác dụng chống viêm mạn 21

2.3.3 Đánh giá độc tính cấp 22

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 24

3.1 Nghiên cứu về tác dụng giảm đau của hai loài Bình vôi nghiên cứu 24

3.1.1 Nghiên cứu tác dụng giảm đau ngoại vi 24

3.1.2 Nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương 25

3.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm của hai loài Bình vôi nghiên cứu 26

3.2.1 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp 26

3.2.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn 28

3.3 Nghiên cứu độc tính cấp của hai loài Bình vôi nghiên cứu 29

3.3.1 Kết quả thử độc tính cấp của mẫu thử BV1 29

3.3.2 Kết quả thử độc tính cấp của mẫu thử BV2 30

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 33

4.1 Tác dụng giảm đau của hai loài Bình vôi nghiên cứu 33

4.1.1 Tác dụng giảm đau ngoại vi trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 33

4.1.2 Tác dụng giảm đau trung ương trên mô hình mâm nóng 34

4.2 Tác dụng chống viêm của hai loài Bình vôi nghiên cứu 35

4.2.1 Tác dụng chống viêm cấp qua mô hình gây phù chân chuột bằng Carrageenan 35 4.2.2 Tác dụng chống viêm mạn qua mô hình tạo u hạt 36

4.3 Độc tính cấp của hai loài bình vôi nghiên cứu 37

KÊT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

5-HT 5-hydroxytryptamine receptors

ADP Adenosin diphosphat

BC Breast cancer (ung thư vú)

Bl Blum

BV1 Stephania viridiflavens (Bình vôi 1)

BV2 Stephania venosa (Bình vôi 2)

DMSO Dimethyl sulfoxid

DPPH α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl

EC50 Half maximal effective concentration (nồng độ có tác

dụng 50%) FK-3000 Hoạt chất phân lập từ Stephania cepharantha

FRAP Ferric ion reducing antioxidant power (Test sắt làm giảm

sức mạnh chống oxy hóa) Hep-2 Hepatocellular carcinoma (Ung thư gan)

HepG-2 Liver hepatocellular carcinoma

HIV Human immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn

dịch ở người) HSV Virus herpes simplex

IC50 Half maximal inhibitory concentration (nồng độ ức chế

50%)

KB Epidermoid carcinoma

LD50 Lethal dose 50% (liều gây chết trung bình)

LC Lung cancer (ung thư phổi)

NaCMC Sodium carboxymethyl cellulose

NF-KB Nuclear Factor-kappa B (Yếu Tố Nhân kappa)

NMDA N-methyl-D-aspartate receptor

PBMCs Peripheral blood mononuclear cells (Tế bào bạch cầu đơn

nhân trong máu ngoại vi) Raw 264.7 Dòng tế bào đại thực bào chuột

RD Rhabdosarcom (Ung thư cơ vân)

RNA Acid ribonucleic

RPMI Roswell park memorial institute

S Stephania

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Một số chất đã được phân lập trong các loài bình vôi Việt Nam 4

Bảng 1.2 Một số acaloid đã được phân lập trong S viridiflavens 9

Bảng 1.3 Một số alcaloid đã được phân lập trong S venosa 11 Bảng 2.1.Thông tin cao đặc 15 Bảng 3.1 Kết quả nghiên cứu giảm đau ngoại vi của hai loài Bình vôi

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Mẫu củ S.viridiflanvens 14

Hình 2.2 Mẫu củ S.venosa 14 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu 17 Hình 2.4 Quy trình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi 18 Hình 2.5 Quy trình đánh giá tác dụng giảm đau trung ương 19 Hình 2.6 Quy trình đánh giá tác dụng tác dụng chống viêm cấp 20 Hình 2.7 Quy trình đánh giá tác dụng chống viêm mạn 22 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn độ tăng khối lượng u hạt tươi trên mô hình

gây u hạt bằng viên bông

28

Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn độ tăng khối lượng u hạt khô trên mô hình

gây u hạt bằng viên bông

28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Stephania Lour là một chi lớn thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae), trên thế

giới có khoảng 100 loài phân bố ở vùng Đông Nam Á, Nam Á, nhiều nước như Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Myanma, Thái Lan, Lào, Nhật Bản… [23]

Ở Việt Nam, các loài thuộc chi Stephania Lour thường có tên gọi là “Bình vôi”,

có khoảng 20 loài thuộc chi Stephania Lour đã được nghiên cứu về đặc điểm thực vật,

thành phần hóa học và tác dụng sinh học [16], [18], [24], [28] Một số tác dụng được

quan tâm nghiên cứu của các loài thuộc chi Stephania Lour bao gồm: tác dụng an thần,

giảm đau, chống viêm, chống dị ứng, gây độc tế bào ung thư Từ đó đã chứng minh

được kinh nghiệm sử dụng các loài thuộc chi Stephania Lour trong dân gian

Trong quá trình phát triển, nền y học hiện đại đã có rất nhiều nghiên cứu và tổng hợp ra các nhóm thuốc hóa dược có tác dụng giảm đau, chống viêm Các nhóm thuốc điều trị giảm đau như: nhóm thuốc giảm đau trung ương (morphin, codein…), nhóm thuốc giảm đau ngoại vi (paracetamol), nhóm thuốc chống viêm không steroid (ibuprofen, piroxicam…) và các nhóm thuốc chống viêm steroid Ngoài ra, nền y học

cổ truyền cũng đã có rất nhiều tài liệu ghi nhận các cây thuốc và dược liệu có tác dụng giảm đau như Độc hoạt, Dây đau xương, Cốt toái bổ với công dụng điều trị đau nhức xương khớp, đau đầu) và các cây thuốc có tác dụng chống viêm như Xạ can, Sài đất với công dụng chữa viêm sưng cổ họng, viêm da, viêm mủ [20] Trong quá trình nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc có công dụng giảm đau, hai loài Bình vôi thu hái ở Bà Rịa - Vũng Tàu và Yên Bái, đã được nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Quốc Huy xác định tên

khoa học lần lượt là là Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang [26] và Stephania

venosa (Bl.) Spreng [17] Hai loài này được dân gian sử dụng để chữa các bệnh vôi hóa

khớp, viêm khớp Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu, đánh giá dược lí nào về tác dụng giảm đau, chống viêm và độc tính của hai loài này ở Việt Nam Để xác định căn cứ khoa học nhằm nâng cao chất lượng sử dụng cây thuốc hiệu quả và an toàn,

chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu: “Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm

trên mô hình thực nghiệm và độc tính cấp của hai loài Stephania Lour ở Việt Nam“

với các mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng giảm đau của loài Stephania viridiflavens H.S Lo &

M Yang và loài Stephania venosa (Bl.) Spreng trên mô hình thực nghiệm

2 Đánh giá tác dụng chống viêm của loài Stephania viridiflavens H.S Lo &

M Yang và loài Stephania venosa (Bl.) Spreng trên mô hình thực nghiệm

3 Xác định độc tính cấp của loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang

và loài Stephania venosa (Bl.) Spreng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan chi Stephania Lour

Chi Stephania Lour được xếp vào họ Tiết Dê (Menispermaceae), thuộc bộ Hoàng

liên (Ranunculales), phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [16]

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Các loài thuộc chi Stephania Lour là cây leo sống lâu năm hoặc hàng năm [7]

Thân gỗ hay thân cỏ Rễ dạng sợi hoặc phình to thành rễ củ, rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc [3] Lá mọc cách, hình lọng Cuống lá thường mảnh, dài 2(-5)-15(-20) cm, hai đầu phình lên [23], có khi gấp khúc ở gốc [6], [16] Cuống lá đính vào phiến lá có thể từ 1/15 đến 1/3 chiều dài phiến lá Phiến lá mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình lọng, hình tam giác rộng, hình trứng - tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn, mép lá nguyên hoặc chia thùy, gân lá dạng chân vịt gồm 8(-9)- 10(-12), gân lá xuất phát từ đỉnh cuống lá [16], [53]

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực và cái thường mọc từ kẽ lá hay mọc trên thân

cây già không lá (S viridiflavens) [12] Cụm hoa thường có dạng tán đơn, tán kép, xim

tán kép, hình đầu đến tán ngù [26] Quả hạch, hình gần tròn, hình trứng, hình trứng ngược, trứng bầu, 2 bên dẹt Quả chín màu vàng đậm hay đỏ tươi nhẵn bóng Hạt (hình dạng tương tự vỏ quả trong) hình móng ngựa, trứng dẹt hoặc hơi tròn, lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2 hoặc 4 dãy dọc các bướu (gai) hay những gờ ngang (vân) [48]

1.1.2 Phân bố

Chi Stephania Lour phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới như: Việt

Nam, Indonesia, Myanma, Thái Lan, Lào, Campuchia, Philippin, Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Trung Quốc, Đài Loan, Papua New Guinea, Nhật Bản, Australia, Nigeria, Ethiopia [22] Ở Việt Nam, các loài Bình vôi thường mọc hoang ở một số vùng núi đá vôi, núi đất, núi đất lẫn đá, ở đồng bằng, ven biển, có loài mọc ngay trên bãi cát hoặc gò hoang vùng ven biển Các loài Bình vôi ở nước ta phân bố rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam [3], [4], [5]

1.1.3 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Stephania Lour

Các nhóm chất đã được xác định có trong củ của loài Bình vôi bao gồm: alcaloid, flavonoid, tinh bột, đường khử tự do và một số chất khác Trong đó alcaloid là thành phần chính Một số hoạt chất đã được phân lập trong củ của nhiều loài Bình vôi như là

L-tetrahydropalmatin, palmatin, cepharanthin, dehydrodicentrin, corypalmin

Ở Việt Nam, nhiều tác giả xác định được một số thành phần hóa học và phân lập

các chất trong các loài Bình vôi Các chất đã phân lập được tóm tắt trong Bảng 1.1:

Bảng 1.1 Một số chất đã được phân lập trong các loài Bình vôi Việt Nam

Aporphin

12 Crebanin

S dielsiana Y C Wu [22]

13 Thailandin

14 Dehydro-crebanin S dielsiana Y C Wu [16]

15 Oxostephanin S dielsiana Y C Wu [16]

16 Roemerin S glabra (Roxb.) Miers [28] Pro-aporphin 17 (+) Stepharin S brachyandra Diels [16]

18 Stepharin S kuinanensis H.S.Lo [22] Flavonoid

1.1.4 Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Stephania Lour

Tác dụng sinh học các loài của chi Stephania Lour được nghiên cứu trên dịch chiết

toàn phần hoặc dựa trên các hoạt chất phân lập trong cây như cepharanthin, tetrandrin, oxostephanin, tetrahydropalmatin, stepholidin, cycleanin, fangchinolin, tetrandra

 Tác dụng chống viêm

Dịch chiết phân đoạn 1 trong dung môi dicloromethan và ethyl acetat của loài S

dielsiana thu hái tại Ba Vì, liều 9 g dược liệu/kg chuột có tác dụng làm giảm phù trên

chân chuột gây ra bằng carrageenan ở tất cả các thời điểm và làm đều giảm khối lượng

u hạt tươi và khô trên mô hình gây viêm mạn bằng cấy viên bông [27]

Chiết xuất của S cepharantha có chứa các alcaloid biscoclaurin như cepharanthin

Trong một cuộc sàng lọc ở Nhật Bản, cepharanthin đã được chỉ ra là có tác dụng chống viêm[46] Hoạt chất này cũng đã được nghiên cứu tác dụng chống viêm trên mô hình gây u hạt ở chuột [45] Thuốc mỡ có chứa thành phần cepharanthin (hàm lượng 2%) có tác dụng điều trị viêm khớp mạn tính do ức chế sản xuấtyêu tốhoại tử khối u (TNFa)

và có tác dụng ức chế viêm tốt nhất ở thời điểm 2 giờ sau khi gây viêm trên chuột bằng

lipopolysaccharid [75]

Tetrandrin có tác dụng độc tế bào với đại thực bào thông qua cơ chế tăng sản xuất prostaglandin Tác dụng này mở ra triển vọng của alcaloid này trong điều trị bệnh bụi phổi silic [76] Ngoài ra, tetrandrin cũng được chứng minh có tác dụng điều trị viêm giác mạc do virus herpes simplex typ I (HSV) gây ra ở chuột [54] Một nghiên cứu khác

của Chen Y J và Tu M L cho thấy tetrandrin có tác dụng bảo vệ cơ thể chống lại tác

dụng chiếu xạ của tia X liều cao và có thể hạn chế các phản ứng viêm gây ra bởi tia X [35] Tetrandrin liều 7,5-30 mg/kg làm giảm khối lượng u hạt và giảm số lượng tế bào viêm, làm giảm sự hình thành ống (gấp 100 lần so với hydrocortison) của tế bào nội mạc thành mạch xảy ra trong quá trình tân tạo mạch được hoạt hóa trong giai đoạn viêm mạn tính [61] Tetrandrin có triển vọng trong điều trị các bệnh miễn dịch, bệnh tăng huyết áp

và bệnh viêm khớp mạn tính ở Trung Quốc [63]

Ở các nước châu Á, tiêu biểu là Hàn Quốc, hai hoạt chất fangchinolin và tetrandrin

phân lập từ loài Stephania tetrandra đều có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù

tai chuột bằng dầu croton.Cơ chế chống viêm củ hai hoạt chất này là ức chế lên các yếu

tố gây viêm Fangchinolin với nồng độ 100 µM làm ức chế cyclooxygenase, nhưng nồng

độ tetrandrine tương tự không có tác dụng này Mặt khác, tetrandrin nồng độ 12,5 µM

có tác dụng dụng ức chế rất hoạt động của murin interleukin-5, trong khi fangchinolin lại không có tác dụng này [37]

 Tác dụng giảm đau

Dịch chiết phân đoạn 1 từ củ của loài S dielsiana liều 9 g dược liệu/kg cân nặng

chuột làm giảm tổng số cơn đau quặn của chuột trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic Trên mô hình mâm nóng có cải tiến (tiêm thêm carrageenan trước khi thực hiện

đo thời gian chịu đau) liều 3 g/kg, 6 g/kg và 9 g/kg đều có tác dụng làm tăng ngưỡng đau của chuột [27]

 Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương

Hỗn hợp alcaloid chiết từ củ Bình vôi với liều 100 mg/kg cân nặng chuột làm tăng cường tác dụng gây ngủ của thiopental một cách rõ rệt khi kéo dài giấc ngủ tới 1,5 lần

so với lô chuột chỉ được sử dụng thiopental [21] Dịch chiết nước toàn phần của

S.dielsiana Y.C.WC với mức liều từ 0,03 g/kg đến 1 g/kg cân nặng chuột làm tăng thời

gian lưu lại tay hở, tăng số lần di chuyển vào trong tay hở và kéo dài thời gian gây ngủ của thiopental [1]

Trong một nghiên cứu của tác giả Mai Thị Huế về bài thuốc An thần hoàn có chứa Bình vôi, kết quả nghiên cứu cho thấy liều dùng trên chuột 4,54 g/kg cao khô An thần hoàn có tác dụng giải lo âu, liều 9,08 g/kg lại có tác dụng gây ngủ [15]

Hai hoạt chất D-tetrahydropalmatin và L-tetrahydropalmatin được phân lập từ

nhiều loài thuộc chi Stephania Lour và cây Corydalis ambigua không chỉ có tác dụng

giảm đau mà còn có tác dụng an thần gây ngủ [99] L- tetrahydopalmatin liều 0,3 mg/kg

có tác dụng cải thiện khả năng học tập và ghi nhớ in vivo trên chuột [11], mức liều 3

mg/kg trở lên thể hiện tác dụng an thần khi làm tăng thời gian và điểm bất động cũng như làm giảm hoạt động tự nhiên của chuột trong môi trường mở [13]

Theo nghiên cứu của Dương Hữu Lợi khi tiêm cho chuột nhắt trắng 0,1 ml dung dịch L-tetrahydropalmatin ở các nồng độ khác nhau: 0,5%, 1%, 2% nhận thấy đều có tác dụng làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh, tác dụng này được duy trì trong vòng 3-5 giờ [19]

Hoạt chất roemerin phân lập từ củ cây Bình vôi có tác dụng an thần, gây ngủ ở liều thấp nhưng lại có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, gây co giật và chết khi dùng ở liều cao Roemerin có tác dụng gây tê niêm mạc và phong bế dẫn truyền Tính theo công thức G Valette, dung dịch 0,5% có tác dụng gây tê niêm mạc tương đương

với dung dịch cocain clohydrat 1,8% Theo thí nghiệm của Mak và Nelson dung dịch roemerin 0,5% có tác dụng gây tê phong bế thần kinh mạnh hơn dung dịch cocain clohydrat 1% và dung dịch novocain 3% [19]

Hoạt chất stepholidin phân lập từ củ Bình vôi có tác dụng trong điều trị bệnh tâm thần phân liệt, giảm một số triệu chứng của bệnh Parkinson [41], [94], [97]

 Tác dụng chống ung thư

Shiraishi N., Akiyama S và cộng sự [82] đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm thuốc Biscoclaurin lên dòng tế bào đa kháng phát sinh từ dòng tế bào ung thư KB ở

người Cepharanthin - một loại biscouclaurin alcaloid được phân lập từ củ của Stephania

cepharantha có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư do khởi động quá

trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) [47] Khả năng ức chế các tế bào ung thư biểu mô dạng vẩy ở miệng của cepharanthin rất đáng kể với nồng độ ức chế dao động trong khoảng 10-20 µg/ml [52] Cepharanthin có tác dụng ức chế lên 2 dòng tế bào ung thư đại trực tràng và ung thư gan với giá trị IC50 tương ứng là 2,4 và 5,3 µM [34]

Thử nghiệm in vitro được tiến hành cho thấy hoạt chất tetrandrin phân lập từ loài

S tetrandra ức chế sự phân bào và gây cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư gan

HepG-2 với giá trị IC50 = 9,0 ±1,0 µM [95] Tetrandrin có tác dụng bảo vệ gan tế bào trên mô hình viêm gan gây ra bởi conconavalin-A [42] và ức chế sự di căn của tế bào ở gan chuột [36] Ngoài ra, tetrandrin còn có tác dụng làm ngừng sự phát triển tế bào ung thư trực tràng [67], ức chế sự hoạt hóa NF-KB, do đó cải thiện được viêm trực tràng gây

ra bởi dextran sulfat natri ở chuột [96]

Hoạt chất oxostephanin - một alcaloid đã được phân lập từ củ Bình vôi cũng được chỉ ra có tác dụng gây độc trên 2 dòng tế bào là ung thư da (Epidermoid carcinoma-KB)

và ung thư vú (Breast cancer-BC) [91], tế bào ung thư gan (Hep-2), ung thư phổi (LC)

và ung thư cơ vân (RD) [16]

 Tác dụng chống dị ứng

Cơ chế chống dị ứng của cepharanthin trong viêm mũi dị ứng có thể là do ức chế giải phóng histamin từ các tế bào mast vàtác động ổn định màng thông qua sự kích thích chức năng của tuyến yên và tuyến thượng thận Trong thực nghiệm trên chuột bị viêm mũi dị ứng, dung dịch cepharanthin liều 0,1 mg/ml nhỏ vào khoang mũi có tác dụng kích thích kháng nguyên, ức chế sự rò rỉ thuốc nhuộm và tăng hoạt động của enzym lysosomase [62]

 Tác dụng trên tim mạch và chuyển hóa

Martinez J A., Bello A và cộng sự [66] đã nghiên cứu tác dụng của cycleanin phân lập từ cây Bình vôi trên tim Kết quả cho thấy, cycleanin có tác dụng đối kháng calci chọn lọc trên mạch máu Cycleanin có tác dụng ức chế bơm Na+- K+- ATPase qua

đó tác dụng lên hệ thống bơm của tế bào cơ tim [83]

Hoạt chất fangchinolin phân lập từ loài S tetrandra với liều 0,3-3 mg/kg làm

giảm đáng kể nồng độ glucose trong máu của chuột trên mô hình gây đái tháo đường [87] Fangchinolin còn có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào cơ trơn động mạch chủ [98]

Roemerin có tác dụng giãn mạch, hạ huyết áp, làm giảm cả huyết áp tối đa và huyết

áp tối thiểu [19]

 Các tác dụng khác

Cepharanthin phân lập từ loài S cepharantha có khả năng ức chế mạnh đối với sự

nhân lên của virus HIV typ I phát triển trong tế bào bạch cầu đơn nhân [73], [74] Hai chất aromolin và FK-3000 được phân lập từ dịch chiết methanol từ củ của loài

S cepharantha có khả năng kìm hãm HIV typ 1 rất mạnh [64] Hợp chất FK-3000 còn

có hoạt tính ức chế mạnh với 2 virus herpes simplex là HSV typ 1 và HSV typ 2 [70]

Ngoài ra còn có rất nhiều tác dụng sinh học khác của các loài thuộc chi Stephania

Lour đã và đang được nghiên cứu trên thế giới

1.2 Thông tin về hai loài Bình vôi nghiên cứu

1.2.1 Thông tin về loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang

Đặc điểm thực vật và phân bố

Đặc điểm thực vật

Loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang thu hái ở Yên Bái [26] có các

đặc điểm đặc trưng của loài so với các loài thuộc chi Stephania Lour bao gồm: Thân

mảnh, nhựa trong Cành non màu xanh lá, cành già màu xanh đậm, hóa gỗ Toàn cây không lông Mép lá nguyên hoặc có gợn sóng nông bất qui tắc, hai mặt lá không lông, cuống lá gần bằng hoặc dài hơn phiến lá

Cụm hoa đực mọc xim tán kép, cuống cụm hoa dài 6-10 cm Cuống hoa đực dài 1-2mm Hoa nhỏ, đường kính 2 mm Đài 6, rời hoặc dính nhau rất ít ở cuống Bộ nhị có chỉ nhị hàn liền thành hình trụ, hạt phấn rất nhiều, hình cầu, trắng

Cụm hoa cái dạng xim tán kép, số lượng hoa lớn hơn và dài hơn so với hoa đực, cuống cụm hoa 6-9 cm Cuống hoa cái dài 2mm Hoa nhỏ, đường kính 1,5-2 mm Bao hoa gồm 2 vòng Tràng rời, mép quăn và hơi cụp vào phía trong Bầu trên, lệch, 0,5mm

x 0,7 mm, một ô, bên trong mang một noãn đính mép Vòi nhụy 5, rất ngắn

Hạt hình móng ngựa, kích thước dài 5 – 8 mm, rộng 4 – 5mm, lưng dày 2mm; lưng hạt có ba hàng gai, các gai tù ở đỉnh cách đều nhau một khoảng 0,5 mm, hạt có một lỗ nhỏ hình trái xoan, hạt có nội nhũ đảo

Phân bố

Loài S viridiflavens phân bố chủ yếu ở phía Tây Trung Quốc [65], còn ở Việt Nam

đã được tìm thấy ở Sơn La [12], Yên Bái [26]

Thành phần hóa học của loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang

Hoạt chất phân lập quan trọng nhất từ loài S viridiflavens được tổng hợp theo

L – tetrahydropalmatin

Aporphin

Corydin

[65] Isocorydin

Methyllaurotetanin Proaporphin Stepharin [28]

Theo nghiên cứu của tác giả Vũ Xuân Giang, trong rễ củ của loài S viridiflavens

chứa nhiều L –hydropalmatin và lá nguyên liệu chủ yếu để chiết suất rotundin [12] Gần đây tại Việt Nam, Tác giả Nguyễn Quốc Huy và nhóm nghiên cứu của mình đã phân lập

thêm 3 alcaloid mới từ củ của S.venosa thu hái tại tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu là roemerin,

thaicanin, stepharin [25]

Tác dụng sinh học của loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang

Hiện nay có rất ít tài liệu công bố về tác dụng sinh học của loài S viridiflavens Ở

Trung Quốc, các bộ phận của cây thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian

chữa đau dây thần kinh và các rối loạn ở ruột [65] Ở Việt Nam, đặc biệt vùng Sơn La,

rễ củ to của loài này thường được sử dụng theo kinh nghiệm để điều trị đau dây thần kinh, đau răng, viêm dạ dày, ruột, viêm họng, viêm đường hô hấp trên, trị nhọt độc và các vết thương do các tác động cơ giới [8]

1.2.2 Thông tin về loài Stephania venosa Bl Spreng

Đặc điểm thực vật và phân bố

Đặc điểm thực vật

Cây dây leo có củ, mủ đỏ Rễ củ to trồi lên mặt đất, đường kính có thể lên tới 40

cm Thân màu rơm hơi đỏ, không lông, nhẵn, lúc khô màu lục Lá mọc cách, phiến lá hình trứng rộng tam giác, gốc lá lõm hình tim, ngọn lá nhọn hay tù, mép lá nguyên hoặc hơi chia thùy [23] Phát hoa ở nách lá, mang vài tán dày Hoa đực: đài 6, cánh hoa 3 Hoa cái có cuống, đài 1, màu cam; cánh hoa 2 [14] Quả hạch hình gần trứng, dẹp nhỏ Hạt hình trứng bầu, dẹt, dọc chiều lưng bụng có 4 hàng gai, mỗi hàng có 12-20 gai nhỏ

[17], [23]

Phân bố

S venosa phân bố chủ yếu ở các nước châu Á: Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan,

Malaysia, Indoneisa, Philippin [43], [44], [55] Ở Việt Nam, S venosa phân bố tập trung tại khu vực các tỉnh phía Nam Chưa có ghi nhận nào về loài S venosa được tìm thấy ở

phía Bắc Việt Nam [14], [23]

Thành phần hóa học của loài Stephania venosa BL Spreng

Hoạt chất được quan tâm trong loài Stephania venosa (Bl.) Spreng là các alcaloid

Đến nay đã phân lập và xác định từ loài này chính xác được 30 alcaloid, thuộc 3 nhóm

(Bảng 1.3):

- Aporphin (17 chất),

- Proaporphin (11 chất),

- Protoberberin (2 chất)

Bảng 1.3 Một số alcaloid đã được phân lập trong S venosa

Trong số trên chỉ có 4 hoạt chất được phân lập được từ loài S venosa tại Việt Nam

là: Ayuthioninin, Thailandin, L-tetrahydropalmatin, Uthongin [16]

Tác dụng sinh học của loài Stephania venosa Bl Spreng

 Tác dụng chống viêm

Dịch chiết của S venosa dùng đường uống trên chuột với liều 250 mg/kg, cho tác

dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan, tại thời điểm 1 giờ (với phần trăm ức chế viêm là 74,3%), không thể hiện tác dụng tại các thời điểm còn lại [80]

Crebanin là một hoạt chất phân lập từ củ của S venosa có tác dụng ức chế viêm

do lipopolysaccharid gây ra, cơ chế phân tử là ức chế các yếu tố gây viêm, làm giảm sự sản xuất các cytokin khởi phát quá trình viêm như interleukin-6 và yếu tố hoại tử alpha khối u gây ra bởi tế bào Raw 264.7 Hơn nữa, crebanin ức chế lipopolysaccharid gây ra cảm ứng oxit nitric và prostaglandin E2 và giảm sự biểu hiện của oxit nitric cảm ứng lên hai enzym synthase và cyclooxygenase-2 Crebanin còn ức chế phosphoryl lipopolysaccharid gây ra các protein viêm và protein kinase mitogen-activated, bao gồm

cả ngoại bào tín hiệu điều tiết các kinase [57]

 Tác dụng chống oxy hóa

Dịch chiết ethanol từ củ của S venosa có tác dụng chống oxy hóa với EC50 là 4,98 mg/ml trên thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH [80], dịch chiết methanol từ củ loài này cũng có tác dụng chống oxy hóa qua thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH và FRAP (khả năng chống oxi hóa liên quán đến sắt) [81]

 Tác dụng giảm lo âu

Cho chuột sử dụng dịch chiết ethanol toàn phần của S venosa theo đường uống

với liều khác nhau, từ 5, 10 và 20 mg/kg cân nặng mỗi ngày một lần trong thời gian 2 tuần Chỉ có liều 20 mg/kg cân nặng cho tác dụng giải lo âu và không có tác dụng chống

trầm cảm [86]

 Tác dụng ức chế sự phát triển và gây độc tế bào

Dịch chiết nước từ củ của S venosa có hoạt tính gây độc tế bào, cảm ứng chu trình

chết cả hai tế bào lympho bình thường và tế bào lympho thu được từ các bệnh nhân ung thư cổ tử cung, chống sự tăng sinh, xâm lấn, di căn tế bào ung thư Hiệu quả nhất trong khi kết hợp 0,5 Gy60Co tia gamma với 300 µg/ml S.venosa IC50 của dịch chiết nước từ

củ S.venosa được xác định bằng cách cho tiếp xúc giữa 4x105 lympho (từ máu người khỏe mạnh được nuôi cấy trong môi trường RPMI) với các nồng độ khác nhau của

S.venosa trong 48 giờ, thuốc nhuộm xanh Trypan được dùng để phát hiện các hoạt động

gây độc tế bào Sự thay đổi pH và các dấu hiệu gây độc tế bào của S.venosa đã được

nghiên cứu trong thời gian 12 tuần IC50 của dịch chiết nước tại 300 µg/ml được chọn để kiểm tra về hoạt tính cảm ứng chu trình chết, cả trong tế bào lympho người bình thường

và tế bào lympho của bệnh nhân ung thư cổ tử cung Hoạt tính cảm ứng chu trình chết

đã được phát hiện ở 48 giờ sau khi tiếp xúc luôn với terminal transferase deoxynucleotidyl [60], [78]

Dịch chiết nước từ S.venosa có hoạt tính gây độc tế bào PBMCs với IC50 là 300

µg/ml [59], [79], [78] ,[84] Ngoài ra dịch chiết nước Stephania venosa (Bl.) Spreng có

hoạt tính chống tăng sinh tế bào trên mô hình khảo nghiệm 3 H-thymidine để đánh giá

sự phát triển của tế bào ung thư, với IC50 của dịch chiết là 40 µg/ml [84]

Dịch chiết cồn 95° từ củ 6 năm tuổi của loài S venosa không có tác dụng gây

hướng hoạt tính estrogen, nhưng lại có dấu hiệu gây độc trên chuột đã cắt buồng trứng

Vì vậy, sử dụng dược liệu này để điều trị chống ung thư buồng trứng ta cần phải được đánh giá lại hoặc sử dụng một cách thận trọng [49]

 Tác dụng khác

Dịch chiết methanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng có tác dụng chống

kết tập tiểu cầu với IC50 55,9 µg/ml trong thử nghiệm xác định hoạt động ức chế kết tập tiểu cầu gây ra bởi adenosin diphosphat (ADP) [81]

Dịch chiết ethanol chiết từ củ của S venosa cho hoạt động ức chế rõ rệt trên

Artemia sp với LC50 của 260,26 µg/ml Liều gây độc/liều gây chết đối với vi khuẩn của dịch chiết là 750 mg/kg Thí nghiệm với phương pháp pha loãng trong môi trường thạch cho thấy rằng dịch chiết có hoạt tính ức chế sự phát triển vi khuẩn khác nhau, với nồng

độ ức chế tối thiểu (MIC) giữa 5-30 mg/ml [80] Ngoài ra dịch chiết ethanol và n-hexan

của củ Stephania venosa (Blume) Spreng còn cho hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với

vi khuẩn Bacillus cereus, Escherichia coli và Staphylococcus aureus (phương pháp khuếch tán đĩa) Kết quả thử nghiệm cho thấy phân đoạn chiết xuất ethanol của S venosa cho tác dụng ức chế mạnh đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm, giá trị MIC cho B

cereus, E coli và S aureus lần lượt là 0,078; 0,625 và 0,078 mg/ml Trong khi phân

đoạn n-hexan cho tác dụng ức chế kém hơn với cả 3 chủng vi khuẩn, nhất là với E coli

(giá trị MIC lần lượt là 2,5; lớn hơn 5,0 và 2,5 mg/ml) [93]

Dịch chiết ethanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng có tác dụng ức chế nấm tyrosinase với IC50 1,74 mg/ml trong thử nghiệm với phương pháp Dopachrome [80]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu và hóa chất, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

 Dược liệu nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu là củ của hai loài Bình vôi đã được tác giả Nguyễn Quốc Huy và cộng sự xác định tên khoa học trong khi đi thực địa tại Yên Bái và Vũng Tàu [17], [26]

Hình 2.1 Mẫu củ S.viridiflavens Hình 2.2 Mẫu củ S.venosa

- Củ của loài Stephania viridiflavens (BV1) thu hái tại tỉnh Yên Bái năm 2018

Tiêu bản mẫu cây được lưu giữ tại Phòng tiêu bản Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật

- Viện Hàn lâm khoa học và CN Việt Nam với mã số ‘‘Tiêu bản số HV – Thủy 2’’

- Củ của loài Stephania venosa (BV2) thu hái tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu năm

2018 Tiêu bản mẫu cây được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội mã số tiêu bản là: ‘‘HNIP/18073/14’’

 Mẫu cao thử BV1 và BV2

Củ của hai mẫu nghiên cứu được cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 55oC đến hàm ẩm dưới 10%, sau đó xay thành bột thô, xác định hàm ẩm bột Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt, dung môi ethanol 70% (ngâm trương nở 24 giờ, tốc độ chảy 1ml/phút, thể tích dung môi ước tính: khối lượng dược liệu là 20:1) Gộp dịch chiết ethanol, sau đó cô thu hồi dung môi bằng dụng cụ cất quay đến cao 1:1 Cao 1:1 sau đó được đem cô trên nồi cách thủy với mức công suất 800W, đến khi thể chất cao đặc, xác

định khối lượng cao thu được Thông tin về mẫu cao được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Thông tin cao đặc

Loài Hàm ẩm Lượng dược liệu trong 1 g cao

Liều dùng trên người quy đổi theo cao

Liều quy đổi sang chuột nhắt

Liều quy đổi sang chuột cống

Stephania

viridiflavens 10,2%

5,55 g dược liệu khô tuyệt đối

2,16 g cao/ngày/người

2,42 g cao/ngày/người 50kg

580 mg/kg 340 mg/kg

 Mẫu chế phẩm thử BV1 và BV2

Cao đặc được hòa tan trong DMSO theo tỷ lệ 1g cao/1,5 ml DMSO (sau khi pha chế phẩm thử %DMSO pha loãng từ 2,15% đến 8% tt/tt tùy vào nồng độ liều của chế phẩm), siêu âm ở 30°C trong 20 phút cho tan hoàn toàn Sau đó phân tán thành hỗn dịch trong NaCMC 0,8% ra các liều thích hợp Chế phẩm thử sau pha chế được bảo quản trong tủ lạnh 8°C Cho động vật uống hỗn dịch chế phẩm thử qua kim đầu tù với các liều thử nghiệm đã được thiết kế

2.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống, cân nặng 20  2g, đạt tiêu chuẩn thí

nghiệm, do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp

Chuột cống trắng chủng Wistar giống đực, khỏe mạnh, cân nặng 120  20g, đạt

tiêu chuẩn thí nghiệm, do trung tâm huấn luyện Học Viện Quân Y cung cấp

Động vật thí nghiệm được nuôi dưỡng ổn định ở điều kiện phòng thí nghiệm bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp, uống nước tự do tại phòng nuôi động vật thí nghiệm của bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội

2.2.1 Hóa chất và thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

Hóa chất

- Indomethacin chất chuẩn, đạt tiêu chuẩn phân tích do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương cung cấp

- Acid acetic (Merck)

- Prednisolon dạng viên nén 5mg sản xuất bởi công ty cổ phần NAHAPHARM

Số đăng kí VD-16472-12, hạn sử dụng 04/05/2022

- Carrageenan (Sigma Aldrich)

- Dung môi pha mẫu cao toàn phần dược liệu : Dimethyl sulfoxid do công ty Kanto Chemical Nhật Bản sản xuất, Cat.no 10378 – 01, Lot No 701B1131

Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

- Cân kĩ thuật GM 312 (Sartorius)

- Máy siêu âm (Power sonic 405)

- Máy đo đau dùng mâm nóng Hot plate LE 7406 (Panlab)

- Đo độ phù chân chuột bằng máy Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instruments)

- Đồng hồ bấm giây (Nhật Bản)

2.3 Nội dung nghiên cứu

Để giải quyết các mục tiêu đã đề ra, nghiên cứu gồm 3 nội dung:

Nội dung 1: Đánh giá tác dụng giảm đau của hai loài Bình vôi nghiên cứu BV1 và

BV2 trên mô hình thực nghiệm:

- Đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic

- Đánh giá tác dụng giảm đau trung ương trên mô hình đo đau mâm nóng

Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống viêm của hai loài Bình vôi nghiên cứu BV1

và BV2 trên mô hình thực nghiệm:

- Đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bằng

carrageenan

- Đánh giá tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt

Nội dung 3: Đánh giá độc tính cấp của hai loài Bình vôi nghiên cứu BV1 và BV2

Sơ đồ nghiên cứu như sau:

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau

Để đánh giá tác dụng giảm đau của mẫu thử, nhóm nghiên cứu tiến hành thực nghiệm trên đối tượng chuột nhắt trắng với các liều thiết kế như sau: BV1 ba mức liều

260 mg/kg, 520 mg/kg, 1040 mg/kg và BV2 ba mức liều 290 mg/kg, 580 mg/kg, 1160

mg/kg

Đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi

Đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi trên mô hình gây quặn đau bằng acid acetic

(phương pháp Koster) [40]:

 Thiết kế thí nghiệm

Chuột nhắt trắng đực được chia ngẫu nhiên thành 8 lô, mỗi lô 10 con:

- Lô 1 (lô chứng): uống dung môi pha mẫu chế phẩm thử (NaCMC 0,8%) liều 0,1ml/10g chuột

- Lô 2 (lô chứng dương): uống indomethacin liều 10 mg/kg chuột

- Lô 3: uống chế phẩm thử BV1 liều 260 mg/kg

- Lô 4: uống chế phẩm thử BV1 liều 520 mg/kg

- Lô 5: uống chế phẩm thử BV1 liều 1040 mg/kg

- Lô 6: uống chế phẩm thử BV2 liều 290 mg/kg

- Lô 7: uống chế phẩm thử BV2 liều 580 mg/kg

- Lô 8: uống chế phẩm thử BV2 liều 1160 mg/kg

Cho chuột uống dung môi và chế phẩm thử liên tục trong 3 ngày, trước khi uống chế phẩm thử chuột được nhịn ăn 1,5 giờ Ngày thứ 3, sau khi cho chuột uống chế phẩm thử 1 giờ, tiêm màng bụng chuột dung dịch acid acetic 1%, thẻ tích 0,2 ml/con Ngay sau khi tiêm acid acetic, động vật được đặt vào một bình trong suốt, dùng máy quay ghi lại các cơn đau của chuột trong 30 phút Một quan sát viên (đã được làm mù) đếm số cơn quặn đau của chuột trong từng 10 phút cho đến hết phút thứ 30 Quy trình nghiên

cứu tác dụng giảm đau quặn của các mẫu thử được trình bày ở Hình 2.4

Hình 2.4 Quy trình đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi

 Thông số đánh giá

Số cơn quặn đau của chuột trong từng 10 phút cho đến hết phút thứ 30 và tổng số cơn đau quặn trong 30 phút sau khi tiêm acid acetic

Đánh giá tác dụng giảm đau trung ương

Đánh giá tác dụng giảm đau trung ương của mẫu thử bằng mô hình đo đau dùng mâm nóng trên chuột nhắt trắng [31] Đặt từng chuột lên mâm nóng có nhiệt độ ổn định 56°C Sử dụng đồng hồ trên thiết bị để xác định thời gian phản ứng đau của từng chuột Chỉ chọn những chuột có phản ứng đau từ 8 – 30 giây vào nghiên cứu

 Thiết kế thí nghiệm

Chuột nhắt trắng đực được chia ngẫu nhiên thành 8 lô, mỗi lô 10 con

- Lô 1 (lô chứng): uống NaCMC 0,8% liều 0,1ml/10g chuột

- Lô 2 (lô chứng dương) uống codein liều 60 mg/kg chuột

- Lô 3: uống chế phẩm thử BV1 liều 260 mg/kg

- Lô 4: uống chế phẩm thử BV1 liều 520 mg/kg

- Lô 5: uống chế phẩm thử BV1 liều 1040 mg/kg

- Lô 6: uống chế phẩm thử BV2 liều 290 mg/kg

- Lô 7: uống chế phẩm thử BV2 liều 580 mg/kg

- Lô 8: uống chế phẩm thử BV2 liều 1160 mg/kg

Chuột được uống dung môi và chế phẩm thử liên tục trong 3 ngày, trước khi uống chế phẩm thử chuột được nhịn ăn 1,5 giờ Ngày thứ 3 chuột được bắt đầu đo đau sau 1,5 giờ sau khi uống chế phẩm Đặt chuột lên mâm nóng (luôn duy trì ở nhiệt độ 56oC bằng

hệ thống ổn nhiệt) Tính thời gian từ lúc đặt chuột vào mâm nóng đến khi chuột có phản

xạ liếm chân sau hoặc nhảy lên Quy trình nghiên cứu tác dụng giảm đau mâm nóng của

các mẫu thử được trình bày ở Hình 2.5

Hình 2.5 Quy trình đánh giá tác dụng giảm đau trung ương

Đánh giá tác dụng chống viêm cấp

 Thiết kế thí nghiệm

Áp dụng mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan của Winter và cộng sự

[90] Chuột cống trắng giống đực, cân nặng 120  20 gam được chia ngẫu nhiên thành

6 lô, mỗi lô 8 con

- Lô 1 (lô chứng): uống NaCMC 0,8% 1 ml/100g chuột

- Lô 2 (lô chứng dương): uống indomethacin liều 10 mg/kg chuột

- Lô 3: uống chế phẩm thử BV1 liều 150 mg/kg

- Lô 4: uống chế phẩm thử BV1 liều 300 mg/kg

- Lô 5: uống chế phẩm thử BV2 liều 170 mg/kg

- Lô 6: uống chế phẩm thử BV2 liều 340 mg/kg

Chuột được uống chế phẩm thử 4 ngày liên tục trước khi gây viêm Ngày thứ 5, sau khi uống chế phẩm thử 1 giờ, gây viêm bằng cách tiêm carrageenan 1% (pha trong nước muối sinh lý) 0,1 ml/chuột vào gan bàn chân sau, bên phải của chuột Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng máy đo độ phù vào các thời điểm: trước khi gây viêm (V0); sau khi gây viêm 1 giờ (V1), 3 giờ (V3), 5 giờ (V5) Quy trình nghiên cứu tác

dụng chống viêm cấp của các mẫu thử được trình bày ở Hình 2.6

Hình 2.6 Quy trình đánh giá tác dụng chống viêm cấp

 Thống số đánh giá

- Thể tích bàn chân phải sau của từng chuột

- Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức:

∆V (%) = Vt − Vo

Vo x 100 Trong đó: V0 là thể tích chân chuột trước khi gây viêm Vt là thể tích chân chuột tại các thời điểm t sau khi gây viêm

 Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%):

I (%) = ∆Vc − ∆Vt

∆V c x 100 Trong đó: ∆Vc: độ tăng thể tích chân chuột trung bình ở lô đối chứng

∆Vt: độ tăng thể tích chân chuột trung bình ở lô uống chế phẩm thử

- Lô 1 (lô chứng): uống NaCMC 0,8%, thể tích 1 ml/100 g chuột

- Lô 2 (lô chứng dương): uống prednisolon liều 5mg/kg

- Lô 3: uống chế phẩm thử BV1 liều 150 mg/kg

- Lô 4: uống chế phẩm thử BV1 liều 300 mg/kg

- Lô 5: uống chế phẩm thử BV2 liều 170 mg/kg

- Lô 6: uống chế phẩm thử BV2 liều 340 mg/kg

Ngày thứ nhất gây mê chuột băng ether, sau đó gây u hạt bằng cách cấy viên bông khối lượng 20±2 mg đã tiệt trùng được tẩm carrageenan 1% (sấy 60oC trong 18 giờ) vào

da lưng của mỗi chuột Sau khi cấy bông, các chuột được uống nước dung môi hoặc thuốc thử liên tục trong 7 ngày Ngày thứ 8 sau khi cho chuột uống thuốc lần cuối 5 giờ, gây mê chuột bằng ether, bóc tách khối u hạt, cân tươi, sấy khô ở nhiệt độ 60oC trong

18 giờ Cân khối lượng u hạt sau khi đã được sấy khô Quy trình thí nghiệm đánh giá

tác dụng chống viêm mạn của các mẫu thử được thể hiện ở Hình 2.7

Hình 2.7 Quy trình đánh giá tác dụng chống viêm mạn

 Thông số đánh giá

- Khối lượng tăng u hạt tươi/khô sau khi mổ của từng chuột

m = Mt – Mo Trong đó

+ m : khối lượng tăng u hạt tươi/khô

+ Mt : khối lượng ổ u hạt tươi/khô

+ Mo : khối lượng bông cấy ban đầu

2.4.3 Đánh giá độc tính cấp

Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 trên chuột nhắt trắng theo đường uống theo hướng dẫn của Bộ Y tế đối với các thuốc đông y, thuốc từ dược liệu [2], hướng dẫn của WHO [92] kết hợp với hướng dẫn của OECD đối với các hóa dược [71], [72] và các tài liệu chuyên môn khác [10]

 Thiết kế thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng, giống cái được dùng cho thử nghiệm độc tính cấp Cho động vật nhịn ăn 3 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống theo nhu cầu Kiểm tra cân nặng trước

và sau khi thử nghiệm

- Thử nghiệm thăm dò: sử dụng lượng chuột hạn chế, mỗi nhóm 2-3 động vật nhằm lựa chọn mức liều thử cho thử nghiệm chính thức

- Thử nghiệm chính thức: động vật thí nghiệm được chia thành nhiều lô (không quá 10 lô), mỗi lô 10 động vật Thông thường, thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không gây chết động vật nào và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ động vật Bước nhảy liều được thiết kế với liều lớn kế tiếp gấp 1,25 liều nhỏ (hoặc liều nhỏ liền kề bằng 0,8 liều lớn)