Nghiên cứu biến dị tế bào soma và xử lý tia gamma trong chọn tạo các dòng đậu nành (glycine max (l ) merrill) chống chịu mặn

Merrill chống chịu mặn” được thực hiện nhằm mục tiêu xác định phương pháp chọn tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn.Nội dung nghiên cứu bao gồm xác định khả năng chống chịu mặn c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG

MÃ NGÀNH: 62 62 01 10

NGHIÊN CỨU BIẾN DỊ TẾ BÀO SOMA VÀ

XỬ LÝ TIA GAMMA TRONG CHỌN TẠO

CÁC DÒNG ĐẬU NÀNH (Glycine max (L.)

LỜI CẢM TẠ

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Bảo Toàn, ngườithầy đã tận tình dìu dắt, giúp đỡ tôi trong công tác, cũng như truyền đạt kiếnthức, kinh nghiệm quý báu để hướng dẫn tôi hoàn thành luận án tiến sĩ

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

- Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Khoa Sau đại học và các đơn vị phòng ban

- Quý thầy cô giảng dạy các môn học nghiên cứu sinh, quý thầy cô tham

dự các hội đồng bảo vệ đề cương, tiểu luận và các chuyên đề nghiên cứu sinh

- Quý thầy cô, các anh chị và các em đang công tác tại Bộ môn Sinh lýSinh hóa, Bộ môn Khoa học Cây trồng, Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nôngnghiệp, và Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã động viên,

tư vấn và nhiệt tình giúp đỡ

- TS Nguyễn Phước Đằng và cô Thái Kim Tuyến, Bộ môn Di truyền vàchọn giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp cácgiống đậu nành phục vụ cho thí nghiệm

- Công ty Vạn Đức (Ấp Đông Hòa, Xã Song Thuận, Huyện Châu Thành, Tỉnh Tiền Giang) đã cung cấp các giống đậu nành phục vụ cho thí nghiệm

- Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã giúp đỡ thực hiện chiếu xạ tia gamma mẫu cấy

- TS Đỗ Tấn Khang đã hỗ trợ thực hiện phân tích kỹ thuật sinh học phântử

- Các em sinh viên Huỳnh Văn Hải, Võ Quang Tiếp, Huỳnh Thị Ý Nhi,Nguyễn Thị Cẩm Tiên, Nguyễn Thị Minh Thi, Trần Thị Tuyết Lan cùng các

em sinh viên lớp Sinh học K37, Công nghệ rau hoa quả và Cảnh quan K42 đãnhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ thực hiện thí nghiệm

Xin trân trọng ghi nhớ công ơn của cha mẹ và gia đình đã luôn bên cạnhđộng viên, chia sẻ, giúp đỡ để tôi yên tâm trong học tập và công tác Xin chânthành cảm ơn sự động viên, chia sẻ, hỗ trợ của thầy cô, các anh chị, các em vàbạn bè đã luôn bên tôi trong những lúc khó khăn, dành tình cảm tốt đẹp và tạođiều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và nghiên cứu

TÓM TẮT

Cây đậu nành là một trong những cây thực phẩm có giá trị cao, cải tạođất rất tốt nhưng cũng là giống cây nhạy cảm với mặn Đề tài “Nghiên cứubiến dị tế bào soma và xử lý tia gamma trong chọn tạo các dòng đậu nành

(Glycine max (L.) Merrill) chống chịu mặn” được thực hiện nhằm mục tiêu

xác định phương pháp chọn tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn.Nội dung nghiên cứu bao gồm xác định khả năng chống chịu mặn của một sốgiống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL, xác định môi trường nuôi cấy mô cây đậunành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phương pháp chọn lọc

và đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằngphương pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma Kết quả cho thấy trongcác giống đậu nành được canh tác phổ biến ở ĐBSCL, các giống MTĐ 748-1,

ĐH 4 và MTĐ 720 có khả năng chịu mặn cao ở nồng độ muối NaCl 4 g/L khiđánh giá bằng phương pháp thủy canh Giống MTĐ 878-3 nhạy cảm với mặn

và giống MTĐ 760-4 chết hoàn toàn ở nồng độ muối này Trong chọn lọc tínhchống chịu mặn, giống không chịu mặn là MTĐ 760-4 đã tạo ra những dòng

mô sẹo và cây chịu mặn Trong các phương pháp chọn lọc các dòng đậu nànhchống chịu mặn thì phương pháp gây biến dị soma trên mẫu trục phôi đậunành MTĐ 760-4 đạt được 01 dòng cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn

ở nồng độ NaCl 5 g/L Có sự khác biệt di truyền trong cấu trúc DNA của mẫuchồi chống chịu mặn so với mẫu đối chứng không xử lý mặn khi phân tíchbằng chỉ thị phân tử ISSR22 Cây đậu nành MTĐ 760-4 sau chọn lọc mặn vớimuối NaCl 5 g/L sinh trưởng bình thường sau 5 tuần thuần dưỡng trong điềukiện tưới mặn ở nhà lưới Cả hai phương pháp gây biến dị soma và phươngpháp chiếu xạ tia gamma Co60 kết hợp chọn lọc mặn với muối NaCl trên mẫu

mô sẹo đều thu được các dòng mô sẹo có khả năng chịu mặn với nồng độ 5g/L ở mẫu không chiếu xạ và mẫu chiếu xạ liều 10 Gy Phân tích di truyền vớichỉ thị ISSR22 cho thấy ở hai mẫu mô sẹo này đều không có sự xuất hiện củabăng DNA khoảng 450 bp so với mẫu đối chứng Đối với mẫu trục phôi xử lýchiếu xạ tia gamma kết hợp chọn lọc mặn chưa thu được các dòng chống chịumặn Kết quả nghiên cứu đề xuất có thể áp dụng phương pháp gây biến dịsoma trên mẫu trục phôi để tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịu mặn,tiếp tục nhân dòng chịu mặn và trồng thử nghiệm ở điều kiện tự nhiên để đánhgiá sự ổn định di truyền của tính chống chịu mặn cũng như quan sát thêm cácđặc tính nông học khác

Từ khóa: Biến dị soma, chiếu xạ tia gamma, chống chịu mặn, đậu nành,

Glycine max (L.) Merrill, ISSR

Soybean is one of food crops that have high value and considerablyimprove soil, but also is sensitive to salt The PhD thesis “Study on somaclonalcell variation and gamma treatment in selection for salt tolerant soybean lines

(Glycine max (L.) Merrill)” was carried out to determine the method to select

the soybean line that is salt tolerant Study contents included determing the salttolerance ability of some soybean varieties which were popular in the MekongDelta, the tissue culture medium of soybean suitale for obtaining initialsources for selection methods and evaluating the ability of selection for salttolerant soybean lines by somaclonal cell variation creating and gammairradiation method The results showed that among soybean varieties popularlycultivated in the Mekong Delta, MTD 748-1, DH 4 and MTD 720 had the highsalt tolerant ability at 4 g/L NaCl when evaluated by hydroponic method.MTD 878-3 variety was sensitive to salt and MTD 760-4 completely died atthis salt concentration In selection for salt tolerance, the intolerant varietywhich was MTD 760-4 formed salt tolerant callus and plantlet lines Inselection methods to achieve salt tolerant soybean lines, creating somaclonalvariation on embryo axes of MTD 760-4 soybean obtained one soybeanplantlet line that was salt tolerant at NaCl of 5 g/L There was geneticdifference in DNA structure of the salt tolerant shoot compared to the controlwith non-salt treatment when analyzed by molecular marker of ISSR22 MTD760-4 soybean plantlets after selected with 5 g/L NaCl normally grew after 5weeks acclimatized under saline water irrigating condition in the greenhouse.Both methods of creating somaclonal variation and Co60 gamma irradiationcombined with NaCl salt selection on callus achieved two salt tolerant calluslines to NaCl dose of 5 g/L at none irradiated explants and irradiated explantswith gamma dose of 10 Gy Genetic analysis with ISSR22 marker in these twocallus explants showed that there was no appearance of DNA band 450 bpcompared to control explants To embyro axes which were gamma irratiatedand salt selected, there was not obtained salt tolerant lines The study resultssuggested that the method of creating somaclonal variation can be applied toform salt tolerant soybean lines and these should be constinuously multipliedand cultivated in the field to evaluate the genetic stability of salt tolerance aswell as observe further other agronomical characteristics

Key words: ISSR, gamma irradiation, Glycine max (L.) Merrill, salt tolerant,

somaclonal variation, soybean

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiêncứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứluận án cùng cấp nào khác

MỤC LỤC

Lời cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Abstract vi

Cam kết kết quả v

Mục lục vi

Danh sách bảng xi

Danh sách hình xiv

Danh mục từ viết tắt xvi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4.1 Đối tượng nghiên cứu 2

1.4.2 Phạm vi nghiên cứu 2

1.5 Ý nghĩa của luận án 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

1.6 Những điểm mới của luận án 4

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Nguồn gốc và phân loại cây đậu nành 5

2.1.1 Nguồn gốc 5

2.1.2 Phân loại 5

2.2 Đặc điểm thực vật 5

2.2.1 Rễ 5

2.2.2 Thân 5

2.2.3 Lá 6

2.2.4 Hoa 7

2.2.5 Trái và hạt 7

2.3 Yêu cầu sinh thái của cây đậu nành 8

2.3.1 Đất 8

2.3.2 Nhiệt độ 8

2.3.3 Nước 9

2.3.4 Ánh sáng 9

2.4 Đất mặn và tình hình xâm nhập mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long 10

2.4.1 Khái niệm đất mặn 10

2.4.2 Tình hình xâm nhập mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long 11

2.5 Sự chống chịu mặn của cây đậu nành 12

2.5.1 Ảnh hưởng của mặn trên cây đậu nành 12

2.5.2 Các nghiên cứu về sự chống chịu mặn trên cây đậu nành 14

2.5.3 Cơ chế chống chịu mặn của cây đậu nành 15

2.6 Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật 19

2.7 Phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma các dòng cây trồng chống chịu mặn 21

2.7.1 Khái niệm biến dị soma 21

2.7.2 Cơ sở của biến dị soma 21

2.7.3 Phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma tính chống chịu mặn 23

2.7.4 Một số ưu và khuyết điểm của phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma24 2.7.4.1 Ưu điểm 24

2.7.4.2 Khuyết điểm 24

2.7.5 Đặc điểm của cây chịu mặn trong chọn lọc in vitro 25

2.8 Một số kết quả nghiên cứu về chọn lọc biến dị tế bào soma các dòng cây trồng chống chịu mặn trên thế giới và trong nước 26

2.9 Phương pháp gây đột biến cây trồng in vitro 28

2.9.1 Khái niệm đột biến 28

2.9.2 Sự phát sinh đột biến 28

2.9.3 Ưu điểm của phương pháp tạo đột biến thông qua nuôi cấy mô 29

2.9.4 Phương pháp tạo đột biến in vitro bằng xử lý tia gamma 29

2.9.4.1 Bức xạ gamma (γ) 29

2.9.4.2 Một số đặc trưng của chất phóng xạ 30

2.9.4.3 Phương pháp thực hiện 30

2.9.5 Kết quả nghiên cứu về tạo đột biến in vitro bằng xử lý tia gamma trên thế giới và trong nước 32

2.10 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 36

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

3.1 Phương tiện 38

3.1.1 Vật liệu 38

3.1.2 Hóa chất 38

3.1.3 Thiết bị 38

3.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 39

3.2 Phương pháp nghiên cứu 40

3.2.1 Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL 40 3.2.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của các giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A và OMĐN 2940

3.2.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của các giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2 41 3.2.2 Nội dung 2: Xác định môi trường nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp để

tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phương pháp chọn lọc 41

3.2.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sự hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 41

3.2.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của NAA và khoáng đa lượng đến sự tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4 42

3.2.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần dưỡng cây đậu nành in vitro trong điều kiện nhà lưới 43

3.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phương pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma 43

3.2.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 43

3.2.3.2 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 46

3.2.3.3 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 48

3.2.3.4 Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 49

3.2.3.5 Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn50 3.2.3.6 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các dòng đậu nành chống chịu mặn trong điều kiện nhà lưới 52

3.2.3.7 Xử lý số liệu 53

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55

4.1 Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu nành phổ biến ở ĐBSCL 55

4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của các giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A và OMĐN 2955 4.1.1.1 Tỉ lệ sống 55

4.1.1.2 Chiều cao cây 57

4.1.1.3 Số lóng trên thân chính 59

4.1.1.4 Chiều dài rễ 60

4.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của các giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2 64 4.1.2.1 Tỉ lệ sống 64

4.1.2.2 Chiều cao cây 66

4.1.2.3 Số lóng trên thân chính 67

4.1.2.4 Chiều dài rễ 69

4.2 Nội dung 2: Xác định môi trường nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp để

tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phương pháp chọn lọc 71

4.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sự hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 71

4.2.1.1 Tỉ lệ tạo mô sẹo 71

4.2.1.2 Tỉ lệ tạo rễ 73

4.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của NAA và khoáng đa lượng đến sự tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4 75

4.2.2.1 Tỉ lệ tạo rễ 75

4.2.2.2 Số rễ 76

4.2.2.3 Chiều dài rễ 77

4.2.2.4 Chiều cao chồi 78

4.2.2.5 Số lá 79

4.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần dưỡng cây đậu nành in vitro trong điều kiện nhà lưới 81

4.2.3.1 Tỉ lệ cây sống 81

4.2.3.2 Chiều cao gia tăng 82

4.2.3.3 Số lá gia tăng 83

4.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phương pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma 84

4.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 84

4.3.1.1 Thí nghiệm 6a: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1 84

4.3.1.2 Thí nghiệm 6b: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2 86

4.3.1.3 Thí nghiệm 6c: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3 86

4.3.1.4 Thí nghiệm 6d: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4 87

4.3.2 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 89

4.3.2.1 Thí nghiệm 7a: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi trong lần chọn lọc 1 89

4.3.2.2 Thí nghiệm 7b: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của chồi trong lần chọn lọc 2 91

4.3.2.3 Thí nghiệm 7c: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của chồi trong lần chọn lọc 3 93

4.3.3 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl

lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 97

4.3.3.1 Thí nghiệm 8a: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1 97

4.3.3.2 Thí nghiệm 8b: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 2 99

4.3.3.3 Thí nghiệm 8c: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 3 101

4.3.3.4 Thí nghiệm 8d: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 4 103

4.3.4 Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 107

4.3.4.1 Thí nghiệm 9a: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự tạo chồivà sinh trưởng của chồitrong lần chọn lọc 1 107

4.3.4.2 Thí nghiệm 9b: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trưởng của chồi trong lần chọn lọc 2 112

4.3.4.2 Thí nghiệm 9c: Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl lên sự sinh trưởng của chồi trong lần chọn lọc 3 113

4.3.5 Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn115 4.3.5.1 Sự sai khác di truyền của các dòng mô sẹo đậu MTĐ 760-4 chống chịu mặn sau chọn lọc biến dị soma và chiếu xạ tia gamma Co60 115

4.3.5.2 Sự sai khác di truyền của các dòng cây đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn sau chọn lọc biến dị soma 117

4.3.6 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các dòng đậu nành chống chịu mặn trong điều kiện nhà lưới 117

4.3.6.1 Chiều cao chồi gia tăng 117

4.3.6.2 Số lóng gia tăng 119

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 124

5.1 Kết luận 124

5.2 Đề xuất 124

TÀI LIỆU THAM KHẢO 125

PHỤ LỤC 1 140

PHỤ LỤC 2 142

PHỤ LỤC 3 145

PHỤ LỤC 4 147

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Gen mã hóa transporter vận chuyển ion liên quan đến sự chống 17

chịu mặn ở đậu nành

2.2 Một số giống cây trồng được xử lý đột biến in vitro bằng chiếu 33

xạ tia gamma trên thế giới

NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.2 Chiều cao cây (cm) của các giống đậu nành ảnh hưởng bởi muối 58

NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.3 Số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ảnh hưởng bởi 60

muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKT

4.4 Chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ảnh hưởng bởi muối 62

4.7 Số lóng trên thân chính của các giống đậu nành ảnh hưởng bởi 68

muối NaCl ở 2, 3 và 5 tuần SKT

4.8 Chiều dài rễ (cm) của các giống đậu nành ảnh hưởng bởi muối 70

4.11 Tỉ lệ tạo rễ (%) của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 75

NAA và khoáng đa lượng ở 2 và 4 tuần SKC

khoáng đa lượng ở 2 và 4 tuần SKC

4.13 Chiều dài rễ (cm)của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 78

NAA và khoáng đa lượng ở 4 tuần SKC

NAA và khoáng đa lượng ở 2và 4 tuần SKC

khoáng đa lượng ở 2 và 4 tuần SKC

4.16 Tỉ lệ sống (%) của cây đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi giá 81thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

hưởng bởi giá thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

4.18 Số lá gia tăng của cây đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi giá 83thể ở 1, 2, 3 và 4 tuần SKTD

4.19 Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 84muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.20 Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 86muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 2

4.21 Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 87muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 3

4.22 Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 87muối NaCl từ 1 đến 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 4

4.23 Hàm lượng proline của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 sau 4 lần 88chọn lọc với muối NaCl (mol g trọng lượng tươi)

4.24 Tỉ lệ tạo chồi (%) của trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng 90bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 1

4.25 Chiều cao chồi (cm) của đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 90muối NaCl trong lần chọn lọc 1

hưởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 2

4.27 Số lá gia tăng của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 92muối NaCl trong lần chọn lọc 2

4.28 Chiều cao chồi gia tăng (cm) của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh 93hưởng bởi muối NaCl trong lần chọn lọc 3

4.29 Số lá gia tăng của chồi đậu nành MTĐ 760-4 ảnh hưởng bởi 94muối NaCl trong lần chọn lọc 3

4.30 Số cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn ở các nồng độ 95muối NaCl

chọn lọc với muối NaCl (mol g trọng lượng tươi)

4.32 Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma 98

Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.33 Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma 100

Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 2

4.34 Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma 102

Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 3

4.35 Tỉ lệ sống của mô sẹo (%) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma 104

Co60 và muối NaCl ở 1, 3 và 5 tuần SKC trong lần chọn lọc 4

4.36 Hàm lượng proline của mô sẹo (mol g trọng lượng tươi) ảnh 106hưởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và muối NaCl sau 4 lần

chọn lọc

4.37 Tỉ lệ sống của trục phôi (%) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma 108

Co60 và muối NaCl ở 2, 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.38 Tỉ lệ tạo chồi (%) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và 110muối NaCl ở 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.39 Chiều cao chồi (cm) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma Co60 và 112muối NaCl ở 4 và 6 tuần SKC trong lần chọn lọc 1

4.40 Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma 113

Co60 và muối NaCl ở 1, 2 và 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 2

4.41 Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hưởng bởi chiếu xạ tia gamma 114

Co60 và muối NaCl ở 1, 2 và 3 tuần SKC trong lần chọn lọc 3

4.42 Chiều cao chồi gia tăng (cm) ảnh hưởng bởi tưới nước mặn 118

DANH SÁCH HÌNH

phôi (a) và nuôi cấy trên môi trường (b)

NaCl

bỏ trục phôi (a) và nuôi cấy trên môi trường (b)

3.4 Sinh trưởng của trục phôi sau khi được chiếu xạ và chọn lọc 49

với muối NaCl

5 giống đậu nành Nhật 17A, MTĐ 748-1, MTĐ 176, MTĐ

760-4, OMĐN 29 (từ phải sang) ở 5 tuần sau khi trồng

rễ cây đậu nành ở 5 tuần sau khi trồng

4.3 Triệu chứng ngộ độc mặn (NaCl 4 g L) trên lá đậu nành ở 5 63

tuần sau khi trồng

5 giống đậu nành ở 5 tuần sau khi trồng

4.5 Sự hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành ở 2 tuần sau khi 71

cấy

NAA

trường MS bổ sung muối NaCl sau 5 tuần nuôi cấy trong

lần chọn lọc 1

trường MS bổ sung muối NaCl sau 5 tuần nuôi cấy trong

môi trường MS bổ sung nước dừa 50 ml L và NAA 0,2

tuần nuôi cấy ở lần chọn lọc 1

tuần nuôi cấy ở lần chọn lọc 4

4.15 Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60

chồi đậu nành MTĐ 760-4 trong lần chọn lọc 1

4.16 Ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma Co60

sinh trưởng của chồi đậu nành MTĐ 760-4

4.17 Phổ diện điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR02 (giếng 1- 115

3), ISSR03 (giếng 4-6), ISSR13 (giếng 7-9) và ISSR19

(giếng 10-12)

4.18 Phổ diện điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR22 (giếng 1-3) 116

và ISSR27 (giếng 4-6)

cây đậu nành MTĐ 760-4 đối chứng ở 5 tuần sau khi trồng

4.21 Sinh trưởng của các dòng đậu nành trong điều kiện tưới 121

mặn ở 4 tuần sau khi trồng

760-4 chống chịu mặn từ mẫu cấy trục phôi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Đậu nành (Glycine max (L.) Merrill) là cây thực phẩm có giá trị kinh tế rất

cao không chỉ được trồng làm thức ăn cho người và gia súc vì có hàm lượngprotein cao (40%), lipid (18%), các acid amin cơ bản và nhiều loại vitamin, đậu

nành còn là cây luân canh cải tạo đất rất tốt (Phạm Văn Biên và ctv., 1996) Biện pháp luân canh cây đậu nành với cây lúa vừa hạn chế được dòng đời sâu bệnh

phát triển, vừa góp phần làm cho đất thêm màu mỡ, mang lại hiệu quả kinh tế caocho cả lúa và đậu nành giúp cho nông dân tăng thêm thu nhập, cải thiện đời sống

và giúp cho ngành chăn nuôi, thủy sản có thêm nguyên liệu để chế biến Đồngbằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là trọng điểm nông nghiệp của cả nước, việcchuyển đổi cơ cấu cây trồng là một nhu cầu bức thiết nhằm xây dựng nền nôngnghiệp bền vững, phá thế độc canh cây lúa và cắt sự lây truyền của sâu rầy Vìvậy, việc đưa cây đậu nành vào cơ cấu luân canh với cây lúa là một trong những

biện pháp hữu hiệu (Nguyễn Phước Đằng và ctv., 2010) Tuy nhiên, hiện nay do

tình hình biến đổi khí hậu, ĐBSCL là một trong những vùng chịu ảnh hưởng trựctiếp, đặc biệt là tình trạng xâm nhập mặn vào sâu trong đất liền khiến cho nhiềudiện tích đất canh tác bị thu hẹp Đậu nành được xem là loài nhạy cảm với mặn(Lauchli, 1984) Sản lượng của các giống đậu nành nhạy cảm với mặn giảm rất

nghiêm trọng dưới điều kiện mặn (Chang et al., 1994, Katerji et al., 2003) Chính

vì vậy, để có thể canh tác tốt và mở rộng diện tích cây trồng này ở ĐBSCL, việc

sử dụng giống chịu mặn là một trong các phương pháp thích hợp nhất và ít tốnkém nhất so với các phương pháp khác như cải tạo đất hoặc làm đê bao ngănmặn Đối với những vùng bị nhiễm mặn, vào những mùa vụ năng suất trồng lúa

không cao thì nông dân có thể trồng cây đậu nành thay thế Theo Wang et al.

(2003), hiện nay chọn giống là một chiến lược quan trọng để cải thiện tính chốngchịu mặn trên cây đậu nành Tuy nhiên, công tác lai tạo và chọn giống theo cách

cổ điển rất khó, tốn nhiều thời gian, công sức và chi phí Trong khi đó phươngpháp chọn lọc các biến dị thích nghi với mặn thông qua nuôi cấy mô đã đượcthực hiện thành công trên nhiều cây trồng Đặc biệt là hiệu quả chọn lọc có thể

được tăng cường bằng cách kết hợp với kỹ thuật gây đột biến in vitro Rất nhiều

báo cáo đã cho thấy các dòng cây trồng chống chịu mặn có thể được tạo bằng các

kỹ thuật này như lúa (Dang Minh Tam and Nguyen Thi Lang, 2003; Saleem et

al., 2005; Zinnah et al., 2013), mía (Patade et al., 2008), lúa mì (El-Sayed et al.,

2007), khoai tây (Yaycili and Alikamanoglu, 2012)… Trên thế

giới, việc ứng dụng phương pháp này để chọn lọc tính chống chịu mặn trêncây đậu nành cũng đã thực hiện nhưng còn rất hạn chế và chưa được nghiên

cứu một cách đầy đủ Một số kỹ thuật nuôi cấy in vitro cây đậu nành cơ bản

cũng đã được thực hiện ở một số giống, tuy nhiên, một quy trình nuôi cấy đầy

đủ cũng chưa có Vì vậy, các nghiên cứu về chọn lọc các dòng đậu nành chốngchịu mặn để thích nghi với sự bất lợi của môi trường như sự xâm nhập mặn ởĐBSCL là rất cần thiết và hứa hẹn sẽ mang lại nhiều đóng góp giá trị cho côngtác chọn tạo giống đậu nành mới

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định phương pháp chọn tạo dòng đậu nành có khả năng chống chịumặn

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác định khả năng chống chịu mặn của một số giống đậu

nành phổ biến ở ĐBSCL

Nội dung 2: Xác định môi trường nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp

để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho các phương pháp chọn lọc

Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu

mặn bằng phương pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma

- Tạo biến dị tế bào soma từ mô sẹo và trục phôi bằng cách nuôi cấy trên môi trường mặn (bổ sung muối NaCl)

- Chiếu xạ tia gamma Co60 mẫu mô sẹo và trục phôi và chọn lọc trên môitrường mặn (bổ sung muối NaCl)

- Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn sau chọn lọc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các dòng đậu nành chống chịu mặn sau chọn lọc trong điều kiện tưới mặn ở nhà lưới

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.4.1 Đối tượng nghiên cứu

Đặc tính chống chịu mặn của cây đậu nành

1.4.2 Phạm vi nghiên cứu

- Xác định khả năng chống chịu mặn của các giống đậu nành bằng phương pháp thủy canh được thực hiện trong nhà lưới

- Xác định môi trường nuôi cấy mô cây đậu nành thích hợp để tạo nguồnvật liệu khởi đầu cho các phương pháp chọn lọc và thực hiện chọn tạo cácdòng đậu nành có khả năng chịu mặn trong phòng thí nghiệm với 1 giống đãđược đánh giá mức độ chịu mặn trong nhà lưới.

- Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nành chống chịu mặn sau chọn lọc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Thuần dưỡng và trồng thử nghiệm dòng đậu nành sau chọn lọc trong nhà lưới

1.5 Ý nghĩa của luận án

- Luận án đã ứng dụng phương pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tiagamma Co60 để chọn tạo các các dòng đậu nành chống chịu mặn, sử dụng chỉthị phân tử ISSR để đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đậu nànhchống chịu mặn sau chọn lọc và đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triểncủa các dòng này trong điều kiện tưới mặn ở nhà lưới

- Kết quả của luận án đã xác định được phương pháp tạo dòng đậu nànhMTĐ 760-4 có khả năng chống chịu mặn, cung cấp nguồn tài liệu trong nghiêncứu khoa học, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo và phục vụ trong giảngdạy

có khả năng chống chịu mặn để có thể canh tác tốt và mở rộng diện tích câytrồng này ở ĐBSCL là rất cần thiết Ứng dụng phương pháp gây biến dị tế bàosoma có thể chọn lọc được dòng đậu nành chống chịu mặn Kết quả luận án đãđạt được 01 dòng đậu nành MTĐ 760-4 có khả năng chống chịu mặn ở nồng

độ muối NaCl 5 g/L Từ đó có thể trồng thử nghiệm và phát triển giống mớinày ra điều kiện tự nhiên, đặc biệt là những vùng đất canh tác đang bị nhiễmmặn ở ĐBSCL.

1.6 Những điểm mới của luận án

- Kết quả luận án đã đánh giá được khả năng chống chịu mặn của 10 giốngđậu nành trồng ở ĐBSCL là MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A,OMĐN 29, ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 và MTĐ 885-2 bằngphương pháp thủy canh Trong đó, các giống MTĐ 748-1, ĐH 4 và MTĐ

720 có khả năng chịu mặn cao ở nồng độ muối NaCl 4 g/L Giống MTĐ 878-3nhạy cảm với mặn và giống MTĐ 760-4 chết hoàn toàn ở nồng độ muối này

-Luận án đã tạo ra những dòng mô sẹo và cây chịu mặn từ giống không chịu mặn là MTĐ 760-4

- Trong các phương pháp chọn lọc các dòng đậu nành chống chịu mặnthì phương pháp gây biến dị soma trên mẫu trục phôi đậu nành MTĐ 760-4đạt được 01 dòng cây đậu nành có khả năng chống chịu mặn ở nồng độ NaCl

5 g/L Có sự khác biệt di truyền trong cấu trúc DNA của mẫu chồi chống chịumặn so với mẫu đối chứng không xử lý mặn khi phân tích bằng chỉ thị phân tửISSR22 Cây đậu nành MTĐ 760-4 sau chọn lọc mặn với muối NaCl 5 g/Lsinh trưởng bình thường sau 5 tuần thuần dưỡng trong điều kiện tưới mặn ởnhà lưới

- Cả hai phương pháp gây biến dị soma và phương pháp chiếu xạ tiagamma Co60 kết hợp chọn lọc mặn với muối NaCl trên mẫu mô sẹo đều thuđược các dòng mô sẹo có khả năng chịu mặn với nồng độ 5 g/L ở mẫu khôngchiếu xạ và mẫu chiếu xạ liều 10 Gy Phân tích di truyền với chỉ thị ISSR22cho thấy ở hai mẫu mô sẹo này đều không có sự xuất hiện của băng DNAkhoảng 450 bp so với mẫu đối chứng

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc và phân loại cây đậu nành

2.1.1 Nguồn gốc

Đậu nành (đậu tương) là một trong những loại cây trồng mà loài người

đã biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu nànhcũng sớm được xác minh Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ họcđều công nhận rằng đậu nành có nguyên sản ở châu Á và có nguồn gốc từTrung Quốc Cây đậu nành được thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đạitiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và khảo sát có thể trong triều đạiShang (năm 1700-1100 B.C) trước công nguyên Những thông tin về nguồngốc đậu nành được trình bày chi tiết trong tài liệu của trong Ngô Thế Dân và

ctv (1999).

2.1.2 Phân loại

Đậu nành Glycine max (L.) Merrill thuộc họ đậu Leguminosae, họ phụ

cánh bướm Papilionoideae và bộ Phaseoleae (Bernard and Weiss, 1973)

Đậu nành được thuần hóa từ đậu nành hoang, G soja Sieb and Zucc., là

một loài dây leo hằng niên có trái chứa hạt màu đen (Hymowitz, 1970) Đậu

nành canh tác và tổ tiên của nó G soja thuộc chi phụ Soja (Moench.) F.J.

Herm (Singh and Hymowitz, 1989)

2.2 Đặc điểm thực vật

2.2.1 Rễ

Rễ cây đậu nành khác với rễ cây hòa thảo là có rễ chính và rễ phụ Rễchính có thể ăn sâu 30-50 cm và có thể trên 1 m Trên rễ chính mọc ra nhiều rễphụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm, rộng 30-40 cm2(Nguyễn Danh Đông, 1982) Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần Bộ rễphân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vàogiống, đất đai, khí hậu và kỹ thuật trồng (Trần Văn Điền, 2007)

2.2.2 Thân

Tùy theo đặc điểm của giống và điều kiện môi trường mà cây đậu nành

có số lóng và số cành khác nhau (Nguyễn Thị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc,2011)

Thân cây đậu nành thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lôngnhỏ

Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sangmàu nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắccủa hoa sau này Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khicòn non thân có màu tím thì hoa có màu tím đỏ.

Thân có trung bình 14-15 lóng, các lóng ở phía dưới thường ngắn, cáclóng ở phía trên thường dài (vì những lóng phía trên phát triển từ ngày 35-40trở đi vào lúc cây đang sinh trưởng nhanh nên lóng thường dài) Tùy theogiống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ3-10 cm Cây đậu nành trong vụ hè thường có lóng dài hơn vụ xuân và vụđông Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao của thân Thân câyđậu nành thường cao từ 0,3-1,0 m Giống đậu nành dại cao 2-3 m Nhữnggiống thân nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc.Những giống thân to thường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gióbão Toàn thân có một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn,đến cả cuống lá Thực tế cũng có giống không có lông tơ Những giống có mật

độ lông tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn và chịu rét khỏe Ngượclại những giống không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sứcchống chịu kém Thân có lông tơ nhiều ít dài ngắn, dày thưa là một đặc điểmphân biệt giữa các giống với nhau (Trần Văn Điền, 2007)

2.2.3 Lá

Cây đậu nành có 4 loại lá bao gồm lá mầm (lá tử diệp), lá sơ cấp đơn, lákép lông chim và lá bắc (một cặp lá đơn dài 1 mm ở gốc của mỗi nhánh bên)(Carlson and Lersten, 2004)

Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ Lá có nhiều hình dạng khác nhau tùytheo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn khỏe nhưng thường cho năngsuất thấp Những giống lá to chống chịu hạn kém nhưng thường cho năng suấtcao hơn Nếu 2 lá kép đầu to và dày thường biểu hiện giống có khả năngchống chịu rét Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá to hay nhỏ chi phốirất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các lá nằm cạnhchùm hoa nào giữ vai trò chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa ấy Nếu

vì điều kiện nào đó làm cho lá bị úa vàng thì trái ở vị trí đó thường bị rụnghoặc lép

Các nhà chọn giống đậu nành đưa ra cơ sở để nâng cao năng suất đậunành là tăng cường quá trình quang hợp và muốn quang hợp với hiệu quả caothì phải chọn những cây có bộ lá nhỏ, dày, thế lá đứng và lá có dạng hìnhtrứng

Số lá nhiều to khỏe nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ Khi phiến lá pháttriển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi là biểu hiện cây sinh trưởngkhỏe có khả năng cho năng suất cao (Trần Văn Điền, 2007).

2.2.4 Hoa

Chồi bên phát triển thành cụm gồm 2-35 hoa Hoa rụng từ 20-80% Đậunành có hoa có tràng cánh bướm (Carlson and Lersten, 2004) Hoa đậu nànhthuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5

lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy

+ Đài hoa có màu xanh, nhiều bông

+ Cánh hoa: Một cánh to gọi là cánh cờ, 2 cánh bướm và 2 cánh thìa.+ Nhị đực: 9 nhị đực cuốn thành ống ôm lấy vòi nhụy cái và 1 nhị riênglẻ

+ Nhụy cái: Bầu thượng, tử phòng một ngăn có 1-4 tâm bì (noãn) nên thường trái đậu nành có 2-3 hạt

Các cánh hoa vươn ra khỏi lá đài từ ngày hôm trước và việc thụ phấnxảy ra vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 giờ sáng trước khi nụ hoặc hoa chưa nởhoàn toàn Mùa hè hoa thường nở sớm hơn mùa đông và thời gian nở hoa rấtngắn sáng nở chiều tàn Hoa đậu nành thường thụ phấn trước khi hoa nở và làcây tự thụ phấn, tỉ lệ giao phấn rất thấp chiếm trung bình 0,5-1% (Ngô Thế

Dân và ctv., 1999).

2.2.5 Trái và hạt

Chùm hoa ở mỗi đốt có thể phát triển từ 1 đến hơn 20 trái Một cây cóthể có đến 400 trái Trái đậu nành tương tự như trái các cây họ đậu khác Một

trái thường chứa 1 đến 3 hạt và hiếm khi 4 hạt, ngoại trừ các cây có na allele

có những lá chét hẹp và có tỉ lệ trái 4 hạt cao hơn (Singh et al., 2007).

Trái đậu nành thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2-7 cm hoặc hơn Trái

có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc đen Màu sắc tráiphụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc của lông, sự có mặt của cácsắc tố antocyanin Lúc trái non có màu xanh nhiều lông (có khả năng quanghợp do có diệp lục), khi chín có màu nâu Hoa đậu nành ra nhiều nhưng tỉ lệđậu trái thấp 20-30%

Ví dụ trong vụ xuân 1 cây có thể có 120 hoa nhưng chỉ đậu 30-40 trái làcao, trên một chùm 5-8 hoa chỉ đậu 2-3 trái Những đốt ở phía gốc thường trái

ít hoặc không có trái, từ đốt thứ 5-6 trở lên tỉ lệ đậu trái cao và trái chắc nhiều.Trên cành thường từ đốt 2-3 trở lên mới có trái chắc, những trái trên đầu cành

thường lép nhiều Sau khi hoa nở được 2 ngày thì cánh hoa héo và rụng, ngàythứ 3 đến ngày thứ 5 sau hoa nở đã hình thành trái và 7-8 ngày sau là thấynhân trái xuất hiện Trong 18 ngày đầu trái lớn rất nhanh sau đó chậm dần, vỏdày lên và chuyển từ màu xanh sang màu vàng Hạt lớn nhanh trong vòng 30-

35 ngày sau khi hình thành trái

Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: Hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt Giống có màu vàng giá trị thương phẩm cao Trong hạt, phôi thường chiếm2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt Hạt to nhỏkhác nhau tùy theo giống, khối lượng một nghìn hạt (M1.000 hạt) thay đổi từ20-400 g trung bình từ l00-200 g

Rốn hạt của các giống khác nhau thì có màu sắc và hình dạng khác nhau,đây là một biểu hiện đặc trưng của các giống (Trần Văn Điền, 2007)

2.3 Yêu cầu sinh thái của cây đậu nành

Đậu nành chịu mặn và chịu chua kém hơn nhiều cây trồng khác Độ pH

có thể phát triển bình thường được là từ 5,0-8,0, độ pH thích hợp nhất là 7,0, dưới 4,0 và trên 9,5 đậu nành không sống được (Trần Văn Điền, 2007)

6,0-Ở miền Nam nước ta, đậu nành cũng được trồng trên nhiều loại đất nhưđất phù sa mới, đất phù sa cổ, đất đỏ, đất xám, đất phèn ít, đất phèn mặn, đấthữu cơ… (Nguyễn Thị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc, 2011)

2.3.2 Nhiệt độ

Đậu nành được trồng rải ở nhiều nước trên thế giới, có thể trồng tới 470

vĩ bắc (Ngô Thế Dân và ctv., 1999) Đậu nành có nguyên sản ở Trung Quốc

nên nói chung đậu nành là một loại cây ưa nhiệt độ ấm Nhiều tài liệu nghiêncứu cho rằng muốn trồng cây đậu nành phải có nhiệt độ đầy đủ trong các thời

kì sinh trưởng hay tổng tích ôn không nhỏ quá 24000C (Nguyễn Danh Đông,1982) Đậu nành có thể trồng được ở những vùng nào nhiệt độ trong suốt thờigian sinh trưởng từ 170C đến 290C và nhiệt độ ban đêm không thấp dưới

150C (Lawn, 1982) Cây đậu nành ưa nhiệt độ cao nhưng tùy theo thời kỳsinh trưởng khác nhau mà yêu cầu nhiệt độ khác nhau (Trần Văn Điền, 2007)

2.3.3 Nước

Theo Nguyễn Thị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc (2011), nước là một trongnhững yếu tố hàng đầu của môi trường có ý nghĩa rất quan trọng đối với sựsinh trưởng và phát triển của đậu nành Trong thực tế sản xuất, mặc dù hiếm

có trường hợp đậu nành chết vì hạn, nhưng nước là một yếu tố thường hạnchế năng suất đậu nành, nhất là trong điều kiện mùa khô ở miền Nam

So với lúa, bắp, cao lương, khi nảy mầm hạt đậu nành hút thu một lượngnước lớn hơn rất nhiều, nhưng sức hút nước của hạt thì lại kém hơn các loạitrên Trong trường hợp độ ẩm của đất chỉ đủ cho hạt trương lên mà không đủđảm bảo cho hạt nảy mầm, cũng như trong điều kiện đất bị úng ở tuần đầu thìhạt thường bị nấm mốc tấn công và thối Đây là nguyên nhân gây ra tình trạngđậu nành mọc không đều ở ngoài đồng

Đậu nành không chịu được hạn lẫn úng Bộ rễ của cây tập trung phần lớn

ở tầng đất cày nên khả năng sử dụng nước ở các tầng đất sâu khó hơn Muốncho quá trình sinh trưởng của cây không bị kìm hãm thì ẩm độ đất trongkhoảng 75-90% độ ẩm giới hạn ngoài đồng ở tầng đất 1-20 cm Ẩm độ đấtdưới 75% ẩm độ giới hạn ngoài đồng sẽ kìm hãm sự sinh trưởng của cây đậunành nhưng mức độ kìm hãm thay đổi tùy theo điều kiện khí hậu, nhiệt độ và

giai đoạn sinh trưởng của cây (Trần Thượng Tuấn và ctv., 1983).

Trong cả vụ, nhu cầu nước đối với cây đậu nành dao động từ khoảng 350

tới 800 mm (Mayer et al., 1992) Nhưng nhu cầu nước phụ thuộc vào độ dài

thời gian sinh trưởng, tốc độ phát triển của cây trước khi phủ kín đất và lượngnước sẵn có trong đất Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước củacây không đồng đều qua các giai đoạn Ở giai đoạn nảy mầm và cây con, tỉ lệ

sử dụng nước thấp do tán cây còn nhỏ và phần lớn số nước mất đi do bay hơitrên mặt đất Nhu cầu nước của cây đậu nành tăng dần khi cây ở giai đoạn từ3-5 lá kép, tăng nhanh và cao nhất ở giai đoạn sinh trưởng sinh thực từ khi cây

ra hoa đến khi quả vào chắc Giai đoạn quả bắt đầu chín, nhu cầu nước lạigiảm đi cùng với sự tàn của lá và lượng nước bay hơi giảm

Ảnh hưởng của nước có thể do thừa nước gây tổn thương bộ rễ do thiếukhông khí hoặc có thể do thiếu nước dẫn đến cây bị héo Nước ảnh hưởngđến sinh trưởng của cây bao gồm về cả sinh lý, sinh hóa, hình thái và giảiphẫu của cây dẫn đến làm giảm năng suất (Trần Văn Điền, 2007)

2.3.4 Ánh sáng

Đậu nành thuộc cây ngày ngắn Tuy nhiên, ngày nay nó phân bố rất rộngtrên thế giới với những giống có phản ứng rất khác nhau với quang kỳ Trong

điều kiện miền Nam nước ta, các giống ít quang cảm và không quang cảmthích hợp hơn vì chúng có khả năng thích nghi rộng và trồng được nhiều mùa

vụ khác nhau (Trần Thượng Tuấn và ctv., 1983).

Về mặt cường độ ánh sáng, nhu cầu của đậu nành 50.000 lux (Upmeyerand Kollar, 1973) thấp hơn nhiều so với bắp, cao lương và nhiều cây trồngkhác Có thể vì thế cây đậu nành thích hợp trồng xen với các cây trồng khác cóyêu cầu về cường độ ánh sáng cao hơn Cường độ ánh sáng bão hòa đối vớitán cây đậu nành bằng khoảng 60.000 lux (bằng nửa cường độ ánh sáng giữatrưa) vào đầu thời kỳ trổ hoa, sau đó giảm xuống còn 40.000 lux ở giai đoạnhạt xanh của cây

Đậu nành thuộc nhóm cây có hiện tượng quang hô hấp, tức là hiện tượnggia tăng hô hấp ở cường độ ánh sáng cao Quá trình hô hấp tiêu phí mất mộtlượng đáng kể sản phẩm quang hợp theo con đường oxy hóa đến CO2 nên hạnchế năng suất của đậu nành Vì điều kiện ánh sáng ảnh hưởng đến quá trìnhquang hợp, tạo ra các sản phẩm cung cấp cho hoạt động của nốt sần nên cũng

có ảnh hưởng gián tiếp đến sự hình thành nốt sần và sự cố định đạm (NguyễnThị Xuân Thu và Lê Vĩnh Thúc, 2011)

2.4 Đất mặn và tình hình xâm nhập mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long

2.4.1 Khái niệm đất mặn

Đất mặn được xem là đất có vấn đề rất phổ biến trên thế giới, làm hạnchế năng suất cây trồng Tính chất vật lý và hóa học của đất mặn rất đa dạng.Biến thiên này tùy thuộc vào nguồn gốc của hiện tượng mặn, pH đất, hàmlượng chất hữu cơ trong đất, chế độ thủy văn, và nhiệt độ (Akbar andPonnamperuma, 1982) Đất mặn chứa một lượng muối hòa tan trong nước ởvùng rễ cây, làm thiệt hại đến hoạt động sinh trưởng của cây trồng Mức độgây hại của đất mặn tùy thuộc vào loài cây trồng, giống cây, thời gian sinhtrưởng, các yếu tố môi trường đi kèm theo nó, và tính chất của đất Do đó,người ta rất khó định nghĩa đất mặn một cách chính xác và đầy đủ Hội KhoaHọc Đất của Mỹ (SSSA, 1979) đã xác định đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC)lớn hơn 2 dS m, không kể đến hai giá trị khác là tỉ lệ hấp thu sodium (SAR) và

pH Tuy nhiên, hầu hết các định nghĩa khác đều chấp nhận đất mặn là đất có

độ dẫn điện EC cao hơn 4 dS m ở điều kiện nhiệt độ 250C, phần trăm sodiumtrao đổi ESP kém hơn 15, và pH nhỏ hơn 8,5 (US Salinity Laboratory Staff,1954) Đến 2005 thì định nghĩa đất mặn cũng vẫn là đất có độ dẫn điện củadung dịch được ly trích từ hỗn hợp đất bão hòa nước Ece (Electrical

Conductivity of the extract) là 4 dS m (≈ NaCl 2,3 g L hoặc cao hơn)

(Chinnusamy et al., 2005).

2.4.2 Tình hình xâm nhập mặn ở Đồng bằng sông Cửu Long

Theo Lê Xuân Định và ctv (2016), những năm gần đây, diễn biến xâm

nhập mặn ở ĐBSCL phức tạp, bất thường, năm sớm năm muộn so với cùng kỳnhiều năm Năm 2011, xâm nhập mặn sớm hơn, từ giữa tháng 2, nhiều địaphương vùng ĐBSCL, Tây Nguyên đã phải đối phó với hạn hán và đặc biệt làtình trạng nước mặn xâm nhập Tại một số tỉnh ven biển ĐBSCL, nước biểnxâm nhập sâu vào các sông rạch khiến các dòng sông bị nhiễm mặn sớm, gâyảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống người dân và hoạt động nông nghiệp.Đặc biệt, những tháng đầu năm 2016, diễn biến xâm nhập mặn tại ĐBSCLđược đánh giá nặng nề nhất trong 100 năm qua và dự báo còn diễn biến xấuhơn trong những năm tiếp theo

Do vị trí địa lý, ĐBSCL chịu ảnh hưởng của thủy triều từ cả biển Đông

và biển Tây Trong mùa cạn, khi lưu lượng nước ở thượng lưu đổ về giảm,thủy triều ảnh hưởng mạnh lên thượng lưu và hệ thống kênh rạch nội đồng,dẫn theo nước mặn xâm nhập sâu cả trên sông và nội đồng Theo thống kê, cótrên 50% diện tích ĐBSCL (39.330 km2) bị nhiễm mặn, gồm địa phận các tỉnhnhư Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau

và Kiên Giang Trên cơ sở số liệu tại các trạm đo mặn và số liệu điều tra khảosát mặn ở vùng cửa sông Tiền - sông Hậu (các tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, TràVinh, và một phần Sóc Trăng), sông Vàm Cỏ (tỉnh Long An), vùng Bán đảo

Cà Mau (tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau) và vùng ven biển Tây (tỉnhKiên Giang và một phần tỉnh Cà Mau), có thể chia ĐBSCL ra các vùng chịuảnh hưởng của xâm nhập mặn như sau:

- Vùng ven sông Vàm Cỏ thuộc địa phận tỉnh Long An: Hiện trạng xâmnhập mặn vùng hai sông Vàm Cỏ từ đầu mùa khô đến đầu tháng 3 (4/3/2016),

độ mặn xuất hiện lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 tăng từ 4,7-7,4 g/L

- Vùng các cửa sông Cửu Long: Hiện tượng xâm nhập mặn vùng cửasông Cửu Long từ đầu mùa khô đến đầu tháng 3 (ngày 4 3 2016), độ mặn xuấthiện lớn nhất so với cùng kỳ năm 2015 tăng từ 1,5-8,2 g/L

- Vùng các cửa sông Tiền, sông Hậu: Mặn cũng theo thủy triều từ biểnĐông xâm nhập vào trong sông Độ mặn trung bình tháng và độ mặn lớn nhấttrong năm thường xuất hiện trong tháng 3 hoặc tháng 4 Độ mặn cao nhấttrong mỗi tháng và độ mặn lớn nhất trong thời gian quan trắc tại các vị trí khácnhau trên một dòng sông Chiều dài xâm nhập của độ mặn 4‰ khoảng 50-57

km, trong đó sâu nhất trên nhánh cửa Tiểu - nhánh sông có tỉ lệ phân nước nhỏnhất (Lê Hữu Thuần, 2013).

- Vùng ven biển Tây gồm tỉnh Kiên Giang và một phần tỉnh Cà Mau:Hiện tượng xâm nhập mặn khu vực ven biển Tây, trên sông Cái Lớn từ đầumùa khô đến đầu tháng 3 (ngày 4 3 2016), độ mặn xuất hiện lớn nhất so vớicùng kỳ năm 2015 tăng từ 4,8 - 7,6 g/L

- Vùng Bán đảo Cà Mau: Đây là khu vực chịu ảnh hưởng của mặn theothủy triều ở cả biển Tây và biển Đông Mặn theo thủy triều biển Đông ngượcsông Hậu và sông Mĩ Thanh ảnh hưởng trong phạm vi tỉnh Sóc Trăng, ngượcsông Gành Hào ảnh hưởng tới thị xã Bạc Liêu trên kênh Cà Mau-Bạc Liêu,đến kênh Quản Lộ-Phụng Hiệp Trên kênh Cà Mau-Bạc Liêu xuất hiện vùnggiáp triều-mặn ở khu vực lân cận thị xã Bạc Liêu Khi triều lên, nước chảy từBạc Liêu về phía sông Gành Hào

Diễn biến mặn trong khu vực khá phức tạp, độ mặn lớn nhất trong thời kỳquan trắc hầu như không xuất hiện đồng thời cùng một năm ở các vị trí khácnhau Tuy nhiên, độ mặn trung bình tháng lớn nhất xuất hiện chủ yếu trongtháng 4 hoặc tháng 5, chậm hơn so với các khu vực khác

2.5 Sự chống chịu mặn của cây đậu nành

2.5.1 Ảnh hưởng của mặn trên cây đậu nành

Đậu nành được xem là loài nhạy cảm với mặn (Lauchli, 1984) Sảnlượng của các giống đậu nành nhạy cảm với mặn giảm rất nghiêm trọng dướiđiều kiện mặn Sản lượng đạt 80% ở 4,0 dS/m, 44% ở 6,7 dS/m so với 100% ở

0,8 dS/m (Katerji et al., 2003) Tổn hại do mặn ở đậu nành là do sự tích lũy

của ion Cl- trong thân và lá và được biểu hiện qua hiện tượng cháy lá (Abeland MacKenzie, 1964; Essa, 2002) Tuy nhiên các kiểu gen khác nhau về mức

độ tổn thương cho thấy có sự đa dạng di truyền trong tính chống chịu mặn.Theo Ashraf (1994), đậu nành được xếp vào nhóm cây trồng chịu mặntrung bình và năng suất cuối cùng của đậu nành sẽ giảm khi độ mặn của đất

vượt quá 5 dS/m Kết quả của Chang et al (1994) cho thấy sản lượng trung

bình của 20 giống đậu nành ở các điều kiện mặn là đối chứng, 14-15 dS/m, và18-20 dS m tương ứng là 2.261,4±438,3 kg/hm2 (đối chứng), 1.073,4±267,1kg/hm2 (47,5% của đối chứng), và 880,8±259,9 kg/hm2 (38,9% của đốichứng)

Nồng độ muối cao gây tổn hại cả chu kỳ đời sống của cây đậu nành Mức

độ chống chịu mặn của các giống đậu nành khác nhau ở các giai đoạn pháttriển khác nhau (Abel and MacKenzie, 1964)

Ảnh hưởng đến sự nảy mầm: Sự nảy mầm của đậu nành bị trì hoãn ởnồng độ muối thấp (NaCl 0,5 và 1 g/L) Nồng độ muối cao dẫn đến giảm hoàntoàn sự nảy mầm (Abel and MacKenzie, 1964) Ảnh hưởng của các muối lênthời điểm bắt đầu và tỉ lệ nảy mầm càng nổi bật hơn ở những giống nhạy cảmvới mặn so với giống chống chịu mặn (Abel, 1969).

Ảnh hưởng ở giai đoạn trưởng thành: Sự chống chịu mặn cao ở giai đoạnnảy mầm không chỉ ra một sự chống chịu tương tự ở giai đoạn trưởng thành

Ví dụ giống đậu nành “Lee”, “Coiquitt” và “Clark 36” có cùng một mức độgiảm tỉ lệ nảy mầm khi được cảm ứng mặn, tuy nhiên, ảnh hưởng bất lợi củamặn lên chiều cao cây và trọng lượng khô của chồi ở giống “Lee” thấp hơn rấtnhiều so với 2 giống còn lại (Essa, 2002)

Giai đoạn cây con của đậu nành nhạy cảm với stress mặn nhiều hơn giai

đoạn nảy mầm rất nhiều (Hosseini et al., 2002) Sự sinh trưởng của cây con ở

nồng độ NaCl 12,9 g/L giảm 5% so với đối chứng không xử lý, trong khi đó sự

ức chế sinh trưởng được quan sát ở nồng độ NaCl 17,5 g/L Sự nảy mầm(40%) vẫn có thể đạt được thậm chí khi nồng độ Na+ trong trục phôi đạt 9,3mg/g trọng lượng tươi, trong khi sự sinh trưởng của cây con hoàn toàn bị ứcchế khi trong mô có nồng độ Na+ 6,1 mg/g trọng lượng tươi

Các đặc tính nông học của đậu nành có thể bị ảnh hưởng nghiêm trọngbởi độ mặn cao như giảm chiều cao, kích thước lá, sinh khối, số lóng, sốnhánh, số trái, trọng lượng cây và trọng lượng 100 hạt (Abel and MacKenzie,

1964; Chang et al., 1994).

Ảnh hưởng của mặn lên sự thành lập nốt sần: Các giai đoạn sớm liênquan đến sự thành lập nốt sần ở đậu nành rất nhạy cảm với muối NaCl Thậmchí, nồng độ thấp (NaCl 1,6 g/L) làm giảm đáng kể trọng lượng và số lượngnốt sần Kết quả là hàm lượng đạm ở chồi bị giới hạn do mô nốt sần không đủ

để đáp ứng nhu cầu đạm của các chồi không bị stress (Singleton and Bohlool,1984)

Nốt sần của đậu nành chống chịu mặn dòng Rhizobium USDA 208 và dòng nhạy cảm mặn Bradyrhizobium RCR 3407 (CBl809) được Elsheikh and

Wood (1995) đánh giá trong điều kiện đất mặn ở nhà lưới Kết quả cho thấykhông có sự khác biệt giữa trọng lượng khô của rễ, chồi, số lượng và trọng

lượng nốt sần giữa dòng chịu mặn Rhizobium và dòng nhạy cảm mặn

Bradyrhizobium Nốt sần đậu nành giảm hơn 50% khi đất có bổ sung NaCl 2

g/L Hoạt động của nốt sần ở cả hai dòng cũng giảm bởi mặn Nốt sần nhạycảm hơn so với sinh trưởng của cây trong điều kiện mặn Dòng chịu mặn cốđịnh đạm nhiều hơn dòng nhạy cảm trong điều kiện mặn

Song et al (2017) đã đánh giá các kiểu gen đậu nành chống chịu mặn

liên quan đến nốt sần và sự hấp thu đạm ở đậu nành Kết quả cho thấy các kiểugen chống chịu mặn biểu hiện tốt hơn về nốt sần, màu xanh của lá và sự hấpthu đạm dưới điều kiện mặn

Ảnh hưởng lên chất lượng hạt: Stress mặn làm giảm hàm lượng proteinhạt Tuy nhiên, kết quả về ảnh hưởng của nó lên hàm lượng dầu trong hạt vẫnchưa thuyết phục do các kết quả thí nghiệm khác nhau ở các địa điểm thínghiệm khác nhau trên các giống khác nhau được xử lý với độ mặn khác nhau

(Chang et al., 1994; Wan et al., 2002).

2.5.2 Các nghiên cứu về sự chống chịu mặn trên cây đậu nành

Một số kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của mặn trên sự sinh trưởng của cây đậu nành

Shereen et al (2001) đã áp dụng phương pháp thủy canh để nghiên cứu

sự sinh trưởng và mối liên hệ giữa các ion của 4 giống đậu nành ở nồng độmuối từ 0,6-2,3 g/L ở các giai đoạn phát triển khác nhau Kết quả cho thấynồng độ muối gia tăng làm giảm trọng lượng tươi và khô của chồi Tốc độtăng trưởng tương đối giảm khi tăng nồng độ muối Sự chống chịu mặn liênquan đến sự điều hòa Na+ ở chồi Nồng độ K+ và dòng chảy K+ cao nhất ở đốichứng và giảm ở điều kiện mặn Một tỉ lệ K+/Na+ cao nói chung liên quan đếnkhả năng chống chịu mặn tốt hơn

Valencia et al (2008) đã tìm ra một phương pháp hiệu quả cho việc phát

hiện tính kháng mặn trên cây đậu nành Kết quả này sẽ giúp cho việc quan sát

và ghi nhận sự đáp ứng của cây đậu nành đối với stress mặn một cách nhanhchóng và hiệu quả dựa trên những triệu chứng ở lá

Hamayun et al (2010) đã nghiên cứu những ảnh hưởng bất lợi của ngộ

độc mặn do muối NaCl lên các đặc tính sinh trưởng và mức độ các hormonenội sinh như gibberellins (GA), abscisic acid (ABA), jasmonic acid (JA) vàsalicylic acid (SA) của giống đậu nành cv Hwangkeumkong Chiều cao cây,sinh khối, hàm lượng chlorophyll, số trái, trọng lượng 100 hạt và sản lượnggiảm một cách ý nghĩa ở nồng độ muối NaCl 4,1 và 8,2 g L Dưới điều kiệnstress mặn, hàm lượng GA và SA giảm trong khi hàm lượng ABA và JA tăngrất đáng kể Kết quả cho thấy stress mặn làm giảm nghiêm trọng sự sinhtrưởng và các thành phần sản lượng của đậu nành thông qua ảnh hưởng lêncác hormone sinh trưởng nội sinh

Farhoudi and Tafti (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của stress mặn lên

sự sinh trưởng và sự cân bằng ion nội môi của cây con 3 giống đậu nành Hill,

Klark và Williams Hạt được gieo trên đĩa petri chứa các nồng độ muối NaCl

có các giá trị EC là 4, 8, 12 và 16 dS m và nước cất dùng làm đối chứng Hạtđược đặt dưới điều kiện 16 giờ ngoài sáng, 8 giờ tối, ẩm độ 70% và nhiệt độ24±10C Các chỉ tiêu được lấy 1 lần/ngày trong 10 ngày Kết quả cho thấystress mặn làm giảm sự nảy mầm, trọng lượng tươi của cây con, sinh trưởngcủa cây con và tỉ lệ K+ trong sinh khối khô nhưng làm tăng thời gian nảy mầmtrung bình và tỉ lệ Na+ Tỉ lệ K+/Na+ của giống Hill cao hơn của Klark vàWilliams cho thấy sinh trưởng của cây con giống Hill dưới điều kiện mặn tốthơn hai giống còn lại

Trong nghiên cứu của Kondetti et al (2012), ảnh hưởng của sự stress

mặn lên 11 giống đậu nành Ấn Độ (Co-1, CoSoy-2, DS-40, GujratSoy-1, 80-21, MACS-13, MAUS-2, NRC-2, PalamSoy, Pusa-16 và Shilageet) đượcphân tích dưới các nồng độ muối NaCl tăng dần (0; 7,0; 10,5; 14,0 và 17,5g/L) Mặn có ảnh hưởng bất lợi cho sự nảy mầm và tất cả các chỉ tiêu sinh lý(chiều dài rễ, chiều cao chồi, tỉ lệ rễ/chồi, sản lượng vật chất khô của rễ vàchồi, hàm lượng ẩm độ của rễ và chồi) ở giai đoạn sinh trưởng sớm của câycon Kết quả cho thấy có sự khác biệt về giống ở tất cả các chỉ tiêu

JS-Ở Việt Nam, Quach et al (2019) đã so sánh tính chống chịu mặn trên 18

giống đậu nành Dưới điều kiện stress NaCl từ 0 đến 11,7 g/L, có sự khác biệtlớn trong sự chống chịu mặn của 18 giống đậu nành này PI 675847 A (giốngđậu nành Việt Nam DT2008) được xác định là nguồn chống chịu mặn có hiệuquả Trong suốt quá trình sinh trưởng dinh dưỡng, PI 675847 A có tỉ lệ cháy láthấp hơn, sự bền vững màng tế bào cao hơn, quang hợp và tích lũy sinh khốitốt hơn trong điều kiện mặn so với 17 dòng còn lại Thêm vào đó, PI 675847 Aduy trì sinh trưởng và sản lượng hạt tốt hơn trong điều kiện mặn so với cácdòng nhạy cảm Phân tích hàm lượng ion trong lá dưới điều kiện mặn cho thấy PI 675847 A có thể giới hạn sự hấp thu và vận chuyển Na+ và Cl-

2.5.3 Cơ chế chống chịu mặn của cây đậu nành

Theo Phang et al (2008), cơ chế chống chịu mặn của đậu nành có thể

được chia thành 4 nhóm chính, bao gồm: (i) duy trì sự cân bằng ion nội môi(ion homeostasis); (ii) sự điều chỉnh trong đáp ứng với stress thẩm thấu; (iii)

sự phục hồi cân bằng oxy hóa; và (iv) sự thích nghi về mặt cấu trúc và trao đổichất khác Khả năng chống chịu mặn khác nhau thể hiện ở các giống khácnhau được quyết định bởi hiệu quả của chúng trong sự hoạt động và phối hợpgiữa các hệ thống này

Duy trì sự cân bằng ion nội môi và vai trò của các transporter vận chuyển ion

Theo Gao et al (2007), các loại muối ưu thế ở các vùng ven biển và nội

địa là NaCl và Na2CO3/NaHCO3 Hầu hết các nghiên cứu trên A thaliana và

lúa cho thấy Na+ là ion gây chết chủ yếu và sự tích lũy Na+ quá ngưỡng lànguyên nhân cơ bản của sự chết do mặn Tuy nhiên, ở đậu nành, các thínghiệm cơ bản được thực hiện bởi Abel và cộng sự cho thấy sự tổn hại do mặnliên quan đến hàm lượng Cl- trong các bộ phận tiếp xúc với không khí (Abeland MacKenzie, 1964; Abel, 1969) Na+ hay Cl- đóng vai trò quan trọng hơngây ra sự chết do mặn với muối NaCl ở đậu nành vẫn còn chưa sáng tỏ (Phang

et al., 2008).

Một vài kết quả nghiên cứu đã ủng hộ ý kiến cho rằng sự chia ngăn trong

và ngoài tế bào có liên quan đến sự điều hòa của nội cân bằng ion Na+ ở câyđậu nành Khi xử lý NaCl, các tế bào nhu mô có thể biệt hóa thành các tế bàovận chuyển với vách phát triển tốt phồng lên liền kề với các lỗ của mạch mô

gỗ bị bao lại ở vùng đầu của rễ và thân Vách mọc vào trong được quan sát ởcác tế bào nhu mô mô gỗ của đậu nành trong điều kiện stress mặn (Lauchli andWieneke, 1978) Hơn thế, nhu mô mô gỗ ở ranh giới mô gỗ/symplast của rễđậu nành có thể bơm tích cực ion Na+ từ dòng thoát hơi nước trong sự trao đổivới ion K+ Sự trao đổi Na+-K+ được điều hòa bởi các antiporters Na+/H+ và

K+/H+ Quá trình này được cung cấp năng lượng bởi H+-ATPase, được tăngcường bởi nồng độ K+ ở bên ngoài và phụ thuộc vào tính thấm của anion(Durand and Lacan, 1994; Lacan and Durand, 1995)

Một số gen mã hóa các transporter vận chuyển ion của đậu nành đã đượcxác định và cho thấy có liên quan đến sự chống chịu mặn (Bảng 2.1), bao gồm

cả các transporter vận chuyển ion nằm trên màng sinh chất và không bào

(Phang et al., 2008).

Bảng 2.1 Gen mã hóa transporter vận chuyển ion liên quan đến sự chống chịumặn ở đậu nành

GmCLC1 Kênh Cl+ trong không bào Li et al., 2006

GmNHX1 Antiporter Na+/K+ trong Li et al., 2006; Sun et al.,

GmSOS1 Antiporter Na+/K+ Phang, 2008

GmCNGC Kênh cation có cổng Phang, 2008

nucleotide

GmGLR3 Receptor glutamate Phang, 2008

GmNKCC Đồng vận chuyển Phang, 2008

Na+/K+/Cl

-GmCAX1 Trao đổi cation/proton Luo et al., 2005b

Sự điều chỉnh thẩm thấu bởi các chất bảo vệ thẩm thấu

Nồng độ muối cao dẫn đến thế năng nước trong môi trường thấp, kết quả

là gây ra stress thẩm thấu cho cây Cơ thể cây đậu nành sẽ có các đáp ứng thẩmthấu để đương đầu với hạn sinh lý Ở điều kiện stress mặn trong thủy canh,cây đậu nành ngay lập tức trải qua sự stress thẩm thấu, quan sát bởi hiện tượng

lá héo rũ trong 1 giờ và độ dẫn của khí khẩu giảm thấp hơn 50% vạch ranhgiới trong 10 phút sau khi xử lý với NaCl Lá lấy lại sức trương sau nhiều giờ

xử lý cho thấy cơ thể thực vật phải trải qua sự điều chỉnh thẩm thấu để bảo tồndòng thoát hơi nước của chúng

Sự tích lũy các chất bảo vệ thẩm thấu

Trong sự đáp ứng đối với stress thẩm thấu gây ra do mặn hoặc hạn, câytrồng có thể tích lũy các chất biến dưỡng hoạt động như là các chất tan tươnghợp để làm thấp thế năng thẩm thấu của tế bào mà không ảnh hưởng đến các

phản ứng trao đổi chất bình thường (Hasegawa et al., 2000) Các chất tan

tương hợp này thường là các hợp chất ưa nước với trọng lượng phân tử thấp

và không mang điện ở pH sinh lý Về mặt hóa học, các chất này được chia làm

4 nhóm: Hợp chất onium (glycine betaine, dimethyl sulfonio propionate),polyols đường (mannitol, D-ononitol, trehalose, pinitol), amino acids(proline), và alkaloids (trigonelline) Các chất tan tương hợp này có thể có cácchức năng bảo vệ khác ngoài chức năng điều chỉnh thẩm thấu Ví dụ, glycinebetaine có thể làm ổn định protein và màng (Papageorgiou and Murata, 1995),trong khi mannitol có thể tham gia chống lại các gốc oxy hóa tự do ROS

(reactive oxygen species) (Shen et al., 1997a,b) Vì vậy các chất tan này còn

được gọi là các chất bảo vệ thẩm thấu Một số chất bảo vệ thẩm thấu chínhtham gia vào sự chống chịu mặn ở đậu nành như glycine betaine, trigonelline,pinitol, và proline

Sự phục hồi cân bằng oxy hóa

Ty thể và lục lạp là nơi sản xuất chính ROS do hoạt động vận chuyển

electron của chúng (Bartoli et al., 2004) Ở tình trạng cân bằng sinh lý, ROS

được loại bỏ bởi các chất chống oxy hóa khác nhau Mặn và stress thẩm thấu

có thể làm xáo trộn sự cân bằng giữa sự tạo ra và loại bỏ ROS bằng cách làmsuy yếu quá trình loại bỏ Mức độ cao không mong muốn của ROS có thể gây

ra nhiều ảnh hưởng bất lợi đến tế bào, bao gồm sự ngăn chặn các enzymenhạy cảm, giảm diệp lục tố, peroxid hóa lipid, tấn công các đại phân tử bao

gồm acid nhân và thậm chí có thể làm chết tế bào (Fath et al., 2001).

Một cơ chế có thể của sự chống chịu mặn ở đậu nành là nâng cao hàmlượng và hoạt động của các chất chống oxy hóa khác nhau để phục hồi lại sựcân bằng oxy hóa và làm giảm tối thiểu sự tổn hại tế bào do stress oxy hóa thứcấp

Tổn hại oxy hóa (sự tích lũy O2 và MDA), hoạt động của các scavengerROS thuộc enzyme (SOD, CAT, peroxidase (POD), APX), và hàm lượng củacác scavenger ROS không thuộc enzyme (ascorbic acid, carotenoid vàglutathione) được đo trong lá và rễ của cây đậu nành bị stress mặn

Ở tử diệp đậu nành, 80%, 11%, và 9% hoạt động SOD tổng số được tìm

thấy trong tế bào chất, ty thể và lục lạp (Chen et al., 1997) Stress mặn đầu tiên

ức chế hoạt động của SOD trong lục lạp, kế tiếp trong ty thể và tiếp theo trong

tế bào chất Hoạt động và thành phần của các isozymes SOD cũng bị thay đổi

khi stress mặn (Chen et al., 1997), cho thấy vai trò quan trọng của các

isozymes SOD trong sự chống chịu mặn của đậu nành

Sự thích nghi về mặt cấu trúc

Sự thích nghi về mặt cấu trúc, bao gồm sự phát triển của các cấu trúcgiống tuyến muối và sự sửa đổi cấu trúc vách và màng tế bào có thể đóng vaitrò quan trọng trong sự chống chịu mặn ở đậu nành

Mặc dù đậu nành là loài không chịu mặn nhưng cấu trúc giống tuyến

muối được tìm thấy ở lá và thân của đậu nành hoang (Glycine soja) được thu thập ở Trung Quốc (Lu et al., 1998).

Protein vách tế bào giàu proline là một trong các thành phần của vách tếbào và rất nhạy cảm với các kích thích bên ngoài Ở đậu nành, SbPRP3 mã hóacho protein vách tế bào giàu proline, được cảm ứng bởi salicylic acid, sự xâm

nhiễm virus, stress mặn và hạn (He et al., 2002) Chức năng của SbPRP3 ở

đậu nành vẫn chưa rõ nhưng có thể hiểu được là đậu nành có thể đáp ứng

với stress mặn bằng cách tăng sản xuất SbPRP3 để thay đổi cấu trúc vách tếbào.

Hàm lượng acid béo bão hòa được nâng lên trong màng sinh chất có thểcải thiện sự thích nghi của màng sinh chất và tăng cường sự chống chịu mặncủa đậu nành (Surjus and Durand, 1996)

Luo et al (2005) báo cáo rằng cơ chế chống chịu mặn của đậu nành hoang khác với đậu nành được canh tác Sự chống chịu mặn ở G max chủ yếu

do sự ngăn cản sự vận chuyển ion Cl- từ rễ lên các bộ phận phía trên của câygiúp ngăn cản sự tích lũy đến mức gây độc trong thân và lá Ngược lại, lá của

các dòng đậu nành G soja chịu mặn hoặc đậu nành hoang thì không dễ bị tổn

thương do ngộ độc Cl- như G max nhưng dễ bị tổn thương hơn đối với sự

tích lũy Na+ Sự chống chịu mặn ở G soja chủ yếu là từ sự loại bỏ ion Na+

giúp ngăn cản sự tích lũy đến nồng độ độc ở thân và lá

2.6 Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Các giai đoạn trong nuôi cấy:

Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ

Đây là giai đoạn cải thiện điều kiện sinh lý và vệ sinh của cây mẹ nhằmlàm giảm bớt tỉ lệ mẫu bị nhiễm nấm (Debergh and Maene, 1981)

Khi lựa chọn cây mẹ phải xác định đúng cây cần nhân giống Cây mẹphải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòngtăng trưởng Cây mẹ sạch bệnh và đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thìkhi nhân giống sẽ đạt hiệu quả cao (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,2002)

Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng

Mẫu được đưa từ bên ngoài vào nhưng phải đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ

lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ tăng trưởng nhanh (Lê Trần Bình và ctv.,

1997)

Giai đoạn 2: Nhân nhanh số lượng

Giai đoạn này là tạo được số lượng cây con nhiều thông qua quá trìnhkích thích các trung tâm mô phân sinh (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Có 3phương pháp nhân chồi là phát sinh chồi bất định từ mô sẹo nhận được từ môphân sinh nuôi cấy, phát sinh chồi bất định trực tiếp từ mô thực vật khôngthông qua mô sẹo và phương pháp nhân chồi bên Trong đó phương pháp tạochồi bất định như một phương pháp nhân giống vô tính nhằm làm tăng sốlượng cây con Chồi bất định và những mô có liên quan là những cấu trúc có

nguồn gốc từ những vùng không phải là trục lá hoặc chồi ngọn Chồi bất định,

rễ, vi củ và các cấu trúc đặc biệt khác có thể có nguồn gốc từ thân, lá, củ, rễ.Chồi hoặc rễ bất định có thể có nguồn gốc từ mô sẹo và mô sẹo được coi như

là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con Số lượng cụm chồi/mô sẹo đượctăng qua những lần phân cắt khi cấy chuyền Cây con có thể chuyển sang giaiđoạn 3 để tạo rễ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Chồi, rễ vàphôi vô tính cũng có thể phát sinh trực tiếp từ mẫu cấy mà không qua giaiđoạn trung gian tạo mô sẹo (George, 1996)

Giai đoạn 3: Kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng

Trong nhiều trường hợp sự kéo dài là yêu cầu cho một sự tạo rễ đầy đủ.Chồi và cây con được tạo ra ở giai đoạn 2 thường rất nhỏ chưa có đủ khảnăng để phát triển ngoài môi trường tự nhiên Do đó, mục đích của giai đoạnnày là tạo cây phát triển đầy đủ rễ, thân, lá có khả năng thực hiện quang hợp

và sống sót mà không cần cung cấp nguồn cacbohydrate nhân tạo

Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hoặc một cytokininyếu hơn cytokinin đã được sử dụng trong giai đoạn 2 Có thể cần thiết thêmthan hoạt tính để trung hòa hiệu quả cytokinin còn lại trong giai đoạn 2 Tùythuộc vào kiểu cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hay cụm Auxin

là chất thường được sử dụng để tạo rễ, bên cạnh đó than hoạt tính cũng được

sử dụng rất phổ biến trong môi trường tạo rễ (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Thanhoạt tính tạo thuận lợi cho sự phát triển của rễ nhờ khả năng hấp thụ các chấtthải có tính ức chế của bản thân cây hoặc mô nuôi cấy, đồng thời giảm cường

độ ánh sáng vùng rễ phát triển (Druart and Wulf, 1993) Theo Nguyễn BảoToàn (2010), than hoạt tính có thể chứa các thành phần kích thích nhưpolyamine

Giai đoạn 4: Thuần dưỡng

Là giai đoạn chuyển cây ra nhà ươm, chuẩn bị cây con sẵn sàng cung cấp

cho sản xuất Chất lượng cuối cùng của kế hoạch in vitro tùy thuộc một phần

vào việc thuần dưỡng Thông thường, các rễ non được tạo ra trong ốngnghiệm có một biểu bì yếu ớt, nên khi đặt tiếp xúc với chất nền trong nhàươm, chúng trở nên khô héo nhanh chóng và chết Đây là giai đoạn tinh tếnhất, các rễ được sinh ra trong bình thì cực yếu và khi tiếp xúc với chất nền,chúng chết đi Phải chờ sự thành lập và sinh trưởng của rễ mới để cây tựdưỡng (Lâm Ngọc Phương, 2006)

Cây con chuyển từ giai đoạn 3 được rửa sạch agar, sau đó trồng trên giáthể thích hợp, được giữ ẩm độ cao, tránh cường độ ánh sáng cao Thời gian tốithiểu cho sự thích nghi khoảng 2-3 tuần, trong thời gian này cần hạn chế tối đa

những yếu tố bất lợi như mất nước nhanh chóng làm cho cây khô héo, nhiễm

vi khuẩn và nấm làm cho cây thối nhũn, cháy lá do nắng (George, 1993)

2.7 Phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma các dòng cây trồng chống chịu mặn

2.7.1 Khái niệm biến dị soma

Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối vàphương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây đồng nhất và như

bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú Tuy nhiên, với các công trình nghiên cứutrên nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế, người ta thấy rằng tế bào và môđược nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi ditruyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễmsắc thể, đột biến gen Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh.Nuôi cấy mô gây ra các biến dị trong cây tái sinh, được gọi là biến dị soma(somaclonal variation) (Larkin and Scowcroft, 1981) Biến dị soma chịu ảnhhưởng bởi loài cây, kiểu gen trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian

nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome Như vậy bản thân nuôi cấy mô

và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú

trong các điều kiện đã thích ứng Quan trọng hơn, theo Skirvin et al (1993) và

Jain (1998), nó có thể tạo ra các biến dị bền vững về mặt di truyền, rất có íchtrong cải thiện cây trồng, tương tự như được cảm ứng bởi tác nhân gây độtbiến vật lý và hóa học Theo Jain (2001) thì biến dị soma thì không thể dựđoán được trong tự nhiên, và có thể có cả tính di truyền và không di truyền(biểu sinh)

2.7.2 Cơ sở của biến dị soma

Sự xuất hiện biến dị soma liên quan đến các đột biến điểm, sự tái tổ hợp

và sắp xếp lại nhiễm sắc thể, sự methyl hóa DNA, số bản sao trình tự bị thayđổi, các nguyên tố chuyển vị, và dường như bị ảnh hưởng bởi kiểu gen, loạimẫu cấy, môi trường nuôi cấy và tuổi của cây cho (Jain, 1998) Tùy thuộc loạicây, số lần cấy chuyền là một yếu tố cũng có thể dẫn đến biến dị nhiều hơn Hệthống nuôi cấy mô tự bản thân nó hoạt động như một hệ thống gây đột biếnbởi vì các tế bào trải qua sự tổn thương khi phân lập, và có thể tái lập chươngtrình trong quá trình tái sinh dưới điều kiện rất khác với điều kiện tự nhiên Sựtái lập chương trình hay tái lập cấu trúc có thể tạo ra rất nhiều biến dị biểusinh trong cây tái sinh (Jain, 2000)

Biến dị soma ở mức độ nhiễm sắc thể

Biến dị nhiễm sắc thể đã được ghi nhận ở một vài loài cây cấy mô và thế

hệ con cháu của nó (Ahloowalia, 1976; Duncan, 1997; Gupta, 1998) Mẫu cấy

có số nhiễm sắc thể cao và có bội thể (ploidy) cao có nhiều biến dị hơn loài có

số nhiễm sắc thể thấp và ploidy thấp (Creissen and Karp, 1985) Các kiểm soátchu kỳ tế bào bình thường (có vai trò ngăn cản sự phân chia tế bào trước khi

sự sao chép DNA hoàn thành) bị gián đoạn bởi nuôi cấy, kết quả là tạo ra sự

đứt đoạn nhiễm sắc thể (Phillips et al., 1994) Nhiễm sắc thể bị đứt và hậu quả

của nó (sự thiếu, nhân đôi, đảo đoạn và chuyển đoạn) gây ra sự sai khác(Duncan, 1997)

Nguyên tố chuyển vị (Transposable elements)

Hoạt động của nguyên tố chuyển vị là một dạng biến dị nữa được cảmứng trong nuôi cấy mô Gen chuyển vị có thể được hoạt hóa trong nuôi cấy

mô dẫn đến biến dị soma được đề nghị lần đầu tiên bởi Ahloowalia (1985).Các dòng đột biến từ cây tái sinh tự nó không biểu hiện ra là đột biến khôngbền vững hay đột biến chất lượng Chỉ có một vài trường hợp đột biến khôngbền vững hay một phần nào đó của đột biến trong thế hệ con cháu được báocáo Groose and Bingham (1986) đã xác định đột biến màu hoa không bềnvững, hoạt động giống như đột biến được cảm ứng bởi nguyên tố chuyển vị.Tuy nhiên, các ngụ ý về nguyên tố chuyển vị vẫn chưa được chứng minh

Kaeppler et al (1998) đề nghị rằng các nguyên tố chuyển vị có thể chỉ chiếm một tỉ lệ tương đối nhỏ của biến dị trong nuôi cấy mô.

Biến dị phân tử

Những thay đổi kiểu hình ở cây được tái sinh và thế hệ sau của chúng lànhững đột biến chất lượng, là những đột biến gen đơn được di truyền theođịnh luật Mendel và là gen lặn Một số đột biến gen đơn như thiếu diệp lục tố,

lùn, tính trạng hạt, cấu trúc sinh sản, lá hoại tử ở bắp (Phillips et al., 1994).

Biến dị phân tử trong cây cấy mô được nhận diện ở mức độ DNA và protein.Biến dị ở mức độ DNA được nghiên cứu nhiều nhất bằng cách sử dụngphương pháp phân tích enzyme giới hạn Trong hầu hết trường hợp, nhữngthay đổi về kiểu giới hạn xảy ra như kích thước đoạn bị thay đổi hơn là sự

thêm vào hoặc mất đoạn giới hạn (Kaeppler et al., 1998).

Methyl hóa DNA

Sự methyl hóa DNA liên quan đến sự biểu hiện bị thay đổi của gen ở rấtnhiều loài thực vật và động vật Vai trò trực tiếp của methyl hóa DNA trong sựbiểu hiện gen vẫn còn là chủ đề tranh cãi mặc dù sự methyl hóa cytosine có

liên quan đến sự biểu hiện gen bị sửa đổi ở thực vật và động vật Sự methylhóa có thể tăng cường các biến dị tính trạng số lượng vì một số gen có thể bị

ảnh hưởng cùng lúc (Phillips et al., 1990) Tăng sự methyl hóa in vitro có tiềm

năng làm tăng sự điều hòa và hoạt động của gen Sự methyl hóa gen làm bấthoạt quá trình phiên mã và kết quả là kiểm soát sự biểu hiện của gen trong quá

trình phát sinh phôi soma (Duncan, 1997) Theo Lambe et al (1997), sự

methyl hóa gen liên quan đến sự biệt hóa tế bào và sự loại bỏ khả năng biệthóa của tế bào là nguyên nhân gây mất khả năng phát sinh cơ quan Biến dị tạo

ra do sự methyl hóa DNA có tính chất biểu sinh "epigenetic"

2.7.3 Phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma tính chống chịu mặn

Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật, mô hay cơ quan trên môi trường có

chứa tác nhân chọn lọc tạo cơ hội để chọn lọc và tái sinh cây với các đặc tínhmong muốn Kỹ thuật này cũng được sử dụng có hiệu quả để cảm ứng sựchống chịu bao gồm việc sử dụng một vài tác nhân chọn lọc cho phép sự sốngsót và sinh trưởng một cách ưu ái của những kiểu hình mong muốn (Purohit

et al., 1998) Các tác nhân được sử dụng trong chọn lọc in vitro là NaCl (cho

tính chống chịu mặn), PEG hoặc mannitol (cho tính chống chịu hạn), dịch lọc

nuôi cấy nấm đặc hiệu (fungal culture filtrate-FCF) hoặc phytotoxin nhưfusaric acid hoặc mầm bệnh (cho tính kháng bệnh) Mẫu cấy được tiếp xúc vớimột giới hạn rộng các tác nhân chọn lọc được thêm vào môi trường nuôi cấy.Chỉ những mẫu cấy có khả năng chịu đựng được môi trường này sống sóttrong một thời gian dài được chọn lọc

Hai kiểu phương pháp chọn lọc được đề nghị là chọn lọc dần dần(gradual selection), hay còn gọi là chọn lọc lâu dài (long-term selection) hay

xử lý lâu dài theo dạng bậc thang (stepwise long-term), nghĩa là mẫu cấy đượctiếp xúc với stress với nồng độ tác nhân chọn lọc tăng dần và thứ hai là chọnlọc tái diễn (recurrent selection), hay còn gọi là chọn lọc một bước (singlestep) hay xử lý sốc, trong đó mẫu cấy được tiếp xúc trực tiếp với sốc ở nồng

độ cao và chỉ những mẫu chịu đựng được mức độ này mới sống sót (Purohit et

al., 1998) Các phương pháp này dựa trên sự tạo các biến dị di truyền giữa các

tế bào, mô và/hoặc cơ quan trong nuôi cấy và tái sinh cây (Mohamed et al., 2000) Chọn lọc in vitro có thể rút ngắn một cách đáng kể thời gian chọn lọc

các tính trạng mong muốn dưới áp lực chọn lọc với các tương tác môi trườngthấp nhất và có thể chọn lọc ngoài đồng để bổ sung (Jain, 2001) Theo Dix(1990) thì phương pháp chọn lọc lâu dài ở nồng độ muối cao dường như làchiến lược tốt nhất Tuy nhiên, nồng độ muối cao hơn làm thấp sự sinh trưởngcủa mô sẹo và vì vậy làm hạn chế mật số tế bào mà các đột biến có thể xảy ra.Chọn lọc lâu dài làm tăng các sai khác nhiễm sắc thể tích lũy trong các tế bào

được nuôi cấy và cuối cùng là làm giảm tỉ lệ tái sinh cây dưới mức độ có thể

chấp nhận được Ở cây thuốc lá, Nabor et al (1980) đã sử dụng phương pháp

chọn lọc tái diễn với các nồng độ muối NaCl tăng cho thấy dường như cây táisinh có nhiều hơn một dạng chống chịu mặn

Vật liệu dùng trong kỹ thuật chọn lọc in vitro bao gồm mô sẹo, nuôi cấy

treo, phôi vô tính, nuôi cấy chồi Trong đó, mô sẹo (callus) hoặc mô sẹo phátsinh phôi (embryogenic callus) là vật liệu thường được sử dụng trong nhiềunghiên cứu

2.7.4 Một số ưu và khuyết điểm của phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma

2.7.4.1 Ưu điểm

Theo Jain (2001), phương pháp chọn lọc biến dị soma có các ưu điểmnhư:

- Các biến đổi có thể xảy ra ở các tính trạng nông học quan trọng

- Xảy ra với tần suất cao

- Một vài thay đổi có thể mới và có thể không có được bằng phương pháp chọn giống truyền thống

- Chọn lọc in vitro có thể giúp phân lập các dòng chống chịu với stress

sinh học và phi sinh học

- Rút ngắn thời gian phân lập dòng soma với tính trạng mong muốn

- Một quần thể lớn tế bào được sử dụng cho chọn lọc

2.7.4.2 Khuyết điểm

Mặc dù có nhiều thuận lợi, sự phát triển của cây chống chịu stress thông

qua chọn lọc in vitro có một vài hạn chế như:

- Mất khả năng tái sinh trong suốt quá trình chọn lọc

- Thiếu sự tương quan giữa các cơ chế chống chịu hoạt động trong tếbào, mô hay cơ quan và của cả cây với hiện tượng thích nghi biểu sinh Trong

suốt chọn lọc in vitro, các tế bào không chống chịu đôi khi có thể trải qua sự

thích nghi biểu sinh nghĩa là các thay đổi biểu sinh bền vững (stable epigeneticalterations) được thừa hưởng chỉ thông qua sự phân bào (mitosis) mà khôngphải thông qua sự phân bào giảm nhiễm (meiosis) đối với tác nhân chọn lọcđặc hiệu, vì vậy che khuất sự chọn lọc các đột biến hiếm có khả năng chốngchịu thật sự (meiotically inherited) (Tal, 1994) Hàng loạt các nghiên cứu chothấy sự methyl hóa DNA được sửa đổi là nguyên nhân chính gây ra các sửa