Nghiên cứu thành phần hóa học cặn chiết nhexane quả cây Trâu cổ (Ficus pumila L.)

Trước đây, khi mà Tây y chưa xâm nhập và phát triển ở nước ta thì những bài thuốc trong dân gian dường như đã gắn liền với đời sống của nhân dân Việt Nam. Trong quá trình đất nước phát triển, nhân dân đã đúc kết được nhiều bài thuốc vô cùng quý báu, phát hiện được nhiều cây thuốc ngay cạnh nhà có giá trị cao trong y học. Đó là hệ thống y Dược học cố truyền lúc bấy giờ. Đất nước càng phát triển thì yêu cầu về chất lượng càng cao. Vì vậy để kế thừa và phát triển nguồn thực vật làm thuốc có sẵn nhằm nâng cao hiệu quả trong y học, cần phải nghiên trên cơ sở khoa học một cách chính xác, đầy đủ và toàn diện. Khí hậu nước ta nói chung rất độc đáo: khí hậu nóng nhưng không khô hạn như Tây Nam Á, Bắc Phi. Nóng ẩm nhưng không nóng ẩm quanh năm như các quần đảo ở Đông Nam Á. Đặc biệt hoạt động mạnh mẽ của gió mùa, tác động của biển Đông đã mang đến cho nước ta lượng mưa và độ ẩm dồi dào. Lượng mưa trung bình từ 15002000mmnăm, những nơi có sườn núi đón gió biển hoặc núi caolượng mưa tới 35004000mmnăm. Độ ẩm không khí tương đối cao trên 80%. Riêng Bắc Bộ quanh năm có nhiệt độ tương đối cao và ẩm, nền khí hậu chịu ảnh hưởng từ lục địa Trung Hoa chuyển qua và mang tính chất khí hậu lục địa. Trong khi một phần khu vực Duyên hải lại chịu ảnh hưởng tính chất khí hậu cận nhiệt đới ấm và gió mùa ẩm từ đất liền, tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loài sinh vật. Theo các tài liệu thống kê, Việ Nam là một trong 25 nước có độ đa dạng sinh học cao trên thế giới với dự tính có thể có tới 15.000 loài thực vật. Việt Nam được xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học (chiếm 6,5% số loài có trên thế giới. Hiện nay đã ghi nhận nước ta có 13.766 loài thực vật, trong đó có trên 3.200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian. Đây chính là cơ sở để nước ta phát triển tiềm năng về nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có trong các loài tực vật 1, 2, 3. Trong vô số các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc chi F. pumila L. và các loài này đã được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền. Chi Ficus ở Việt Nam có 99 loài và nhiều loài này đã được sử dụng như làm thuốc giảm đau, thanh nhiệt, cầm máu, trị ghẻ lở; một số loài còn dùng quả để bồi bổ sức khỏe,...1. Cây Trâu cổ cũng là một trong số các cây thuốc thuộc loài này và đã được sử dụng ở nước ta. Một thí nghiệm gần đây trên chuột nhắt, polysaccharid của quả trâu cổ vói liều 416,6 mgkg, tiêm xoang bụng hoặc tiêm dưới da liên tục 10 ngày có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung thư đã được cấy ghép trên chuột, mạnh nhất đối với sarcom lympho I và sarcom 180. Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, polysaccharid có tác dụng tăng cường phản ứng miễn dịch của chuột cả ở lô bình thường và lô đã được cấy ghép khối u cũng như lô đã cấy ghép khối u đang dùng hóa trị liệu hoặc xạ trị liệu (radiotherapy). Thuốc làm tăng số lượng tế bào sinh kháng thể ở lách, tăng cường tác dụng thực bào của các macrophage ở xoang bụng, đồng thời làm tăng số lượng bạch cầu máu ngoại vi 9, 10. Quả trâu cổ còn là một vị thuốc bổ được nhân dân dùng từ lâu đời để chữa dương ủy di tinh, liệt dương, đau lưng, lỵ lâu ngày thoát giang, tắc tia sữa,....Nhưng đến nay vẫn chưa có tài liệu nào công bố về thành phần hóa học của quả cây Trâu cố. Và đặc biệt, trong quá trình tìm hiểu và nghiên cứu đã phát hiện loại cây này cũng có ở nhiều nơi tại Tỉnh nhà và xuất hiện nhiều trong khuôn viên Trường Đại học Hùng Vương Cơ sở Phú Thọ, tạo điều kiện thuận lợi trong việc thu hái và nghiên cứu. Xuất phát từ các lý do trên, nhằm mục tiêu tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên từ các loài thực vật của Việt Nam, góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học và tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng các loài thực vật, tôi lựa chọn nghiên cứu khóa luận “Nghiên cứu thành phần hóa học cặn chiết nhexane quả cây Trâu cổ (Ficus pumila L.)”

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

 Các phương pháp sắc ký

TLC Thin Layer Chromatography: Sắc ký lớp mỏng

CC Column Chromatography: Sắc ký cột

 Các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer:

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Giá trị Rf và màu sắc các vệt chất trên bản mỏng 33Bảng 3.2 : Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng n-Hexane 35Bảng 3.3 : Kết quả các phân đoạn thu được từ phân đoạn F2 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cây Trâu cổ 12

Hình 2.2: Các dung môi thông dụng được dùng để phân lập các hợp chất thiên nhiên 13

Hình 2.3: Máy cất quay dung môi IKA-RV10 của Anh 14

Hình2.4 : Bình triển khai sắc kí bản mỏng 15

Hình 2.5: Bộ chưng cất dung môi 15

Hình 2.6: Bếp điện đôi Gali 16

Hình 2.7: Máy soi UV 16

Hình 2.8 : Máy nghiền 17

Hình 2.9: Ngâm mẫu và mẫu chất sau khi đã lọc 17

Hình 2.10 : Minh họa sắc kí lớp mỏng 18

Hình 2.11: Minh họa sắc kí cột 20

Hình 2.12 : Minh họa phương pháp kết tinh 20

Hình 2.13: Độ chuyển dịch hóa học của proton 22

Hình 2.14: Ví dụ minh họa về sự tách vạch phổ 23

Hình 2.15: Độ chuyển dịch hóa học carbon C-13 24

Hình 2.16: Phổ DEPT của ethylbenzene 25

Hình 3.1: Mẫu khi mới thu hái 26

Hình 3.2: Mẫu quả cây Trâu cổ 26

Hình 3.3 : Mẫu quả sau khi phơi khô 27

Hình 3.4 : Hình ảnh ngâm quả Trâu cổ trong dung môi n–Hexane 27

Hình 3.5 : Dung dịch qua lọc vải và lọc giấy 28

Hình 3.6 : Cất quay mẫu bằng máy cất quay chân không 28

Hình 3.7 : Cặn dịch chiết n-hexane quả cây Trâu cổ 29

Hình 3.8: Sơ đồ ngâm chiết quả cây Trâu cổ 30

Hình 3.9: Sắc kí lớp mỏng 31

Hình 3.10: Bản mỏng đang nướng trên bếp điện đôi Gali 31

Hình 3.11: Kết quả khảo sát TLC cặn chiết n-hexne quả cây Trâu cổ 32

Hình 3.12: TLC cặn n-hexane quả cây Trâu cổ với hệ dung môi (II) 33

Hình 3.13 : Cột tổng silica gel trước khi đưa chất lên 34

Hình 3.14 : Cột tổng silica gel cặn n-Hexane 35

Hình 3.15: Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F5 36

Hình 3.16 : Cột chạy silica gel 37

Hình 3.17 : Chất tẩm silica gel đã tơi 38

Hình 3.18 : Cột phân đoạn F2 38

Hình 3.19: Sơ đồ phân lập chất FPFHC1 40

Hình 3.20 : Hình ảnh chất FPFHC1 40

Hình 3.21 : Sắc kí đồ TLC của FPFHC1 41

Hình 3.22: Cấu trúc của hợp chất FPFHC1 41

Hình 3.23: Phổ ESI-MS của FPFHC1 42

Hình 3.24: Phổ IR của FPFHC1 43

Hình 3.25: Phổ 1H-NMR của hợp chất FPFHC1 44

Hình 3.26: Phổ 13C-NMR của FPFHC1 45

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

MỞ ĐẦU 1

1.Lí do lựa chọn đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về chi F.pumila L 4

1.2 Đặc điểm thực vật của cây Trâu cổ 7

1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Ficus 8

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Hóa chất và thiết bị 12

2.2.1 Các hóa chất sử dụng 12

2.2.2 Các thiết bị nghiên cứu 13

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp ngâm chiết 16

2.3.2 Phương pháp sắc kí 18

2.3.3 Phương pháp kết tinh 20

2.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Quá trình điều chế cặn dịch chiết n-Hexane quả cây Trâu cổ 26

3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết n-hexane cây Trâu cổ 30

3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi 30

3.2.2 Quá trình phân lập các chất 34

3.3 Xác định cấu trúc hợp chất FPFHC1 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

1 Kết luận 46

2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

MỞ ĐẦU

1.Lí do lựa chọn đề tài

Trước đây, khi mà Tây y chưa xâm nhập và phát triển ở nước ta thì

những bài thuốc trong dân gian dường như đã gắn liền với đời sống của nhândân Việt Nam Trong quá trình đất nước phát triển, nhân dân đã đúc kết đượcnhiều bài thuốc vô cùng quý báu, phát hiện được nhiều cây thuốc ngay cạnhnhà có giá trị cao trong y học Đó là hệ thống y Dược học cố truyền lúc bấygiờ Đất nước càng phát triển thì yêu cầu về chất lượng càng cao Vì vậy để

kế thừa và phát triển nguồn thực vật làm thuốc có sẵn nhằm nâng cao hiệuquả trong y học, cần phải nghiên trên cơ sở khoa học một cách chính xác, đầy

đủ và toàn diện

Khí hậu nước ta nói chung rất độc đáo: khí hậu nóng nhưng không khôhạn như Tây Nam Á, Bắc Phi Nóng ẩm nhưng không nóng ẩm quanh nămnhư các quần đảo ở Đông Nam Á Đặc biệt hoạt động mạnh mẽ của gió mùa,tác động của biển Đông đã mang đến cho nước ta lượng mưa và độ ẩm dồidào Lượng mưa trung bình từ 1500-2000mm/năm, những nơi có sườn núiđón gió biển hoặc núi cao-lượng mưa tới 3500-4000mm/năm Độ ẩm khôngkhí tương đối cao trên 80% Riêng Bắc Bộ quanh năm có nhiệt độ tương đốicao và ẩm, nền khí hậu chịu ảnh hưởng từ lục địa Trung Hoa chuyển qua vàmang tính chất khí hậu lục địa Trong khi một phần khu vực Duyên hải lạichịu ảnh hưởng tính chất khí hậu cận nhiệt đới ấm và gió mùa ẩm từ đất liền,tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loài sinh vật

Theo các tài liệu thống kê, Việ Nam là một trong 25 nước có độ đa dạngsinh học cao trên thế giới với dự tính có thể có tới 15.000 loài thực vật ViệtNam được xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học (chiếm 6,5% số loài cótrên thế giới Hiện nay đã ghi nhận nước ta có 13.766 loài thực vật, trong đó

có trên 3.200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian Đây

chính là cơ sở để nước ta phát triển tiềm năng về nghiên cứu các hợp chấtthiên nhiên có trong các loài tực vật [1]., [2]., [3]

Trong vô số các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc chi F.

pumila L và các loài này đã được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền Chi

Ficus ở Việt Nam có 99 loài và nhiều loài này đã được sử dụng như làm thuốc

giảm đau, thanh nhiệt, cầm máu, trị ghẻ lở; một số loài còn dùng quả để bồi

bổ sức khỏe, [1] Cây Trâu cổ cũng là một trong số các cây thuốc thuộc loàinày và đã được sử dụng ở nước ta Một thí nghiệm gần đây trên chuột nhắt,polysaccharid của quả trâu cổ vói liều 416,6 mg/kg, tiêm xoang bụng hoặctiêm dưới da liên tục 10 ngày có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung thư đãđược cấy ghép trên chuột, mạnh nhất đối với sarcom lympho I và sarcom 180.Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, polysaccharid có tác dụng tăng cường phảnứng miễn dịch của chuột cả ở lô bình thường và lô đã được cấy ghép khối ucũng như lô đã cấy ghép khối u đang dùng hóa trị liệu hoặc xạ trị liệu(radiotherapy) Thuốc làm tăng số lượng tế bào sinh kháng thể ở lách, tăngcường tác dụng thực bào của các macrophage ở xoang bụng, đồng thời làmtăng số lượng bạch cầu máu ngoại vi [9]., [10]

Quả trâu cổ còn là một vị thuốc bổ được nhân dân dùng từ lâu đời đểchữa dương ủy di tinh, liệt dương, đau lưng, lỵ lâu ngày thoát giang, tắc tiasữa, Nhưng đến nay vẫn chưa có tài liệu nào công bố về thành phần hóa họccủa quả cây Trâu cố Và đặc biệt, trong quá trình tìm hiểu và nghiên cứu đãphát hiện loại cây này cũng có ở nhiều nơi tại Tỉnh nhà và xuất hiện nhiềutrong khuôn viên Trường Đại học Hùng Vương Cơ sở Phú Thọ, tạo điều kiệnthuận lợi trong việc thu hái và nghiên cứu

Xuất phát từ các lý do trên, nhằm mục tiêu tìm kiếm các hợp chất thiênnhiên từ các loài thực vật của Việt Nam, góp phần làm sáng tỏ thành phần hóahọc và tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng các loài thực vật, tôi lựa chọn

nghiên cứu khóa luận “Nghiên cứu thành phần hóa học cặn chiết n-hexane

quả cây Trâu cổ (Ficus pumila L.)”

2 Mục tiêu đề tài

- Điều chế cặn dịch chết n-hexane của cây Trâu cổ

- Phân lập hợp chất thứ cấp từ 1 -2 phân đoạn nhỏ của dịch chiết hexane của cây Trâu cổ

n Xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp phân lập được bằng các phươngpháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Các kết quả nghiên cứu được sẽ cung cấp phần lớn

thông tin cho việc nghiên cứu hóa học các hợp chất hữu cơ như: kĩ thuậtngâm chất, tách chất, xử lí phân đoạn chất, Đặc biệt là xác định được cấutrúc hợp chất và các hoạt tính sinh học của chất có trong cây Trâu cổ

- Ý nghĩa thực tiễn: Việc nghiên cứu trên thực nghiệm sẽ cung cấp cơ sở

khoa học định hướng cho việc nghiên cứu Cung cấp tài liệu phục vụ chonghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và việc nghiên cứu vềthành phần hóa học cây Trâu cổ nói riêng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về chi F.pumila L.

Theo tác giả Võ Văn Chi [1]., chi Trâu cổ (F.pumila L) thuộc họ Dâu tằm (Moraceae) [Tên Latin của cây, biến âm của chữ sakon: Tên Hy Lạp

của cây Sung ngọt] – Sung, Vả, Đa Nhóm này ưa khí hậu nhiệt đới vànóng, phân bố chủ yếu ở vùng Ấn Độ, Mã Lai Tính đến nay có khoảng 800loài Riêng ở Việt Nam có 99 loài và nhiều loài được biết đên từ lâu nhưmột vị thuốc quý báu

Theo các nghiên cứu loài Ficus L ở dạng cây gỗ lớn, cây nhỡ hay dâyleo, có dịch như sữa Cây Trâu cổ có lá mọc so le hay mọc đối, nguyên, chiathùy hoặc có răng; lá kèm thường rụng sớm Quả của cây trâu cổ hay còn gọi

là cây vẩy ốc hay cây xộp Nguời Tày quen gọi là cây mác pốp

Tên gọi Đông y của quả Trâu cổ là lương phấn quả, bị lệ thực hayvương bất lưu hành Quả non phơi khô còn gọi bị lệ lạc thạch đằng.Theonghiên cứu, trong vỏ quả Trâu cổ có chứa đến 13% chất gôm Khi tiếnhành thuỷ phân sẽ cho ra các phân tử đường đơn gồm glucose, arabinose

và fructose Bộ phận thân và lá có chứa amyrin, mesoinositol, taraxerylacetate, sitosterol Phần hạt trong quả có chứa chất polysaccharid

F.abelii Miq –Sung chè, Rù rì

Loài sung chè, Rù rì phân bố ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Việt Nam,Lào Ở nước ta có gặp từ Lạng Sơn, Hà Tây, Thanh Hóa vào Thừa Thiên –Huế Loài này thường ở dạng bụi cao 1-2m Lá các loài sung chè mọc so le,hình trứng ngược thuôn hay hình dải, dài 4-8cm, rộng 1-2cm, mặt trên bóng,mặt dưới đầy lông xám, gốc nhọn hay tù tròn, cành và cuống lá có lông dàyxám Cụm hoa hình trứng ngược tròn hay hình quả lê, hoa đực có 3-5 lá đài, 1nhị; hoa cái có 4 lá đài.Có hoa quả vào tháng 11 Cây thường mọc dọc bờ suối

và trên các ngách đá ven suối khắp nước ta

F.carica L – Sung ngọt, Vả tây.

Loài Vả tây có xuất xứ từ vùng khô hạn Trung Á,sinh trưởng tự hiên tạinhững vùng núi lửa ở Iran nhất là vùng núi Kohestan của vùng Khorasan Câythuộc nhóm cây gỗ nhỏ, thân cao từ 3-10cm, vỏ cây màu nâu xám, cuống làcứng, thân hợp trục, cành nhán thẳng Lá và búp màu đỏ, sớm rụng Lá chấtliệu dai, có lông, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt và hơi ráp Hệ gâncủa lá có từ 2-4 cặp gân sơ cấp và 5-7 cặp gân thứ cấp từ mõi gân sơ cấp Quả

có dạng hình trụ hay cầu, to, dạng như quả lê, màu sắc có thể thay đổi khichín Có quả từ tháng 5 đến tháng 7 hàng năm

F.altissima Blume – Đa tía, Đa

Đây là một loài thực vật có hoa, Ficus altissima là loài bản địa ở ĐôngNam Á và nhiều hòn đảo ở Thái Bình Dương Phạm vi của nó bao gồm cácquần đảo Andaman, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam, Lào, Nam Trung Quốc vàkhu vực Malesia Lá cây mọc so le cứng hoặc hơi dai, hoàn toàn nhẵn, dài 4-16cm, rộng 4-8cm, có 3-5 gân gốc; cuống khá to, hơi hẹp, có rãnh, dài 2,5-3,5cm Quả sung trên những nhánh có lá, hình trứng, không cuống, dài 2cm,rộng 1,5cm, khi chín màu tím Có hoa và quả vào khoảng tháng 2 đến tháng 5.Loài này được Blume mô tả khoa học đầu tiên năm 1825, lần đầu tiên được

mô tả bởi nhà thực vật học người Hà Lan Carl Ludwig Blume năm 1826 từJava Cây mọc khắp nơi ở nước ta, từ vùng thấp cho tới vùng cao, đến độ cao1500m, và cũng thường được trồng lấy bóng mát ở các tỉnh Lạng Sơn, VĩnhPhú, Hà Nội, Hà Tây, Ninh Bình, Thanh Hoá, Gia Lai, Khánh Hoà, NinhThuận,Đồng Nai,…

F.erecta Thunb.Var.BeecheyanaKinh - Sung thiên tiên.

Theo y học cổ truyền, dược liệu Sung thiên tiên Rễ khư phong, trừ thấp;quả sung có tác dụng noãn hạ, nhuận tràng Cây nhỡ hoặc cây gỗ, cao 1-8m,cành to 5mm, lúc non có lông nằm Lá dài từ 7-18cm, rộng 3,5-9cm, đầu nhọn

và có phiến bầu dục thon Gốc hẹp hình tim, gân từ gốc chạy đến 1/2 phiến,

gân phụ khác 5 cặp; cuống dài 1,5cm Quả sung tròn tròn, đường kính 1,8cm, trên cuống dài 2,3cm; bao chung có 3 lá bắc nhỏ; hoa đực rải rác, có 3

1-lá bắc, 2-3 nhị; hoa cái có 3 1-lá đài, vòi nhuỵ dài; quả bế 1-3mm Ở TrungQuốc, rễ cây được dùng chữa phong thấp đau nhức xương còn quả sung dùngchữa chứng trĩ  Loài này thường thấy ở Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan vàViệt Nam

F.hirta Vahl – Vú bò, Ngái lông

Cây này còn có tên khác như: Ngái khỉ, Ngõa khỉ, Vú bò lông Phân bốchủ yếu ở Bắc Giang, Sơn La, Hòa Bình Loài cây này mọc tự nhiên trong cácmảng thứ sinh và những nơi ẩm, lầy Thường ra hoa và quat từ tháng 12 đếntháng 2 hàng năm Được biết đến với các công dụng như: trị thấp khớp, camtrẻ em,… và cả cây có thể dùng làm thuốc, không chỉ riêng lá, quả hay rễ.Đây là loài cây thân nhỡ hay cây nhỏ, có nhựa mủ, cao 2-8m; cành, lá, cuống

lá và hoa đều có lông hoe dày Lá cây có dạng hình bầu dục, hay xoan ngược,phiến đơn hay chia 3 thùy, dài 8-25cm, rộng 4-13cm cuống 2,5-5cm, có lôngdày, cứng

F.sumatrana Miq.var.sub sumatranaCorner – Đa cừa, Cừa

Cây được phân bố từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế Gia Lai.Ngoài dùng làm cảnh thì nhựa của cây còn được dùng để cầm máu Cây rahoa vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 Là loại cây gỗ cao 20m, nhánh non khámảnh, dây 3-5mm Lá cây dài 5-10cm, rộng 3-5cm, rất nhẵn, dai, hình bầudục, tù hay tròn ở gốc, hơi thót lại ở đầu tù; cuống lá dài 15mm, dẹp; mépnguyên; gân gốc 3, gân phụ 5 đôi, dính nhau với gân mép, không có rãnh,rộng 2,5mm Lá kèm của cây có hình ngọn giáo nhọn, dài 15-18mm

F.elastica Roxb.Ex Horn– Đa búp đỏ

Đa búp đỏ còn gọi là Đa cao su hay Đa dai Có hoa quả vào tháng 1 đếntháng 3 Là loại cây gỗ thường xanh cao rất cao (35cm) Đường kính thân lớntới 70cm Lá to, hình trái xoan hoặc bầu dục, dày và dai Lá kèm tạo ra mộtbúp đỏ bao lấy chồi ngọn Cụm hoa hình cầu dẹt, thường mọc ở nách lá, cụm

quả chín rất dễ nát, khi chìn thường có màu vàng lục Ở nước ta cây mọc dại ởnhững nơi rừng núi hoặc được trồng làm bóng mát ở thôn làng Quả cây còn

có thể dùng làm thức ăn cho cá vì vậy ta thường thấy cây được trồng quanh ao

hồ Trên thế giới, loài cây này có ở Ấn Độ, Nepan, Mianma, Malaixia,Inđônêxia

F.pumila L– Trâu cổ, Sộp, Vẩy ốc

Cây Trâu cổ còn gọi cây xộp, vẩy ốc, bị lệ, mác pốp (cách gọi củadân tộc Tày và Nùng) Trâu cổ là loại dây leo, mọc bò với rễ phụ bám lên

đá, bờ tường hay cây cổ thụ Toàn thân có nhựa mủ trắng Lá mọc so le; ởcác cành có rễ bám thì lá nhỏ, không có cuống, gốc lá hình tim , Quả trâu cổ có vị ngọt, mát, tính bình Lá và cành vị chua chát,tính mát có tác dụng thông tiện,lợi sữa Dây leo bò với rễ bám, có mủ trắnglúc cây còn non, có những nhánh bò mang lá không có cuống, gốc hình tim,nhỏ như vẩy ốc, ở dạng trưởng thành, có những nhánh tự do mang lá lớnhơn và có cuống dài Cụm hoa có đế hoa bao kín dạng quả sung, khi chín cómàu đỏ vào mùa tháng 5-10

Trong vỏ quả (đế của cụm hoa dạng Sung) có tới 13% chất gôm, khi

thuỷ phân cho glucose, fructose và arabinose Trong thân và lá có một số chất

như: Mesoinositol, b- sitosterol, Taraxeryl aceatate, b- amyrin Quả được

dùng trị lỵ lâu ngày, kinh nguyệt không đều, ít sữa, tắc tia sữa, viêm tinhhoàn, phong thấp, ung thũng, cũng dùng cho người bệnh di tinh, liệt dương,đái ra dưỡng trấp Dây, rễ dùng trị phong thấp tê mỏi, sang độc, ung nhọt vàkinh nguyệt không đều Lá được dùng trị viêm khớp xương, nhức mỏi chântay, đòn ngã tổn thương cũng dùng trị đinh sang, ngứa lở

1.2 Đặc điểm thực vật của cây Trâu cổ

Loài Trâu cổ còn được gọi với cái tên khác như Vương bất lưu hành, câyxộp, cây vẩy ốc,… Vừa là một loại cây cảnh lại vừa là một loại cây có nhiềucông dụng qúy

Trâu cổ là một loài dây leo bò với rễ bám Rễ cây mọc xung quanh cácđốt, bám trên các tảng đá, tường gạch lâu ngày hay sống bám trên các thâncây khác Đường kính của thân trung bình vào khoảng 3-5mm lõi cây hóa gỗ,

vỏ thân xù xì, kích thước từng đốt khác nhau [1]

Lúc còn non cây có mủ trắng, có những nhánh bò mang lá không cócuống, gốc hình tim, nhở như vẩy ốc Cụm hoa có đế bao kín dạng quả sung,khi chín thường có màu đỏ.Loài này thường có hoa quả vào khoảng tháng 5đến tháng 10 Ở vùng Ấn Độ - Malaixia nơi mà cây Trâu cổ phân bố chủ yếu,người ta thường dùng quả thu hái vào mùa thu, thái nhỏ Còn cành non, thânnon có thể thu hái quanh năm, dung tươi sẽ có công dung hơn so với phơikhô Lá thân được gọi là Bị lệ lạc thạc đằng, còn quả thường gọi là Vương bấtlưu hành đều là những dược liệu quý Ngoài ra, ở một số nơi họ còn dùng cảnhựa cây [3]

Quả Trâu cổ thường đơn độc ở nách lá, dạng phức lớn, hình chópngược, màu đỏ sẫm khi chín, mềm, nạc thơm, thường có vị ngọt, chát, tínhbình Cây rất dễ sinh trưởng và phát triển mà không cần chăm sóc, ưa ẩm,mát, đủ ánh sáng, dễ sống Qủa Trâu cổ thường được thu hoạch vào mùa thu,dài khoảng 30-40 mm, đường kính khoảng 25-30mm [1]., [3]

1.3 Các nghiên cứu về hóa thực vật chi Ficus

Dựa trên các tài liệu tham khảo cho thấy đến nay vẫn chưa có công trìnhkhoa học nào công bố chi tiết về thành phần hóa học của cây Trâu cổ

Theo Từ điển thực vật thông dụng của tác giả Võ Văn Chi chỉ ra cho

thấy cây Trâu cổ có chứa steroid như β – sitosterol (1) [1]

Công trình công bố trên thế giới năm 2012, cho thấy nhóm các hợp chất

terpenoid lupeol (2), guaiazulene (3), cadalene (4); flavonoid như quercitin (5), alkaloid như dopamine (6), adrenaline (7), serotonin (8); các hợp chất coumarin như umbeliferone (9) đã được phân lập từ một số loài thuộc chi

Ficus [12]

Năm 2014, nhóm tác giả Đài Loan đã phân lập được một số hợp chất

thiên nhiên 4-(2-hydroxyethyl)-2-methoxyphenol (10), meso-2,3-butanediol (11), (2R,3R)-2,3-butanediol (12), (2S,3S)-2,3-butanediol (13) từ quả xanh

loài Ficus nota [15]

Năm 2016 nhóm tác giả Malaysia Shukranul Mawa đã phân lập được

hợp chất triterpenoid 28,28,30-trihydroxylupeol (14) từ thân cây Ficus

aurantiaca Griff [14]

Ở Việt Nam, năm 2017, tác giả Phạm Thị Nhật Trinh và cộng sự đã tách

được hợp chất isoquercitrin (15) cùng nhiều hợp chất khác từ lá cây Ficus

pumila L Kết quả này đã được nhóm nghiên cứu công bố trên tạp chí Natural

Products Research [16]

Cũng trong năm 2017, tác giả Đào Thị Hải Yến trong nhóm nghiên cứucủa Trường Đại học Hùng Vương khi nghiên cứu về cây Trâu cổ đã phân lậpđược hợp chất -Sitosterol (16) từ cặn chiết n-hexane của lá cây Trâu cổ [11]

Gần đây nhất vào năm 2018, trong nhóm nghiên cứu của Trường Đại họcHùng Vương về cây Trâu cổ, tác giả Hoàng Hương Ly đã phân lập được hợp

chất Taraxerol (17) từ cặn chiết n-hexane lá cây Trâu cổ Đây là hợp chất

triterpenoid khung taraxerane lần đầu tiên được phân lập từ chi Ficus [4].

(17)

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu cây Trâu cổ được thu hái tại khuôn viên Trường Đại học HùngVương, cơ sở Thị xã Phú Thọ, tỉnh Phú Thọ Mẫu tiêu bản cây kí hiệuQHT_01 được lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật-Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam và tại Bộ môn Hóa học - Khoa Khoa học

Tự nhiên - Trường Đại học Hùng Vương

Hình 2.1: Cây Trâu cổ

Phạm vi nghiên cứu: Các phân đoạn nhỏ dịch chiết n-hexane của quả cây

Trâu cổ

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Các hóa chất sử dụng

Sử dụng các loại dung môi như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH,

acetone các dung môi này đều là các hóa chất kỹ thuật của Việt Nam, HànQuốc được chưng cất lại và tồn trữ trong những bình thủy tinh khi sử dụngchắt các loại dung môi ra các bình thủy tinh nhỏ tối màu có dán nhãn phânbiệt các bình đựng các loại dung môi khác nhau tránh nhầm lẫn dung môi

Hình 2.2: Các dung môi thông dụng được dùng để phân lập các hợp chất

thiên nhiên 2.2.2 Các thiết bị nghiên cứu

Các quá trình ngâm chiết được thực hiện trong các bình thủy tinh códung tích 5 lít Sau khi ngâm chiết dung môi được thu hồi lại bằng các thiếtbị: Máy cất quay chân không IKA®RV 10 của Anh: là thiết bị được sử dụng

với mục đích loại bỏ dung môi bằng phương pháp bay hơi, cô cạn các dịchchiết mẫu chất sau khi quá trình ngâm chiết được thực hiện.

Hình 2.3: Máy cất quay dung môi IKA-RV10 của Anh

Hỗn hợp các sản phẩm được tinh chế bằng hai phương pháp: sắc ký cộtsilica gel và là sắc ký lớp mỏng Kích cỡ cột phụ thuộc vào lượng chất ít haynhiều: 1; 2; 2,5; 4; 10 Chất nhồi cột sắc ký là silica gel 60 (0,063 –0,200 mm) (70 – 230 mesh astm) đều là của Merck còn sắc ký lớp mỏng sửdụng bình sắc ký lớp mỏng Camag của Đức và bản mỏng sắc ký trángsilicagel 60 F254 trên tấm nhôm 20 × 20 cm của Đức

- Các bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck

có độ dày 0,25 mm, bình triển khai sắc kí bản mỏng Camag

Sau khi soi xong UV, đem bản mỏng đi thử với dung dịch thuốc thửCeri sunfate và thực hiện trên bếp điện đôi Gali

Hình 2.6: Bếp điện đôi Gali

Các bước sóng UV 254, 366 nm được thực hiện trên hệ thống đèn UVCAMAG sẽ giúp soi rõ các vệt chất trên bản mỏng

Hình 2.7: Máy soi UV

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp ngâm chiết

Kỹ thuật ngâm chiết không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễdàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây

Mẫu cây sau khi phơi khô cần được say nghiền thành bột Quá trìnhnghiền làm phá vỡ màng tế bào thực vật, giúp dung môi dễ tẩm thấu vào bộtcây để dễ dàng chiết tách hết các hợp chất ra khỏi cây.

Hình 2.8 : Máy nghiền

Sau khi nghiền nhỏ, mẫu được ngâm lần lượt với các dung môi: hexane;CH2Cl2 EtOAc; MeOH Mỗi dung môi ngâm 5 lần, mỗi lần ngâm 5Ltrong 24h, sau đó ta đem lọc Lọc qua hai lần, lần thứ nhất là lọc vải lần thứhai đem phần mẫu đã qua lọc vải để lọc giấy Phần bã cây hoặc sinh khối cònlại được lọc bỏ

n-Hình 2.9: Ngâm mẫu và mẫu chất sau khi đã lọc

Do ở nhiệt độ cao có thể làm phân hủy một số hợp chất kém bền nêndung môi lọc được sẽ đem cất quay ở nhiệt độ thấp từ 30-45oC và áp suấtgiảm.

Trong phương pháp nghiên cứu hợp chất thiên nhiên thường sử dụng cácloại dung môi như: MeOH, CH2Cl2, EtOAc, n-hexane để ngâm chiết các mẫuthực vật Do các dung môi có độ phân cực khác nhau nên sẽ chiết tách được

các nhóm chất thứ cấp có độ phân cực khác nhau Chẳng hạn, n-hexane

thường chiết các nhóm chất phân cực thấp như acid béo, terpene,

2.3.2 Phương pháp sắc kí

2.3.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng là một kĩ thuật sắc kí được dùng để tách chất trong hỗnhợp Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng cácchất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit hoặc cellulose được phủtrên một mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích đượchòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn,tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trongdung dịch [6]., [13]

Hình 2.10 : Minh họa sắc kí lớp mỏng

Độ phân cực tăng dần

Rf của A= Quãng đường di chuyển của hợp chất A

Quãng đường di chuyển của dung môi Z Với Rf là độ linh động của mỗi chất, ta có:

Tương tự như vậy với hợp chất B hay với những hợp chất khác Độ linhđộng của mỗi chất là khác nhau nên mỗi Rf sẽ cho kết quả khác nhau

Bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độdày 0,25 mm được dùng để sắc kí với các hệ dung môi khác nhau tùy thuộcvào độ phân cực của mỗi hợp chất Một số hệ dung môi thông dụng như :CH2Cl2/n-Hexane, EtOAc/ n-Hexane,…

Ceri sulfate Ce(SO4)2, vanilin được dùng làm thuốc thử

Phương pháp sắc ký silica gel có cơ sở chung là dựa trên khả năng hấpphụ khác nhau của các chất trên silica gel (pha tĩnh) sau đó sẽ được dung môirửa giải (pha động) kéo lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải hấp) ở các vịtrí khác nhau trên đường đi của dung môi Do mỗi chất có độ phân cực làkhác nhau như đã nói ở trên nên chất nào có độ phân cực kém hơn sẽ đi lênnhanh hơn (cao hơn) chất có độ phân cực cao hơn (thấp hơn)

Dựa vào khảo sát TLC để lựa chọn hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel

2.3.2.2 Phương pháp sắc kí cột

Đây là một phương pháp phổ thông nhất trong các phòng thí nghiệm Cơ

sở khoa học của phương pháp này là dựa vào khả năng hấp thụ khác nhau củacác chất và sự tương tác giữa pha động và pha tĩnh Trong đó, pha tĩnh là chấthấp thụ rắn thường là silica gel (SiO2) 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230-400mesh astm) của hãng Merck Pha động – dạng lỏng thường là mốt số hệ dung

môi như : n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-hexane/acetone, được rót

từ trên đỉnh cột và chảy xuống nhờ trọng lực hoặc áp suất ngoài [6]

Hình 2.11: Minh họa sắc kí cột

Các chất có độ phân cựa khác nhau sẽ cho kết quả khá nhau Chất có độphân cựa kém hơn sẽ đi xuống dưới cột trước Cứ tiếp tục tăng dần hệ dungmôi rửa rải để các chất có độ phân cực cao hơn tiếp tục xuống

Có nhiều kích cỡ cột sắc kí nên tùy thuộc vào lượng chất ít hay nhiều màlựa chọn cột phù hợp

2.3.3 Phương pháp kết tinh

Hình 2.12 : Minh họa phương pháp kết tinh

Đây là phương pháp quan trọng để tinh chế chất rắn Cơ sở của phươngpháp này là dựa trên sự khác nha về độ tan của các chất trong dung môi (hayhỗn hợp các dung môi) ở các nhiệt độ khác nhau Hay có sự khác nhau về độtan các chất, giữa chất chính và tạp chất ở cùng nhiệt độ [6]

Ta chọn dung môi hay hệ dung môi phù hợp để hòa tan chất cần kết tinhkhi đun nóng và ít hòa tan khi làm lạnh Sau khi làm lạnh bằng dung dịch bãohòa, chất cần kết tinh sẽ lắng xuống ở dạng tinh thể, tạp chất ở lại trong dungdịch Trường hợp tạp chất không tan khi đun nóng thì cần lọc bỏ sau đó làmlạnh dung dịch bão hòa

2.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân(NMR)

Cơ sở lý thuyết của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trêntương tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trường ngoài [5]., [7]

Phổ cộng hưởng từ nhân proton (1H-NMR):

- Số lượng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học,

H) xác nhận các loại proton khác nhau và môi trường bao quanh mỗi protontrong phân tử

- Vị trí của tín hiệu cho biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậcmột, bậc hai, bậc ba,… Các proton khác nhau này có các môi trường electronbao quanh khác nhau, và chính môi trường electron bao quanh xác địnhproton hấp thụ ở đâu trong miền phổ

Trên phổ 1H-NMR tín hiệu các proton được ghi nhận thông qua độchuyển dịch hóa học  ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nộichuẩn TMS được gán  = 0 ppm