Hoàng thảo Kèn là một trong những loài lan tuyệt đẹp và quý hiếm. Ở một số nơi trên thế giới nó còn được đưa vào diện được bảo vệ nghiêm ngặt. Tại Việt Nam, cây có mặt ở miền Bắc. Hiện nay, Hoàng thảo Kèn rất ít được tìm thấy trong tự nhiên do bị thu mua và khai thác với số lượng lớn. Nhu cầu ngày càng lớn của thị trường đã khiến giá thành của Hoàng thảo Kèn bị đẩy lên rất cao và trở thành loài ngày càng bị khai thác nhiều. Việc nhân giống Hoàng thảo Kèn theo phương pháp truyền thống rất chậm không đáp ứng đủ nhu cầu thị trường 2. Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì vi nhân giống (in vitro) là công cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm. Nhân giống in vitro cho hệ số nhân giống cao cây tạo ra sạch bệnh đồng đều, không tốn diện tích nhân giống. Trong nhân giống in vitro ngoài môi trường nuôi cấy cùng các dinh dưỡng, các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn chiếu sáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy thường là ánh sáng đèn huỳnh quang, các loại đèn halogen kim loại, natri cao áp, dây tóc được sử dụng nhằm tăng cường độ sáng. Tuy nhiên những nguồn ánh sáng này bao gồm cả những bước sóng không cần thiết cho sự sinh trưởng của cây trong nuôi cấy in vitro 1, 3, 6, 9. Ánh sáng đơn sắc là một nguồn năng lượng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô với khả năng nâng cao quá trình tăng trưởng sinh học nhờ vào ưu điểm kích thước nhỏ,tiêu thụ điện năng ít, cấu trúc rắn, an toàn, ít tỏa nhiệt, tuổi thọ cao. Ánh sáng đơn sắc bao gồm các bước sóng có lợi cho quá trình quang hợp từ đó ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp của cây và quá trình nhân nhanh in vitro 4, 5. Hiện nay trên thế giới chưa có tác giả nào tác giả nào nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên quá trình nhân giống in vitro lan Hoàng thảo Kèn. Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên quá trình nhân chồi và ra rễ của lan Hoàng thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) in vitro”.
Trang 1KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN -
NGUYỄN HOÀNG TÙNG
ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG ĐƠN SẮC LÊN QUÁ TRÌNH NHÂN CHỒI VÀ RA RỄ CỦA LAN HOÀNG THẢO KÈN
(Dendrobium lituiflorum) IN VITRO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Ngành: Sư phạm Sinh học
PHÚ THỌ, 2019
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƯƠNG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN -
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận, em đã nhận được
sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo trường Đại học Hùng Vương, các thầy cô trong
Trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học trường Đại học Hùng Vương cùng
toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện
giúp đỡ để em thực hiện và hoàn khóa luận này Đặc biệt, em xin gửi lời cảm
ơn chân thành nhất tới cô giáo hướng dẫn Th.S Lê Thị Mận đã hướng dẫn
tận tình, quan tâm và động viên em hoàn thành khóa luận
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
khóa luận này
Em xin chân thành cảm ơn!
Trang 4LỜI CAM ĐOAN
Tôi đã đọc và hiểu về các hành vi vi phạm đạo đức trong học thuật Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong đề tài này là do Tôi thực hiện, đảm bảo trung thực, không vi phạm yêu cầu về đạo đức trong học thuật Mọi sự giúp
đỡ cho việc thực hiện đề tài này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong
đề tài đã được chỉ rõ nguồn gốc và được phép công bố
Phú Thọ, ngày … tháng … năm 2019
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Hoàng Tùng
Trang 5DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AC BAP
: :
Than hoạt tính Benzylamino purine IAA
KC NAA
: : :
Indole acetic acid Knudson C
Naphthalen acetic acid
MS : Môi trường Murashige & Skoog
MT : Môi trường PLSs : Protocorom M1 : Ánh sáng đỏ M2 : Ánh sáng vàng M3 : Ánh sáng xanh lá
Trang 6DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên khả năng nhân chồi lan
Hoàng thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) 27 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên số lá/chồi, chiều cao chồi
lan Hoàng thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) 28 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các loại ánh sáng đơn sắc lên quá trình ra rễ lan
Hoàng thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) 35
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên hệ số nhân chồi cây lan Hoàng Thảo Kèn sau 8 tuần nuôi cấy 34 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên chiều cao chồi và số lá/chồi cây lan Hoàng Thảo Kèn sau 8 tuần nuôi cấy 34 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của các loại ánh sáng đơn sắc lên chiều dài rễ và
số rễ/chồi cây lan Hoàng Thảo Kèn sau 8 tuần nuôi cấy 38
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Lan Hoàng Thảo Kèn thời kì ra hoa (Dendrobium lituiflorum) 9 Hình 3.1 Cụm chồi lan Hoàng Thảo Kèn trên môi trường sử dụng ánh sáng đơn sắc sau 4 tuần nuôi cấy 30 Hình 3.2 Cụm chồi lan Hoàng Thảo Kèn trên môi trường sử dụng ánh sáng đơn sắc sau 8 tuần nuôi cấy 31 Hình 3.3 Hình ảnh cụm chồi trong bình nuôi cấy sau 4 tuần 33 Hình 3.4 Hình ảnh cụm chồi trong bình nuôi cấy sau 8 tuần
33 Hình 3.5 Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên quá trình ra rễ lan Hoàng Thảo Kèn sau 8 tuần nuôi cấy 36 Hình 3.6 Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên quá trình ra rễ lan Hoàng Thảo Kèn sau 8 tuần nuôi cấy 37
Trang 7MỤC LỤC
PHẦN MỞ ĐẦU ……… ……….….1
1 Tính cấp thiết của đề tài 1
2 Mục tiêu đề tài 2
3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2
3.1 Ý nghĩa khoa học 2
3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2
PHẦN NỘI DUNG 3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU……… …3
1.1 Ánh sáng và tác động của ánh sáng đối với thực vật 3
1.1.1 Vai trò của ánh sáng đối với đời sống 3
1.1.2 Vai trò của ánh sáng đối với đời sống, quá trình phát sinh hình thái thực vật 4
1.2 Một số nguồn sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 6
1.3 Giới thiệu chung về chi Hoàng Thảo (Dendrobium) và lan Hoàng Thảo Kèn (D lituiflorum) 6
1.3.1 Chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 6
1.3.2 Hoàng Thảo Kèn (D lituiflorum) 8
1.4 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 9
1.4.1 Khái niệm 9
1.4.2 Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật 10
1.4.3.Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật 11
1.4.4 Các giai đoạn trong nuôi cấy in vitro 12
1.4.5.Các điều kiện nuôi cấy in vitro 14
1.4.6.Môi trường nuôi cấy 15
Trang 81.4.7.Ứng dụng 19
1.5.Tình hình nghiên cứu 19
1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19
1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 22
CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP………25
2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 24
2.2 Nội dung nghiên cứu 24
2.3 Phương pháp nghiên cứu 24
2.3.1 Phương pháp luận 24
2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 24
2.3.3 Phương pháp thu thập số liệu 25
2.3.4.Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 26
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………27
3.1 Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên quá trình nhân chồi lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) in vitro 27
3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên quá trình ra rễ lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum) in vitro………34
KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ……… ….40
1 Kết luận 40
2 Kiến nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO………41
PHỤ LỤC 44
Trang 9PHẦN MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Hoàng thảo Kèn là một trong những loài lan tuyệt đẹp và quý hiếm Ở một
số nơi trên thế giới nó còn được đưa vào diện được bảo vệ nghiêm ngặt Tại Việt Nam, cây có mặt ở miền Bắc Hiện nay, Hoàng thảo Kèn rất ít được tìm thấy trong tự nhiên do bị thu mua và khai thác với số lượng lớn Nhu cầu ngày càng lớn của thị trường đã khiến giá thành của Hoàng thảo Kèn bị đẩy lên rất cao và trở thành loài ngày càng bị khai thác nhiều Việc nhân giống Hoàng thảo Kèn theo phương pháp truyền thống rất chậm không đáp ứng đủ nhu cầu thị trường [2]
Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì vi nhân giống
(in vitro) là công cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài lan quý hiếm Nhân giống in vitro cho hệ số nhân giống cao cây tạo ra sạch bệnh đồng đều, không tốn diện tích nhân giống Trong nhân giống in vitro ngoài môi trường nuôi
cấy cùng các dinh dưỡng, các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn chiếu sáng được
sử dụng trong môi trường nuôi cấy thường là ánh sáng đèn huỳnh quang, các loại đèn halogen kim loại, natri cao áp, dây tóc được sử dụng nhằm tăng cường độ sáng Tuy nhiên những nguồn ánh sáng này bao gồm cả những bước sóng không
cần thiết cho sự sinh trưởng của cây trong nuôi cấy in vitro [1, 3, 6, 9] Ánh sáng
đơn sắc là một nguồn năng lượng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô với khả năng nâng cao quá trình tăng trưởng sinh học nhờ vào ưu điểm kích thước nhỏ, tiêu thụ điện năng ít, cấu trúc rắn, an toàn, ít tỏa nhiệt, tuổi thọ cao Ánh sáng đơn sắc bao gồm các bước sóng có lợi cho quá trình quang hợp từ đó ảnh hưởng đến
quá trình sinh tổng hợp của cây và quá trình nhân nhanh in vitro [4, 5]
Hiện nay trên thế giới chưa có tác giả nào tác giả nào nghiên cứu về ảnh
hưởng của ánh sáng đơn sắc lên quá trình nhân giống in vitro lan Hoàng thảo Kèn
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ảnh hưởng của ánh
sáng đơn sắc lên quá trình nhân chồi và ra rễ của lan Hoàng thảo Kèn
(Dendrobium lituiflorum) in vitro”
Trang 102 Mục tiêu đề tài
- Đánh giá được ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến quá trình nhân chồi lan
Hoàng thảo Kèn in vitro
- Đánh giá được ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc đến quá trình ra rễ lan Hoàng
Kết quả nghiên cứu được ứng dụng trong nuôi cấy mô loài lan Hoàng Thảo
Kèn (Dendrobium lituiflorum), góp phần sản xuất giống có hiệu quả cao, chất
lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế trên địa bàn tỉnh Phú Thọ
Trang 11PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Ánh sáng và tác động của ánh sáng đối với thực vật
1.1.1 Vai trò của ánh sáng đối với đời sống
Ánh sáng là một yếu tố sinh thái, ánh sáng có vai trò quan trọng đối với các
cơ thể sống Ánh sáng là nguồn cung cấp năng lượng cho thực vật tiến hành quang hợp Một số vi sinh vật dị dưỡng (nấm, vi khuẩn) trong quá trình sinh trưởng và phát triển cũng sử dụng một phần ánh sáng Ánh sáng điều khiển chu kỳ sống của sinh vật Tùy theo cường độ và chất lượng của ánh sáng mà nó ảnh hưởng nhiều hay ít đến quá trình trao đổi chất và năng lượng cùng nhiều quá trình sinh lý của các cơ thể sống Ngoài ra ánh sáng còn ảnh hưởng nhiều đến nhân tố sinh thái khác như nhiệt độ, độ ẩm, sự phân bố và thành phần quang phổ của ánh sáng
Tất cả sự sống trên bề mặt Trái Đất tồn tại được là nhờ năng lượng chiếu sáng của Mặt Trời và sinh quyển Bức xạ mặt trời là một dạng phóng xạ điện từ với một biên độ các bước sóng rộng lớn Bức xạ mặt trời khi xuyên qua khí quyển
đã bị các chất trong khí quyển như O2, O3, CO2, hơi nước hấp thụ một phần (khoảng 19% toàn bộ bức xạ) ; 34% phản xạ vào khoảng không vũ trụ và 49% lên
bề mặt trái đất Phần ánh sáng chiếu thẳng xuống mặt đất gọi là ánh sáng trực xạ (ánh sáng mặt trời), còn phần bị bụi, hơi nước khuyếch tán gọi là ánh sáng tán
xạ Có khoảng 63% ánh sáng trực xạ và 37% ánh sáng tán xạ ánh sáng phân bố không đồng đều trên bề mặt trái đất do độ cong của bề mặt trái đất và độ lệch trục trái đất so với mặt phẳng quỹ đạo của nó quay quanh mặt trời
Do vậy ở các vùng nhiệt đới nguồn năng lượng bức xạ nhận được lớn gấp
5 lần so với vùng cực Càng lên cao cường độ ánh sáng càng mạnh hơn vùng thấp Ánh sáng còn thay đổi theo thời gian trong năm, ở các cực của Trái Đất mùa đông không có ánh sáng, mùa hè ánh sáng chiếu liên tục, ở vùng ôn đới có mùa hè ngày
kéo dài, mùa đông ngày ngắn Càng đi về phía xích đạo thì độ dài ngày càng giảm
Trang 121.1.2 Vai trò của ánh sáng đối với đời sống và quá trình phát sinh hình thái thực vật
Ánh sáng có ảnh hưởng đến toàn bộ đời sống của thực vật từ khi hạt nảy mầm, sinh trưởng, phát triển cho đến khi cây ra hoa kết trái rồi chết.Độ dài bước sóng có ý nghĩa sinh thái vô cùng quan trọng đối với sinh vật nói chung và đối với động vật, thực vật nói riêng
Ánh sáng ảnh hưởng khác nhau đến sự nảy mầm của các loại hạt Có nhiều loại hạt nảy mầm trong đất không cần ánh sáng, nếu các hạt này bị bỏ ra ngoài ánh sáng thì sự nảy mầm bị ức chế, hoặc không nảy mầm, như hạt cà độc dược, hoặc hạt của một số loài trong họ Hành (Liliaceae) Ngược lại có một số hạt giống ở chỗ tối không nảy mầm được tốt như hạt cây phi lao, thuốc lá, cà rốt và phần lớn các cây thuộc họ Lúa (Poaceae) Ánh sáng có ảnh hưởng nhất định đến hình thái và cấu tạo của cây Những cây mọc riêng lẽ ngoài rừng hay những cây mọc trong rừng có thân phát triển đều, thẳng, có tán cân đối Những cây mọc ở bìa rừng hoặc trên đường phố có tường nhà cao tầng, do có tác dụng không đồng đều của ánh sáng ở 4 phía nên tán cây lệch về phía có nhiều ánh sáng Đặc tính này gọi là tính hướng ánh sáng của cây [8]
Ánh sáng còn ảnh hưởng đến hệ rễ của cây Đối với một số loài cây có rễ trong không khí (rễ khí sinh) thì ánh sáng giúp cho quá trình tạo diệp lục trong rễ nên rễ có thể quang hợp như một số loài phong lan trong họ Lan (Orchidaceae) Còn hệ rễ ở dưới đất chịu sự tác động của ánh sáng, rễ của các cây ưa sáng phát triển hơn rễ của cây ưa bóng Lá là cơ quan trực tiếp hấp thụ ánh sáng nên chịu ảnh hưởng nhiều đối với sự thay đổi cường độ ánh sáng Do sự phân bố ánh sáng không đồng đều trên tán cây nên cách sắp xếp lá không giống nhau ở tầng dưới,
lá thường nằm ngang để có thểtiếp nhận được nhiều nhất ánh sáng tán xạ; các lá ở tầng trên tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng nên xếp nghiêng nhằm hạn chế bớt diện tích tiếp xúc với cường độ ánh sáng cao [3]
Ngoài ra cây sinh trưởng trong điều kiện chiếu sáng khác nhau có đặc điểm hình thái, giải phẫu khác nhau Trên cùng một cây, lá ở ngọn thường dày, nhỏ, cứng, lá được phủ một lớp cutin dày, mô giậu phát triển, có nhiều gân và lá có
Trang 13màu nhạt Còn lá ở trong tầng bị che bóng có phiến lá lớn, lá mỏng và mềm, có tầng cutin mỏng, có mô giậu kém phát triển, gân ít và lá có màu lục đậm Ánh sáng có ảnh hưởng đến quá trình sinh lý của thực vật, trong thành phần quang phổ của ánh sáng, diệp lục chỉ hấp thụ một số tia sáng
Bằng những thí nghiệm, Enghelman đã chứng minh được rằng, những tia sáng bị diệp lục hấp thụ mới phát sinh quang hợp Cường độ quang hợp lớn nhất khi chiếu tia đỏ là tia mà diệp lục hấp thụ nhiều nhất Khả năng quang hợp của các loài thực vật C3 và C4 khác nhau rất đáng kể Ở thực vật C4 quá trình quang hợp tiếp tục tăng khi cường độ bức xạ vượt ngoài cường độ bình thường trong thiên nhiên ở thực vật C3, quá trình quang hợp tăng khi cường độ chiếu sáng thấp, nhất là các cây ưa bóng Thực vật C3 gồm các loài Triticum vulgare, Secale cereale, Trifolium repens [4]
Liên quan đến cường độ chiếu sáng, thực vật được chia thành các nhóm cây ưa sáng, cây ưa bóng và cây chịu bóng Cây ưa sáng tạo nên sản phẩm quang hợp cao khi điều kiện chiếu sáng tăng lên, nhưng nói chung, sản phẩm quang hợp đạt cực đại không phải trong điều kiện chiếu sáng cực đại mà ở cường độ vừa phải (optimum) Ngược lại cây ưa bóng cho sản phẩm quang hợp cao ở cường độ chiếu sáng thấp Trung gian giữa 2 nhóm trên là nhóm cây chịu bóng nhưng nhịp điệu quang hợp tăng khi sống ở những nơi được chiếu sáng đầy đủ Đặc điểm cấu tạo
về hình thái, giải phẫu và hoạt động sinh lý của các nhóm cây này hoàn toàn khác nhau thể hiện đặc tính thích nghi của chúng đối với các điều kiện môi trường sống khác nhau Do đặc tính này mà thực vật có hiện tượng phân tầng và ý nghĩa sinh học rất lớn
Ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh sản của thực vật Tương quan giữa thời gian chiếu sáng và che tối trong ngày - đêm gọi là quang chu kỳ Tương quan này không giống nhau trong các thời kỳ khác nhau trong năm cũng như trên các vĩ tuyến khác nhau Quang chu kỳ đã được Garner và Alland phát hiện năm 1920 Liên quan đến độ dài chiếu sáng, thực vật còn được chia thành nhóm cây ngày dài và cây ngày ngắn Cây ngày dài là cây ra hoa kết trái cần pha
Trang 14sáng nhiều hơn pha tối, còn ngược lại, cây ngày ngắn đòi hỏi độ dài chiếu sáng khi ra hoa kết trái ngắn hơn [9]
1.2 Một số nguồn sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Ngày nay cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thì vi nhân giống
(in vitro) là công cụ đắc lực trong việc bảo tồn và phát triển các loài thực vật trong
đó có các loài lan quý hiếm Trong nhân giống in vitro nguồn chiếu sáng được sử
dụng trong môi trường nuôi cấy thường là ánh sáng đèn điện quang, các loại đèn halogen kim loại, natri cao áp, dây tóc được sử dụng nhằm tăng cường độ sáng Tuy nhiên những nguồn ánh sáng này có nhược điểm là tiêu hao điện năng cao, tỏa nhiều nhiệt, độ bền không và nguồn ánh sáng này bao gồm cả những bước
sóng không cần thiết cho sự sinh trưởng của cây trong nuôi cấy in vitro [1, 3, 7,]
Bên cạnh những nguồn sáng truyền thống thì ánh sáng đơn sắc LED là một nguồn năng lượng đầy hứa hẹn cho các phòng nuôi cấy mô với khả năng nâng cao quá trình tăng trưởng sinh học nhờ vào ưu điểm kích thước nhỏ, tiêu thụ điện năng
ít, cấu trúc rắn, an toàn, ít tỏa nhiệt, tuổi thọ cao Ánh sáng đơn sắc bao gồm các bước sóng có lợi cho quá trình quang hợp từ đó ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng
hợp của cây và quá trình nhân nhanh in vitro [5,7]
1.3 Giới thiệu chung về chi Hoàng Thảo (Dendrobium) và lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum)
1.3.1 Chi Hoàng Thảo(Dendrobium)
thuộc Châu Á, tập trung nhiều ở Đông Nam Á và Châu Úc [1]
Trang 15Trên thế giới chi lan Hoàng thảo có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và một số đảo ven biển [2] Các đại diện của chi Hoàng thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá Chúng thường mọc ở nơi ẩm, với độ cao 500 – 1500 m so với mực nước biển, cũng có khi gặp chi lan này mọc ở độ cao 200m hoặc tới 2000
m so với mực nước biển
Chi Hoàng thảo có một số đặc điểm sau:
- Thân: Chi lan Hoàng thảo là cây thân thảo mọc cụm, thẳng đứng hoặc rủ thõng, phân đốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc số ít các loài sống bám trên
đá, trong rừng ẩm Chi này thuộc nhóm đa thân với nhiều giả hành, vừa có thân thật vừa có giả hành Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới Đa số các củ giả hành có màu xanh nên nó đã cùng với lá làm nhiệm vụ quang hợp [1]
Thân của các đại diện chi Hoàng thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy có chiều dài từ 2-3cm đến 120cm Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu dục Phần gốc, nơi xuất phát của rễ thưởng nhỏ mảnh nhưng cũng có thể phình to [1]
- Rễ: Rễ của các đại diện chi Hoàng Thảo là rễ khí sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống Ở một số loài được bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao gồm cả những lớp tế bào chết chứa đầy không khí do đó có ánh lên màu xám bạc Chiều dài rễ từ 0,1 - 0,3cm; rễ thường mọc từ phần gốc của thân hoặc có thể ở mấu thân một vài loài
- Lá: Lá mọc thành hai dãy so le, không có cuống, có bẹ ôm lấy thân Lá thường cứng, dạng đa bóng, bề mặt thường nhẵn, đôi khi bề mặt và bẹ lá (thường khi lá non) có phủ lông cứng ngắn màu đen sớm rụng [1]
- Cụm hoa: Cụm hoa chùm thường nhiều hoa hoặc ít hoa Cụm hoa dài thường rũ thõng xuống, nhiều loài hoa có giá trị làm cảnh [1]
Trang 16- Hoa: Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên Màu sắc hoa đa dạng, sặc sỡ Hoa
đa số có loài có hương thơm Bao hoa chia hai vòng, vòng ngoài gồm một lá đài giữa và hai lá đài bên, vòng trong gồm có hai cánh hoa và một cánh môi [1]
- Cằm: Là một bộ phận được hình thành nhờ mép phần gốc hai lá đài bên dính nhau và dính với chân cột Cằm có các hình bán cầu, hình túi đến hình cựa, hình trụ cong ít nhiều [1]
- Cánh môi: Cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn lại của bao hoa cả về màu sắc, kích thước và trang trí Trang trí đa dạng trên cánh môi như đốm, vạch, diềm tua, u lồi, đường sống, lông phủ chiếm vị trí khá quan trọng trong phân loại Nhiều loài có gốc cánh môi dính với chân cột tạo thành cựa [1]
- Quả: Quả nang thường hình chạy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh Hạt rất nhỏ, hầu như không trọng lựợng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa đầy không khí dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió [1]
- Hạt: Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt lan có kích thước rất nhỏ, phôi hạt chưa phân hóa Sau 12 - 18 tháng hạt chín phát tán nhờ gió Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp hạt
sẽ nảy mầm [1]
1.3.2 Hoàng Thảo Kèn (D lituiflorum)
Hoàng Thảo Kèn có tên khoa học là Dendrobium lituiflorum Phong lan biểu sinh trong rừng lá rộng trên thân cây ở độ cao khoảng 300-1600m, phát triển trong nhiệt độ mát đến ấm nóng, loài Hoàng Thảo Kèn còn có khả năng chịu lạnh xuống đến 1,2ºC Chúng ưa ánh sáng trung bình, không ưa nắng trực tiếp[1]
Thân cây dài 50-80 cm mềm mại rủ xuống, hình trụ, căng tròn, nhẵn bóng, thon nhọn dần về phía đầu ngọn, đôi khi đốt thân thắt hình thoi rất nhẹ Lá hẹp, thuôn dài, dẻo dai rụng vào mùa thu Hoa mang sắc tím quyến rũ biến thiên từ nhạt đến sậm, môi loa hình chiếc kèn, vành môi trắng
Hoàng Thảo Kèn rất sai hoa, nở nhiều hoa to 6-7 cm, mọc từng chùm 2-3 chiếc trên 1 mắt ở các đốt giữa thân đến ngọn, phát sinh từ thân cây trụi lá cũ Cây nở hoa từ cuối mùa đông đến mùa xuân, rất thơm và lâu tàn Hoàng Thảo Kèn cần
Trang 17nhiều ẩm và phân bón trong lúc phát triễn thân non, chỉ để khô khi cây đã ngừng phát triển Hoàng Thảo Kèn thuộc loại dễ trồng, nhưng điều đó còn phụ thuộc vào
thời tiết vùng miền Hoàng Thảo Kèn nhìn xa rất giống với Den.anosmum vì màu
tím trầm tương tự, nhưng thực tế so sánh nhau thì hình dáng lại có sự khác biệt
hoàn toàn
Hoàng Thảo Kèn là một trong những loại lan đẹp và quý hiếm Hoàng Thảo Kèn rất được ưa chuộng trên thị trường với giá bán khá cao Cây có thân dài khoảng 20cm được bán với giá 250.000 đồng Ngoài tự nhiên số lượng loài này còn ít, nếu không có biện pháp bảo vệ kịp thời có thể lâm vào nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên
Hình 1.1: Lan Hoàng Thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum)
1.4 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.4.1 Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật
ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện
vô trùng Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước kia người
ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự
Trang 18phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy
mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực vật như sinh lý học, hóa sinh học, di truyền học và cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống của con người
1.4.2 Lịch sử phát triển của kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Năm 1902, nhà thực vật học người Đức Gottlied Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể nhưng những thí nghiệm của Haberlandt khi đó với các tế bào mô mềm biểu bì đã bị thất bại do chúng không thể phân chia được [11] Năm 1922, Kotte là học trò của Haberlandt cùng với Robbins đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo (cây ngô) Hai tác giả đã nuôi được trong một thời gian ngắn (12 ngày) trên môi trường lỏng có chứa đường glucozơ và muối khoáng thu được
hệ rễ nhỏ [11] Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White (người Mỹ) đã duy trì được sinh trưởng của đầu rễ cà chua trong một thời gian khá dài, trên môi trường lỏng có chứa đường, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men [11] Trong thời gian 1941 - 1952, nhiều chất điều kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin được nuôi cấy và tổng hợp thành công: axit naphthalen axetic (NAA), axit 2,4 D - dichlorophenoxy axetic (2,4 D)…Năm
1954, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trưởng rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá Một năm sau, chất đó được tổng hợp thành công và được Skoog gọi là kinetin có tác dụng kích thích sự phân bào Skoog và Miller đã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng độ tương đối của auxin/cytokinin
và từ đó đưa ra quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan ở thực vật Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1962, Murashige
Trang 19và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy, đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô
Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay [10] Trong khoảng thời gian
từ 1954 - 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển và hoàn thiện dần Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dưỡng định kỳ Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo được cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp Năm 1960 - 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính địa lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và đã tạo ra được các protocom từ địa lan Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy
mô đầu tiên được thương mại hóa Năm 1966, Guha & cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược Sau đó Bourin & Nitsch (1967) cũng thành công với cây thuốc lá Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đóng góp rất lớn cho các nghiên cứu di truyền và lai tạo giống Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi 2 tác giả người Nhật là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được cellulose Melchers và cộng sự (1978) đã lai tạo thành công protoplast của
cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật Ngoài ra, trong những điều kiện nhất định, các protoplast có khả năng hấp thụ các phân tử lớn, hoặc các cơ quan tử từ bên ngoài, do đó chúng là những đối tượng
lý tưởng cho các nghiên cứu về di truyền thực vật [11] Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen ở thực vật…
1.4.3.Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật
1.4.3.1 Tính toàn năng của tế bào
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đã đưa ra giả thuyết về tính toàn
Trang 20năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời" Theo ông:
“Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi
tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” [11] Tính toàn năng của
tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô
tế bào thực vật Cho đến ngày nay, các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ
1.4.3.2 Sự phân hóa và phản phản hóa
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào thành các mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong những điều kiện môi trường thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào hợp tử ban đầu và cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Quá trình đó được gọi là sự phản phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình điều hoà hoạt hóa gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể
có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước đây bị hạn chế) để tạo ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào, quá trình hoạt hóa sẽ được xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có trong bộ gen đó[11]
1.4.4 Các giai đoạn trong nuôi cấy in vitro
Quá trình nuôi cấy in vitro được chia ra 5 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ
(cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus
và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi
Trang 21lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của
mẫu cấy in vitro
* Giai đoạn 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách và sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng
là đoạn thân, mảnh lá…Chồi ngon, chồi nách được sử dụng để nhân nhanh các cây: măng tây, dứa, khoai tây, thuốc lá, hoa cúc…ở súp lơ thì dung hoa tự non, ở
bầu bí các mảnh lá mầm là nguyên liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro
Chồi non nảy mầm từ hạt cũng có thể được sử dụng làm mẫu cấy[11]
* Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo phôi
vô tính Phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất Nếu môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Điều kiện nuôi cấy thường là 25 - 27 0C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang chu kì chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối
* Giai đoạn 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ Auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng
* Giai đoạn 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườm ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) Cây con cao 5 - 7 cm và có
từ 3 - 4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất
Trang 22dinh dưỡng Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát
nước Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườm ươm, cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp [11]
1.4.5.Các điều kiện nuôi cấy in vitro
1.4.5.1.Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của quá trình nuôi cấy in vitro Nếu trong quá trình nuôi cấy không đảm bảo điều kiện vô trùng thì mẫu sẽ
- 120 phút
- Khử trùng ướt: Là phương pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô trùng môi trường và các dụng cụ nuôi cấy Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô trùng, nhiệt độ thường dùng ở 121 0C
- Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm có kích thước 0,025 -
10 µm khỏi môi trường nuôi cấy, nước cất Đây là phương pháp phù hợp với các môi trường mà thành phần của chúng bị phân huỷ ở nhiệt độ cao
* Vô trùng mẫu cấy: Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu cấy nhưng ở các vị trí khác nhau thì phương pháp khử trùng mẫu cấy là khác nhau Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất
có khả năng tiêu diệt vi sinh vật như cồn 700, các chất làm giảm sức căng bề mặt như Tween 20, Tween 80, fotoflo, teepol, thủy ngân hoặc các chất kháng sinh,… Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ, thời gian xử lý hóa chất khử trùng Một hóa chất được lựa chọn để vô trùng phải đảm bảo 2 thuộc tính: Có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít ảnh hưởng mẫu thực vật [11]
Trang 231.4.5.2 Ánh sáng và nhiệt độ
Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những phòng nuôi ổn định về ánh sáng và nhiệt độ Tất cả các trường hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ một số trường hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình nhân giống của chúng cũng cần
có ánh sáng Nhiệt độ của các phòng nuôi cây thường được duy trì từ 25 - 28 0C nhờ các máy điều hoà nhiệt độ[11]
1.4.6.Môi trường nuôi cấy
1.4.6.1 Thành phần của môi trường
Thành phần môi trường nuôi cấy mô - tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy khác nhau thì môi trường nuôi cấy khác nhau cũng khá cơ bản Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhưng môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau:
* Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lượng và vi lượng) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy
- Trong muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung cấp là: Nitơ, phospho, kali và sắt
+ Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng nitrat (NO3-) với hàm lượng ≈ 25 mM và amon (NH4+) với hàm lượng từ 2 - 20 mM
+ Phospho thường được đưa vào môi trường ở dạng muối phosphat, hai loại hợp chất hay được dùng nhất là NaH2PO4 và KH2PO4 Hàm lượng phospho trong môi trong môi trường nuôi cấy từ 0,15 - 0,40 mM
+ Kali được cung cấp cho môi trường nuôi cấy dưới dạng KNO3, KCl và
KH2PO4 Nồng độ kali sử dụng từ 2 - 25 mM
- Yêu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy khá phức tạp và ít được nghiên cứu Chúng cần thiết để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy Đây là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ nhỏ hơn 30 ppm, chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme
Trang 24+ Fe: thiếu Fe làm giảm ARN, protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia
+ Bo: thiếu Bo trong môi trường nuôi cấy thường gây lên biểu hiện thừa Auxin Mô nuôi cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hóa mạnh nhưng thường là mô xốp, mọng nước, kém tái sinh
* Thành phần hữu cơ
- Vitamin, aminoaxit, amit, myo - inositol:
+ Vitamin: Các vitamin hay được sử dụng là các vitamin nhóm B (B1, B3, B6), ngoài ra môi trường nuôi cấy còn sử dụng một số vitamin khác như vitamin
H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E với các nồng độ khác nhau
+ Myo-inositol là một loại đường - rượu liên quan đến quá trình tổng hợp phospholipit, pectin của thành tế bào và các hệ thống màng trong tế bào, tham gia vào dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường và trao đổi hydratcacbon Hàm lượng
sử dụng là 100 mg/l môi trường [11]
+ Các aminoaxit và amit: Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường phải được bổ sung các aminoaxit, amit vì chúng có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái Theo Skoog & Milles (1957) tất cả các dạng tự nhiên của aminoaxit (dạng L) dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ, L-arginin dùng cho nuôi cấy rễ, L- tyrolin dùng cho nuôi cấy chồi, L- serin dùng cho nuôi cấy hạt phấn Nồng độ sử dụng mỗi loại 10 - 100 mg/l [11]
- Thành phần hữu cơ phức hợp: Được dùng trong môi trường nuôi cấy để cung cấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất Chúng được
sử dụng khi môi trường khoáng xác định không đạt kết quả mong muốn về sinh trưởng và phát triển của mẫu nghiên cứu Một số chất được sử dụng phổ biến là: Cazein thuỷ phân, dịch chiết nấm men, dịch chiết hoa, củ, quả,
* Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu được trong
môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại và nồng
độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy
Trang 25- Nhóm Auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính (Epstein&cs, 1989)
Các loại auxin thường sử dụng cho nuôi cấy:
+ IAA (Indole acetic acid)
+ IBA (Indole butyric acid)
+ NOA (Naphthoxy acetic acid)
+ α- NAA (α- Naphthalene acetic acid) + 2.4 D (2.4 diclorophenoxy acetic acid) IAA ít sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, nếu dùng thì ở hàm lượng cao 1,0 - 3,0 mg/l (Dodds & Robert, 1999) Các auxin khác có hàm lượng
sử dụng từ 0,1 - 2,0 mg/l
- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh
trưởng của chồi in vitro (Miller, 1962) Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo
rễ và sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Các loại cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô là:
+ Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-2-enylamino] purine)
+ Kinetin (6-furfurylamino purine) + BAP (Bezylamino purine)
+ TDZ (Thidiazuzon)
Hàm lượng sử dụng của các Cytokinin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/l Ở những nồng độ cao hơn, nó có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi nách, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Trong các loại cytokinin nói trên, kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả Đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tỷ lệ khác nhau
- Nhóm Gibberellin: Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô người ta còn sử dụng thêm Gibberellin để kích thích kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại Gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất Tuy nhiên do mẫn cảm với nhiệt độ nên phải lọc qua màng lọc vô trùng rồi mới đưa vào môi trường
Trang 26* Nguồn cacbon Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp nhưng ở cường độ rất thấp Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất hydratcacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường saccharose với hàm lượng từ 2 - 6% (W/v) Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol rất ít dùng Hàm lượng đường thấp được sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần, ngược lại hàm lượng đường cao cần cho nuôi cấy hạt phấn và phôi
* Các thành phần khác
- Tác nhân tạo gel quyết định trạnh thái vật lý của môi trường nuôi cấy Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là agar Nồng độ agar sử dụng từ 0,5 - 10 % (W/v) tuỳ theo chất lượng của chúng và môi trường sử dụng Khi môi trường nuôi cấy là môi trường lỏng hoặc bán lỏng thì không hoặc bổ sung rất ít agar
- Than hoạt tính được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu Mặt khác, khi bổ sung vào môi trường, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do môi trường trở nên sẫm vì vậy có thể kích thích quá trình tạo rễ, một số trường hợp còn có tác dụng thúc đẩy phát sinh phôi vô tính và kích thích sinh trưởng phát sinh cơ quan ở các loài cây gỗ [11] Nhưng than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của các chất điều hoà sinh trưởng, nồng độ than hoạt tính thường sử dụng từ 0,2 - 0,3(W/v) [11]
1.4.6.2 pH của môi trường
pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 - 6,0 pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar
có thể rất cứng Nếu trong môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH trong phạm vi nói trên vì ở pH kiềm hoặc quá axit thì GA3 sẽ chuyển sang dạng không
có hoạt tính
1.4.6.3 Tính thẩm thấu của môi trường
Hấp thụ nước của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy bị chi phối bởi thế năng của nước trong dịch bào và trong môi trường dinh dưỡng Các thành phần chính có ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường bao gồm: Hàm lượng
Trang 27đường, hàm lượng agar, một số thành phần muối khoáng Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy đồng thời còn tham gia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường Hàm lượng đường cao, mô nuôi cấy khó hút được nước Hàm lượng đường thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng thuỷ tinh hóa ở mẫu nuôi cấy, đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm hoặc đồng ruộng
1.4.7 Ứng dụng
Phương pháp này có ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống Về mặt lý luận sinh học cơ bản: đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi
cấy trước hết là mô phân sinh (meristem) rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo (callus) và từ mô sẹo thì có thể kích thích tái sinh và tạo
cây hoàn chỉnh Về mặt thực tiễn sản xuất: phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao Hiện nay phương pháp này đã trở thành phổ biến và áp dụng trong công tác chọn giống cây trồng Ngoài ra, bằng phương pháp này chỉ sau thời gian ngắn chúng ta
có thể tạo được sinh khối lớn có hoạt chất sinh học được tạo ra vẫn giữ nguyên được hoạt tính của mình
1.5 Tình hình nghiên cứu
1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong những năm gần đây những tiến bộ trong phương pháp nuôi cấy mô thực vật liên quan đến yêu cầu về chiếu sáng hiện đang tập trung vào tính năng cải tiến của điốt phát quang Sự phát triển bền vững của công nghệ LED, với sự ra đời của các vật liệu bán dẫn mới có thể áp dụng trong nhiều lĩnh vực Là một giải pháp thay thế cho hệ thống chiếu sáng truyền thống, LED đã chứng tỏ nó là một nguồn sáng nhân tạo cho nuôi cấy mô thực vật Có rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để điều tra tác động của đèn LED lên cây trồng
Trong những năm gần đây những tiến bộ trong phương pháp nuôi cấy mô thực vật liên quan đến yêu cầu về chiếu sáng hiện đang tập trung vào tính năng cải tiến
Trang 28của điốt phát quang Sự phát triển bền vững của công nghệ LED, với sự ra đời của các vật liệu bán dẫn mới có thể áp dụng trong nhiều lĩnh vực Là một giải pháp thay thế cho hệ thống chiếu sáng truyền thống, LED đã chứng tỏ nó là một nguồn sáng nhân tạo cho nuôi cấy mô thực vật Có rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để điều tra tác động của đèn LED lên cây trồng
Năm 2004, Ruey - Chi Jao và Wei Fang đã nghiên cứu ảnh hưởng của đèn
LED tới sự tăng trưởng và hệ số nhân của cây khoai tây in vitro Nghiên cứu đã
sử dụng các loại ánh sáng đèn LED có bước sóng ánh sáng dao động từ 380- 760
nm, thí nghiệm đã cho kết quả khả quan về hệ số nhân nhanh cây khoai tây in vitro Ánh sáng đèn LED 720 Hz với thời gian chiếu sáng 16h trên ngày cho kết
quả hệ số nhân nhanh đạt 5.7 lần và mẫu sinh trưởng thực vật là tốt nhất, chồi trên môi trường này đạt 106,1 mm [18]
Năm 2006, Teresa Cybularz- Urban và cộng sự đã tìm hiểu ảnh hưởng của bước sóng ánh sáng lên sự phát sinh cơ quan của lan Cattleya hybrid trong nuôi cấy in vitro Kết quả đã đánh giá được ảnh hưởng của bước sóng ánh sáng tới sự nhân lên tăng trưởng mô và hàm lượng sắc tố, Teresa Cybularz- Urban và cộng
sự bắt dầu thí nghiệm trên protocorm được nuôi cấy trong môi trường MS thay đổi 5,0 mg/l BA, 0,2 mg /l Zeatin, 1,0mg/l NAA Kết quả cho thấy tốc độ phát sinh của cơ quan phụ thuộc vào bước sóng của ánh sáng đơn sắc, thí nghiệm với ánh sáng đỏ và ánh sáng xanh dương có hiệu quả trong việc phát sinh hình thái Kết quả ghi lại hệ số phát sinh hình thái đạt 11,7 lần dưới ánh sáng đỏ, 10,6 lần dưới ánh sáng xanh dương, 8,3 lần dưới ánh sáng trắng và 6,2 lần trong bóng tối Bên cạnh đó hàm lượng diệp lục và carotenoit trong điều kiện ánh sáng trắng là cao nhất, giảm dần từ màu xanh dương sang đỏ Ánh sáng xanh dương tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân lên và kéo dài rễ [20]
Năm 2008, Wongnok A và các cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của đèn LED lên sự sinh trưởng của hạt lan Hồ điệp lai Ở nghiên cứu này, hạt của lan Hồ Điệp được cấy vào môi trường cơ bản Murashige và Skoog (MS) bổ sung 0,1 mg/l 6-
benzyladenine (BA) và 0,5 mg /l axit axít naphthalene (NAA) và nuôi cấy in vitro
trong 45 ngày Thí nghiệm đã tiến hành với sáu loại ánh sáng khác nhau: Đèn
Trang 29huỳnh quang (CON), đèn LED đơn sắc màu xanh (B), ba hỗn hợp LED màu xanh
và đỏ (B: R = 3: 1, 1: 1, 1: 3) và đèn LED đỏ đơn sắc (R) Nghiên cứu đã chỉ ra, protocorm sinh trưởng cao nhất dưới điều kiện ánh sáng của đèn LED (80% đỏ
và 20% xanh) [22]
Năm 2014, Kumala Dewi và cộng sự đã phân tích ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED lên quá trình sinh trưởng và ra hoa của cây lan Hồ điệp, các cây con trong ống nghiệm được nuôi trên điều kiện các màu ánh sáng khác nhau như đỏ, xanh dương, vàng, xanh lá trong 2 hoặc 4 tuần với thời gian chiếu sáng 14h/ngày,
và sau đó mỗi cây con được trồng trong một chậu nhựa có chứa sphagnum và phát triển trong buồng sinh trưởng dưới chất lượng ánh sáng tương tự trong 3 tháng Kết quả thí nghiệm cho thấy tăng trưởng thực vật được tăng cường dưới đèn LED xanh dương, đỏ-xanh hoặc trắng so với đèn huỳnh quang Hàm lượng Gibberellin
và cytokinin tăng lên trong cây con có đèn LED trắng Dựa trên mức tăng trung bình của lá, người ta cho rằng sự phát triển của cây con có thể được thúc đẩy bằng cách cho các đèn LED màu xanh dương, đỏ-xanh hoặc trắng [13]
Năm 2014, Jaime A và cộng sự đã thử nghiệm ảnh hưởng của đèn LED đơn sắc lên sự phát triển của protocorm của các loài thuộc chi Lan kiếm, nghiên cứu đã thực trên nhiều loại công thức ánh sáng như: 100% ánh sáng đỏ, 60% ánh sáng đỏ/40% ánh sáng xanh dương, 100% ánh sáng xanh dương, 70% ánh sáng đỏ/30% ánh sáng vàng,… Kết quả cho thấy nguồn ánh sáng với tỷ lệ 40% ánh sáng đỏ/60% ánh sáng xanh dương ảnh hưởng tốt đến sự phát triển và nhân nhanh của protocorm cây Lan kiếm [12]
Năm 2013, S.Dutta Gupta, B Jatothu đã nghiên cứu ứng dụng của các
điốt phát quang (LEDs) trong sự phát sinh hình thái của cây trồng in vitro Kết
quả cho thấy tốc độ phát sinh hình thái của cây trồng khá nhanh chóng và ổn định dưới tác động của các điốt phát quang, nghiên cứu đã được tiến hành để nghiên cứu ảnh hưởng của LED lên cây trồng, điều này đã dẫn đến nhiều kết quả khả quan Các đặc điểm hình thái, giải phẫu và sinh lý khác nhau như: hình thành chồi nách, phôi soma,giải phẫu lá, và khả năng quang hợp của thực vật phát triển
ổn địnhtrong ống nghiệm đã được tìm thấy được điều chỉnh bởi tính chất quang
Trang 30phổ của đèn LED Khảo sát cho thấy hệ số nhân nhanh đạt đến 11,3 lần sau 3 tuần theo dõi trên cây khoai tây in vitro được chiếu sáng với ánh sáng tỷ lệ 60% đỏ:40% vàng [16].
1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2012, Nguyễn Bá Nam và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của loại
mẫu cấy và hệ thống chiếu sáng đơn sắc lên khả năng tái sinh chồi cây hoa Cúc
(Chrysanthemum morifolium ramat Cv “jimba”) nuôi cấy in vitro Lá Cúc được
cắt thành hình tròn có đường kính 0,8 cm và thân được cắt thành từng lớp mỏng
có kích thước là 10 mm với độ dày từ 0,5 - 0,6 mm Hai nguồn mẫu này được cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 0,5 mg/l NAA và 2 mg/l
BA và nuôi cấy dưới các điều kiện chiếu sáng khác nhau: 100 % LED đỏ, 100 % LED xanh, 50 % LED đỏ + 50 % LED xanh, 70 % LED đỏ + 30 % LED xanh, 80
% LED đỏ + 20 % LED xanh, 90 % LED đỏ + 10 % LED xanh, ánh sáng đèn huỳnh quang và trong tối Kết quả thu được sau bốn tuần nuôi cấy cho thấy, 70% ánh sáng LED đỏ kết hợp với 30 % ánh sáng LED xanh là tỉ lệ phù hợp cho sự tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá và gián tiếp từ lớp mỏng tế bào thân cây Cúc [5]
Năm 2014, Nguyễn Thanh Phương và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại đèn chiếu sáng và bình nuôi cấy đến sự sinh trưởng, phát triển của giống cẩm chướng hồng hạc cấy mô Kết quả chỉ ra trong giai đoạn nhân nhanh,
sử dụng bình trụ nút bông hoặc túi nilon thoáng khí để nuôi cấy cho chất lượng cây giống tốt nhất Đèn LED 13R-4B-3W cho cây sinh trưởng chiều cao tốt, tuy nhiên đèn LED 17R-3B lại có tác dụng kích thích cây tăng số lá, số chồi cao hơn
và cho chất lượng cây giống tốt (nuôi cấy cây trong bình trụ nút bông đạt 21,53 lá/cây, số chồi là 5,67 chồi/cây Khi nuôi cấy trong túi nilon thoáng khí đạt 26,60 lá/cây và cho số chồi là 7,30 chồi/cây) Bên cạnh đó, đèn LED 17R-3B cũng cho chất lượng cây nhân giống tốt hơn ở các công thức đèn khác Trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, sử dụng đèn LED 13R-4B-3W là tốt nhất (Chiều cao cây khi nuôi cấy trong bình trụ nút bông đạt 4,74cm, nuôi cấy trong túi nilon thoáng khí là 5,13cm Số lá/cây đạt 11,73 lá trong bình trụ nút bông và đạt 12,20 lá trong túi