Luận án tiến sĩ sinh học đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

Hiện nay, việc cải tiến cây trồng theo hướng tăng hàm lượng tinh bột là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng và luôn được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu.. Như vậy, ứng dụng cô

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍCH LŨY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍCH LŨY TINH BỘT VÀ THỬ

NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍCH LŨY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Phạm Bích Ngọc

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Chu Hoàng Hà

Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI - 2018

i

PGS.TS Phạm Bích Ngọc và PGS.TS Chu Hoàng Hà

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hồng

ii

Chu Hoàng Hà đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trung tâm tài nguyên thực vật, Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong

khuôn khổ đề tài: “Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn có khả năng chống chịu bệnh và năng suất cao bằng công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa

học và công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ; thời gian thực hiện từ 6/2012 đến 6/2015 do PGS.TS Phạm Bích Ngọc làm chủ nhiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, và

Bộ phận phụ trách đào tạo đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, nghiên cứu

và hoàn thiện luận án

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa, Lãnh đạo khoa và cán bộ trong bộ môn Khoa học cây trồng, Bảo vệ thực vật, khoa Nông Lâm Ngư nghiệp, ĐH Hồng Đức đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi yên tâm công tác, học tập và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Minh Hồng

iii

1.1 Cây sắn và một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn 4 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4 4 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền 5 5 1.1.3 Giá trị của cây sắn 8 8 1.1.4 Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam 9 9 1.1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn 13 13 1.1.6 Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay 15 15

1.2 Quá trình hình thành và tích luỹ tinh bột ở cây sắn 19

1.2.1 Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật 19 19 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan 20 20

1.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống sắn biến đổi gen 27 27

1.3.1 Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn 27 27 1.3.2 Một số phương pháp chuyển gen ở sắn 32 32 1.3.3 Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen 35 35

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 43 2.1 Vật liệu nghiên cứu 43 43

2.1.1 Vật liệu thực vật 43 43 2.1.2 Chủng vi khuẩn, vector 43 43 2.1.3 Hoá chất và thiết bị thí nghiệm 43 43 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 44 44 2.1.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 45 45

2.2 Phương pháp nghiên cứu 45 45

2.2.1 Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu đánh

giá 45 45 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 45 45 2.2.3 Phương pháp phân lập gen và promoter 51 51 2.2.4 Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen 52 52 2.2.5 Kỹ thuật canh tác, chăm sóc các giống sắn phu ̣c vu ̣ cho nghiên cứu 54 54

phát triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA 64 64 3.1.5 Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu

hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột 65 65 3.1.6 Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá

trình sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và

củ sắn 66 66

3.2 Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và

thiết kế vector chuyển gen 75

3.2.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu 75 75 3.2.2 Phân lập gen SSIV ở sắn 76 76 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen 82 82

3.3 Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh

tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá 87 87

3.3.1 Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen

chuyển 87 87 3.3.2 Đánh giá hoạt động các gen chuyển 92 91

3.3 Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường

sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá 87

3.3.1 Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen

chuyển 87

87 3.3.2 Đánh giá hoạt động các gen chuyển 92 92

v

GUS 106 106 3.4.3 Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột 113 113

Chương 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 118 118 4.1 Sự biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất

tinh bột 118 4.2 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc

lá 122 122 4.3 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn 124 124

4.3.1 Hệ thống tái sinh cây sắn 124 124

4.3.2 Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A tumefaciens 126 126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 130 130 TÓM TẮT TIẾNG ANH……… 131 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ……… …… 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO 137 137

vi

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam từ năm

Bảng 1.4 Một số công trình nghiên cứu tái sinh invitro ở cây sắn 29

Bảng 1.5 Tổng kết một số công trình công bố về chuyển gen vào cây sắn 36

Bảng 3.1 Đặc điểm của một số giống sắn sử dụng trong phân tích biểu

Bảng 3.2 Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu RNA tổng số tách chiết

Bảng 3.3 Cơ sở dữ liê ̣u các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

Bảng 3.4 Trình tự các cặp mồi để khuếch đại các gen quan tâm 75

Bảng 3.5 Trình tự các cặp mồi nhân dòng gen liên quan đến sinh tổng

Bảng 3.6 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen SSIV ở giống

Bảng 3.7 Vị trí sai khác trong trình tự axit amin suy diễn của protein

Bảng 3.8 Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S: SSIV:T35S và

Bảng 3.9 Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong lá và trong rễ cây thuốc lá

chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S ở các dòng

Bảng 3.10 Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong rễ cây thuốc lá chuyển gen

pBI121 – C54: SSIV: NOST ở các dòng chuyển gen 98

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu và môi trường đến khả năng

Bảng 3.12 Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi trên môi trường CI 102

Bảng 3.14 Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa 105

vii

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của Kanamycin đến tỷ lệ ra rễ của chồi giống sắn

viii

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan 21

Hình 1.5 Quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây sắn 31

Hình 1.6 Kết quả tạo mô sẹo phôi hoá ở giống sắn TME 14 32

Hình 2.1 Trình tự đoạn cmyc và vị trí của các mồi PCR 53

Hình 2.2 Quá trình canh tác và thu hoa ̣ch các giống sắn quan tâm ta ̣i Tra ̣i

thực nghiê ̣m sinh học Cổ Nhuế phu ̣c vu ̣ nghiên cứu 54

Hình 2.3 Quy trình kiểm tra hàm lượng tinh bột trong lá bằng phương

pháp nhuộm iodine

58

Hình 2.4 Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ lá

cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S

60

62

Hình 3.2 RNA tổng số tách chiết từ các mẫu củ (A) và lá các giống sắn (B) 63

Hình 3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen actin từ cDNA sắn 64

Hình 3.4 Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPS qua các giai đoạn

Hình 3.5 Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPL qua các giai đoạn

Hình 3.6 Phân tích mức độ biểu hiện gen GBSS qua các giai đoạn phát

Hình 3.7 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSI, SSIII, SSIV qua các

giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 71

Hình 3.8 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSII qua các giai đoạn phát

triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR

72

Hình 3.9 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SBE qua các giai đoạn phát

Hình 3.14 Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST 85

ix

89

Hình 3.17 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc

pK7WG2D-35S:SSIV:T35S bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu

Hình 3.18 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc

Hình 3.19 Kết quả Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển gen SSIV 92

Hình 3.20 Ảnh điện di RNA tổng số được tách từ các mẫu thuốc lá chuyển gen 93

Hình 3.21 Kết quả PCR nhân gen actin từ cDNA của lá từ một số dòng

Hình 3.22 Điê ̣n di sản phẩm RT-PCR của các gen SSIV ở các dòng thuốc

Hình 3.23 Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc

Hình 3.24 Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI

Hình 3.25 Mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu khác nhau 101

Hình 3.26 Các khối mô sẹo phân hóa các giai đoạn mô phôi khác nhau ở 5

Hình 3.27 Chồi và cây sắn tái sinh từ mô sẹo phôi hóa 106

Hình 3.28 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biến nạp gen

Hình 3.29 Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 và KM140 112

Hình 3.30 Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST vào

Hình 3.31 Cây sắn giống KM140 chuyển gen SSIV được trồng ở nhà lưới 115

Hình 3.32 Điện di DNA tổng số các dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc

Hình 3.33 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với

Hình 3.34 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với

x

2.4D axit 2,4-diclophenoxiaxetic

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

AGPase ADP-glucose pyrophosphorylase

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

HSPs Heat shock proteins

IBA Indol -3- butyric acid

Kinetin 6 – fufuryl amino purine

xi

nptII Neomycin photphotranspherase gene

Picloram 4-amino-3,4,5 tricloro pyridine - 2-

cacboxylic acid

RT-PCR Realtime polymerase chain reaction

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

glucuronide

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong những loại cây lương thực

chủ lực quan trọng nhất đối với nhiều nước trên thế giới do chúng khả năng cung cấp carbonhydrate cao, thậm chí trong các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như lượng mưa thấp, hạn hán hoặc đất nghèo dinh dưỡng

Hiện nay, trong bối cảnh biến đổi khí hậu làm trái đất nóng lên, nước biển dâng cao, đe dọa an ninh lương thực thế giới và sự cạn kiệt của nguồn nguyên liệu hóa thạch thì cây sắn được coi là cây trồng đem lại giải pháp kép nhằm đạt cả hai mục tiêu: góp phần đảm bảo an ninh lương thực và cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, từng bước thay thế nhiên liệu hóa thạch

Trong kế hoạch 5 năm 2015 - 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đưa ra chủ trương giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn Kế hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha vào năm 2015

và ổn định diện tích 450.000 ha vào năm 2020, năng suất đạt khoảng 21 tấn/ha Nếu đạt được theo kế hoạch với mức sản lượng 11 triệu tấn thì vẫn sẽ xảy ra tình trạng tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản xuất ethanol với các nhà máy thức ăn chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn và lượng sắn dùng cho xuất khẩu

Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng như là nguồn lương thực và nguyên liệu công nghiệp Hiện nay, việc cải tiến cây trồng theo hướng tăng hàm lượng tinh bột là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng và luôn được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu Do vậy, các nghiên cứu tìm hiểu về con đường tổng hợp và phân hủy tinh bột ở cây trồng nói chung và đối với sắn nói riêng

sẽ góp phần thúc đẩy mục tiêu cải tạo hàm lượng tinh bột

Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và chuyển gen tạo cây sắn có hàm lượng tinh bột cao, phù hợp với mục đích

sử dụng phục vụ cho công nghiệp và xuất khẩu là một vấn đề cấp thiết ở nước ta Ngoài ra, các hướng nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử và di truyền học ở cây sắn chưa được quan tâm và phát triển nhiều Đặc biệt, chưa có những nghiên

cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ các giống sắn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn bằng công nghệ gen

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đề xuất nhiệm vụ nghiên cứu “Đánh giá

hoa ̣t đô ̣ng của mô ̣t số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bô ̣t và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Bước đầu đã chuyển được gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới

sự điều khiển của promotor đặc hiệu C54 vào giống sắn KM140 nhờ A.tumefaciens

thông qua FEC

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột

Nội dung 2: Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bô ̣t, thiết

kế vector chuyển gen

Nội dung 3: Đánh giá khả năng tổng hợp tinh bô ̣t của gen SSIV trên cây thuốc

lá mô hình

Nội dung 4: Chuyển gen SSIV vào cây sắn

4 Những đóng góp mới của luận án

+ Đã phân lập và đánh giá được hoạt động của gen SSIV liên quan đến quá khả năng tổng hợp tinh bột từ lá và củ sắn

+ Đã thu được những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc C54:SSIV-cmyc:NOST với mức độ tích lũy hàm lượng tinh bột cao hơn so với những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S từ 19,7

pB121-– 48,1% và cao hơn 15,6 pB121-– 65,7% so với cây đối chứng

+ Đây là công trình đầu tiên chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới sự điều khiển promoter đặc hiệu ở củ C54 vào mô sẹo phôi hóa (FEC)

của giống sắn KM140 thông qua A tumefaciens Kết quả bước đầu thu được 7 dòng

sắn chuyển gen dương tính khi kiểm tra với PCR

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này bao gồm các gen và hệ thống các vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp tinh bột, được phân lập từ các giống sắn quan trọng đã được đánh giá chỉ tiêu nông sinh học tại Việt Nam; cấu trúc vector mang gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector mang gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector chuyển gen và các quy trình đánh giá hoạt động gen chuyển ở mức độ sinh học phân tử Hơn nữa, hoạt động của các cấu trúc vector chuyển gen SSIV có tăng khả năng tích lũy tinh bột còn được đánh giá, kiểm tra thông qua biến nạp vào cây mô hình thuốc lá, cây sắn giống KM140 Đây chính

là tiền đề để phát triển các nghiên cứu ứng dụng tạo nên cây sắn chuyển gen mang tính trạng có lợi

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đây là đề tài nghiên cứu đầu tiên áp dụng công nghệ gen, công nghệ sinh học hiện đại nhằm tạo giống sắn năng suất cao tại Việt Nam dựa trên cơ sở khảo sát, nghiên cứu hệ gen của chính các giống sắn thu thập tại Việt Nam Do vậy, phạm vi ứng dụng của đề tài không chỉ ở chuyển gen tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột vào sắn mà còn có thể ứng dụng ở các cây lương thực dự trữ tinh bột khác như khoai tây, khoai lang

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY SẮN VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH BỘT Ở SẮN

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

1.1.1.1 Nguồn gốc

Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách đây 5000 năm Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật

củ sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela và khoảng 2000 năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru Trong khi đó, những lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900 - 200 trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất lâu đời (Rogers, 1965) Ở Châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII, Việt Nam và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ XVIII Tuy nhiên, đến thế kỷ XIX, nghề trồng sắn và tiêu thụ sắn mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ thuật chế biến ở Brazin bởi các nô lệ Từ đó đến nay, diện tích, năng suất và sản lượng sắn ngày một tăng (Trần Ngọc Ngoạn, 2007)

1.1.1.2 Phân loại

Chi Manihot bao gồm những cây có hoa, hạt kín, có hai lá mầm, họ thầu dầu Vào năm 1651 Bauhin là người đầu tiên đã dùng danh từ Manihot để chỉ

chi này khi ông mô tả một mẫu cây đã được một thày tu Pháp A Thevet mang từ

Brazin về, ông đặt tên loài là Manihot theveti Có thể cho rằng loài cây đó hiện nay người ta gọi tên là Manihot esculenta Crantz (Rogers, 1965)

Năm 1776, Crantz công bố sự mô tả loài với tên Manihot esculenta, căn cứ

vào một mẫu cây Merian mang về từ Surinam năm 1726 Sau đó nhiều tác giả

đã nghiên cứu về chi Manihot với các cách phân nhóm khác nhau Đến năm 1938, Cifferi trở lại cách gọi tên của Crantz, ông dùng lại tên loài M.esculenta và

không còn phân biệt giữa sắn đắng và sắn ngọt, ông cung cấp một quan niệm về các giống trồng phổ biến (cultivar) Bảng phân loại cuối cùng của Rogers và Appan (1973) là kết quả của một công trình nghiên cứu rất đầy đủ về chi

Manihot, tiến hành trong 20 năm với phương pháp phân loại số lượng

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

* Thân cây

Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1 - 3 m Chiều cao của cây phụ thuộc vào giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng Thân sắn có khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây Thân và cành già đã hoá gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng Số lượng thân phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của

vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bì rất mỏng Khi nhân vô tính sắn người ta sử dụng các đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh, phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom không bị mất nước (Tribadi và cs., 2010; Ceballos & Cruz, 2012)

* Lá sắn

Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá Cuống lá dài từ 3 - 30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tuỳ theo giống (màu vàng, xanh vàng, hồng, đỏ tươi) Phiến lá thường chia 5 - 7 thuỳ nhưng cũng có khi không chia thuỳ Lá của cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chí thuỳ không đều Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thuỳ của phiến lá thường giảm Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô dậu, tầng mô hổng và biểu bì Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng

30 µm và có khoảng 700 lỗ/mm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Tribadi và cs., 2010)

Hình 1.1: Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz)

Hoa cái có năm lá đài và có màu sắc sặc sỡ, ngoài rìa có lông Giữa hoa cái có một bầu hoa 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài Trên bầu có 3 vòi nhuỵ ngắn với đầu nhuỵ uốn cong Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn

ở bên trong và có lông ở phía ngoài Có khoảng 8 - 10 nhị đực xếp thành hai vòng

và mọc lên từ các thuỳ của mỗi đĩa phía dưới Bao phấm mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày dính, màng ngoài hạt phấn có gai nhỏ (Ceballos and Cruz, 2012)

Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ phấn Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây Hoa

đực thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào cuối buổi chiều Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn trước khi hoa nở 1 giờ, sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn trong khoảng 30

cm Tuổi thọ của hạt phấn là 1 tuần còn thời gian tiếp nhận hạt phấn của đầu nhuỵ trong vòng 24 giờ Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang màu nâu, khô đi

và rụng chậm nhất sau 1 ngày Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ tinh kéo dài từ 8 -

19 giờ (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos and Cruz, 2012)

* Quả và hạt

Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1 - 1,5 cm Quả có 3 ngăn được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa 1 hạt Màu sắc quả thường biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng dến lục hay đỏ tía Cuống quả phình lên ở chỗ tiếp xúc với quả Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả Hạt sắn hình trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác Hạt có vân hoặc những vết màu đỏ nâu trên nền kem hoặc xám nhạt (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos & Cruz, 2012)

* Rễ sắn

Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại làm giống cho vụ kế tiếp) Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ mọc thẳng cắm xuống đất sau đó các rễ phụ mọc ra, cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ Rễ mọc ra

từ hom đầu tiên thì mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất, rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hoá và dự trữ Rễ đồng hoá thường cắm sâu trong lòng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây vững chắc Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành Khi cây mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ có một số rễ con được tập trung dinh dưỡng phát triển thành củ

Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể có hoặc không có cuống củ (Ceballos & Cruz, 2012)

1.1.2.2 Đặc điểm sinh thái

Cây Sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae

sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới (Allem., 2002) Sắn được phân bố phổ biến từ 33o vĩ Bắc đến 33o vĩ Nam

Sắn được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa lý nơi trồng

Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yucca (tiếng Tây Ban Nha) hoặc mandioca (tiếng

Bồ Đào Nha)

Cây sắn yêu cầu khoảng nhiệt độ tối thích khá rộng từ 20 – 40oC Yếu tố nhiệt

độ ảnh hưởng đến tuổi thọ lá và chỉ số diện tích lá Khi nhiệt độ tăng từ 20 – 24oC, tuổi thọ của lá giảm nhưng tăng số lá mới hình thành Là cây ưa sáng, cây sắn thích hợp với thời gian chiếu sáng 12h/ngày để tích luỹ tinh bột về củ (Keating và cs.,1998)

Rogers & Appan (1973) đã xây dựng một bảng phân loại cho 98 loài thuộc

chi Manihot, phân thành 17 nhóm Sự nhận dạng các loài và các nhóm dựa vào sự

phân tích nhiều mặt của đặc điểm hình thái ở các bộ phận trên mặt đất Nhờ vào bảng phân loại người ta đã lập được một bảng nhận dạng các loài trong chi

1.1.3 Giá trị của cây sắn

Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới sau lúa và ngô (Kim và cs., 2010) Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84 - 87% khối lượng khô, là nguồn cung cấp carbonhydrate cho hơn 500 triệu người ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới Trong củ sắn cũng có một số loại axit amin chứa lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm lượng thấp các protein, chất béo, một số chất khoáng (P, K, Mg, ) và vitamin (B1, B2, ) (Trần Ngọc Ngoạn, 2007)

Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người và động vật, sắn còn góp phần vào sự đa dạng về kinh tế và tạo cơ hội cho phát triển công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học với hơn 80 quốc gia có khả năng phát triển ngành công nghiệp từ sắn (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Abrahamian

& Kantharajah, 2011) Tinh bột sắn được dùng để sản xuất các loại bánh, kẹo, bột ngọt, mì ăn liền, làm phụ gia dược phẩm và đặc biệt, sắn được sử dụng làm nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất cồn sinh học đem lại hiệu suất và hiệu quả

kinh tế cao Thân sắn dùng để sản xuất nấm, nguyên liệu cho công nghiệp xenlulozơ và nguyên liệu để sản xuất một số sản phẩm khác như màng phủ sinh học, chất giữ ẩm, bao bì và phụ gia dược phẩm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007)

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của sắn

(Nguô ̀n: Christopher et al., 1995)

Giá trị chủ yếu của cây sắn là hàm lượng tinh bột tập trung ở rễ (củ) Củ sắn giàu chất bột, năng lượng, khoáng, vitamin C, hạt bột sắn nhỏ mịn, độ dính cao nhưng nghèo chất béo và nhất là nghèo đạm, hàm lượng các acid amin không cân đối, thừa arginin nhưng thiếu các acid amin chứa lưu huỳnh Tùy theo giống sắn, vụ trồng, số tháng thu hoạch sau trồng và kỹ thuật phân tích mà tổng số vật chất khô và hàm lượng đạm, béo, khoáng, xơ, đường, bột có sự thay đổi

1.1.4 Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1 Tình hình sản xuất sắn trên thế giới

Theo nghiên cứu thị trường sắn toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Quốc tế (FAO) và Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI),

với tầm nhìn đến năm 2020 sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,10 triệu tấn, trong

đó sản xuất sắn chủ yếu ở các nước đang phát triển là 274,7 triệu tấn, các nước đã phát triển khoảng 0,4 triệu tấn Mức tiêu thụ sắn ở các nước đang phát triển dự báo đạt 254,60 triệu tấn so với các nước đã phát triển là 20,5 triệu tấn Khối lượng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu là 176,3 triệu tấn và thức ăn gia súc 53,4 triệu tấn Tốc độ tăng hàng năm của nhu cầu sử dụng sản phẩm sắn làm lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc đạt tương ứng là 1,98% và 0,95% Hiện nay, Châu Phi vẫn là khu vực dẫn đầu sản lượng sắn toàn cầu với dự báo sản lượng năm 2020 sẽ đạt 168,6 triệu tấn Trong đó, khối lượng sản phẩm sử dụng làm lương thực thực phẩm là 77,2%, làm thức ăn gia súc là 4,4% Châu Mỹ Latinh giai đoạn 1993 - 2020, ước tính tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn tăng hàng năm

là 1,3%, so với châu Phi là 2,44% và châu Á là 0,84 - 0,96% Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan trọng trong nhiều nước châu Á, đặc biệt là các nước vùng Đông Nam Á

- nơi cây sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa và ngô và tổng sản lượng đứng thứ ba sau lúa và mía (Hoàng Kim, 2013)

Bảng 1.2: Diện tích, năng suất, sản lượng sắn của các khu vực trên thế giới

trong năm 2014 – 2015

Khu vực

Diện tích (ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (tấn)

Diện tích (ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (tấn) Thế giới 23.939.301 11,004 263.439.862 24.225.200 11,157 270.278.871

lượng cao nhất với 8,1 triệu tấn và năng suất 35,6 tấn/ha Trong khi ở châu Mĩ sản lượng là 32,8 triệu tấn (cao hơn 2,3 triệu tấn đạt được 2014), với năng suất trung bình 21,8 tấn/ha (Bảng 1.2) Diện tích canh tác sắn trên thế giới vẫn tăng trong những năm gần đây (chỉ có ở Châu Á là giảm nhẹ)

1.1.4.2 Tình hình sản xuất sắn tại Việt Nam

Sắn được trồng khá phổ biến ở Việt Nam và đã từ lâu được xem là cây lương thực và thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và ngô Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%), dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%) và khoảng 12,2% dùng tiêu thụ tươi (Trần Ngọc Ngoạn, 2007) Bắt đầu từ những năm 2000, cây sắn đã được chuyển đổi từ một cây lương thực sang cây công nghiệp Sắn có những ưu điểm phù hợp với các hộ nông dân nhỏ và nghèo như: dễ trồng, hợp nhiều loại đất, chịu được đất nghèo dinh dưỡng và các mùa khô hạn, ngoài ra sắn có thể nằm trong đất từ 7 tháng đến 2 năm sau khi trồng và thu hoạch khi cần thiết, vốn đầu tư thấp, phù hợp khả năng kinh tế với nhiều hộ gia đình nông dân nghèo, thiếu lao động, tận dụng đất để lấy ngắn nuôi dài Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ biến ở hầu hết các tỉnh của các vùng sinh thái nông nghiệp từ Bắc đến Nam Diện tích sắn trồng nhiều nhất ở vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi và trung du phía Bắc, vùng ven biển Nam Trung Bộ và vùng ven biển Bắc Trung Bộ Thông thường, sắn được trồng chính vụ vào khoảng từ tháng 2 đến tháng 4 và thu hoạch sau khoảng 7 - 10 tháng tùy thuộc điều kiện khí hậu từng vùng Theo thông báo tại Hội nghị toàn cầu về cây sắn 2011 tại Thái Lan thì từ năm 2000 đến 2010, diện tích trồng sắn của Việt Nam đã tăng từ 237,6 nghìn ha tới 560,4 nghìn ha, năng suất tăng từ 8,36 tấn/ha đến 16,90 tấn/ha và sản lượng tăng từ 1,99 lên tới 9,45 triệu tấn Hiện tại 70% sản lượng là dành cho xuất khẩu Năm 2010, mặc dù năng suất sắn vẫn đạt ở mức cao khoảng 17,0 tấn/ha nhưng sản lượng sắn cả nước chỉ đạt 8,52 triệu tấn, tức giảm 0,4% so với năm 2009 do diện tích trồng sắn đã giảm 2,5% còn 560.000 ha Dự kiến năm 2020 diện tích giảm còn 450.000 ha nhưng năng suất tăng 21,0 tấn/ha

Bên cạnh đó sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước, là nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, bio-ethanol, mì ăn liền, bánh kẹo, siro, nước giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất

giữ ẩm cho đất Mỗi năm Việt Nam xuất khẩu trên 4 triệu tấn sản phẩm từ cây sắn, đứng thứ hai khu vực, sau Thái Lan Tuy nhiên, tỷ lệ hao hụt trong thu hoạch, vận chuyển còn rất lớn, chiếm khoảng 10% tổng sản lượng Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 3,8 triệu tấn củ tươi/năm

và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ công rải rác tại hầu hết các tỉnh trồng sắn Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.000 – 1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước

Bảng 1.3: Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam

từ năm 2010 – 2016

(nghìn ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

ăn chăn nuôi: 3,67 triệu tấn; iii) Sản xuất tinh bột sắn: 1,8 triệu tấn; iv) Lượng sắn

củ tươi còn lại dành cho xuất khẩu chỉ vào khoảng 200.000 tấn

Việt Nam trong thời gian gần đây đang phát triển chính sách E5, E10 và yêu cầu sản xuất từ 100 đến 150 triệu lít mỗi năm Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025" nhằm mục đích để sản xuất nhiên liệu sinh học và một phần thay thế nhiên liệu truyền thống Điều này sẽ đóng góp vào an ninh năng lượng và bảo vệ môi

trường Tập đoàn dầu khí Việt Nam có kế hoạch xây dựng ba nhà máy sắn sản xuất ethanol ở miền Bắc (Phú Thọ), miền Trung (Quảng Ngãi) và miền Nam (Bình Phước) với tổng công suất dự kiến khoảng 300 triệu lít mỗi năm Để thực hiện lộ trình sử dụng xăng sinh học E5 như đã đề ra năm 2015 cần khoảng gần 4 triệu tấn sắn tươi; năm 2020 cần khoảng 5,5 triệu tấn và đến năm 2025 cần khoảng 6,8 - 8,0 triệu tấn Nếu căn cứ vào mức sản lượng sắn như hiện tại thì vào năm

2025, khi tất cả các nhà máy đều đi vào hoạt động với công suất tối đa, cả nước sẽ thiếu khoảng 2,2 - 2,5 triệu tấn sắn tươi nguyên liệu

Sự phát triển của ngành sắn hiện nay cho thấy nhu cầu cấp bách trong công tác hoạch định chiến lược phát triển dài hạn cho ngành này, trong đó có tính đến các khía cạnh cân đối cung cầu về xuất khẩu, nguồn cung nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, sản xuất ethanol, quỹ đất và đặc biệt cần có các hướng đầu tư nghiên cứu để tăng năng suất của cây sắn tại Việt Nam

1.1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn

1.1.5.1 Giống

Hàm lượng tinh bột trong củ sắn là yếu tố chất lượng quan trọng quyết định giống có được chấp nhận hay không Trong quá trình chọn tạo giống sắn các dòng

có hàm lượng tinh bột < 25% sẽ không được lựa chọn

Hàm lượng tinh bột là tính trạng rất khó cải thiện bằng các biện pháp kỹ thuật canh tác tuy nhiên lại bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian thu hoạch, giống, lượng mưa… Mỗi giống có khả năng giữ tinh bột ở mức độ khác nhau, tuỳ thuộc vào khả năng đó mà có thể phân ra giống ngắn ngày, trung ngày, dài ngày

Tại Việt Nam, kết quả khảo sát ở 250 giống sắn đã thống kê được 34 giống sắn có hàm lượng tinh bột cao (28 - 29,5%): SM 937-26; KM313-3; Gòn (Phạm Bích Ngọc., 2016), (Phụ lu ̣c 1) Những giống có đặc tính quý này cần được lưu giữ

để làm nguồn gen cho các nghiên cứu tiếp theo: chọn bố mẹ cho các phép lai, làm nguồn vật liệu đột biến tạo biến dị có lợi trong công tác chọn giống (Nguyễn Hữu

Hỷ và cs., 2012)

1.1.5.2 Yếu tố quang hợp

Sản phẩm thu hoạch chủ yếu ở cây sắn là củ Ngay sau trồng 28 ngày, một lượng lớn hạt tinh bột đã được hình thành ở mạch gỗ của từng nhu mô rễ củ Tuy nhiên, việc phân tích trong thời gian này không có khả năng phân biệt được giữa rễ

và củ mà sau này nhờ vào quá trình tích lũy tinh bột để trở thành củ và còn một số

rễ vẫn chỉ là rễ thường Vào khoảng 6 tuần sau khi trồng, một số rễ củ bắt đầu lớn lên một cách nhanh chóng Số củ được quyết định từ 2 - 3 tháng sau trồng và ít có

sự thay đổi trong quá trình sinh trưởng ở hầu hết các giống sắn Các tác giả cho rằng

củ bắt đầu tích lũy khi sự cung cấp hydratcacbon vượt quá yêu cầu sinh trưởng của thân lá (Keating và cs., 1998)

Một trong những đặc điểm khác biệt của cây sắn so với cây ngũ cốc khác là cây sắn có sự phát triển đồng thời giữa phát triển thân lá và tích lũy tinh bột vào củ

Có nghĩa sản phẩm quang hợp được phân phối cho duy trì và phát triển thân lá mới

và phình to của củ Như vậy, năng suất sắn củ phụ thuộc vào khả năng quang hợp của lá và sự phân phối vật chất khi hình thành cho các bộ phận khác nhau của cây

Có thể nói là có sự cạnh tranh giữa bộ phận trên mặt đất và dưới mặt đất về sử dụng sản phẩm của quang hợp

1.1.5.3 Nhiệt độ, ánh sáng

Cây sắn yêu cầu khoảng nhiệt độ tối thích khá rộng từ 20 – 40oC Yếu tố nhiệt

độ ảnh hưởng đến tuổi thọ lá và chỉ số diện tích lá Khi nhiệt độ tăng từ 20 – 24oC, tuổi thọ của lá giảm nhưng tăng số lá mới hình thành (Keating và cs.,1998) Từ đó tác động đến quan hệ giữa quang hợp và hô hấp của cây, năng suất của củ

Trong điều kiện ngày dài đêm ngắn cây sắn thường tăng cường tích lũy tinh bột về củ Độ dài ngày thích hợp để tích lũy tinh bột về củ là 12h/ngày Khi bị che bóng 60% ánh sáng so với không che bóng, năng suất củ bị giảm tới 36% (Keating

và cs., 1998)

Mặc dù sắn là cây trồng chịu hạn, thậm chí có thể hạn kéo dài tới 5 - 6 tháng Song hạn hán kéo dài làm năng suất củ bị giảm đáng kể Do chỉ số diện tích lá giảm nhanh trong điều kiện khô hạn (CIAT 1987-1989) dẫn đến năng suất củ khô trung bình giảm 14%, năng suất thân lá giảm 38%, năng suất sinh vật học giảm 22%, hệ

số thu hoạch tăng 9% Nhưng cũng có những dòng sắn biểu thị khả năng chịu hạn tốt như dòng CM4013-l, năng suất củ khô trong điều kiện thiếu nước đạt tới 11,5 tấn/ha, tăng 0,6 tấn/ha so với một số dòng sắn trồng trong điều kiện không thiếu nước (CIAT, 1992) Các dòng có khả năng thích ứng với điều kiện thiếu nước và đủ nước thường có chỉ số diện tích lá cao hơn chỉ số diện tích lá tối ưu

1.1.6 Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay

1.1.6.1 Cải tạo giống sắn bằng kỹ thuật lai hữu tính

CIAT (Trung tâm quốc tế nông nghiệp nhiệt đới) là nơi bảo tồn nguồn gen

giống sắn đứng đầu của thế giới Hiện tại CIAT đã thu thập, bảo quản được 5.782 mẫu giống sắn và đăng ký tại FAO gồm 5.138 mẫu sắn lai của CIAT, 163 mẫu giống sắn vùng Châu Á, 19 mẫu giống sắn vùng Châu Phi (Hoàng Kim, 2011) Trong đó có 35 loài hoang dại được thu thập nhằm sử dụng lai tạo ra giống sắn kháng sâu bệnh hoặc giàu protein Những nguồn gen giống sắn nêu trên đã được CIAT bảo tồn và đánh giá cẩn thận về khả năng cho năng suất, giá trị dinh dưỡng, thời gian sinh trưởng, khả năng chống chịu sâu bệnh hại cũng như thích ứng với sự thay đổi của môi trường Từ đó chọn ra những cặp bố mẹ phục vụ cho công tác cải tiến giống sắn để trao đổi và lưu giữ nguồn gen với các nước

Hầu hết những nghiên cứu đối với cây sắn hiện nay tập trung chủ yếu vào việc chọn tạo các giống sắn có năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn thông qua các phương pháp lai tạo truyền thống Một trong những yếu tố chính góp phần hiệu quả trong việc nâng cao năng suất và sản lượng sắn là sự tăng cường nghiên cứu, nhập nội, lai tạo, ứng dụng công nghệ mới trong việc chọn tạo và nhân giống sắn lai (Trần Công Khanh và cs., 2008) Trước năm 1990, Gòn, H34 và Xanh Vĩnh Phú là những giống sắn phổ biến ở Việt Nam Từ năm 1986 đến năm 1993, Trung tâm Hưng Lộc đã thu thập và tuyển chọn được 3 giống sắn mới là HL20, HL23 và HL24 được canh tác mỗi năm ở các tỉnh phía Nam khoảng 70 000 – 80 000 ha (Trần Công Khanh và cs., 2009) Giai đoạn 1991 - 2005, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam phối hợp với Chương trình sắn Việt Nam và CIAT đã nhập nội, tuyển chọn và giới thiệu cho sản xuất 5 giống sắn tốt: KM60, KM94, KM95, SM937-26, KM98-1 (Trần Công Khanh, 2008) Tổng diện tích các giống sắn mới ở Việt Nam năm 2005 ước tính đạt 270.000 ha, chiếm 69,2% tổng diện tích sắn của cả nước Năm 2007, giống sắn lai KM140 được phát triển bởi các nhà khoa học tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Ưu điểm của giống KM140 là thời gian sinh trưởng ngắn 7-10 tháng, hàm lượng bột tương đương KM94 (tỷ lệ tinh bột trong củ là ~ 28%), dạng củ đẹp, thịt củ màu trắng, ít đắng, dạng cây thẳng (Trần Công Khanh và cs., 2008) Hiện nay một số vùng trồng sắn ở Việt Nam: Quảng Ngãi, Phú Yên, Kon Tum, Tây Ninh,… đã xuất hiện sắn nhiễm bệnh chổi rồng và đang có nguy cơ bùng phát do người dân có thói quen canh tác những giống cũ, bị nhiễm bệnh qua hom giống

Cho tới nay những phương pháp lai tạo truyền thống và việc áp dụng chỉ thị phân tử đã thành công trong việc tạo ra những giống sắn mới có phẩm chất cao Tuy nhiên, trong thực tiễn sản xuất các phương pháp lai tạo truyền thống vẫn còn tồn tại những vấn đề khó giải quyết tuyệt đối để phát triển và cải tạo cây sắn theo hướng

mong muốn (Phạm Bích Ngọc., 2016)

1.1.6.2 Chọn tạo giống mới bằng phương pháp xử lý đột biến – chọn dòng

Ở Việt Nam, sắn cùng lúa và ngô là ba cây trồng được ưu tiên nghiên cứu phát

triển trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn Năm 2013, diện tích trồng sắn toàn quốc đạt 544,30 ngàn ha, năng suất

củ tươi bình quân 17,89 tấn/ha, sản lượng 9,74 triệu tấn (FAOSTAT, 2014) So với năm 2000, sản lượng sắn Việt Nam đã tăng gấp 3,93 lần, năng suất sắn đã tăng lên gấp hai lần Tuy nhiên, năng suất sắn của Việt Nam còn thấp hơn so với một số nước Đông Nam Á như: Lào (25,17 tấn/ha), Indonesia (22,86 tấn/ha), Thái Lan (21,82 tấn/ha) Do vậy, để đáp ứng được nhu cầu tăng năng suất và phát triển cây sắn của cả nước một cách bền vững thì nhất thiết phải có một bộ giống sắn phong phú cho năng suất và chất lượng cao, thích hợp với nhiều vùng sinh thái của Việt Nam Tuy nhiên, trong trường hợp nếu sử dụng phương pháp lai hữu tính truyền thống có thể mất từ bảy đến tám năm mới tạo ra một giống sắn mới Do vậy, chọn tạo giống sắn bằng phương pháp đột biến cũng được xem là một trong các phương pháp nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp lai tạo Gần đây phương pháp chọn tạo giống sắn bằng phương pháp xử lý đột biến bằng nguồn phóng xạ Coban60

đã được đánh giá qua thế hệ M4 có 4 dòng triển vọng đạt năng suất củ tươi cao nhất vượt đối chứng 30 - 50 % ở dòng KM94-14-4, KM140-3, KM 98-5-10-2 NS, KM 140-5- 4 và rút ngắn thời gian chọn tạo giống sắn mới đã được nghiên cứu thành công ở Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Hưng Lộc - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam (Phạm Thị Nhạn, Nguyễn Hữu Hỷ, 2015)

1.1.6.3 Áp dụng công nghệ sinh học trong tạo cây sắn chuyển gen

Năm 1996, 3 nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời công bố kết quả chuyển gen thành công vào cây sắn Việc cải thiện chất lượng giống sắn và tạo giống mới thông qua các phương pháp công nghệ sinh học đã mở ra một hướng mới nhờ phương pháp tái sinh hiệu quả cây con từ mô sẹo của cây sắn chuyển gen sau khi

đồng nuôi cấy với A tumefaciens (Li và cs., 1996) Bên cạnh đó là kết quả của quá

trình tạo mô sẹo phôi hóa các giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai 5 và M7, từ đó tạo được cây sắn hoàn chỉnh từ các mô này Đặc biệt, nghiên cứu đã làm giảm đáng

kể quá trình hình thành cây từ mô sẹo của giống sắn TMS60444 mang gen chuyển

bằng cả 2 kĩ thuật, thông qua hệ thống A tumefaciens và súng bắn gen (Raemakers

và cs., 1996) Và sau đó quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua kĩ thuật bắn gen mục tiêu vào mô sẹo nhằm tạo nguyên liệu cho quá trình chọn lọc tế bào mang gen chuyển Kết quả tạo được cây chuyển gen từ các tế bào này đã được thử

nghiệm với các gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) và beta- glucuronidase (uidA) nuôi trong môi trường chọn lọc, sau đó phân tích phân

tử Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, DNA ngoại lai có thể tồn tại trong hệ gen của sắn một cách bền vững và lâu dài (Schöpke và cs., 1996)

Hình 1.2 Một số phương pháp phổ biến tạo cây sắn biến đổi gen

(Nguồn: Taylor và cs., 2004)

Taylor và cs., 2004 đã mô tả 4 hệ thống hiện đang sử dụng để chuyển gen vào sắn (Hình 1.2) Ở cả bốn hệ thống này đã sử dụng 4 loại mô đích khác nhau làm đối tượng chuyển gen: Mô lá chưa trưởng thành, các cấu trúc phôi, mảnh lá mầm và mô sẹo phôi hóa Mô lá chưa trưởng thành và các cấu trúc phôi chỉ có

thể chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens trong khi đó mảnh lá mầm hay

mô sẹo phôi hóa có thể sử dụng thêm súng bắn gen để chuyển gen Sau khi chuyển gen, mô đích được tái sinh trên môi trường chọn lọc để tạo cây hoàn chỉnh mang gen cần chuyển Các đánh giá phân tích cả 4 hệ thống chuyển gen cho

thấy mỗi hệ thống trên đều có những ưu, nhược điểm riêng Mặc dù vậy, các nhà

khoa học thường ưu tiên lựa chọn phương pháp chuyển gen sử dụng A tumefaciens thay vì súng bắn gen vì lí do sử dụng A tumefaciens có chi phí thấp

hơn và cho kết quả ổn định hơn Khoảng 50% số cây chuyển gen thu được

thông qua A tumefaciens mang 1 bản gen cần chuyển trong khi con số này chỉ

là 10% khi sử dụng súng bắn gen

Nhờ sự phát triển phương pháp chuyển gen sử dụng A tumefaciens có cải

tiến để chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa, kết quả cho tần suất biến nạp và tái sinh cây chuyển gen cao hơn các phương pháp cũ Cho đến nay, đây vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến để chuyển gen mong muốn vào cây sắn Cũng như chọn tạo giống ở các cây trồng khác, một trong các vấn đề quan trọng đối với chọn giống sắn là làm sao tích hợp được gen đích mong muốn vào một nguồn gen phù hợp Đây cũng là một khó khăn với công tác tạo giống sắn bằng phương pháp chuyển gen vì lý do các giống sắn phản ứng khác nhau trong điều kiện nuôi

cấy in vitro, đặc biệt là trong quá trình tạo mô đích phục vụ biến nạp Do đó, việc

nghiên cứu khả năng tái sinh và tạo mô đích phục vụ biến nạp là cần thiết trên các giống sắn triển vọng

1.2 QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH VÀ TÍCH LUỸ TINH BỘT Ở CÂY SẮN 1.2.1 Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật

1.2.1.1 Cấu tạo tinh bột

Tinh bột, công thức hóa học (C6H10O5)n là một polysacarit carbohydrate chứa tỷ

lệ phần trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ

lệ này thường từ 20:80 đến 30:70 Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau Chúng đều là các polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6) Tinh bột được thực vật tạo ra trong tự nhiên từ các quả, củ như: ngũ cốc Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác Ngoài sử dụng làm thực phẩm, tinh bột còn được dùng trong công nghiệp sản xuất giấy, rượu, băng bó xương

A Cấu trúc phân tử amylose

(glucose-α-1,4-glucose)

B Cấu trúc phân tử amylopectin

Hình 1.3 Công thức hóa học của tinh bột

(Nguồn: https://doi.org/10.1094/1891127012.001)

1.1.1.2 Vai trò của tinh bột ở thực vật

Ở thực vật, các cơ quan không diễn ra quá trình quang hợp như thân, rễ, qủa

và hạt, sucrose có thể được chuyển thành tinh bột dự trữ trong một loại plastid chuyên biệt gọi là amyloplasts Tinh bột lưu trữ được tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của cây Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài người phần lớn là cơ quan lưu trữ tinh bột ở thực vật Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngô, lúa mì, lúa mạch, lúa miến… ) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ thân (khoai tây, khoai lang, khoai mỡ), rễ củ (sắn, khoai môn) và hạt cây họ đậu Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn cho chăn nuôi Tuy nhiên nhu cầu sử dụng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một tăng lên Đặc biệt tinh bột sắn đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu sinh học trong tương lai do đặc tính dễ lên men

1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan

1.2.2.1 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột

Sinh tổng hợp tinh bột là một quá trình phức tạp, có sự tham gia biểu hiện của nhiều gen và có sự khác biệt giữa các loài khác nhau và bộ phận khác nhau của cây về các yếu tố quy định quá trình chuyển hoá tinh bột, cấu trúc của tinh bột và sự thuỷ phân tinh bột

Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bước quan trọng xảy ra trong lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào trong các thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii) tổng hợp tinh bột từ ADPG (Zeeman, 2010) Bước đầu tiên là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và ATP

được xúc tác bởi ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) Một khi được hoạt hóa, starch synthase (SS) chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4 glucan để tạo thành các sợi α-1,4 glucan Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan được dùng như là các cơ chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (BE hoặc Q-enzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là amylopectin Cuối cùng amylopectin được tinh thể hóa tạo thành tinh bột dưới tác động của các enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme)

và glucanotransferase (D-enzyme) Ngoài ra, UDP-glucose: protein glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa) cũng được dự đoán tham gia vào bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột (Zeeman, 2010)

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan

(Nguô ̀n: https://www.jic.ac.uk/STAFF/trevor-wang/images/full/starchpath2.jpg)

1.2.2.2 Một số gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột

Quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở thực vật được bắt đầu từ việc chuyển hoá glucose - 1 - P và ATP thành ADP - glucose dưới sự xúc tác của ADP - glucose - pyrophosphorylase (AGPase) ADP - glucose là một monomer cho quá trình sinh tổng hợp tinh bột với sự tham gia của nhiều enzyme tiếp theo GBSS (Granule - bound starch synthase) đảm nhận quá trình tổng hợp amylose và SS (I - IV) giữ vai

trò sinh tổng hợp nên amylopectin Ngoài ra, bên cạnh các enzyme SS, còn có các enzyme xúc tác quá trình phân nhánh SBE (Starch branching enzyme) hay enzyme phân huỷ tinh bột tham gia vào quá trình điều hoà hàm lượng tinh bột ở thực vật (Geigenberger, 2011)

* Nhóm gen AGP

Enzym AGPase là một trong những enzym quan trọng, xúc tác cho bước đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột và đã được chứng minh là enzym điều hòa, điều chỉnh tốc độ phản ứng của toàn bộ chu trình sinh tổng hợp glycogen ở vi khuẩn

và tinh bột ở thực vật Một loạt đột biến của gen AGPase Escherichia coli (glgC16)

mã hóa cho các dạng điều khiển khác nhau của enzyme này đã được dùng để biểu hiện mạnh ở plastid trong cây khoai tây chuyển gen, một vài dòng đã có khả năng tích luỹ tinh bột cao hơn dòng không chuyển gen là 60% (Hostettle., 2014) Tuy nhiên, với các cây khác như sắn, ngô và các loài khác việc tăng tinh bột không đạt được mức như vậy Các nỗ lực khác trong việc làm tăng hàm lượng tinh bột ở các cây ngũ cốc sử dụng các thể đột biến của tiểu đơn vị lớn AGP là phần đóng góp nhỏ vào hoạt động xúc tác của enzyme nhưng giữ vai trò quan trọng trong việc xác định các tính chất điều khiển của enzyme này Giroux và cs., (1996) đã thu được các dòng ngô biểu hiện Sh2r6hs (một biến thể đột biến của gen mã hóa cho tiểu đơn vị lớn của AGP), mã hóa cho một enzyme không nhạy cảm dị lập thể Hàm lượng tinh bột trong các dòng này cao hơn khi so sánh với các dòng đối chứng, tuy nhiên % tinh bột trong hạt không tăng lên thay vào đó khối lượng các hạt tăng lên một cách đáng kể (Giroux và cs., 1996) Trong nghiên cứu gần đây, Li và cs., (2011) đã chỉ ra

sự biểu hiện gen BT2 mã hóa cho tiểu đơn vị bé của APG cây ngô hoặc SH2 mã hóa cho tiểu đơn vị lớn của APG cây ngô dẫn đến việc tăng cường khối lượng hạt

và hàm lượng tinh bột

Hoạt tính của AGPase, enzym tổng hợp tinh bột trong củ ở giống sắn Fuxuan (F01) có hàm lượng tinh bột cao hơn một cách đáng kể khi so sánh với giống sắn Huanan (H124) có hàm lượng tinh bột thấp trong cả hai giai đoạn hình thành hệ thống rễ và phần củ Tuy nhiên, hoạt tính của enzym amylase trong rễ của F01 thấp hơn

khi so sánh với H124 trong trong hai giai đoạn này Các kết quả chỉ ra rằng khả năng tổng hợp tinh bột cao, khả năng phân giải tinh bột thấp ở trong rễ có liên quan mật thiết đến sự tích lũy tinh bột cao trong củ ở các giai đoạn phát triển (Li và cs., 2016)

Mặc dù cơ chất sử dụng cho quá trình tổng hợp tinh bột, sucrose, glucose và fructose có hàm lượng khác nhau ở các mô khác nhau của cây sắn, nhưng điều này cũng không chỉ ra được sự thay đổi về khả năng phát triển một cách đồng bộ hoặc

có trật tự vì chúng có thể được chuyển đổi lẫn nhau một cách liên tục trong suốt quá trình tổng hợp tinh bột (Geigenberger., 2011) Ở lá của cả hai giống sắn F01 và H124, mỗi giai đoạn phát triển hàm lượng đường sucrose thấp hơn nhiều so với hàm lượng glucose và fructose, điều này có nghĩa là đường sucrose sau khi tổng hợp ở lá được chuyển ra ngoài một cách kịp thời và vận chuyển qua thân vào rễ Không tìm thấy đường sucrose trong dịch nhựa của hệ thống phloem của thân ở hai giai đoạn tạo củ và tạo tinh bột hoàn chỉnh Trong khi đó, hàm lượng của fructose

và glucose rất cao trong dịch nhựa của hệ thống phloem của thân tương ứng với giai đoạn tương tự như trên Điều này chỉ ra rằng một phần đường sucrose bị phân giải thành glucose và fructose trong giai đoạn vận chuyển qua thân Không có fructose nhưng một lượng lớn hơn glucose được phát hiện trong dịch nhựa hệ thống phloem của thân ở giai đoạn tạo tinh bột hoàn chỉnh biểu thị fructose đã bị biến đổi một phần thành glucose (Geigenberger., 2011)

* Nhóm gen GBSS

Các gen SS của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký hiệu là GBSS, SSI, SSII, SSIII, và SSIV GBSS gắn chặt với hạt tinh bột và chịu trách nhiệm tổng

họp amylose Các đột biến khác nhau của SS (thường gọi là SS hòa tan) tạo ra các

chuỗi amylopectin (1 dạng tinh bột đã polyme hóa) có thể tan hoặc trong các plastic hoặc một phần hòa tan một phần gắn với hạt tinh bột Số liệu di truyền và sinh hóa chỉ ra rằng mỗi đột biến enzyme SS có các cấu thành khác nhau và vai trò nhất định trong tổng hợp amylopectin Keeling và cs., (1998) đã chỉ ra rằng các enzyme SS có vai trò trong quá trình tổng hợp tinh bột, kiểm soát thông lượng của dòng chảy cho đến một thể thống nhất Điều này chứng tỏ thực tế hoạt động xúc tác tối đa của SS ở

quá trình trao đổi chất thông qua quá trình tổng hợp tinh bột ở một vài cơ quan dự trữ tinh bột đã chứng minh rằng SS là nhân tố chủ chốt trong việc điều chỉnh quá trình tổng hợp tinh bột Vì vậy, đây là hướng nghiên cứu tối ưu trong quá trình tạo

ra các cây trồng có hàm lượng tinh bột cao sử dụng công nghệ gen Tuy nhiên, việc biểu hiện của gen SS lại đang ít khi được sử dụng để làm tăng quá trình tích lũy tinh bột Điều này, chủ yếu là do sự hiện diện khác nhau của các lớp enzym SS trong cây trồng tương tác với nhau tạo thành một phức hợp protein và giữ vai trò cụ thể trong quá trình kiến tạo nên các hạt tinh bột (Hennen-Bierwagen và cs., 2008) Do đó, những thay đổi trong việc biểu hiện một SS đơn lẻ có thể dẫn đến các hiệu ứng sâu sắc và khó lường không chỉ trong cấu trúc của hạt tinh bột mà còn trong hàm lượng tinh bột, bên cạnh đó các đồng phân SS có vai trò đặc trưng nhưng phục thuộc lẫn nhau trong quá trình tổng hợp tinh bột Vấn đề này được chứng minh bằng các kết quả thu được ở các cây khoai tây chuyển gen biểu hiện enzym glycogen synthase

E.coli (Enzym xúc tác cho phản ứng tương tự như SS) ở củ có hàm lượng tinh bột ít

hơn so với các củ đối chứng Thêm vào đó, tinh bột ở các củ chuyển gen có sự thay đổi về thuộc tính cấu trúc Roldán và cs., (2007) đã báo cáo các đột biến SSIV T-

DNA chỉ tích lũy tinh bột trong một hạt lớn ở các lục lạp A.thaliana Bên cạnh đó, Szydlowski và cs., (2009) chỉ ra rằng các đột biến A.thaliana SSIII/SSIV T-DNA

tích lũy tinh bột vô cùng ít Các dữ liệu tổng thể cho thấy rằng SSIV giữ vai trò quan trọng trong quá trình khởi động hình thành hạt tinh bột và quá trình tích lũy tinh bột, là yếu tố thiết yếu để hình thành số lượng đều đặn của các hạt tinh bột được tìm thấy ở các cây đối chứng Phân tích việc phân phối chiều dài chuỗi amylopectin trong các cây đột biến và cây chuyển gen mất các đột biến enzyme SS đặc trưng đã dẫn tới kết luận rằng nhóm SSI, SSII, và SSIII đóng vai trò trong việc kéo dài các chuỗi ngắn, trung bình và dài tương ứng (Zeeman, 2010) Thành phần amylose của tinh bột được tổng hợp bởi GBSS Các cây đột biến và chuyển gen thiếu enzyme này là cần thiết để tạo ra cây không có amylose Các hạt tinh bột không có amylose vẫn có hình thái bình thường, điều đó chứng tỏ rằng amylopectin

là cần thiết cho việc hình thành hạt GBSS khác các đột biến khác nhau của enzyme

SS ở chỗ vị trí đặc biệt đối với các hạt và kiểu phản ứng Không giống các biến thể synthase của tinh bột, GBSS chuyển các gốc glucosyl từ thực vật bậc cao

Bên cạnh các gen đã được nghiên cứu, gen SSIV đã và đang được nghiên cứu ứng dụng nhằm tăng hiệu quả của quá trình sinh tổng hợp tinh bột Nhiều nghiên cứu gần đây cho cho thấy SSIV giữ vai trò quan trọng trong khởi đầu quá trình hình thành các hạt tinh bột (Szydlowski và cs., 2009) Để đánh giá sự ảnh hưởng của việc bất hoạt gen SSIV đến quá trình sinh tổng hợp ở cây thuốc lá cho thấy khi chuyển gen MUT - SSIV xuất hiện các kiểu hình sinh trưởng kém hơn so với đối chứng Mặt khác, hàm lượng polysaccharide dự trữ không khác biệt so với cây đối chứng Tuy nhiên, các cây chuyển gen đã có sự suy giảm về số lượng hạt tinh bột, cùng với đó là sự gia tăng về kích thước của các hạt tinh bột trong lá (Roldan và cs., 2007) Để loại bỏ hoạt động của SSIV trong có việc làm giảm số lượng các hạt

tinh bột và hàm lượng tinh bột ở lá A.thaliana gợi ý rằng số lượng các hạt tinh bột

có thể đại diện cho một bước điều chỉnh trong việc kiểm soát sự tích lũy tinh bột (D'Hulst & Mérida, 2010) Xác nhận giả thiết này, Gámez-Arjona et al., (2011)

báo cáo rằng các sự biểu hiện SSIV làm tăng hàm lượng tinh bột ở lá A.thaliana

Hàm lượng tinh bột cao được tích lũy vào thời điểm cuối ngày được huy động hoàn toàn trong suốt đêm ở các cây biểu hiện gen SSIV, điều này cho phép hình thành một tỷ lệ tinh bột cao khi so sánh với các cây đối chứng Gámez-Arjona và

cs., (2011) cũng chỉ ra rằng việc biểu hiện gen SSIV dẫn đến việc tăng kích thước

hạt tinh bột và hàm lượng tinh bột ở các củ khoai tây chuyển gen được trồng trong nhà kính và ngoài đồng ruộng Tiếp theo đó là công trình nghiên cứu những cây thuốc lá đột biến khuyết gen SSIV bên cạnh sự suy giảm số lượng hạt tinh bột/ lục lạp ở lá trưởng thành còn gây ra hiện tượng không tạo thành tinh bột và gia tăng hàm lượng ADP - glucose ở lá non (Matilda và cs., 2013)

Trong các báo cáo mới đây, việc điều khiển sự biểu hiện của các gen SS (starch synthase) đã được chứng minh có khả năng tăng sự tích luỹ tinh bột Tuy nhiên có rất ít nghiên cứu về nhóm gen này do có nhiều lớp gen SS (I - IV) khác nhau trong thực vật Các lớp gen này được cho là tương tác với nhau trong một phức hợp protein và đóng một vai trò đặc biệt trong việc tổng hợp cấu trúc cuối

cùng của hạt tinh bột Do đó, những thay đổi trong việc biểu hiện của một gen SS

có thể dẫn tới các ảnh hưởng phức tạp Điều này được chứng minh rõ nét qua các kết quả thu được trên khoai tây chuyển gen glycogen synthase có nguồn gốc từ vi khuẩn Củ của các cây khoa tây chuyển gen này tích luỹ lượng tinh bột ít hơn so với

củ các cây khoai tây có cấu trúc, đặc tính đã bị biến đổi Shewmaker và cs., (1994)

đã chỉ ra rằng SS lớp IV có liên quan đến sự khởi đầu hình thành hạt tinh bột và có

thể điều khiển số lượng hạt tinh bột trong lục lạp ở lá cây A.thaliana Việc loại bỏ

protein này dẫn đến sự giảm sút tinh bột trong lá và toàn bộ tinh bột trong một lục tạp được tích luỹ trong một hoặc hai hạt tinh bột khổng lồ (Rolda’n và cs., 2007) Mặt khác, Subasinghe (2013) khi nghiên cứu ảnh hưởng của việc biểu hiện quá mức gen SSIV đã làm tăng sự tích luỹ tinh bột trong cả cơ quan quang hợp và cơ quan

dự trữ Như vậy, việc tăng cường biểu hiện gen SSIV hứa hẹn là một hướng đi làm tăng hàm lượng tinh bột tích luỹ trong cả cơ quan tự dưỡng và dị dưỡng bằng con đường công nghệ sinh học

* Nhóm gen SBE

Bên cạnh SS còn có gen SBE (Starch branching enzyme) tham gia vào quá trình sinh tổng hợp tinh bột Quá trình phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời với quá trình kéo dài chuỗi Quá trình phân nhánh được xúc tác bởi enzyme phân nhánh (BE) Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị glucose hoặc nhiều hơn tới vị trí C6 của gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác

BE của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II Nhóm I vận chuyển các chuỗi dài hơn Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc biệt trong tổng hợp amylopectin

* Nhóm gen DBE

Ngoài các enzym tổng hợp tinh bột còn có các enzyme phân huỷ Enzym khử phân nhánh DBE (De-branching enzym) có khả năng làm mất các điểm phân nhánh

và có vai trò quan trọng trong việc quyết định cấu trúc của amylopectin Ở thực vật

có hai loại DBE: isoamylase (ISA) và limitdextrinase (LDA, hay còn gọi là pullulanase) Hai loại này khác nhau bởi trình tự amino acid và cơ chất, ISA có 3

nhóm ISA1, ISA2, và ISA3; ISA1 và ISA2 liên quan chặt với tổng hợp

amylopectin Vai trò cơ bản của LDA và ISA3 là phân hủy tinh bột ISA1 hoạt động

mạnh nhất khi cơ chất là các chuỗi glucan tương đối dài như là các amylopectin bị hòa tan, trong khi đó LDA và ISA3 có hoạt tính cao với các chuỗi glucan ngắn như β-limit dextrins ISA2 dường như không có hoạt tính xúc tác mà tác dụng điều tiết hoặc ổn định ISA1 chứ không tham gia trực tiếp vào quá trình hủy phân nhánh (Burton và cs., 2002) Trong các cây đột biến hoặc chuyển gen thiếu hụt ISA1, tinh bột dạng hạt bị giảm, thậm chí không có và thay thế một phần bởi các glucan tan trong nước Hiện tượng này quan sát được ở một số thực vật, ví dụ như ở nội nhũ

non của ngũ cốc, lá A.thaliana và củ khoai tây Trong A.thaliana và khoai tây việc

mất hoạt tính ISA2 có ảnh hưởng giống như mất hoạt tính của ISA1 (Wattebled và

cs., 2008) Đột biến thiếu hoạt tính DBE (tức là đột biến đồng thời 4 gen: isal, isa2, isa3, ida), khi đột biến xảy ra sẽ không phát hiện được sự có mặt của các hạt tinh

bột ở lá Kết quả này hoàn toàn đồng nhất với ý kiến cho rằng hoạt tính DBE là cần thiết cho việc sinh tổng hợp tinh bột

1.3 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG SẮN BIẾN ĐỔI GEN

1.3.1 Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn

1.3.1.1 Phương thức nuôi cấy

Phương thức tái sinh cây sắn in vitro có thể phát sinh thông qua sự phát sinh

cơ quan trực tiếp (mảnh lá, đỉnh sinh trưởng, chồi nách) hoặc tái sinh thông qua mô sẹo, phôi soma, mô sẹo phôi hoá Tuy nhiên, cho đến nay phương thức tái sinh cây sắn thông qua mô sẹo phôi hóa đang phổ biến hơn cả

1.3.1.2 Nguyên liệu

Về cơ bản, đặc tính sinh lý mô cấy càng giống tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu Vì vậy, tế bào và mô non là mô cấy triển vọng nhất (Lê Trần Bình và cs., 1997) Tuy nhiên, nguyên liệu thực vật

dùng để nuôi cấy in vitro rất đa dạng: có thể từ thuỳ lá non (Li và cs., 1996), từ

đỉnh chồi của cây con (Zhang., 2000; Đỗ Xuân Đồng và cs., 2012), từ chồi nách