Nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (ahpnd) trên tôm biển

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌCISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH

HỘI ĐỒNG KHOA HỌCISO 9001 : 2008

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH

CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG

ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus,

GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH

(AHPND) TRÊN TÔM BIỂN

Chủ nhiệm đề tài: ThS NGUYỄN THỊ TRÚC LINH

Chức danh: Giảng viên

Đơn vị: Khoa Nông nghiệp - Thủy sản

Trà Vinh, ngày tháng năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH

HỘI ĐỒNG KHOA HỌCISO 9001 : 2008

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG

ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus,

GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH

(AHPND) TRÊN TÔM BIỂN

Nguyễn Thị Trúc Linh

Trà Vinh, ngày tháng năm 2016

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2014 đến tháng 8/2015 với mục đích tìm ra

chủng vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mạnh nhất và

ứng dụng chúng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp cũng như hạn chế việc sử

dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản vì thế đề tài "nghiên cứu phân lập và

định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm biển"

được tiến hành Vi khuẩn lactic (LAB) được phân lập từ các nguồn khác nhau như:

(1) ruột tôm biển; (2) ruột cá rô phi (Oreochromis niloticus); (3) bùn và nước của

các ao nuôi tôm ở tỉnh Trà Vinh, và Sóc Trăng Các dòng vi khuẩn LAB được sànglọc bằng các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, và sinh hóa sau đó xác định tính đối kháng

với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng

thạch Thí nghiệm xác định khả năng kháng khuẩn bằng bacteriocin và khả năng

chịu đựng nồng độ muối của 5 chủng vi khuẩn kháng với Vibrio parahaemolyticus

cũng được tiến hành Kết quả phân lập từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi, bùn và nước

ao tôm biển ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng là như sau: 30 chủng vi khuẩn lactic ởTrà Vinh, và 25 chủng vi khuẩn lactic ở Sóc Trăng đã được phân lập Kết quả xác

định khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus như sau: trong tất cả các chủng LAB phân lập được có 02 chủng có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus rất yếu với đường kính vô trùng nhỏ hơn 11 mm Các chủng vi

khuẩn này không thể ứng dụng trong phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp 40 chủng vi

khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus nhưng vòng vô

trùng chỉ ở mức trung bình (++) từ 11-16mm 13 chủng vi khuẩn còn lại có vòng vôkhuẩn lớn (+++) từ lớn hơn 16 mm Trong 13 chủng vừa nêu có 2 chủng rp5.4.1 vàrp5.5.1 có vòng vô khuẩn lớn nhất tương ứng là 18,2 và 18 mm Nghiên cứu nàycho thấy dòng rp5.4.1 và rp5.5.1 có thể được sử dụng trong việc phòng bệnh hoại tửgan tụy cấp tính trên tôm biển Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của

bacteriocin với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của 5 chủng vi khuẩn lactic là do

vi khuẩn tiết acid lactic không phải tiết bacteriocin Các chủng vi khuẩn thí nghiệmđều phát triển ở độ mặn từ 0-25‰ nhưng phát triển tốt nhất ở độ mặn 5-15‰, vàphát triển chậm hơn ở độ mặn 25‰ Tuy nhiên ở chủng vi khuẩn lactic TV20 thìphát triển mạnh nhất ở độ mặn 25‰

MỤC LỤC

TÓM TẮT 3

DANH MỤC BẢNG BIỂU 6

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH 7

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 8

LỜI CẢM ƠN 9

PHẦN MỞ ĐẦU 10

1 Tính cấp thiết của đề tài 10

2 Tổng quan nghiên cứu 11

2.1 Tổng quan về tình hình nuôi tôm nước lợ 11

2.1.1 Trên thế giới 11

2.1.2 Ở Việt Nam 11

2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi 12

2.2.1 Bệnh do virus trên động vật thủy sản 12

2.2.2 Bệnh do vi khuẩn trên tôm 13

2.3 Sơ lược về vi khuẩn lactic 23

2.4 Ứng dụng vi sinh vật hửu ích trong nuôi trồng thuỷ sản 28

3 Mục tiêu nghiên cứu 30

4 Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu 30

4.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 30

4.2 Quy mô nghiên cứu 30

4.3 Phương pháp nghiên cứu 30

4.3.1 Dụng cụ và hóa chất 30

4.3.2 Phương pháp nghiên cứu 31

4.3.2.1 Thu mẫu và bảo quản mẫu 31

4.3.2.2 Tiến hành thí nghiệm 32

4.4 Phương pháp xử lý số liệu 37

PHẦN NỘI DUNG 38

Chương 1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn lactic từ các nguồn khác nhau và các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa 38

1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác nhau 38

1.2 Sàng lọc các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 39

Chương 2: Tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus trong điều kiện in vitro 40

2.1 Kết quả xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus trong điều kiện in vitro 40

2.2 Kết quả xác định khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahemolyticus của vi khuẩn lactic bằng bacteriocin 42

2.3 Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng lên mật số của vi khuẩn lactic 43

Chương 3 Kết quả định danh dòng vi khuẩn phân lập được có khả năng kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 45

3.1 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s 46

3.2 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.4.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s 46

3.3 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.2.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s 47

3.4 Kết quả định danh vi khuẩn lactic RP5.2.1 và T5.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16s 48

PHẦN KẾT LUẬN 50

1 Kết luận 50

2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.2.1 Các loại virus chính gây bệnh trên tôm biển 14

Bảng 1 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic 40

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 2.2.2a Dấu hiệu tôm bị bệnh hoại tử gan tuỵ 18

Hình 2.2.2b Hình dạng vi khuẩn V Parahaemolyticus và thể thực 18khuẩn

Hình 2.2.2c Hình mô bệnh học của tôm khoẻ 19Hình 2.2.2 d Hình mô bệnh học của tôm bệnh hoại tử gan tụy 19

Hình 2 2.2 e Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 20Hình 1: Quy trình phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, cá rô phi, 32bùn đáy và nước ao nuôi tôm biển

Hình 2: Quy trình xác định khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn 34

lactic với V parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng

Hình 6 khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với V. 41

parahaemolyticus tại Sóc Trăng

Hình 7 Kết quả xác định khả năng ức chế vi khuẩn V. 42

parahaemolyticus bằng bacteriocin

Hình 8 Kết quả thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng 43lên mật số của vi khuẩn lactic

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU, ĐƠN VỊ

ĐO LƯỜNG, TỪ NGẮN HOẶC THUẬT NGỮ

AHPNS Acute Hepatapancreatic Necrosis Syndrome

CFU Colony Forming Unit

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

EMS Early Mortality Syndrome

FAO Food and Agriculture Organization

GAV Gill Associated Virus

OIE Office International des Epizooties

PCR Polymerase Chain Reaction

PL Post Larval

TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar

TSA Tryptone Casein Soy Agar

TSB Tripticase Soya Broth

TSV Taura Syndrome Virus

V P : Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

WSSV White Spot Syndrome Virus

YHV Yellow Head Virus

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em đồng nghiệp, Ban Lãnh đạo KhoaNông nghiêp Thủy sản, Phòng Khoa học Công nghệ và Ban Lãnh đạo Trường Đạihọc Trà Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và cấp kinh phí cho tôi thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS TS Trương QuốcPhú đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, quan tâm, động viên và tạo điều kiện thuậnlợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn đến PGS TS Đặng Thị Hoàng Oanh, Khoa Thủy sản,trường Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận về cơ sở vật chất và dành rất nhiềuthời gian để giúp tôi hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảm ơn các anh chị em tại Bộ môn Bệnh học Khoa Thủy sảnTrường Đại học Cần Thơ đã đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thờigian nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, những người thân,bạn bè và các em sinh viên lớp DA11TS đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trongsuốt thời gian nghiên cứu tại trường Đại học Trà Vinh

Xin chân thành cảm ơn!

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việc nuôi tôm sú, tôm thẻ ở Đồng Bằng sông Cửu Long trong những năm trướcđây đã đem lại nguồn lợi nhuận đáng kể và góp phần vào việc phát triển nền kinh tếcho cả nước Nhưng trong khoảng thời gian gần đây (2010 -2012), nghề nuôi tômđang đối mặt với rất nhiều thách thức, dịch bệnh, môi trường ô nhiễm và hiện tượngtôm chết hàng loạt đã gây ra thiệt hại kinh tế hơn 800 tỷ đồng Trong đó đáng quantâm nhất là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic NecrosisSyndrome - AHPNS) (Flegel, 2012) hay còn gọi là hội chứng chết sớm (early

mortality syndrome – EMS) (Lightner et al., 2012) Hội chứng hoại tử gan tụy cấp

tính xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009, ở Việt Nam vào năm 2010 rồi đến Thái

Lan và Mã Lai vào năm 2011 (Lightner et al., 2012; Flegel, 2012) Bệnh này xuất

hiện và gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở các Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh,Bến Tre và Kiên Giang Bệnh xuất hiện ở tôm sú và tôm thẻ khoảng 10 - 45 ngàysau khi thả giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% ở những ao nhiễm nặng Tác nhân

gây ra hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Lightner et al., 2012) mang thể thực khuẩn (Bateriophage) (Loc Tran, et al, 2012).

Hiện nay có nhiều biện pháp được đề xuất để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp như: dùng hóa chất diệt

khuẩn, sử dụng kháng sinh, áp dụng biện pháp sinh học, Tuy nhiên, biện pháp sửdụng hóa chất, kháng sinh thì hiệu quả không cao, dễ gây ra nguy cơ phát sinh nhiềuloài vi khuẩn gây bệnh kháng với kháng sinh Thêm vào đó, sự tồn dư thuốc trongthực phẩm cũng là chỉ tiêu quan trọng trong kiểm định nhập khẩu sản phẩm nôngnghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới Vì thế, cách tốt nhất là sử dụng biện pháppháp sinh học, dùng vi khuẩn có lợi có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh.Biện pháp này không những có thể kiểm soát được mật độ vi khuẩn gây bệnh màcòn đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và có lợi cho môi trường do chỉ sử dụng cácloài vi khuẩn hữu ích

Vi khuẩn lactic đã được ứng dụng rộng rãi và ngày càng phổ biến trong việc sảnxuất chế phẩm sinh học, bổ sung trong thức ăn động vật thủy sản, thức ăn chăn nuôicũng như việc bón vào ao nuôi để ức chế các loài vi khuẩn gây bệnh cho động vậtthủy sản Trong nghiên cứu về các loài vi khuẩn hữu ích thì có một số dòng vi

khuẩn tiết ra chất ức chế đề kháng lại với vi khuẩn khác như Lactobacillus sp kháng lại vi khuẩn Vibrio sp (Trịnh Hùng Cường, 2011); Lactobacillus suntoryeus LII1 có khả năng kháng mạnh đối với Escherichia coli và Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu và ctv, 2010) Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh ra acid hữu

cơ, chúng ức chế vi khuẩn gây bệnh do sự tác động lên tế bào chất của vi khuẩn, ảnh

hưởng đến chức năng bảo vệ của màng tế bào (Fooks et al., 1999; Jay, 2000;

Gerald, 1999; Kuipers et al., 2000) Kishinouye (1996) đã sử dụng vi khuẩn lactic

để phòng bệnh trong ương tôm Gân (Penaeus latisulcatus) Ngô Văn Hai et al., (2009) đã sử dụng vi khuẩn lactic để kháng lại vi khuẩn Photobacterium damselae

subsp piscicida trong nuôi cá bơn (Solea senegalensis) Các nghiên cứu vừa nêu đã

chỉ ra rằng dòng vi khuẩn lactic có khả năng tiết ra chất ức chế vi khuẩn gây bệnh.Việc nghiên cứu khả năng phòng trị bệnh của các chủng vi khuẩn là rất khả thi vàđặc biệt là việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại chế phẩm sinh học Chúng phân chiathành các loại như chế phẩm phân hủy chất hữu cơ, kiềm hãm, và tiêu diệt các dòng

vi khuẩn gây hại Trên thực tế, người nuôi đã sử dụng nhiều loại chế phẩm sinh họckhác nhau trong quá trình nuôi tôm, nhưng bệnh hoại tử gan tụy vẫn diễn ra và gâythiệt hại to lớn về kinh tế Thế nhưng, vẫn chưa có công bố nào về việc nghiên cứuchế phẩm sinh học trong phòng bệnh hoại tử gan tụy trên tôm biển Do đó, để giảiquyết vấn đề cấp bách trong việc phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cũng như góp phầngiảm thiểu ô nhiễm môi trường và nâng cao chất lượng tôm biển trên thị trường thế

giới Việc "nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả

năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp

tính (AHPND) trên tôm biển" là việc làm cần thiết.

2 Tổng quan nghiên cứu

2.1 Tổng quan tình hình nuôi tôm nước lợ

2.1.1 Trên thế giới

Hiện nay, có rất nhiều mô hình và đối tượng nuôi tôm nước lợ trên thế giớinhư tôm hùm, tôm thẻ, tôm sú,… Trong đó 2 loài tôm được nuôi phổ biến nhất đó

là tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)

(weidner and Rosenberry, 1992) Theo thống kê của FAO (2011) trong năm 2010tổng sản lượng thủy sản thế giới đạt đến 148,5 triệu tấn Sản lượng khai thác và nuôitrồng thủy sản toàn cầu có thể đạt kỷ lục mới 160 triệu tấn trong năm 2013, so với

157 triệu tấn của năm 2012 trong khi xuất khẩu thủy sản sẽ đạt 136 tỉ USD, nuôitrồng chiếm 59,9 triệu tấn, ước tính tăng khoảng 25 triệu tấn so với năm 2001.Trong đó, sản lượng cá nước ngọt chiếm 56,4% (33,7 triệu tấn), nhuyễn thể chiếm23,6% (14,2 triệu tấn), giáp xác chiếm 9,6% (5,7 triệu tấn), cá nước lợ chiếm 6,0%(3,6 triệu tấn), cá nước mặn chiếm 3,1% (1,8 triệu tấn) và những động vật thủy sảnkhác chiếm 1.4 % (814 300 tấn)

2.1.2 Ở Việt Nam

Đồng bằng Sông Cửu long là vùng nuôi tôm trọng điểm tại Việt Nam, baogồm các tỉnh: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Bến Tre, Trà Vinh,… với hai đốitượng nuôi chính là tôm sú và tôm thẻ Tổng diện tích nuôi trồng thủy sản ở

ĐBSCL với diện tích khoảng 1.366.430 ha, trong đó nuôi nước lợ mặn là 886.249

ha (chiếm 89% cả nước) Diện tích nuôi của vùng tăng từ 527.398 ha năm 2011 lên746.373 ha năm 2008, đạt tốc độ tăng trưởng bình quân 5,09%/năm (Viện kinh tế

và quy hoạch thuỷ sản, 2009)

Theo Tổng cục Thuỷ sản (2013) trong năm 2012, toàn quốc có 30 tỉnh thànhnuôi tôm nước lợ diện tích trên 657.523 ha tăng 0,2% so với năm 2011 nhưng doảnh hưởng của dịch bệnh đã khiến sản lượng trong năm giảm từ 495.657 tấn chỉ còn476.424 tấn Trong đó, tôm sú chiếm 94,1% tổng diện tích và 62,7% sản lượng tômnuôi trong cả nước; thẻ chân trắng nuôi chiếm 5,9% diện tích với sản lượng chiếm27,3% Khu vực ĐBSCL vẫn là vùng nuôi tôm nước lợ chủ lực của cả nước vớidiện tích 595.723 ha với sản lượng 358.477 tấn chiếm 90,61% diện tích, 75,2% sảnlượng nuôi tôm cả nước) Trong đó diện tích nuôi tôm sú là 579.997 ha, sản lượng280.647 tấn (chiếm 93,6 % diện tích, 94% sản lượng tôm sú cả nước) và diện tíchnuôi tôm chân trắng là 15.727 ha, sản lượng 77.830 tấn (chiếm 41,2% diện tích,42% sản lượng tôm chân trắng nuôi cả nước) tập trung ở một số tỉnh trọng điểm như

Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng và Bến Tre (Tổng cục Thủy sản, 2013)

2.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi

2.2.1 Bệnh do virus trên động vật thuỷ sản

Theo Fulks và Main, 1992: Virus là một trong những tác nhân gây bệnhnghiêm trọng cho tôm Hiện nay trên thế giới đã phát hiện hơn 20 loài virut gâybệnh trên tôm biển trong đó có khoảng 6 loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến việcnuôi tôm biển trong đó có các bệnh truyền nhiễm như WSSV (white spot syndromevirus), YHV (Yellow Head virus), MBV (Monodon Baculo virus), IHHNV(Infectious hyperdermal and hematopoetic virus), TSV (Taura syndrome virus), vàIMNV (Infectious Myonecrosis virus) Các loại bệnh này đã gây tỉ lệ chết rất lớn.Trong các bệnh do virus gây ra thì bệnh WSSV (white spot syndrome virus) đãgây tổn thất lớn về kinh tế hơn bất cứ dịch bệnh nào trước đó với ước tính thiệt hạikhoảng 30 tỷ USD Bệnh xuất hiện mọi lứa tuổi và cảm nhiễm trên rất nhiều đốitượng nuôi giáp xác khác nhau (FAO, 2005)

Trong các bệnh do virus gây ra trên tôm biển, MBV (Monodon Baculo virus)cũng gây thiệt hại không kém MBV đã được xác định là một bệnh phổ biến đối vớitôm sú và có phân vùng địa lý khá rộng Trong đó, tôm sú thường bị nhiễm nặng và

phổ biến nhất (Đỗ Thị Hoà và ctv., 2004) Bệnh có khả năng gây chết cao đối với

các giai đoạn ấu trùng (zoea và mysis) và giai đoạn đầu của postlarval nhưng lại ítnguy hiểm hơn ở giai đoạn trưởng thành Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBVcòn tuỳ thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (BùiQuang Tề, 2003; Walker and Mohan, 2009) Ngoài ra, nhiều nhà nghiên cứu cònchứng minh rằng MBV còn làm cho tôm yếu đi, sức đề kháng kém và dễ dàng mẫn

cảm với các mầm bệnh nguy hiểm khác như Vibrio, HPV, IHHNV và WSSV, gây

tỷ lệ chết cao trong quần đàn (Đỗ Thị Hoà và ctv., 2004).

Một bệnh do virus gây ra gây thiệt hại không kém đó là bệnh TSV (Taurasyndrome virut) Thiệt hại do TSV gây ra tại Mỹ ước tính từ 1-2 tỷ USD vào năm

2001, và vẫn chưa có thống kê chính xác về hậu quả của loại virus này gây ra tạikhu vực châu Á đến thời điểm này (Walker and Mohan, 2008) Bên cạnh TSV thìbệnh hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV) cũng gây ảnh hưởng không nhỏ đến sảnlượng tôm thẻ chân trắng trên thế giới, bệnh gây ra ”Hội chứng dị hình còi cọc” vàước tính thiệt hại khoảng 10-15% của mỗi vụ nuôi Tuy nhiên IHHNV (Infectioushyperdermal and hematopoetic virus) lại ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng cũng nhưkhả năng sinh sản của tôm sú (Walker and Mohan, 2008)

2.2.2 Bệnh do vi khuẩn trên tôm

Tác nhân gây bệnh nguy hiểm đe dọa đến nghề nuôi tôm ở một số quốc gia

trên thế giới là vi khuẩn, chủ yếu là các loài thuộc nhóm Vibrio (Lightner, 1996; Flegel, 2012) Vibriosis trên tôm thường do các tác nhân chính: Vibrio anguillarum,

V alginolyticus, V parahaemolyticus, V harveyi, V penaeicida (Lightner, 1996)

trong đó V harveyi được xem là loài gây bệnh chủ yếu Các chủng V harveyi phát

sáng được báo cáo gây thiệt hại trầm trọng trên tôm nuôi ở Philiphine, Australia,Mexico (Rao, 2007) Vibriosis được ghi nhận gây thiệt hại mỗi năm khoảng 30.800

tấn tôm he (Marsupenaeus japonicus) với giá trị thiệt hại xấp xỉ 85 triệu USD

(Prayitno and Latchford, 1995) Theo Saulnier et al (2000) bệnh do vi khuẩn Vibrio

thường xảy ra trong tháng nuôi đầu tiên khi tôm bị ảnh hưởng bởi một số thay đổi từmôi trường nuôi (pH, nhiệt độ, độ mặn, ) liên quan đến một số bệnh như nhiễmkhuẩn cục bộ, nhiễm khuẩn trên gan tụy (Lighner, 1996), hoại tử đuôi (Tailnecrosis), đỏ thân (Red disease), hội chứng mềm vỏ (Losse shell syndrome),…

(Jayaree et al., 2006).

- Sơ lược về vi khuẩn Vibrio sp gây bệnh trên động vật thủy sản.

Đặc điểm chung của các vi khuẩn Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi

cong, kích thước 0,3-0,5 µm x 1,4-2,6 µm, không hình thành bào tử và chuyển độngnhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao mảnh, tất cả chúng đều yếm khí tùy tiện vàhầu hết là oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose Thiosulphate citrate

bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của Vibrio Hầu hết các loài đều phát

triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả

các loài Vibrio, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl, chúng

không sinh H2S, mẫn cảm với Vibriostat 2.4 diamino-6,7 diisopropyl pteridinephosphat (O/129) Cơ bản chúng sống trong môi trường nước biển và cửa sông(vùng nước lợ) (Nguyễn Thị Minh Trang, 2013)

Tôm có sự thay đổi màu sắc và chuyển sang màu hồng nhợt nhạt khi cảm

nhiễm vi khuẩn Vibrio gây bệnh phát sáng (Bùi Quang tề, 2006).

Đặng Thị Hoàng Oanh et al (2006) trong nghiên cứu về xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) thu được kết quả kháng sinh đồ của 26

trong số 27 dòng vi khuẩn phát sáng được thử với 6 loại thuốc kháng sinh thườngdùng trong nuôi thủy sản cho thấy 100% số dòng vi khuẩn thử nghiệm kháng vớiampicilin Các dòng vi khuẩn phát sáng thử nghiệm mẫn cảm với chloramphenicol,norfloxacin và nitrofurantoin hơn so với tetracycline vàtrimethoprim/sulfamethoxazole Phần lớn các dòng vi khuẩn thử nghiệm chỉ khángvới một loại kháng sinh (77%) Có khoảng 15% dòng vi khuẩn kháng với 2 loạikháng sinh và 4% kháng với 4 loại thuốc được thử Có 4% số dòng vi khuẩn khángvới cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm

Các chủng vi khuẩn phát sáng có những đặc điểm hình thái điển hình của vi

khuẩn giống Vibrio Các đặc điểm đó là di động, cho phản ứng oxidase và catalase

dương tính, là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng lên men glucose trong cảhai điều kiện hiếu khí và kị khí, tạo nitrit từ nitrat, mọc trên môi trường chọn lọc

cho nhóm Vibrio (Thiosulfate-Citrate-Bile salts-Sucrose TCBS) và nhất là nhạy với

hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129,150 μg) là hợp chất giúpg) là hợp chất giúp

phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas Các chủng vi khuẩn phát sáng đều phát

triển tốt ở môi trường có 3% NaCl, sinh indole và có khả năng tạo axít từ mannitol

và trehalose (West et al.1986).

Bảng 2.2.2a Một số bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm

S Tên bệnh Giai đoạn tôm Vi khuẩn gây bệnh Tác hại

1 Bệnh phát sáng ấu trùng, giống V.parahaemolyticus Gây chết hàng

2 Bệnh đỏ dọc thân Ấu trùng, giống V.alginolyticus Gây chết rải rác

3 Bệnh đỏ thân Tôm thịt Vibrio spp. Gây chết rải rác Bệnh vỏ hay ăn mòn ở các giai đoạn của Vibrio spp., chết rải rác,

Chen (1989) phân lập được trong gan tụy tôm sú có 18 loài Vibrio trong đó: Vibrio harveyi chiếm 26,9% và V splendidus chiếm khoảng 0,5% Hai loại này

thường làm tôm bị chết nhiều, có lúc tới 100%, chúng có thể kháng lại 24 loại thuốc

kháng sinh (Baticados et al., 1991) Chỉ có một loại kháng sinh kiềm chế sự phát triển của hai loại Vibrio này.

+ Các bệnh Vibriosis trên tôm he (Marsupenaeus japonicus)

Trong quá trình nuôi, việc quản lý môi trường ao nuôi là rất quan trọng Khiđiều kiện môi trường ao nuôi bất lợi thì một số loài vi khuẩn cơ hội, đặc biệt là vi

khuẩn Vibrio sẽ tồn tại trong môi trường nước ao nuôi, xâm nhập vào cơ thể tôm và

có khả năng gây ra bệnh Nếu môi trường ao nuôi tiếp tục xấu đi thì mật độ vi khuẩnngày càng gia tăng, chúng có thể gây ra chết tôm trong thời gian ngắn hoặc gâybệnh mãn tính trên tôm Các bệnh thường gặp trên tôm khi môi trường ao nuôi bịnhiễm bẩn như là bệnh phân trắng, bệnh phát sáng, đen mang,… Bệnh phân trắnghay còn gọi là “bệnh phân trắng, teo gan”, tôm bị bệnh thải ra phân trắng và gan tụy

bị teo hay mềm nhũng gây thiệt hại đáng kể cho người dân nuôi tôm (Nguyễn KhắcLâm, 2004) Bệnh phân trắng không lây lan thành dịch mà thường xảy ra ở một số

ao nuôi thâm canh, nuôi với mật độ cao, ít thay nước (Đặng Thị Hoàng Oanh và

ctv., 2008) Trong các nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh (2008) khi thu 220

mẫu tôm trong các ao có bệnh phân trắng ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Bến Tre từtháng 5/2005 đến tháng 5/2006 và phân tích bằng phương pháp mô bệnh học, chothấy có sự hiện diện của các mầm bệnh trong đó có ký sinh trùng, vi khuẩn và virus,các mầm bệnh này nhiễm trên các cơ quan gan tuỵ, mang, cơ quan lymphoid và ruộtgiữa

Bệnh phát sáng trên tôm nuôi thường xảy ra ở tất cả các giai đoạn (Đỗ Thị Hoà

và ctv., 2001) Vibrio gây bệnh phát sáng xâm nhập vào bể ương qua trứng tôm, tôm

mẹ, thức ăn…, bệnh phát triển mạnh trong những ao có hàm lượng chất hữu cơ cao,chất thải đáy ao tích tụ nhiều, và phát triển mạnh nhất ở độ mặn 30-35‰, bệnh xuấthiện khi pH 7,5-9, có thể xuất hiện khi mất tảo đột ngột hay do môi trường biến

động mạnh (Harris et al., 1996).

+ Nghiên cứu Vibriosis trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vanamei)

Tôm thẻ chân trắng là một trong những đối tượng nhạy cảm với mầm bệnh

Vibriosis ở một số quốc gia trên thế giới Hiện tại, đã có nhiều nghiên cứu thí

nghiệm về độc lực của các chủng Vibrio trên đối tượng này bằng một số phương

pháp khác nhau đã được ghi nhận như cảm nhiễm bằng cách ngâm ấu trùng tôm thẻ

chân trắng với V harveyi và V campbellii (Robertson et al., 1998; Soto-Rodríguez

et al., 2006) và phương pháp tiêm trên tôm trưởng thành (Wanget al., 2005) Tôm

được gây cảm nhiễm trong các thí nghiệm này đều xảy ra hiện tượng chết cao (>50%) trong thời gian 48 – 96 giờ tương ứng với mật độ vi khuẩn

105 CFU/ml đối với phương pháp ngâm và 104 CFU/ml đối với phương pháp tiêm.Hầu như không ghi nhận được bất kì dấu hiệu lâm sàng nào trên tôm cảm nhiễmtrong các thí nghiệm nói trên nhưng khi tiến hành phân tích mô bệnh học trên cácmẫu thì phát hiện được một số biến đổi mô học đặc trưng trên một số cơ quan gan

tụy, mang và cơ quan lymphoid Tôm nuôi nhiễm Vibriosis nói chung thường biểu

hiện một số đặc điểm mô học đặc trưng như hiện tượng nhiễm khuẩn cục bộ trêncác cơ quan, sau đó là sự tập trung của tế bào máu vây quanh các cụm vi khuẩn,kèm theo hiện tượng melamin hóa thường thấy trên cơ quan lymphoid, gan tụy,

mang, mô liên kết mang, hệ thống tiêu hóa, (Lightner, 1996; Robertson et al., 1998; Pitogo et al., 1990) Các đặc điểm bệnh học tương tự cũng được ghi nhận khi gây cảm nhiễm V harveyi lên tôm thẻ (Penaeus semisulcatus) với các mật độ vi khuẩn khác nhau (Mohajeri et al, 2011) và trong thí nghiệm cảm nhiễm của Jayasree et al., (2012) trên tôm sú với các chủng vi khuẩn phân lập được trên tôm bị

hội chứng mềm vỏ Bên cạnh đó, cũng ghi nhận được hiện tượng các tế bào máu

bao vây các cụm vi khuẩn trên cơ quan lymphoid (Nash et al., 1992) và hiện tượng

mất các không bào trên vùng gan tụy, làm ảnh hưởng đến khả năng dự trữ lipid và

glycogen của gan (Anderson et al., 1988; Mohajeri et al., 2011).

+ Sơ lược về bệnh hoại tử gan tụy trên tôm biển

Đặng Thị Hoàng Oanh et al (2012) vào đầu năm 2011, sự xuất hiện của hội

chứng hoại tử gan tụy cấp tính chưa rõ nguyên nhân đã gây thiệt hại nghiêm trọngđến sản lượng tôm nuôi cả nước nói chung và khu vực ĐBSCL nói riêng Tôm mắcphải hội chứng gan tụy cấp tính thường biểu hiện một số dấu hiệu lâm sàng như gantụy teo, dai; vỏ mềm, ruột rỗng; đôi khi xuất hiện những đốm đen có thể nhìn thấybằng mắt thường; tôm thường chết đáy và chết cấp tính trong khoảng 2 – 4 ngày saukhi xuất hiện các dấu hiệu trên

Theo Lightner., et al (2013) bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm biển lần đầu tiên

được phát hiện vào năm 2009 được gọi là “Hội chứng tôm chết sớm-EMS (EarlyMortality Syndrome)” Năm 2011, một tên mới được đặt dựa trên mô tả bệnh tíchcấp tính, gọi là “hội chứng hoại tử cấp” (AHPNS -Acute Hepatopancreatic NecrosisSyndrome) Năm 2013, tên gọi “bệnh Hoại tử Gan tuỵ Cấp” (AHPND - AcuteHepatopancreatic Necrosis Disease) được dùng khi tác nhân gây bệnh được xácđịnh) Bệnh gây tác hại lớn trên tôm sú, thẻ chân trắng ở các trang trại tôm ĐôngNam Á, Thái Bình Dương và phía Tây Mê Hi Cô Bệnh AHPND ban đầu đượcphân loại là bệnh không rõ nguyên nhân, bởi vì không có mầm bệnh chuyên biệtnào được xác nhận Tuy nhiên kể từ đầu năm 2013, Phòng nghiên cứu Bệnh họcThuỷ sản Trường Đại học Arizona (UAZ-APL) đã phân lập được dòng vi khuẩn

thuần của mầm bệnh AHPND là Vibrio Parahaemolyticus phân lập từ cả hai nước

Việt Nam và Mê Hi Cô đều cho cùng tác nhân gây bệnh Dòng vi khuẩn này thuộc

nhánh của vi khuẩn Vibrio harveyi, gần nhất với loài vi khuẩn V parahaemolyticus.

Theo thống kê của Tổng cục Thủy sản (2013) trong năm 2012, cả nước cókhoảng 100.776 ha diện tích tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh, trong đó tôm sú

là 91.174 ha gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi và ảnh hưởng đến sảnlượng, giá trị xuất khẩu Nguyên nhân chủ yếu được xác định là do dịch bệnh hoại

tử gan tụy và bệnh đốm trắng gây ra kèm theo một số nguyên nhân như thời tiếtbiến đổi bất thường, chất lượng môi trường nuôi chưa tốt; nuôi tôm không theo lịchthời vụ khuyến cáo; sử dụng hóa chất, thuốc thú y, chế phẩm sinh học còn tùy tiện,chưa được kiểm soát chặt chẽ; chất lượng con giống chưa bảo đảm, Các địa

phương bị dịch bệnh nhiều nhất là Sóc Trăng thiệt hại 23.371,5 ha (56,6% diện tíchthả nuôi); Bạc Liêu 16.919 ha (50% diện tích thả nuôi); Bến Tre thiệt hại 2.237 hanuôi thâm canh, bán thâm canh (29,06% diện tích thả nuôi); Trà Vinh thiệt hại12.200 ha (49,3% diện tích thả nuôi); Cà Mau diện tích tôm nuôi công nghiệp bịbệnh 958,58 ha, tăng trên 420 ha so với năm 2011 Riêng Tiền Giang, diện tích tômnuôi thâm canh và bán thâm canh bị thiệt hại là 922,88 ha, chiếm 30,63% tổng diệntích thả nuôi tôm

Đầu vụ nuôi năm 2013, tình hình dịch bệnh vẫn tiếp tục diễn biến và gây thiệthại đến diện tích nuôi tôm ở một số tỉnh ĐBSCL Theo Sở Nông nghiệp và Pháttriển Nông thôn tỉnh Trà Vinh, tính đến tháng 3, trên địa bàn tỉnh đã có gần 400 hộnuôi tôm tại các huyện Duyên Hải, Cầu Ngang và Trà Cú thả nuôi tôm thẻ chântrắng với gần 140.000 con, thì trong đó có gần một nửa trong số này đã bị thiệt hại

và chưa có dấu hiệu dừng lại Tình trạng tương tự cũng được ghi nhận ở một số aonuôi tôm sú thâm canh thuộc các huyện Đầm Dơi, Phú Tân, Cái Nước với thiệt hạitrên 116 ha trong số 2.740 ha diện tích tôm đang nuôi Trong 3 tháng đầu năm 2013,sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của tỉnh Cà Mau chỉ đạt 45.000 tấn, thấp hơn nhiều sovới cùng kỳ, báo hiệu một năm kinh tế thuỷ sản đang đứng trước nhiều khó khăn.Nguyên nhân tôm chết ở 2 tỉnh đã được xác định đa phần do nhiễm bệnh đốm trắng

và hoại tử gan tụy cấp làm cho tôm chết ở giai đoạn 25- 40 ngày tuổi, gây thiệt hạinặng, đặt ra nhiều thách thức cho nghề nuôi tôm trong năm

Lê Hữu Tài và ctv., 2011; Nguyễn Thị Hiền và ctv., 2011 còn cho biết nhiệt độ

và độ mặn cũng có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh và lây lan của AHPNS Ởnhững vùng nuôi có nhiệt độ và độ mặn càng cao thì khả năng nhiễm bệnh và tỷ lệ

của ống thận bị bong tróc Có sự tụ tập của tế bào máu và nhiễm khuẩn thứ cấp.

Bệnh AHPNS do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang thể thực khuẩn gây ra và chỉ lây nhiễm qua đường tiêu hóa (Loc Tran et al., 2013), thể hiện ở hình 2.2.2 a;

A:Tôm có màu sẫm B: Gan tuỵ teo C: gan tuỵ có màu sẫm, nhũn, ruột rỗng

Hình 2.2.2a Dấu hiệu tôm bị bệnh hoại tử gan tuỵ (Đặng T H Oanh, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ)

Hình vi khuẩn V Parahaemolyticus Thể thực khuẩn

( Nguồn Lightner, 2013)

Hình 2.2.2b Hình dạng vi khuẩn V Parahaemolyticus và thể thực khuẩn

Theo Trần Hữu Lộc và ctv, 2012 nghiên cứu ảnh hưởng của cá rô phi trong việc khống chế sự lây nhiễm bệnh AHPND lên tỉ lệ chết của tôm thẻ chân trắng (P.

vannamei) bởi dòng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) Trong nghiên

cứu này cho thấy kết quả sau 2 tuần tảo chlorella phát triển Sau đó cảm nhiễm vớidòng vi khuẩn gây bệnh AHPND Kết quả đem lại những tác dụng tích cực đểkhống chế sự bùng phát của bệnh AHPND

Lê Hồng Phước và ctv, 2012 đã nghiên cứu hội chứng hoại tử gan tụy gây

chết hàng loạt tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long Tôm có dấu hiệu hoại tử gantụy sớm nhất là 19 ngày, trung bình từ 2-2,5 tháng Mẫu tôm thu từ các ao không cóbiểu hiện bệnh lý, lúc thu mẫu cũng có tỷ lệ hoại tử 0-16% Khả năng hồi phục củatôm nuôi khi bị hoại tử gan tụy là không có

Theo Lê Hồng Phước và ctv (2012) thì dấu hiệu hoại tử gan tụy xuất hiện

sớm nhất ở ngày thứ 17 và muộn nhất vào ngày thứ 77 (nhiều nhất từ 20-45 ngày vàtập trung ở giai đoạn 19-31 ngày tuổi) Tất cả mẫu thu từ ao có tôm chết và được

ghi nhận có dấu hiệu hoại tử gan tụy đều phải thu hoạch sau khi phát hiện hoại tử

2-3 ngày và tôm bệnh không có khả năng hồi phục

Theo Chien, 2012 nghiên cứu các giải pháp môi trường nhằm ngăn ngừa và

quản lý dịch bệnh đối với Hội chứng hoại tử gan tụy do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus khi bị cảm nhiễm bởi một thể thực khuẩn sẽ tạo ra độc tố cực

mạnh Bên cạnh đó sự gia tăng và sinh sôi nhanh chóng của các mầm bệnh virustrong môi trường ương nuôi, sự tương tác của 2 điều kiện bất lợi: sức đề kháng củatôm yếu và môi trường nuôi xấu đi thường tạo điều kiện thuận lợi cho dịch bệnhbùng phát Quản lý môi trường tốt có thể làm giảm bớt áp lực bên ngoài, ngăn chặn

sự phát triển của mầm bệnh, tăng sức đề kháng giúp tôm chống lại sự xâm hại củamầm bệnh Để hạn chế dịch bệnh EMS nên sử dụng vi khuẩn có lợi, như sử dụng

dòng đặc biệt Subtilis sp., Pseudomonas sp., và Lactobacillus sp., để ngăn chặn sự phát triển của Vibrio sp., và cũng giảm hàm lượng nitơ trong nước, ngăn dịch EMS.

Nuôi kết hợp với rong biển (aquaponic) giúp cải thiện và ổn định chất lượng nước,

và thậm chí hợp chất sulfated polysarcharides trong rong biển giúp tăng sức đềkháng trong tôm

+ Đặc điểm mô bệnh học của bệnh hoại tử gan tụy

Lightner et al (2012) khi phân tích mô bệnh học đối với tôm sú, thẻ chân trắng

bị nhiểm AHPNS, đã mô tả chi tiết như sau: tổ chức gan tụy thoái hóa cấp tính, tếbào ống thận (R, B, F và E) mất chức năng, tế bào có nhân lớn bất thường, biểu bìcủa ống thận bị bong tróc, có sự tụ tập của tế bào máu và nhiễm khuẩn thứ cấp

Hình 2.2.2c Hình mô bệnh học của tôm khoẻ

Giai đoạn cấp tính Giai đoạn cuối

Hình 2.2.2d Hình mô bệnh học của tôm bệnh hoại tử gan tụy

Kết quả này cũng tương tự như mô tả của Prachumwat và ctv (2012) trên tôm

thẻ chân trắng ở Thái Lan

Theo Lê Hồng Phước và ctv (2012) đã chỉ ra kết quả phân tích mô bệnh học

ở Sóc Trăng với tiêu bản mô bệnh học nhuộm Hematoxylin và Eosin, tôm có hai dấu hiệu hoại tử

+ Các tế bào ống gan tụy của tôm bị thoái hoá hoàn toàn và bong tróc vàotrong lòng ống, không có những biến đổi bệnh lý đặc trưng trên tế bào gan tụy khiquan sát dưới kính hiển vi điện tử Các tế bào bị thoái hoá này có thể bị hiện tượng

tự hủy do các enzyme nội bào Có những trường hợp toàn bộ các tế bào hình thànhnên cấu trúc ống gan tụy bị mất hoàn toàn chỉ còn lại bộ khung là các tế bào nền

+ Gan tôm teo dai, sậm màu, cấu trúc ống gan hoàn toàn biến mất, số lượngcác tế bào gan tụy giảm chỉ còn lại vô số tế bào máu bao bọc sung quanh khối hoại

tử Bên trong khối hoại tử là các tế bào chết và vô số trực khuẩn Gram âm khi quansát tiêu bản nhuộm bằng Giemsa và bằng phương pháp nhuộm Gram Có hiện tượngmelanin hoá, viêm quanh các ống gan tụy với sự xuất hiện của vô số tế bào và sựhiện diện của trực khuẩn Gram âm trong vùng hoại tử Do đó trên lâm sàng đôi khithấy xuất hiện một số đốm đen có thể quan sát bằng mắt thường

+ Dấu hiệu bệnh lý:

Tôm khi bị bệnh hoại tử gan tụy thường có dấu hiệu bệnh lý như sau: dấuhiệu lâm sàng: tôm bỏ ăn, lờ đờ, tấp mé, màu sắc nhợt nhạt, vỏ mềm Khi giải phẩutôm quan sát thấy ruột tôm rỗng, gan tuỵ teo, nhạt màu Trên gan tụy có những đốmđen có thể quan sát bằng mắt thường Tỉ lệ chết cao sau 10 ngày thả giống (Eduardo

and Mohan, 2012; Lightner và ctv., 2012)

+ Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Họ: Vibrionaceae

Giống: Vibrio

Loài: Vibrio parahaemolyticus

Hình 2.2.2e Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

(nguồn Kozo Makino et al., 2003)

V parahaemolyticus là trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí và kị khí không bắt

buộc, di động bằng tiêm mao và có khả năng trượt trên bề mặt môi trường có độ

nhớt cao (McCarter, 1999) Nghiên cứu bộ gen của V parahaemolyticus đã xác định

được gen mã hoá hemolysin không bền nhiệt (TLH - thermolabile haemolysin) làgen đặc hiệu của loài, gen mã hoá hemolysin bền nhiệt (TDH – thermostable directhaemolysin) mã hoá protein TDH có tác dụng làm vở tế bào máu và gây tan huyết

(Iida et al., 1998; McCarthy et al., 1999) Vi khuẩn này còn có thể tiết ra protease

và phospholipase làm bất hoạt enzyme gây đông máu ở tôm (Lee et al., 1999).

V parahaemolyticus tồn tại phổ biến ở hệ sinh thái nước mặn và vùng cửa sông

trong đó có các ao nuôi, đặc biệt ở các khu vực Đông Nam Á (Wong et al., 2000).

Nó có thể tồn tại tự do trong môi trường nước và nền đáy, bám trên bề mặt ngoài vàxâm nhập vào bên trong cơ thể của các động vật phù du, cá và giáp xác (Kanekoand Colwell, 1973; Kaneko and Colwell ,1975) và phát triển tốt hơn so với các loài

vi khuẩn khác trong điều kiện nhiệt độ và độ mặn tương đối cao (Williams and

Larock, 1985) Theo Twedt et al (1969) V parahaemolyticus có thể phát triển trong

khoảng nhiệt độ dao động từ 22 – 420C với nhiệt đố tối ưu là 37oC, ngưỡng pH 5 –

11 và nồng độ muối 1 – 7% Khi nghiên cứu về sự tồn tại của loài vi khuẩn nàytrong các sản phẩm thủy hải sản đông lạnh khác nhau Vanderzant and Nickelson

(1972) cho biết V parahaemolyticus có thể tồn tại trong khoảng pH từ 5 – 10 và chỉ

vô hoạt ở nhiệt độ 80 – 1000C trong 15 phút

V parahaemolyticus có khả năng gây dịch bệnh trên người và động vật thủy

sản như tôm, cua, nhuyễn thể đặc biệt tôm là loài tương đối nhạy cảm với vi khuẩn

này trong tất cả các giai đoạn phát triển (Xie et al., 2005; Zulkifiet al., 2009; Lightner, 1996) Trên tôm, V parahaemolyticus thường được phân lập trong máu và gan tụy (Lighner, 1996; , Bruno et al., 1998; Sung et al., 2001) Các chủng V.

parahaemolyticus cùng với V harveyi, V vulnificus gây chết hàng loạt trên tôm

nuôi ở Thái Lan (Nash et al., 1992) và Philiphine (Lavilla – Pitogo et al., 1998) có

liên quan đến một số bệnh nhiễm khuẩn cục bộ và nhiễm khuẩn trên gan tụy trêntôm sú (Lightner, 1996)

Trong cuộc điều tra về các bệnh do Vibrio spp trên tôm sú nuôi ở vùng ven

biển Andhra Pradesh, Ấn Độ, bệnh đỏ thân và mềm vỏ gây chết với tỉ lệ cao được

xác định có liên quan đến vi khuẩn V Parahaemolyticus (Jayasree et al., 2006).

+ Các yếu tố thúc đẩy sự phát triển của Vibrio parahaemolyticus

Iraqi (1980) đã nghiên cứu acid Glutamic ở nồng độ 1,8% thúc đẫy sự phát

triển của Vibrio parahaemolyticus dòng thứ 12 Hơn nữa, Trehalose và mannital

cũng làm gia tăng sự phát triển của vi khuẩn ở nồng độ 0.1% Kết quả nghiên cứucòn chỉ ra rằng các yếu tố như K2PO4 (0,25%); KH2PO4 (0,015%); MgSO4.7H2O

(0,02%) với nồng độ muối là 2% và pH là 7.6 là thích hợp cho sự phát triển của vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus dòng 12.

+ Các nghiên cứu về độc lực của V parahaemolyticus

Các nghiên cứu về độc lực cũng như đặc điểm sinh học của loài vi khuẩn này

được thực hiện từ những năm 1990 Tedenci et al (1997) đã tiến hành gây cảm nhiễm chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập được từ tôm bị bệnh đỏ thân

gây nhiễm bằng cách tiêm trên tôm sú có trọng lượng 8 -12g với các nồng độ 103 –

106 CFU/g và theo dõi trong thời gian 7 ngày đã ghi nhận xuất hiện các dấu hiệubệnh lý Kết quả cảm nhiễm cho thấy có sự chuyển màu đỏ trên cá thể tôm đượccảm nhiễm tương tự như dấu hiệu của các mẫu tôm bị hội chứng đỏ thân thu trước

đó Đồng thời, thí nghiệm xác định được liều gây chết 50% (LD50) trong vòng 7ngày của chủng vi khuẩn này trên tôm sú là 104 – 105 CFU/g Dấu hiệu bệnh lýtương tự cũng được ghi nhận trong thí nghiệm cảm nhiễm tôm sú bằng phương pháp

ngâm với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập được từ tôm mắc hội chứng

đỏ thân ở vùng ven biển Andhra Pradesh, Ấn Độ của Jayasree et al., (2006), xác

định được liều gây chết 50% (LD50) trong 48 giờ của chủng vi khuẩn dùng trongcảm nhiễm là 4.0 x 104 CFU/ml Thông qua hai thí nghiệm trên đã chứng minh

được V parahaemolyticus là tác nhân gây nên hội chứng đỏ thân trên tôm sú.

Phương pháp ngâm cũng được Roque et al (1998) áp dụng trong thí nghiệm

gây cảm nhiễm của vi khuẩn này trên tôm thẻ chân trắng với các nghiệm thức khácnhau (1) tôm bị tổn thương, tiếp xúc với vi khuẩn, (2) tôm tiếp xúc với vi khuẩn, (3)tôm chỉ bị tổn thương, (4) tôm khoẻ Thí nghiệm được theo dõi trong 4 ngày chothấy tỉ lệ tôm chết cao nhất ở nghiệm thức tôm bị thương cho tiếp xúc với vi khuẩndao động từ 37 – 50%, điều này cho thấy vi khuẩn có khả năng gây bệnh trên tômthẻ chân trắng, đặc biệt khi tôm bị tổn thương hoặc bị sốc do các yếu tố môi trườngnuôi Tuy nhiên không ghi nhận được dấu hiệu bệnh lý nào của tôm cảm nhiễm đốivới vi khuẩn này

Theo nghiên cứu của Nguyễn Hồng Sơn (2013) về xác định khả năng lâynhiễm của hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm he bằng phương pháp cho

tôm khoẻ ăn mẫu tôm bệnh Thí nghiệm này được tiến hành trên tôm sú (Penaeus

monodon) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong 35 ngày Kết quả

cho thấy AHPNS không có lây nhiễm cho tôm khoẻ khi sử dụng mẫu tôm bệnh bảoquản trong điều kiện đông lạnh (-800C) Kết quả phân tích mô bệnh học cho thấy có11/405 mẫu có dấu hiệu tổn thương vùng gan tuỵ trên tôm sú và 16/324 mẫu tômthẻ Tuy nhiên, các dấu hiệu bệnh tích này không phải là dấu hiệu mô bệnh học đặctrưng của AHPNS Kết quả nhuộm Gram mẫu kính phếch trên gan tụy tôm cảmnhiễm có 49 mẫu gan tụy tôm sú và 43 mẫu tôm thẻ ở nghiệm thức cho ăn mẫu tômbệnh phát hiện vi khuẩn Gram âm tập trung xung quanh tế bào gan tụy nhưng số

lượng không nhiều Số mẫu còn lại không có hiện tượng nhiễm khuẩn Bên cạnh đó,

tỉ lệ tôm chết ở các nghiệm thức cho ăn mẫu bệnh phẩm cao hơn tỉ lệ tôm chết tạicác nghiệm thức cho ăn mẫu tôm khoẻ và thức ăn công nghiệp ở cả 3 độ mặn thínghiệm (10, 15, và 20 ‰).

2.3 Sơ lược về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic bao gồm một số giống: Carnobacterim, Enterococcus,

Lactpbacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella thuộc ngành Fermicute (Ercolini et al., 2001; Jay, 2000; Holzapfel et al.,

2001)

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương (Fooks et al., 1999) và lên

men hydrate cacbon khi có hoặc không có oxy và tạo ra sản phẩm cuối cùng là acidlactic (Jay, 2000) Nhóm vi khuẩn này còn sản xuất các hợp chất hữu cơ tạo ra mùithơm và hương vị cho các sản phẩm được lên men (Caplice và Fitzgerald, 1999)

Sự phân loại vi khuẩn lactic dựa vào trình tự rARN (Gevers et al., 2001; Holzapfel et al., 2001) Vi khuẩn lactic được phân lập đầu tiên trong sữa (Carr et

al., 2002; Metchnikoff, 1908; Sandine et al., 1972) và gần đây chúng được phân lập

từ các sản phẩm lên men như: thịt, các sản phẩm từ sữa, rau quả, nước uống và bánh

mì lên men (Aukrust and Blom, 1992; Caplice and Fitzgerald, 1999; Harris et al.,

1992; Gobbetti and Corsetti, 1997; Jay, 2000; Liu, 2003; Lonvaud-Funel, 2001;

* Vi khuẩn lactic và quá trình lên men acid lactic

Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria-LAB) đóng vai trò quan trọng trong quátrình lên men thực phẩm Sản phẩm chủ yếu mà chúng tạo ra trong quá trình lênmen carbohydrate (glucose và lactose) là acid lactic Một vài giống quan trọng như:

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Bifidobacterium và Carnobacterium (Abee et al., 1999).

Tùy thuộc vào sản phẩm của quá trình lên men mà người ta chia quá trình lênmen acid lactic thành hai loại: lên men acid lactic đồng hình và lên men acid lactid

dị hình Theo Abee et al (1999) thì hai quá trình này có những đặc điểm sau:

+ Lên men acid lactic đồng hình: nhờ hoạt động lên men của nhóm vi khuẩn

lactic đồng hình Chúng biến đổi đường thông qua quá trình đường phân và tạo rasản phẩm cuối cùng là acid lactic Quá trình lên men acid lactic đồng hình được cho

là có lợi về mặt năng lượng (ATP) cho vi khuẩn acid lactic vì chúng tạo ra được 2phân tử ATP và 2 phân tử acid lactic từ 1 phân tử đường được lên men Có rất nhiều

loài vi khuẩn acid lactic lên men đồng hình: Lactobacillus lactis ssp lactis,

Lactobacillus lactis ssp cremoris, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,…

Quá trình lên men lactic đồng hình: 1 Glucose → 2 acid lactic + 2 ATP

+ Lên men acid lactic dị hình: nhờ hoạt động lên men của vi khuẩn lactic dị

hình Trong trường hợp này chỉ tạo thành 1 phân tử acid lactic từ 1 phân tử glucoseđược lên men, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như: acid acetic, ethanol,

CO2 Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm Một số loài

LAB lên men acid lactic dị hình: Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides ssp cremoris, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum,…

Quá trình lên men acid lactic dị hình:

1 Glucose → 1 Acid lactic + 1 CO2 + 1 Ethanol + 1 ATP + Một số sản phẩm phụ

+ Thành phần kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn lactic

Tác động kháng lại vi sinh vật của vi khuẩn lactic chủ yếu là do acid lactic vàcác sản phẩm acid hữu cơ Chúng làm giảm pH của môi trường sinh sống của vi

sinh vật khác (Caplice và Fitzgerald, 1999; Kuipers et al., 2000) Ở pH thấp thì các

acid hữu cơ sẽ chuyển thành lipid hòa tan và khuếch tán qua màng tế bào chất(Gottschalk, 1988)

Nghiên cứu của Galindo (2004) cho thấy các loài vi khuẩn thuộc giống

Lactobacillus được phân lập từ dạ dày – ruột của một số loài cá nước ngọt có khả

năng ức chế mạnh một số loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở cá nước ngọt như: A.

hydrophila, E tarda 524362, Yersinia ruckerii và Staphylococcus aureus 169E.

Vi khuẩn lactic cũng sinh ra acetadehyde, H2O2, diacetyl, CO2, đường đa và

bacteriocins (Caplice và Fitzgerald; de Vuyst và Degee, 1999; Rodríguez et al.,

2003)

+ Thành phần kháng khuẩn sinh ra từ bacteriocin

Theo De Vuyst (1994) đã nghiên cứu bacteriocin là những protein hoặc phứchợp protein có hoạt tính kháng khuẩn Khác với hầu hết các kháng sinh dùng trong

y học, nó là các phân tử protein dễ bị phân hủy bởi enzyme protease trong hệ tiêuhóa người Chúng hoạt động chỉ cần một lượng nhỏ và không gây độc

Có nhiều loại bacteriocin được tạo ra bởi vi khuẩn acid lactic Parada et al.

(2007) đã tổng hợp nhiều kết quả phân loại bacteriocin bởi nhiều tác giả khác nhau

và cuối cùng đưa ra hệ thống phân loại bacteriocin thành ba nhóm chính:Lantibiotics, Non – Lantibiotics và những peptide lớn, có khối lượng phân tử lớn (>

30 kDa)

Lactobacillus plantarum là loài vi sinh vật hữu ích, hiện diện trong nước bọt

và đường tiêu hóa của người (Lonnermark et al., 2009), vi khuẩn này được sử dụng phổ biến trong việc lên men thực phẩm Lactobacillus plantarum NCDO 1193 sinh

ra từ một số dạng bacteriocin có tên là Plataricin B hoạt động ức chế đáng kể cácloài vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Charlotte West và Philip Warner, 1998)

Lactobacillus sakei 2a sản sinh ra một loại bacteriocin có tên là P sakacin ức chế

đáng kể sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây hỏng thịt, cá, do đó chúng còn ứngdụng rộng rãi trong việc bảo quản các sản phẩm thịt lên men và một số sản phẩm cá(Milton, 2005)

Nghiên cứu của Reid (1999) và Vázquez et al (2005) cho thấy Lactobacilli

mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng: bám vào tế bào; ngănchặn hoặc giảm sự bám vào tế bào của các tác nhân gây bệnh; cạnh tranh dinhdưỡng với vi khuẩn gây bệnh; kích thích miễn nhiễm cho vật chủ, tồn tại và tăngmật số trong vật chủ, tạo ra acid, H2O2 và bacteriocin để kháng lại sự tăng trưởngcủa các tác nhân gây bệnh, và cân bằng vi sinh đường ruột

Schillinger và Lucke (1989) đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của

Lactobacillus sake được phân lập từ thịt Nghiên cứu chỉ ra rằng bacteriocin thô thu

được từ dịch nuôi L sake có khả năng ức chế nhiều loài Lactobacilli và Listeria

Todorov và Dicks (2007) nghiên cứu bacteriocin ST712BZ – một bacteriocin

được tạo ra bởi Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ Boza (một thức

uống truyền thống của Bulgaria được tạo ra từ sự lên men của nhiều loại ngũ cốc).Kết quả nghiên cứu cho thấy bacteriocin ST712BZ ức chế được nhiều loài vi khuẩn

như: Lactobacillus casei, Escherichia coli, bên cạnh đó thì việc thay đổi khối

lượng của một số thành phần môi trường nuôi có ảnh hưởng tới hoạt tính củabacteriocin này

Karthikeyan và Santosh (2009) đã phân lập và mô tả một loại bacteriocin được

tạo ra từ Lactobacillus plantarum, loài vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon), bacteriocin này đã kháng lại được một vài vi khuẩn gây bệnh như: Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Staphylococcus aereus,

Kết quả nghiên cứu của Riaz et al (2010) cho thấy bacteriocins được tạo ra từ các dòng vi khuẩn Lactobacillus fermentum và Lactobacillus acidophilus được phân

lập từ yogurt, phân gà, có khả năng ức chế sự phát triển của dòng vi khuẩn

Escherichia coli kháng lại kháng sinh cephalosporin.

Bacteriocin hay những chất giống bacteriocin từ vi khuẩn lactic mà đặc biệt là

giống Lactobacillus có khả năng ức chế lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh đã được nghiên cứu và công bố bởi nhiều tác giả (Harris et al (1989), Tahara et al (1996), Chung (2003), Hernández et al (2005), Mezaini et al (2009), Gong et al (2010).

Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng thành phần môi trường và điều kiệnnuôi cấy có ảnh hưởng đến sự tạo ra bacteriocin (Leroy và Vuyst (1999),

Ogunbanwo et al (2003), Todorov và Dicks (2005), Mollendorff et al (2009), Sarika et al (2010), Wang et al (2010)).

+ Một số nghiên cứu về probiotic

Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ với lượng thích hợp

sẽ mang lại những tác động có ích cho vật chủ (FAO/WHO, 2001)

Việc sử dụng probiotics như thức ăn bổ sung cho vật nuôi được bắt đầu từ

1970 Chúng được trộn vào thức ăn để làm tăng sự tăng trưởng và sức khỏe vật nuôibởi chúng giúp vật nuôi tăng khả năng kháng bệnh (Fuller, 1992)

Gildberg et al (1997) đã nghiên cứu tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của cá hồi

tuyết Đại Tây Dương khi bổ sung thức ăn khô có chứa vi khuẩn acid lactic (đượcphân lập từ loài cá này) Kết quả cho thấy tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống, cũng nhưkhả năng kháng bệnh của cá có sự cải thiện rõ rệt hơn so với đối chứng do vi khuẩnlactic đã trở thành nhóm sinh vật chiếm ưu thế trong ruột cá sau thí nghiệm

Carnevali et al (2004) đã phân lập Lactobacillus fructivorans AS17B từ ruột

cá tằm (Sparus aurata) và bổ sung vi khuẩn này trong suốt thời gian nuôi cá tằm với việc sử dụng Brachinons plicatilis, Arternia salina và thức ăn khô Kết quả cho thấy

có sự giảm đáng kể tỷ lệ chết của cá so với nghiệm thức không có bổ sung

Lactobacillus fructivorans AS17B.

Loài Streptococcus lactis là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn Đây là loại ưa

ấm, nhiệt độ tối ưu là 30-350C, nhiệt độ tối thiểu cho sự phát triển là 100C và tối đa

là 40-500C Trong môi trường chúng có khả năng tích tụ được khoảng 0,8-1% acid.Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nisin, là một hợp chất có tính kháng sinh

được dùng trong bảo quản thực phẩm Leconostoc mesenteroides đã được ứng dụng

sản xuất một loại bacteriocin gọi tắt là mesenterocin 5 chống lại vi khuẩn Listeria

monocytogenes (gây ngộ độc trên thực phẩm nhưng không gây ảnh hưởng đến vi

sinh vật hữu ích khác (Daba et al., 1991) Pediococcus pentosaceus FBB61 sản xuất một loại bacteriocin gọi là Pedicin A ức chế các loài thuộc giống Lactobacillus,

Listeria và Clostridium (Andrea Piva và Denis Headon, 1994) Bifidobacterium infantis BCRC 14602 sản sinh một loại bacteriocin có tên là Bifidin I ức chế sự tăng

trưởng của nhiều loại vi khuẩn gây hỏng thực phẩm và bệnh lây truyền qua đườngthực phẩm nên có ứng dụng rất lớn trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm (AhmadCheikhyoussef, 2009)

Kết quả nghiên cứu của Nowroozi et al (2004) cho thấy các dòng

Lactobacillus được phân lập từ xúc xích có mang một số thuộc tính probiotics.

Klayraung et al (2008) đã nghiên cứu một số thuộc tính probiotics của

Lactobacilli được phân lập từ một số thực phẩm truyền thống của Thái Lan Từ 563

dòng được phân lập có 3 dòng mang một số đặc tính probiotics như: tỷ lệ tồn tại caodưới điều kiện acid và muối mật, kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh phổ biến,nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh,

+ Một số kết quả nghiên cứu về việc ứng dụng vi khuẩn lactic kháng vi

khuẩn gây bệnh

Kết quả đề tài nghiên cứu của Trịnh Hùng Cường (2011) tại Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ về việc Phân lập vi

khuẩn Lactobacillus sp trên tôm sú nuôi công nghiệp có khả năng kháng vi khuẩn

gây bệnh Vibrio sp đã cho ra kết quả như sau: tác giả đã tìm ra 38 dòng

Lactobacillus sp được phân lập từ các mẫu tôm thu tại Kiên Giang và Sóc Trăng.

Thử nghiệm khả năng kháng Vibrio sp Bằng phương pháp nhỏ giọt và khuếch tán giếng thạch đã được sử dụng Trong số 38 dòng có khả năng kháng Vibrio sp., 5

dòng (ST322, ST423, KG411, ST111, ST413) có khả năng kháng mạnh, đặc biệt

dòng ST322 thể hiện tính kháng mạnh nhất 5 dòng có khả năng kháng mạnh Vibrio

sp đã được kiểm định về tác nhân kháng, kết quả cho thấy khả năng kháng này

không phải do bacteriocin mà do acid lactic và một số thành phần khác tạo nên.Khảo sát ảnh hưởng của mật số chủng và thời gian nuôi đến khả năng kháng của 5dòng trên cho thấy dòng ST322 với mật số chủng ban đầu 105, thời gian nuôi 72 giờ

cho tính kháng Vibrio sp mạnh nhất trong hầu hết các nghiệm thức thí nghiệm Kết

quả định danh bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy dòng

ST322 tương đồng 100% với Lactobacillus suntoryeus LH5 Qua các kết quả thí

nghiệm cho thấy dòng ST322 có triển vọng để tiếp tục nghiên cứu sử dụng trongnuôi trồng thủy sản Kết quả thí nghiệm còn cho thấy trong tổng số 38 dòng

Lactobacillus sp phân lập được kiểm tra khả năng kháng Vibrio sp thì dòng ST322

tạo đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất (13,7mm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với đường kính vòng vô khuẩn được tạo ra bởi các dòng Lactobacillus sp.

Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2008) đã nghiên cứu thu nhận

bacteriocin bằng phương pháp lên men tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất

mang cellulose vi khuẩn và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu Kếtquả cho thấy lượng bacteriocin thu nhận tương đối cao

Công ty Trách nhiệm Hữu hạn Công nghệ Sinh học Dược NANOGEN đãnghiên cứu và thương mại hóa chế phẩm Microcin Chế phẩm chứa reuterin – một

bacteriocin chiết xuất từ Lactobacillus reuteri, loàivi khuẩn cộng sinh đường ruột.

Chế phẩm đã được khảo nghiệm bởi tiến sĩ Bùi Quang Tề thuộc Viện Nghiên cứuNuôi trồng Thủy sản I Qua kết quả thử kháng sinh đồ chứng tỏ chế phẩm có khả

năng ức chế vi khuẩn gây bệnh ở cá nước ngọt như: Aeromonas hydrophila,

Edwarsiella tarda, Streptococcus sp ở nồng độ thử từ 10 – 60µl.

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Trai (2011) phân lập vi khuẩn

Lactobacillus sp có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và đốm đỏ

trên cá tra tạiViện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học

Cần Thơ đã cho ra kết quả như sau: 45 dòng Lactobacillus sp đã được phân lập

tách ròng từ dạ dày – ruột của cá tra và cá rô phi thu ở 5 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu

Long Trong số 45 dòng Lactobacillus sp phân lập, 43 dòng có khả năng ức chế cả

Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh gan thận mủ và đốm đỏ ở

cá tra khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt

Kết quả nghiên cứu của Lewus et al (1991) cho thấy các dòng vi khuẩn lactic

mà đặc biệt là các loài thuộc giống Lactobacillus có khả năng ức chế được nhiều vi khuẩn gây bệnh mà trong đó có Aeromonashydrophila, Staphylococcus aureus,

Listeria monogenes,

2.4 Ứng dụng vi sinh vật hữu ích trong nuôi trồng thuỷ sản

Chế phẩm sinh học hay việc sử dụng vi khuẩn có lợi đã được ứng dụng rộngrãi để kiểm soát mầm bệnh theo nhiều cơ chế khác nhau và ngày càng được sử dụngrộng rãi để thay thế thuốc kháng sinh Gần đây chúng được sử dụng nhiều trong

Nuôi trồng Thuỷ sản (Gatesoupe, 1999; Gomez-Gil et al., 2000; Verschuere et al.,

2000; Irianto và Austin, 2002; Bachère, 2003) Sự cạnh tranh về không gian sốnghay sự kháng trực tiếp mầm bệnh là những yếu tố quan trọng mà các chế phẩm sinhhọc tác động làm giảm sự nhiễm bệnh và thời gian tồn tại của mầm bệnh Các lợiích của chế phẩm sinh học như: cạnh tranh loại trừ các vi khuẩn gây bệnh

(Garriques và Arevalo, 1995; Moriarty, 1997; Gomez-Gil et al., 2000; Balca’zar, 2003; Balca’zar et al., 2004; Vine et al., 2004a), cung cấp nguồn dinh dưỡng và enzyme cho sự tiêu hoá (Sakata, 1990; Prieur et al., 1990; Garriques và Arevalo,

1995), hấp thu trực tiếp chất hữu cơ hòa tan bởi vi khuẩn (Garriques và Arevalo,

1995; Moriarty, 1997) và tăng hệ thống miễn dịch để chống lại mầm bệnh (Kamei

et al., 1988; Girones et al., 1989; Direkbusaracom et al., 1998).

Mariel., et al (2004) đã nghiên cứu việc lựa chọn vi khuẩn có lợi từ chế phẩm

sinh học và nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng

(Penaeus vannamei) đã cho ra kết quả như sau: tác giả đã phân lập được tổng cộng

80 dòng vi khuẩn từ gan tuỵ của tôm khoẻ ngoài tự nhiên (trọng lượng 30 ±5g) ởManglaralto-Ecuador và kiểm tra khả năng ức chế của chế phẩm sinh học này lên

Vibrio harveyi (S2) trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng phương pháp khuếch tán

giếng thạch và định danh được 3 dòng là Vibrio P62, Vibrio P63 và Bacillus P64 có khả năng kháng lại với vi khuẩn Vibrio harveyi (S2) Khi phân lập trên gan tụy của

tôm thì 3 dòng P62, P63, và P64 chiếm tỉ lệ phần trăm tương ứng 83, 60, và 58%

bằng phương pháp RAPD với 3 đoạn mồi Tỉ lệ phần trăm ức chế vi khuẩn Vibrio

harveyi (S2) được nghiên cứu bởi 3 dòng P62, P63, và P64 tương ứng là 54%, 19%

và 34% Khi phân tích mô bệnh học đã chỉ ra rằng thí nghiệm ác chế và tương tác đãcho kết quả là khi sử dụng các dòng probiotic thì mầm bệnh không xuất hiện P62,

và P64 có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch (bên ngoài ao nuôi) Chỉ số

đáp ứng miễn dịch cao hơn có ý nghĩa trên tôm khi sử dụng P64 và Vibrio

alginolyticus Trọng lượng của tôm cao hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng

khi sử dụng 3 dòng Probiotic này Tóm lại, việc phân lập dòng Bacillus P64 chỉ ra

rằng khi sử dụng vi khuẩn này tôm vừa tăng hệ thống miễn dịch và có được đặc tính

của probiotic (ức chế vi khuẩn có hại) trong khi Vibrio P62 chỉ có tác dụng tốt như

probiotic

Các vi khuẩn được sử dụng như chế phẩm sinh học: Vibrio (Griffith, 1995; Garriques and Arevalo, 1995), Bacillus ssp (Moriatrty, 1998; Rengpipat et al., 1998) và Thalassobacter utilis (Maeda and Lioa, 1992) Hầu hết những nghiên cứu

đã phân lập các dòng probiotic từ nước nuôi tôm (Nogami and Macda, 1992;

Direkbusarakom et al., 1997; Tanasomwang et al., 1998), hoặc từ các ao nuôi thâm canh của các loài tôm thẻ khác (Rengpipat et al., 2000) Gomez-Gil et al (1998) đã chứng minh rằng ở các loài tôm thẻ khoẻ mạnh có đa dạng các loài vi khuẩn vibrio

trong gan tụy của tôm Tuy nhiên, không có báo cáo nào công bố đã sử dụng bất cứcác dòng vi khuẩn từ gan tuỵ của tôm như là chế phẩm sinh học

Khi sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thuỷ sản sẽ làm giảm cácdòng gây bệnh cho vật chủ và thường xuyên làm giảm nguy cơ gây bệnh Việc thúcđẩy hệ thống miễn dịch trong quá trình sử dụng các dòng từ chế phẩm sinh học đã

được nghiên cứu bởi Rengpipat et al (2000) Tôm tăng cường hệ thống miễn dịch

và gia tăng sức đề kháng để kháng lại mầm bệnh do vi khuẩn (Rodriguez and LeMoullac, 2000) Đối với tôm, nhiều vi sinh vật có lợi kết hợp với nhau cũng đượcxem như là sự thúc đẩy chính các chức năng của tế bào, như là β-glucan,

lipopolysaccharides và peptidoglycans (Vargas-Albores et al., 1998) Sự kết hợp từ

các vi sinh vật này được nghiên cứu để đánh giá khả năng chống lại vi khuẩn Vibrio

và WSSV (Itami et al., 1998) Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết hợp của các vi sinh vật được ví như là kẻ thù (heat-killed) của Vibrio (Sung et

al., 1996), phá vỡ thành tế bào của vi khuẩn và tiết ra chất men (Sung et al., 1994;

Song và Hsieht, 1994) Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng khi sử dụng chếphẩm sinh học trong nuôi tôm sẽ giúp tôm tăng cường hệ thống miễn dịch trong hệthống đáp ứng miễn dịch ở tôm

4 Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu

4.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Mẫu tôm sú, thẻ, cá rô phi, mẫu nước, mẫu bùn được thu thập tại các ao nuôi tôm công nghiệp tại địa bàn tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng

- Mẫu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus BL3 được phân lập và lưu trữ tại Bộ

môn Bệnh học, Khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ (Nguyễn Trọng Nghĩa và

ctv., 2015)

- Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Bệnh học Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh và Trường Đại học Cần Thơ từ 17/11/2014 đến ngày 17/9/2015

4.2 Quy mô nghiên cứu

- Đề tài nghiên cứu ở quy mô cấp Trường có khả năng ứng dụng rộng rãi ởcác tỉnh nuôi tôm tại Đồng bằng Sông Cửu Long nói chung và tỉnh Trà Vinh nói

riêng.

4.3 Phương pháp nghiên cứu

4.3.1 Dụng cụ và hóa chất

+ Thiết bị, dụng cụ dùng để phân lập vi khuẩn lactic.

Sử dụng máy móc và thiết bị hiện có tại Bộ môn Bệnh học Thủy sản TrườngĐại Học Cần Thơ và một số dụng cụ và thiết bị tại Trường Đại học Trà Vinh

Dụng cụ và thiết bị: tủ cấy vô trùng (Astec, Anh, Model50546), tủ ủ (Sanyo,Nhật, Mir 262), tủ đông sâu (-860C, MDF-U52V), tủ mát (Alaska), Máy lắc mẫuVortex (Velp, Ý, ZX3), nồi hấp tiệt trùng (HVE 50, Nhật), tủ sấy (Menmert, Đức),cân điện tử (Sartorius, Đức, GM 612), máy ly tâm (Rotina 35, Đức), máy khuấy từ

gia nhiệt (Gostec, Hàn Quốc, GW-92HS), Micropipete các loại (Đức, Lab System),kính hiển vi soi nổi (Olympus, Nhật, CH 30), ống nghiệm 15 mL, đĩa petri đườngkính 8 cm

Dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử: các ống tuýpdùng để ly trích ADN và điện di, máy ly tâm eppendorf, máy nghiền Retsch, máysấy chân không, máy đo OD Backman Coulter, máy PCR Perkin Elmer, máy chụpgel BIORAD UV, máy vortex, các loại ống tube chạy PCR, bộ điện di Run One100/50 volt 13,5 cm (Mỹ), tủ lạnh -200C, microwave, tủ cấy, nồi khử trùng, tủ ủ, tủhút, bộ micropipete, máy giải trình tự ABI 3130

Các thí nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủysản, Trường Đại học Cần Thơ

+ Môi trường

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Tripticase Soya Agar (TSA), Tripticase SoyaBroth (TSB), Nutrient Agar (NA), Nutrient broth (NB) Thiosulfate Citrate BileSalts Sucrose Agar (TCBS) Man Rogosa Sharpe (MRS)

+ Hóa chất

Hóa chất kiểm tra Catalase: dung dịch oxy già (H2O2 ,3%)

Hóa chất thử oxydase: tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride 1% (được công ty Nam Khoa sản xuất dưới dạng dĩa giấy tẩm sẵn dung dịch trên)

Hóa chất dùng để nhuộm Gram vi khuẩn lactic : Iod, Fushin, Crystal violet,

Ethanol (cồn) 70%, nước cất 2 lần vô trùng

Thuốc thử Kovacs dùng để thử khả năng sinh indole

- Vật liệu thí nghiệm

Mẫu tôm sú, thẻ, cá rô phi, mẫu nước, mẫu bùn được thu thập tại các ao nuôi tôm công nghiệp tại địa bàn tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng

Mẫu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được phân lập và lưu trữ tại Bộ môn

Bệnh học, Khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ

4.3.2 Phương pháp nghiên cứu

4.3.2.1 Thu mẫu và bảo quản mẫu

- Mẫu tôm, cá rô phi, bùn và nước ao nuôi tôm được thu ở 2 tỉnh Trà Vinh vàSóc Trăng Mẫu tôm biển ở mỗi tỉnh thu 30 mẫu của 6 ao tôm nuôi thâm canh (5con/ao) Kích cỡ tôm thu mẫu là 20g/con Mẫu cá rô phi khỏe được thu ở các aonuôi kết hợp hoặc các ao tự nhiên Kích cỡ cá khi thu mẫu khoảng 100g/con Sốlượng mẫu thu tương tự như thu mẫu trên tôm Mẫu bùn cũng được thu ở 6 ao nuôi

tôm thâm canh Phương pháp thu mẫu bùn được thực hiện theo Somsiri et al.,