Luận án tiến sĩ hóa học nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm của hai loài hải miên rhabdastrella providentiae và xestospongia muta ở vùng biển

Đặc trưng phổ 13 C-NMR của một số hợp chất isomalabaricane phân lập từ hải miên giống Rhabdastrella .... Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất alkaloid phân lập từ hải mi

Trang 1

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

DƯƠNG THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ KHÁNG VIÊM CỦA HAI LOÀI HẢI MIÊN

Rhabdastrella providentiae VÀ Xestospongia muta Ở VÙNG

BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2019

Trang 2

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

DƯƠNG THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ KHÁNG VIÊM CỦA HAI LOÀI HẢI MIÊN

Rhabdastrella providentiae VÀ Xestospongia muta Ở VÙNG

BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Phan Văn Kiệm

2 TS Bùi Hữu Tài

Hà Nội – 2019

Trang 3

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Phan Văn Kiệm và TS Bùi Hữu Tài Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Dương Thị Dung

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài VAST.TĐ.DLB.01/16-18 Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự khâm phục và kính trọng nhất tới PGS

TS Phan Văn Kiệm và TS Bùi Hữu Tài - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn chỉ dạy cho tôi về mặt chuyên môn, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo và các đồng nghiệp phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển đặc biệt là TS Nguyễn Xuân Nhiệm và ThS Đan Thị Thúy Hằng về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học

Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa sinh biển, Phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học, Khoa Dược-Đại học Wonkwang - Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi trong việc thử hoạt tính

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Dương Thị Dung

Trang 5

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VIII DANH MỤC BẢNG X DANH MỤC HÌNH XII

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về hải miên 3

1.2 Tổng quan về hải miên thuộc giống Rhabdastrella 5

1.2.1 Giới thiệu vài nét về hải miên thuộc giống Rhabdastrella 5

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về hải miên giống Rhabdastrella trên thế giới 6

1.2.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của hải miên giống Rhabdastrella 6

1.2.2.2 Đặc trưng phổ 13 C-NMR của một số hợp chất isomalabaricane phân lập từ hải miên giống Rhabdastrella 12

1.2.2.3 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của hải miên giống Rhabdastrella 16

1.3 Tổng quan về hải miên thuộc giống Xestospongia 19

1.3.1 Giới thiệu chung về hải miên thuộc giống Xestospongia 19

1.3.2 Tình hình nghiên cứu về hải miên thuộc giống Xestospongia trên thế giới 20

1.3.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của hải miên giống Xestospongia 21

1.3.2.2 Đặc trưng phổ 13 C-NMR của một số hợp chất macrocyclic bis-quinolizidine alkaloid phân lập từ hải miên giống Xestospongia 25

1.3.2.3 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất alkaloid phân lập từ hải miên thuộc giống Xestospongia 29

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.1 Loài hải miên Rhabdastrella providentiae 31

Trang 6

2.1.2 Loài hải miên Xestospongia muta 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 32

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 32

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 33

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 33

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 35

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá cơ chế chống ung thư 37

2.3 Phân lập các hợp chất 38

2.3.1 Phân lập các hợp chất từ loài hải miên Rhabdastrella providentiae 38

2.3.2 Phân lập các hợp chất từ loài hải miên Xestospongia muta 41

2.4 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được 44

2.4.1 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài hải miên Rhabdastrella providentiae 44

2.4.1.1 Hợp chất RP1: rhabdastrellin G (hợp chất mới) 44

2.4.1.2 Hợp chất RP2: rhabdastrellin H (hợp chất mới) 44

2.4.1.3 Hợp chất RP3: rhabdastrellin I (hợp chất mới) 44

2.4.1.4 Hợp chất RP4: rhabdastrellin J (hợp chất mới) 44

2.4.1.5 Hợp chất RP5: rhabdastrellin K (hợp chất mới) 45

2.4.1.6 Hợp chất RP6: rhabdaprovidine A (hợp chất mới) 45

2.4.1.7 Hợp chất RP7: rhabdaprovidine B (hợp chất mới) 45

2.4.1.8 Hợp chất RP8: rhabdaprovidine C (hợp chất mới) 45

2.4.1.9 Hợp chất RP9: rhabdaprovidine D (hợp chất mới) 46

2.4.1.10 Hợp chất RP10: rhabdaprovidine E (hợp chất mới) 46

2.4.1.11 Hợp chất RP11: rhabdaprovidine F (hợp chất mới) 46

2.4.1.12 Hợp chất RP12: rhabdaprovidine G (hợp chất mới) 46

2.4.1.13 Hợp chất RP13: jaspolide C 47

2.4.1.14 Hợp chất RP14: globostelletin C 47

2.4.1.15 Hợp chất RP15: globostelletin D 47

2.4.1.16 Hợp chất RP16: jaspiferin A 47

2.4.1.17 Hợp chất RP17: mollisolactone A 48

2.4.1.18 Hợp chất RP18: gibepyrone F 48

Trang 7

2.4.2 Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài hải miên

Xestospongia muta 48

2.4.2.1 Hợp chất XM1: araguspongine C 48

2.4.2.2 Hợp chất XM2: meso- araguspongine C (hợp chất mới) 48

2.4.2.3 Hợp chất XM3: araguspongine N 49

2.4.2.4 Hợp chất XM4: araguspongine O 49

2.4.2.5 Hợp chất XM5: araguspongine P 49

2.4.2.6 Hợp chất XM6: araguspongine A 49

2.4.2.7 Hợp chất XM7: araguspongine E 50

2.4.2.8 Hợp chất XM8: araguspongine L 50

2.4.2.9 Hợp chất XM9: petrosin 50

2.4.2.10 Hợp chất XM10: petrosin A 50

2.4.2.11 Hợp chất XM11: aragupetrosine A 50

2.5 Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập được 51

2.5.1 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài Rhabdastrella providentiae 51

2.5.2 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ loài Xestospongia muta 52

2.5.3 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài Rhabdastrella providentiae 52

2.5.4 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài Xestospongia muta 53

CHƯƠNG 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ 55

3.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài R providentiae 55

3.1.1 Hợp chất RP1: rhabdastrellin G (hợp chất mới ) 55

3.1.2 Hợp chất RP2: rhabdastrellin H (hợp chất mới ) 61

3.1.3 Hợp chất RP3: rhabdastrellin I (hợp chất mới ) 63

3.1.4 Hợp chất RP4: rhabdastrellin J (hợp chất mới ) 66

3.1.5 Hợp chất RP5: rhabdastrellin K (hợp chất mới ) 68

3.1.6 Hợp chất RP6: rhabdaprovidine A (hợp chất mới ) 69

3.1.7 Hợp chất RP7: rhabdaprovidine B (hợp chất mới ) 71

3.1.8 Hợp chất RP8: rhabdaprovidine C (hợp chất mới ) 73

Trang 8

3.1.9 Hợp chất RP9: rhabdaprovidine D (hợp chất mới ) 75

3.1.10 Hợp chất RP10: rhabdaprovidine E (hợp chất mới ) 77

3.1.11 Hợp chất RP11: rhabdaprovidine F (hợp chất mới ) 79

3.1.12 Hợp chất RP12: rhabdaprovidine G (hợp chất mới ) 82

3.1.13 Hợp chất RP13: jaspolide C 89

3.1.14 Hợp chất RP14: globostelletin C 91

3.1.15 Hợp chất RP15: globostelletin D 93

3.1.16 Hợp chất RP16: jaspiferin A 95

3.1.17 Hợp chất RP17: mollisolactone A 97

3.1.18 Hợp chất RP18: gibepyrone F 98

3.1.19 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ loài R providentiae RP1-RP18 99

3.2 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài X muta 102

3.2.1 Hợp chất XM1: araguspongine C 102

3.2.2 Hợp chất XM2: meso-araguspongine C (hợp chất mới ) 105

3.2.3 Hợp chất XM3: araguspongine N 111

3.2.4 Hợp chất XM4: araguspongine O 113

3.2.5 Hợp chất XM5: araguspongine P 116

3.2.6 Hợp chất XM6: araguspongine A 118

3.2.7 Hợp chất XM7: araguspongine E 120

3.2.8 Hợp chất XM8: araguspongine L 122

3.2.9 Hợp chất XM9: petrosin 124

3.2.10 Hợp chất XM10: petrosin A 127

3.2.11 Hợp chất XM11: aragupetrosine A 129

3.2.12 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ loài X muta XM1 - XM11 131 3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập đƣợc 133

3.3.1 Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ loài R providentiae 133

3.3.2 Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ loài X muta 133 3.3.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài R providentiae 134

Trang 9

3.3.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài

X muta 134

KẾT LUẬN 140

KIẾN NGHỊ 142

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 143

TÀI LIỆU THAM KHẢO 144

PHỤ LỤC 1

Trang 10

H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Ph c ng hưởng t h t nh n proton

A-549 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư ph i ở người A-2780 Human ovarian carcinoma cell Tế bào ung thư c tử cung ở

người

CD Circular dichroism Spectroscopy Ph lưỡng sắc tròn

BGC-823 Human gastric cancer cell Tế bào ung thư d dày ở người Bel-7402 Human hepatoma cancer cell Tế bào ung thư gan ở người DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer Spectroscopy

Ph DEPT

DPPH 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Electrospray Ionization Mass

Spectrometry

Ph khối ion h a phun m điện

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma

cell

Tế bào ung thư biểu mô gan

HL-60 Human promyelocytic leukemia

cell

Tế bào ung thư máu

HCT-8 Human colon carcinoma cell Tế bào ung thư biểu mô ru t kết HMBC Heteronuclear Mutiple Bond

Connectivity Spectroscopy

Ph tương t c d h t nh n qua nhi u li n kết

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HR-ESI-MS High Resolution Electrospray

Ionization Mass Spectrometry

Ph khối lượng phân giải cao phun m điện

Trang 11

Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải

LU-1 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư ph i ở người MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú ở người MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-

diphenyltetrazolium bromide

diphenyltetrazolium bromide MDAMB-435 Human breast cancer cell Tế bào ung thư vú ở người L-1210 Mouse lymphocytic leukemia

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-cell

Tế bào ung thư b ch cầu ở chu t

NOESY Nuclear Overhauser

Enhancement Spectroscopy

Ph NOESY

PI3K/Akt An intracellular signaling

pathway important in regulating the cell cycle

M t đường tín hiệu n i bào quan trọng trong việc đi u chỉnh chu

Trang 12

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Số liệu 13 C-NMR của 15 hợp chất khung isomalabaricane từ các loài hải

miên giống Rhabdastrella 15

Bảng 1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của một số loài hải miên giống Xestospongia 19

Bảng 1.3 Số liệu 13 C-NMR tại các vị trí chính của các hợp chất macrocyclic bis-quinolizidine alkaloid từ các loài hải miên giống Xestospongia 27

Bảng 2.1 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 của hợp chất RP1-RP18 51

Bảng 2.2 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào BV2 của các hợp chất XM1-XM11 52

Bảng 2.3 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất RP1-RP18 53

Bảng 2.4 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất XM1-XM11 53

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của RP1 56

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của RP2 và hợp chất tham khảo 62

Bảng 3.7 Số liệu phổ NMR của RP7 và chất tham khảo 72

Bảng 3.19 Số liệu phổ NMR của XM1 và hợp chất tham khảo 103

Trang 13

Bảng 3.22 Số liệu phổ NMR của XM4 và một số vị trí chính hợp chất tham khảo 115

Bảng 3.23 Số liệu phổ NMR của XM5 và các hợp chất tham khảo 117

Bảng 3.25 Số liệu phổ NMR tại các vị trí chính của XM7 và hợp chất tham khảo 121

Bảng 3.30 Tỉ lệ (%) tế bào MCF-7 trong pha G0/G1, S, G2/M và apoptosis (sub-G1) sau 48 giờ xử lí với hợp chất XM1 ở nồng độ 2 và 10µM 136

Trang 14

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hải miên thuộc lớp Hexactinellida 3

Hình 1.2 Hải miên thuộc lớp Calcarea 4

Hình 1.3 Hải miên thuộc lớp Demospongiae 4

Hình 1.4 Hình ảnh loài hải miên R globostellata 6

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất isomalabaricane 12

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của các hợp chất khung macrocyclic bis 1-oxa-quinolizidine hoặc bis 1-oxa-quinolizidine alkaloid 26

Hình 2.1 Hình ảnh loài hải miên R providentiae thu tại vùng biển Cồn Cỏ 31

Hình 2.2 Hình ảnh loài hải miên X muta thu tại vùng biển Vịnh Mốc 31

Hình 2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài hải miên Rhabdastrella providentiae 40 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài hải miên Xestospongia muta 43

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất RP1và hợp chất tham khảo RP1a 55

Hình 3.2 Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất RP1 55

Hình 3.3 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất RP1 57

Hình 3.4 Phổ 1 H-NMR của hợp chất RP1 58

Hình 3.5 Phổ 13 C-NMR của hợp chất RP1 58

Hình 3.6 Phổ HSQC của hợp chất RP1 59

Hình 3.7 Phổ HMBC của hợp chất RP1 59

Hình 3.8 Phổ COSY của hợp chất RP1 60

Hình 3.9 Phổ NOESY của hợp chất RP1 60

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất RP2 và cấu trúc hóa học của hợp chất tham khảo 61

Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất RP3 và hợp chất tham khảo 63

Hình 3.13 Phổ CD thực nghiệm của hợp chất RP3 và phổ CD tính toán theo lý thuyết của dạng đồng phân (22S, 23S) (3a), (22R, 23R) (3b) 64

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất RP4 và hợp chất tham khảo RP4a 66

Hình 3.15 Các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất RP4 67

Hình 3.16 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất RP5 và cấu trúc hóa học của hợp chất tham khảo RP4 68

Hình 3.17 Cấu trúc hóa học của hợp chất RP6 và hợp chất tham khảo RP5 69

Trang 15

Hình 3.26 Các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) của hợp chất RP10 78

Hình 3.27 Cấu trúc hóa học của hợp chất RP11 và hợp chất tham khảo RP11c 79

Hình 3.29 Phổ CD thực nghiệm của hợp chất RP11 và phổ CD tính toán theo lý thuyết của hai đồng phân RP11a và RP11b 81

Hình 3.32 Phổ CD thực nghiệm của hợp chất RP12 và phổ CD tính toán theo lý thuyết của đồng phân RP12a, RP12b 85

Hình 3.33 Phổ HR-ESI-MS (positive) của hợp chất RP12 85

Hình 3.34 Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất RP12 85

Hình 3.35 Phổ CD của hợp chất RP12 86

Hình 3.36 Phổ 1 H-NMR của hợp chất RP12 86

Hình 3.37 Phổ 13 C-NMR của hợp chất RP12 87

Hình 3.38 Phổ HSQC của hợp chất RP12 87

Hình 3.39 Phổ HMBC của hợp chất RP12 88

Hình 3.40 Phổ COSY của hợp chất RP12 88

Hình 3.41 Phổ NOESY của hợp chất RP12 89

Hình 3.42 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất RP13 89

Hình 3.43 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất RP14 91

Hình 3.44 Cấu trúc hóa học của hợp chất RP15 93

Trang 16

Hình 3.50 Cấu trúc hóa học của các hợp chất RP1-RP18 100

Hình 3.51 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) chính của hợp chất XM1 102

Hình 3.52 Các cấu dạng bền của khung 1-oxa-quinolizidine 104

Hình 3.53 Các tương tác NOESY chính ở phần khung 1-oxa-quinolizidine của hợp chất XM1 104

Hình 3.54 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) chính của hợp chất XM2 và cấu trúc hóa học của hợp chất tham khảo XM1 105

Hình 3.56 Phổ HR-ESI-MS (positive) của hợp chất XM2 107

Hình 3.57 Phổ HR-ESI-MS (negative) của hợp chất XM2 107

Hình 3.58 Phổ 1 H-NMR của hợp chất XM2 108

Hình 3.59 Phổ 13 C-NMR của hợp chất XM2 đo trong CD 3 OD 108

Hình 3.60 Phổ 13 C-NMR của hợp chất XM2 đo trong CDCl 3 109

Hình 3.61 Phổ HSQC của hợp chất XM2 109

Hình 3.62 Phổ HMBC của hợp chất XM2 110

Hình 3.63 Phổ COSY của hợp chất XM2 110

Hình 3.64 Phổ NOESY của hợp chất XM2 111

Trang 17

Hình 3.69 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C), COSY (H─H) chính

của hợp chất XM5 và cấu trúc hóa học của các hợp chất tham khảo 116 Hình 3.70 Các tương tác NOESY chính ở phần khung 1-oxa-quinolizidine của hợp

chất XM5 118 Hình 3.71 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất

XM6 118 Hình 3.72 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC (H→C) chính của hợp chất

XM9 124 Hình 3.75 Các đồng phân lập thể phù hợp và tương tác NOESY chính của hợp chất

XM11 và cấu trúc hóa học của các hợp chất tham khảo XM4 và XM10 129 Hình 3.78 Cấu trúc hóa học của các hợp chất XM1-XM11 132 Hình 3.79 Tác động của hợp chất XM1 đến chu kì tế bào MCF-7 136 Hình 3.80 Tác động của hợp chất XM1 ở nồng độ 2 và 10µM lên hình thái tế bào ung

Trang 18

MỞ ĐẦU

Biển và đ i dương chiếm 71% diện tích b mặt tr i đất là nguồn tài nguy n sinh vật đa d ng với 34 trong số 36 ngành sinh vật tr n tr i đất sinh sống với hơn 300.000 loài đ ng thực vật như hải mi n rong biển ru t khoang r u biển th n m m

c c loài vi sinh vật biển Với môi trường sống đa d ng quan hệ sinh tồn tự nhi n c c sinh vật biển là nguồn sản sinh kh ng lồ c c hợp chất chuyển h a thứ cấp Nhi u hợp chất c cấu trúc h a học và ho t tính sinh học đặc biệt đã và đang được sử dụng là những hợp chất dẫn đường cho qu trình ph t triển thuốc và sử dụng trong ngành công nghiệp dược Trong nhi u năm gần đ y với sự h trợ của c c k thuật ti n tiến c c

ho t chất t thi n nhi n đã dần được ph n lập và đ nh gi ho t tính sinh học Rất nhi u thuốc c nguồn gốc sinh vật biển đã c mặt tr n th trường do c c hãng dược lớn tr n thế giới cung cấp như là: Cytarabine Halaven Ziconotide Vidarabine Trabectedin

Việt Nam có bờ biển dài hơn 3.260 km ch y dọc t Bắc tới Nam, với hàng nghìn hòn đảo ven biển đặc biệt có hai quần đảo Trường Sa và Hoàng Sa nằm giữa biển Đông Đi u kiện đ a l đ đã đem l i nhi u thuận lợi, ti m năng v nguồn tài nguy n thi n nhi n phong phú cho đất nước, t o nên hệ sinh vật biển vô cùng đa d ng, dồi dào cả v trữ lượng và thành phần loài Theo thống kê, biển Việt Nam có khoảng 12.000 loài bao gồm 2.038 loài c 6.000 loài đ ng vật đ y 635 loài rong biển và hàng ngàn loài đ ng thực vật phù du Các kết quả nghiên cứu cho thấy số lượng loài hải miên ở vùng biển Việt Nam được phát hiện khoảng 160 loài và phân bố tập trung ở vùng biển quanh c c đảo ven bờ và xa bờ Tính đến nay mới chỉ có khoảng 20 loài được nghiên cứu v thành phần hóa học và ho t tính sinh học Riêng loài hải miên

Rhabastrella providentiae chưa c nghi n cứu nào trên thế giới cũng như ở Việt Nam, loài hải miên Xestospongia muta cũng chưa c nghi n cứu nào ở Việt Nam

Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học và ho t tính sinh học của các loài sinh vật biển nói chung, các loài hải mi n n i ri ng đang là vấn đ thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới T những năm 1960 đến nay trên thế giới đã c hơn

20000 hợp chất được tìm thấy có nguồn gốc t hải miên, chiếm phần lớn số lượng các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc t các sinh vật biển Trong đ 5300 hợp chất được phân lập t hải mi n được đ nh gi là có ho t tính Ở Việt Nam, bước đầu đã c những công trình nghiên cứu v thành phần hóa học và ho t tính sinh học của các loài sinh vật biển đăng tr n c c t p chí quốc tế uy tín nhưng chưa nhi u Chính vì thế nhiệm vụ

Trang 19

nghiên cứu khảo sát v thành phần hóa học và ho t tính sinh học của hải miên nói riêng và sinh vật biển nói chung ở nước ta là rất quan trọng Xuất phát t điểm đ đ

tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm của

hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae và Xestospongia muta ở vùng biển

Trung bộ Việt Nam” đã được lựa chọn

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học của hai loài hải

miên Rhabdastrella providentiae và Xestospongia muta thu ở vùng biển Trung b Việt Nam Đ nh gi ho t tính g y đ c tế bào và ho t tính kháng viêm in vitro của các hợp

chất phân lập được để tìm kiếm các ho t chất làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để t o ra sản phẩm chăm s c sức khỏe cho c ng đồng

Nội dung luận án bao gồm:

1 Phân lập các hợp chất t hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae và Xestospongia muta thu ở vùng biển Trung b Việt Nam bằng c c phương ph p sắc

ký;

2 X c đ nh cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng c c phương ph p vật

lý, hóa học;

3 Đ nh gi ho t tính g y đ c tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được;

4 Đ nh gi ho t tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được

Trang 20

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về hải miên

Hải mi n là c c loài đ ng vật thu c ngành Porifera (đ ng vật ăn lọc – pore bearer) Cơ thể của chúng bao gồm m t lớp trung mô d ng th ch được kẹp giữa hai màng tế bào mỏng Trong khi tất cả c c loài đ ng vật khác có các tế bào chưa biệt hóa

có thể chuyển thành các d ng tế bào chuyên biệt khác nhau thì duy nhất các loài hải miên có m t số tế bào đã được biệt hóa mà vẫn có thể chuyển thành các d ng tế bào khác, thông thường chúng di chuyển giữa các màng tế bào cơ bản và lớp trung mô Hải miên không có hệ thần kinh, hệ tiêu hóa hoặc hệ tuần hoàn Thay vào đ hầu hết chúng dựa vào việc duy trì m t dòng nước n đ nh chảy qua cơ thể để thu nhận thức

ăn và ôxy cũng như thải các chất cặn bã Theo đ hải mi n c hình d ng cơ thể thích nghi tối đa với việc duy trì hiệu quả của dòng nước chảy qua cơ thể Hải miên phân bố

r ng khắp t các vùng thủy tri u cho tới tận đ s u hơn 8800m m t số ít các loài hải

mi n còn được tìm thấy sống ở v ng nước ngọt và nước lợ

Hải mi n được chia thành bốn lớp chính [1], chủ yếu dựa trên thành phần cấu

t o b khung cơ thể của chúng bao gồm: Hexactinellida, Calcarea, Demospongiae và Archeocyatha

- Lớp Hexactinellida (hải mi n đ – glass sponges) có các nhánh silicat, nhánh lớn nhất có sáu cánh có thể tách rời hoặc đính với nhau Thành phần cơ thể chính của chúng là hợp bào (syncytia) trong đ phần lớn các tế bào có chung m t màng ngoài đơn

Hình 1.1 Hải miên thuộc lớp Hexactinellida

Trang 21

- Lớp Calcarea có b khung cơ thể t o bởi Ca, m t d ng CaCO3, có thể t o thành các nhánh riêng biệt hoặc thành m ng lưới lớn Tất cả các tế bào có m t nhân và màng

Hình 1.2. Hải miên thuộc lớp Calcarea

- Lớp Demospongiae hầu hết có các nhánh silicat hoặc sợi xốp hoặc h n hợp cả hai trong các mô m m của chúng Tuy nhiên, m t số loài có chứa cơ quan ngoài được t o nên bởi aragnoit, m t d ng canxi carbonat khác Tất cả các tế bào có m t nhân và

màng

Hình 1.3. Hải miên thuộc lớp Demospongiae

- Lớp Archeocyatha chỉ được biết đến qua các hóa th ch t thời Cambri

Các kết quả nghiên cứu v thành phần hóa học và ho t tính sinh học t các loài hải mi n đã cho thấy sự đa d ng và phong phú Đ y là nguồn cung cấp các ho t chất

kh ng lồ và được nhi u nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu đặc biệt là các nhà khoa học ở c c nước phát triển Các thống kê cho thấy hải miên là nguồn cung cấp chủ yếu các hợp chất thứ cấp t sinh vật biển Chỉ tính ri ng năm 2008 c tới 75% các hợp chất được phân lập t sinh vật biển có nguồn gốc t hải miên [2] T năm những 1960 đến nay trên thế giới đã c hơn 20000 hợp chất được tìm thấy có nguồn

Trang 22

gốc t hải mi n ước tính trung bình khoảng 300 hợp chất mới được phát hiện và phân lập t hải miên m i năm [2, 3] Cơ sở dữ liệu MarinLit năm 2010 cho thấy m t số giống hải miên là nguồn cung cấp các hợp chất chuyển hóa thứ cấp ti m năng như:

Xestospongia (319 hợp chất), Theonella (244 hợp chất), Halichondria (222 hợp chất), Aplysina (118 hợp chất) C c hợp chất thu được t hải mi n được thống kê rất đa

d ng thu c nhi u lớp chất khác nhau bao gồm: chất béo, terpenoid, steroid, alkaloid, quinone và nhi u hợp chất có cấu trúc phức t p khác Các hợp chất có nguồn gốc t hải mi n cũng thể hiện rất nhi u ho t tính quan trọng như: ho t tính g y đ c tế bào, kháng u, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, ức chế enzyme Khoảng 5300 hợp chất phân lập t hải mi n được đ nh gi là c c hợp chất dẫn đường ti m năng [4] Đặc biệt, trên thế giới hiện có m t số lo i thuốc có nguồn gốc t hải mi n đã được FDA

công nhận như: Cytarabine (c nguồn gốc t hải miên Tethya crypta, tr ung thư b ch cầu), Vidarabine (có nguồn gốc t hải miên Tethya crypta, chỉ đ nh để đi u tr các

bệnh herpes đơn giản và viêm não do virut) và Halaven (nguồn gốc t hải miên

Halichondria okaida, sử dụng trong đi u tr ung thư vú) [5] và không ít những hợp

chất có nguồn gốc t hải mi n đang được nghiên cứu lâm sàng và ti n lâm sàng như: agosterol A, motuporamine C, discodermolide, hemiasterlin der, peloruside A, palicylihalamide A và B, ascididemin, variolins [6]

1.2 Tổng quan về hải miên thuộc giống Rhabdastrella

1.2.1 Giới thiệu vài nét về hải miên thuộc giống Rhabdastrella

Hải miên giống Rhabdastrella thu c họ Ancorinidae, b Astrophorida, lớp

Demospongia Đến nay các nhà khoa học đã tìm ra khoảng 19 loài thu c giống

Rhabdastrella trong đ thường gặp nhất là loài R globostellata (Hình 1.4) [7] Chúng

được ph n bố r ng rãi ở c c v ng biển nhiệt đới Nam Th i Bình Dương như: v ng biển Đông New Caledonia và Philippines Cho đến nay mới c khoảng 20 công trình nghi n cứu v thành phần h a học và ho t tính sinh học của hải mi n thu c giống này

Các nghi n cứu chủ yếu tập trung vào loài R globostrella và m t số nghi n cứu v loài R aff distincta T hai loài này c c nhà khoa học đã ph n lập và x c đ nh cấu

trúc của khoảng hơn 80 hợp chất Đặc biệt là hầu hết c c hợp chất ph n lập được đ u

có khung isomalabaricane lo i nortriterpenoid và triterpenoid C c hợp chất này đã được chứng minh là thể hiện nhi u ho t tính như g y đ c tế bào ung thư kh ng vi m,

kh ng khuẩn [7-9]

Trang 23

Hình 1.4. Hình ảnh loài hải miên R globostellata

1.2.2 Tình hình nghiên cứu về hải miên giống Rhabdastrella trên thế giới

Hiện trong nước chưa c công bố nào v thành phần hóa học cũng như ho t tính

sinh học của hải miên thu c giống Rhabdastrella Tính đến năm 2017 tr n thế giới đã

có khoảng 20 công trình công bố, các nhà khoa học ở c c nước trên thế giới đã ph n

lập và x c đ nh cấu trúc của hơn 80 hợp chất t loài R globostellata và loài R aff distincta Đi u đặc biệt, các hợp chất phân lập được chủ yếu có cấu trúc hóa học d ng

khung isomalabaricane Các hợp chất này có thể thu c lo i isomalabaricane triterpenoid (30C), lo i isomalabaricane nor-triterpenoid (29C) hay là c c hợp chất c

số carbon ít hơn nữa hình thành do sự đứt gãy của m nh nhánh t o n n c c hợp chất được gọi chung là isomalabaricane analog Cấu trúc các hợp chất thay đ i đ ng kể theo v trí sinh thái nơi sống của các loài hải miên này

Các hợp chất isomalabaricane được gọi chung cho các triterpenoid ba vòng

ngưng tụ được sắp xếp d ng trans-syn-trans 6,6,5-tricyclic terpenoid, mới chỉ được thông báo tìm thấy t các loài hải miên thu c giống Stelletta, Jaspis, Geodia và Rhabdastrella (thu c họ Astrophorida) Nhi u hợp chất triterpenoid isomalabaricane

đã được tìm thấy có ho t tính g y đ c đ ng kể đối với các dòng tế bào ung thư ở người [10]

1.2.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của hải miên giống Rhabdastrella

Công trình công bố đầu tiên v thành phần hóa học của giống Rhabdastrella mới được bắt đầu vào năm 1996 M t hợp chất isomalabaricane triterpenoid mới có

tên gọi rhabdastrellic acid-A (1) đã được phân lập t loài Rhabdastrella globostellata

thu ở biển Đông [11] Sau đ cho đến năm 2000 t m hợp chất isomalabaricane analog

có 25 carbon (2-9) được phân lập t hải miên R globostellata sống ở vùng biển New

Caledonian [12] Trong đ c c hợp chất 2-5 là các hợp chất mới và được gọi chung là

Trang 24

các hợp chất auroral Các hợp chất này khác với các hợp chất jaspiferal (6-9) do sự

xuất hiện của m t nhóm ethanol ở v trí C-4 Tuy nhiên trong công trình này, các cặp

hợp chất 2 và 3, 4 và 5 phân lập được dưới d ng h n hợp với tỉ lệ 1:1

Cũng t loài hải miên R globostellata được thu thập t vùng biển Philippines,

các nhà khoa học Th Nhĩ Kỳ đã ph n lập được hai hợp chất isomalabaricane

triterpenoid mới được đặt tên là stellettin H (10) và stellettin I (11) cùng với 6 hợp chất

đã biết: rhabdastrellic acid-A (1) và stellettin A-E (12-16) [13] T loài hải miên R aff

Trang 25

distincta các nhà khoa học đã ph n lập được bốn hợp chất mới có d ng khung đặc

trưng isomalabaricane: isogeoditin A (17), (13E)-isogeoditin A (18), isogeoditin B

(19) và 22,23-dihydrostellettin B (20) cùng với bảy hợp chất isomalabaricane đã biết

1, 12-15, geoditin A (21) và geoditin B (22) [7] C c hợp chất 21 và 22 đã được phân

lập trước đ y t loài hải mi n Geodia japonica, được thu thập t khu vực gần nơi lấy

mẫu của R globostellata C c hợp chất 12-15 thường được tìm thấy trong các loài hải miên Stelletta và Jaspis, nhưng hợp chất 1 chỉ được b o c o t loài R globostella

Năm 2006 mười bốn hợp chất isomalabaricane triterpenoid khác được phân lập

t loài hải miên R globostellata bao gồm 11 hợp chất mới: 13E-stelliferin riboside

(23), 3-O-deacetyl-13Z- stelliferin riboside (24), globostelletin (25), acid globostellatic

F-M (26-33); 3 hợp chất đã biết là acid globostellatic A và D (34-35) và 13Z-stelliferin

riboside (36) [14] Qu trình đồng phân hóa thường xảy ra ở liên kết đôi t i C-13/C-14

do t c đ ng của ánh sáng dẫn đến sự chuyển đ i nhanh chóng giữa hai d ng đồng phân

13Z và 13E thường rất khó tách rời các cặp đồng phân E/Z này và các hợp chất

thường thấy công bố phân lập ở d ng h n hợp hai đồng phân với tỷ lệ 1:1 hoặc 2:1

Các hợp chất 25, 26, 34 với nhóm ketone ở C-15 và các dẫn xuất 23, 24, 36 với sự có mặt của m t nhóm thế ribose ở C-20 có vẻ n đ nh hơn trong việc duy trì cấu hình của

liên kết đôi t i v trí C-13/C-14 [14] Ở m t nghiên cứu khác, bốn hợp chất

Trang 26

isomalabaricane cũng đã được phân lập: stelliferin riboside (37),

3-epi-29-acetoxystelliferin E (38), stellettin J (39), stellettin K (40) [8]

Aoki và c ng sự đã ph n lập t loài hải miên R globostellata thu ở vùng biển Indonesia 7 hợp chất mới khung isomalabaricane trong đ c 4 hợp chất là các d ng

đồng phân hình học khác nhau của globostellatic X methyl ester (41-44) và 3 hợp chất dẫn xuất khác (45-47) Cụ thể, c c hợp chất 41-44 tương ứng là c c d ng đồng ph n

hình học (13Z, 17Z), (13Z, 17E), (13E, 17Z) và (13E, 17E) Hợp chất 45 và 46 lần lượt

được gọi là 13E-globostellatic F methyl ester và 13E-globostellatic B methyl ester So

với 4 hợp chất 41-44, các hợp chất 45-47 có sự khác biệt chủ yếu v cấu trúc hóa học

ở m ch nhánh Chúng có thể được hình thành do sự oxy hóa làm đứt m ch t i các v trí

liên kết đôi (47) hay là quá trình dihydroxy hóa các liên kết đôi (45, 46) [15]

T loài hải miên R aff.distincta, các nhà khoa học đã ph n lập được 6 hợp chất

isomalabaricane mới, rhabdastrellin A-F (48-53) Trong đ hợp chất rhabdastrellin F

(53) là m t đồng phân 13Z của hợp chất 52 (13E) [9] Bảy isomalabaricane analog

mới, rhabdastin A-G (54-60) đã được phân lập t d ch chiết methanol của loài hải

miên R globostellata, thu t i Amamioshima, Nhật Bản Các hợp chất 54-56 có thể

được hình thành do sự oxy hóa của các hợp chất stelliferin Quá trình sinh t ng hợp

các hợp chất rhabdastin D-G (57-60) có thể được giải thích dựa trên quá trình oxy hóa

và mở vòng của các hợp chất stelliferin [16] Cũng t loài R globostella các nhà khoa

học đã ph n lập được 14 hợp chất isomalabaricane analog trong đ c 9 hợp chất mới

globostelletin A–I (61-69) và năm hợp chất đã biết 1, 14-16 và jaspolide F (70) Hợp

Trang 27

chất 61 được thông báo với cấu trúc hóa học kh đặc biệt bởi sự oxy hóa cắt m ch

nhánh và phá vỡ vòng 5 c nh của cấu trúc 3 vòng 6,6,5 trans-syn-trans

Globostelletin C và D (63, 64) là m t cặp đồng phân hình học ở liên kết đôi 13/C-14 và chỉ được thông báo phân lập ở d ng h n hợp với tỷ lệ 1:1 Hợp chất 65 và

C-66 cũng là m t cặp đồng phân hình học t i C-13/C-14 nhưng hai hợp chất này đã

được các tác giả công bố phân lập ở d ng riêng rẽ Dựa trên dữ liệu ph 1D, 2D-NMR

cho thấy globostelletin G (67) là d ng đồng phân 13E của jaspolide F (70) Hai hợp

chất này được tác giả phân lập bằng phương ph p HPLC Cấu trúc của hợp chất 68 khá tương đồng với rhabdastrellic acid-A (1) chỉ khác ở ch nhóm cacboxylic của hợp chất

68 liên kết trực tiếp với C-23 thay vì nh m methacrylic acid như trong hợp chất 1 [10] Năm hợp chất mới, stelliferin J-N (71-75), với cấu trúc isomalabaricane analog có

nhóm 3β-acetoxy cũng đã được phân lập t loài hải miên R cf globostellata thu t i

đảo Ishigaki, Okinawa [17]

Trang 28

Li và c ng sự đã ph n lập và x c đ nh cấu trúc của 9 hợp chất mới khung

isomalabaricane triterpenoid t loài hải miên R globostellata và đặt tên là

globostelletin J-R (76-84) [18] Chín hợp chất này là m t nhóm các hợp chất khung

isomalabaricane triterpenoid ít gặp với sự có mặt của m t vòng cyclopentane ở m ch nhánh Sự hình thành vòng cyclopentan ở phần nhánh của các hợp chất này được giải

thích tương tự như sự hình thành vòng cyclopentane ở hợp chất rhabdastin D-G 60) được mô tả chi tiết bởi Iwagawa và c ng sự [16] Các d ng đồng phân hình học

(57-13Z (83) và 13E (84) thường gặp ở lớp chất isomalabaricane cũng được phân lập và

công bố Globostelletin O (81) và P (82) có thể được hình thành t 83 qua quá trình

epoxy hóa t i C-16/C-25 và hydroxy hóa t i C-20 t o thành cặp đồng phân quang học

20S/20R Con đường sinh t ng hợp của globostelletin J (78) được mô tả hình thành t

stellettin E (16) Hợp chất globostelletin K (77) được t o thành t 76 qua quá trình dehydroxyl hóa, trong khi 78 được x c đ nh là d ng methyl ester của 77

Như vậy mặc d mới chỉ c khoảng 20 công trình nghi n cứu v thành phần

h a học và chỉ tập trung ở hai loài hải mi n R globostellata và R aff distincta, các

nhà khoa học đã ph n lập và x c đ nh cấu trúc của 84 hợp chất isomalabaricane analog – m t lớp hợp chất triterpenoid 3 vòng hiếm gặp, mới chỉ được phát hiện t các loài

hải miên thu c bốn giống Stelletta, Japsis, Geodia và Rhabdastrella (b Astrophorida) C c mẫu hải mi n giống Rhabdastrella đã được nghiên cứu chủ yếu

được thu thập t i vùng biển Đông T y thu c vào v trí lấy mẫu mà cấu trúc của các

Trang 29

hợp chất isomalabaicane phân lập được có sự thay đ i khác nhau Cấu trúc hóa học của chúng được đặc trưng bởi phần khung với ba vòng ngưng tụ 6,6,5-tricyclic d ng

trans-syn-trans và m ch nhánh là m t chu i polyene liên hợp c đ dài, ngắn khác

nhau đính t i v trí C-13 thông qua m t nối đôi M t số điểm đặc trưng ở cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được có thể thấy như có m t nhóm ketone luôn nằm ở

v trí C-12; t i v trí carbon C-3 và carbon của nhóm methyl C-29 thường b oxy hóa thành các d ng nhóm chức hydroxyl, ketone, acetoxy, hay acid/alkyl-O-carboxyl (với

C-29) C c đồng phân 13Z và 13E , 17Z và 17E thường tìm thấy trong quá trình phân

lập M t điểm lưu ở các hợp chất này là có thể xảy ra sự đồng phân hóa cặp đồng

phân E/Z của các liên kết đôi trong trường hợp các hợp chất này không được bảo quản

cẩn thận

1.2.2.2 Đặc trưng phổ 13 C-NMR của một số hợp chất isomalabaricane phân lập từ hải miên giống Rhabdastrella

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất isomalabaricane

T ng hợp các tài liệu công bố v cấu trúc hóa học và số liệu ph NMR của các

hợp chất isomalabaricane analog phân lập t giống hải miên Rhabdastrella nhận thấy

các sự thay đ i: sự có mặt của nhóm thế đ dài m ch nhánh, hay các d ng đồng phân hình học được thể hiện rõ nét qua chuyển d ch hóa học của các tín hiệu carbon trên

ph 13C-NMR Chính vì thế, việc t ng hợp số liệu ph c ng hưởng t h t nhân carbon

13

C-NMR của các hợp chất đã được công bố sẽ giúp có những dự đo n bước đầu trong

x c đ nh cấu trúc của các hợp chất khung isomalabaricane t loài hải miên

Rhabdastrella Số liệu ph 13C-NMR của 15 hợp chất isomalabaricane có cấu trúc đặc

trưng thường gặp t các loài hải miên thu c giống Rhabdastrella được trình bày ở Bảng 1.1

Dựa vào số liệu trên ph 13C-NMR của các hợp chất trên Bảng 1.1 nhận thấy:

Trên ph 13C-NMR của 15 hợp chất xuất hiện tín hiệu của 30 carbon đặc trưng cho lớp chất triterpenoid Ngoài ra, tùy thu c vào sự có mặt của các nhóm thế khác nhau sẽ

Trang 30

xuất hiện thêm các tín hiệu c ng hưởng của nhóm thế và thường thấy là nhóm acetoxy, methoxy Với c c đặc điểm v cấu trúc hóa học này, trên ph 13C-NMR có thể được nhận d ng bằng các tín hiệu như sau:

Sự xuất hiện m t số lượng khá nhi u các tín hiệu nhóm methyl bậc 3 (thường là bảy hoặc tám nhóm) t i các v trí C-18, C-19, C-21, C-26, C-27, C-28, C-29, C-30 Các giá tr đ chuyển d ch của carbon methyl t i các v trí : C-18 (δC 14,5-16,1), C-19 (δC 19,5 -23,5), C-21 (δC 12,8-21,1), C-26 (δC 18,7-29,8), C-27 (δC 12,6-29,8), C-28 (δC 23,1-29,0), C-29 (δC 16,7-19,5), C-30 (δC 24,5- 25,9) Sự d ch chuyển của các tín hiệu này v v ng trường thấp hoặc trường cao có thể gợi được sự có mặt của các nhóm thế lân cận hay sự biến đ i v đồng phân cấu hình Chẳng h n, tín hiệu của C-18

c δC khoảng 14.5 ppm thì có thể dự đo n cấu hình của nối đôi C-13/C-14 là E (chất

52, 50, 10, 45, 46, 42, 44) trong khi đ với cấu hình 13Z thì tín hiệu của C-18 d ch

chuyển v v ng trường thấp hơn δC khoảng 16.0 ppm (chất 16, 49, 11, 41, 43, 27)

Trong hợp chất 13Z mà có thêm nhóm hút điện tử m nh (như nh m ketone) ở v trí lân

cận thì tín hiệu của C-18 có thể b d ch chuyển nhi u hơn nữa v v ng trường thấp ở

cấu hình là 17E (chất 41, 42) Tuy vậy, muốn khẳng đ nh chính xác cấu hình của các

liên kết đôi này cần có thêm xác nhận thông qua các tín hiệu tương t c tr n ph NOESY

Ngoài ra, trên ph 13C-NMR của các hợp chất này còn có sự xuất hiện tín hiệu của các nhóm carbonyl C=O thường ở v trí C-3, C-12 Nhóm carbonyl t i v trí C-12 thường cố đ nh và c đ chuyển d ch hóa học trong khoảng δC 204,9-208,4 ppm Tuy nhiên, nếu có sự xuất hiện của tín hiệu carbon t i trường thấp hơn ở khoảng δC 219 ppm thì ta có thể gợi ý có sự hiện diện của nhóm ketone t i C-3 Trong m t số trường hợp, nhóm keton t i C-3 được thay thế bởi nhóm hydroxyl hay acetoxy thì tín hiệu của C-3 d ch chuyển m nh v v ng trường cao ở δC 73,6 -81,0 Bên c nh đ nh m methyl

t i v trí C-29 cũng thường được thế bởi các nhóm CH2OH, COOH, COOCH3 Các nhóm thế này được nhận biết khi trên ph 13C-NMR của hợp chất thấy mất đi m t tín

Trang 31

hiệu của nh m methyl mà thay vào đ là tín hiệu của m t nhóm oxymethylene c đ chuyển d ch hóa học δC khoảng 63,7-65,2 ppm gợi ý cho nhóm CH2OH thế t i C-29

Khi có sự xuất hiện của cặp tín hiệu carbon với đ chuyển d ch t i δC 176,7 và 51,5 ppm thì gợi ý cho nhóm thế COOCH3 t i C-29 Trong trường hợp thấy xuất hiện tín hiệu của pic carbon carbonyl t i δC 180,5-182,7 ppm gợi ý cho ta nhóm thế t i C-29 là COOH Đồng thời sự xuất hiện của các nhóm thế COOH hoặc COOCH3 ở C-29 (chất 45) sẽ làm cho tín hiệu của C-3 d ch chuyển v v ng trường

176,0-cao (ΔδC ~ 7 ppm) so với các hợp chất C-29 không b thay thế (52, 53, 10, 11)

Sự xuất hiện tín hiệu của 8-10 carbon olefin với đ chuyển d ch hóa học trong khoảng δC 123,9-148,3 ppm đặc trưng cho m t nhánh polyene liên hợp chứa 4-5 nối đôi C-C đính vào khung t i v trí carbon C-13

Các hợp chất có sự đ ng vòng ở m ch nhánh không thể hiện rõ ràng trên ph

13C-NMR Việc x c đ nh sự có mặt của các vòng này cần có phân tích của ph khối lượng phân giải cao

C c isomalabaricane analog được hình thành t sự đứt gãy của m ch nhánh, số tín hiệu carbon trên ph 13C-NMR của các hợp chất này thường dưới 30C (20C-29C)

Sự đứt gãy của m ch nh nh thường xảy ra do quá trình oxy hóa, trên phần m ch nhánh

sẽ có thêm các nhóm chức như COOCH3 COOH CHO C=O Như vậy, cấu trúc của các hợp chất isomalabaricane analog chỉ khác các hợp chất isomalabaricane triterpenoid ở đ dài ngắn của m ch nhánh và d ng nhóm chức ở m ch nhánh Vì thế đặc trưng ph NMR của các isomalabaricane analog sẽ tương đồng ở các tín hiệu thu c phần cấu trúc 3 vòng 6,6,5-tricyclic thể hiện bởi tín hiệu của 17 carbon và chỉ khác biệt ở số tín hiệu carbon thu c m ch nhánh Tùy thu c vào số lượng carbon phân tích được trên ph 13C-NMR có thể dự đo n được đ dài của m ch nhánh

Trang 33

1.2.2.3 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của hải miên giống Rhabdastrella

Trong m t nghiên cứu của Guo và c ng sự đánh giá tác dụng g y đ c tế bào ung thư của cặn chiết CH2Cl2 và cặn nước loài Rhabdastrella globostellata trên các

dòng tế bào ung thư ở người bao gồm A-549, BGC-823, HCT-8, Bel-7402 và A-2780 nhận thấy cặn chiết CH2Cl2 thể hiện tác dụng g y đ c đối với dòng tế bào A-2780, trong khi phân đo n nước thể hiện ho t tính gây đ c tế bào yếu trên các dòng tế bào thử nghiệm [19]

Tương tự các hợp chất triterpenoid nói chung, ho t tính sinh học của các hợp chất isomalabaricane được công bố n i bật với tác dụng g y đ c tế bào ung thư

Rhabdastrellic acid-A (1), m t hợp chất đầu ti n được tìm thấy t giống

Rhabdastrella, có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư HL-60 rất

triển vọng với giá tr IC50 là 0,68 µg/ml Cơ chế g y đ c tế bào ung thư của hợp chất này được giải thích theo con đường apoptosis Nghiên cứu s u hơn ở mức đ phân tử cho thấy, rhabdastrellic acid-A kích ho t ho t đ ng của enzyme caspase-3 là m t trong các yếu tố làm tăng cường quá trình apoptosis Bên c nh đ tác giả còn nhận thấy rằng rhabdastrellic acid-A ức chế đường dẫn PI3K/Akt (là m t trong những con đường chính đi u hòa tăng trưởng tế bào, sinh sôi nảy nở, chuyển hóa, sống sót và t o m ch)

và kích ho t enzyme caspase-3 trong các tế bào ung thư b ch cầu ở người HL-60 [19]

Trong m t nghiên cứu khác, hợp chất 1 cũng được đ nh gi ho t tính g y đ c tế bào

trên m t số dòng tế bào ung thư ở người như: A-549, BGC-823, HCT-8, Bel-7402 và

A-2780 Kết quả cho thấy hợp chất 1 có tác dụng ức chế m nh sự phát triển của dòng

tế bào ung thư c tử cung A-2780 với giá tr IC50 4,23 µM Ngoài ra, rhabdastrellic

acid-A (1) cho thấy ức chế m nh mẽ chống l i các tế bào HL-60 và nó gây ra

apoptosis của tế bào HL-60 theo m t cơ chế khác trong pha G2/M [10]

Các hợp chất 2-9 cũng được thử ho t tính g y đ c tế bào đối với dòng tế bào

ung thư biểu mô KB, kết quả cho thấy h n hợp c c đồng phân 13E/13Z auroral 2-3 và

jaspiferal 6-7 thể hiện ho t tính g y đ c tế bào với giá tr IC50 lần lượt là 0,2 và 5,5

μg/ml Các hợp chất auroral 4-5 thể hiện ho t tính g y đ c trung bình đối với dòng tế

bào KB với giá tr IC50 là 8 μg/ml trong khi jaspiferal 8-9 không thể hiện ho t tính [12] Hợp chất 17 thể hiện ho t tính g y đ c tế bào đối với ba dòng tế bào HL-60, PC-

3MIE8, BGC-823 với giá tr IC50 ở nồng đ cỡ ng (130, 70, 470 ng/mL) đã cho thấy

đ y là m t tác nhân rất có triển vọng cho phát triển các thuốc có tác dụng đi u tr ung

Trang 34

thư Tuy vậy đ nh gi t c dụng g y đ c tế bào ung thư của hợp chất 18 (d ng đồng

phân hình học 13E của 17) l i không nhận thấy thể hiện ho t tính g y đ c tế bào Với

kết quả này tác giả đã đ xuất d ng đồng phân hình học 13Z là yếu tố quyết đ nh tới

tác dụng g y đ c tế bào Khi so sánh mức đ g y đ c tế bào của hợp chất 20 với hợp

chất stellettin B (13) tác giả cũng cho thấy liên kết đôi giữa C-23/C-24 trong vòng

δ-lactone đ ng m t vai trò quan trọng [7]

Ở m t nghiên cứu khác, các hợp chất 37-40 cũng được đ nh gi ho t tính gây

đ c tế bào đối với dòng tế bào ung thư c tử cung A2780 Tất cả các hợp chất đ u thể hiện ho t tính g y đ c tế bào đối với dòng tế bào A2780 Đ ng chú là c c hợp chất

có m ch nhánh không bão hòa như hợp chất 37 và 38 có khả năng thúc đẩy quá trình

n đ nh DNA-polymerase Clement và c ng sự lí giải sự quay tự do của m ch nhánh

do không có các liên kết đôi sẽ cho phép tương t c hiệu quả hơn với phức hợp nh phân enzyme – DNA Mặc d chưa c kết luận rõ ràng v cơ chế g y đ c tế bào của

37-40, nhưng c c nghi n cứu đã cho thấy c c hợp chất stellettin có ho t tính g y đ c tế

bào rất m nh đối với nhi u dòng tế bào ung thư trong danh mục NCI 60 (m t danh mục gồm 60 dòng tế bào ung thư ở người được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ sử dụng để sàng lọc các hợp chất chống ung thư ti m năng) [8] Trong m t nghiên cứu của Jason và c ng sự v tác dụng chống ung thư của các hợp chất isomalabariane phân

lập t loài R globostellata thông qua tác dụng tăng cường sự sửa chữa DNA Kết quả

đã cho thấy các hợp chất này làm tăng khả năng li n kết giữa DNA và enzyme

DNA-polymerase β (m t enzyme thúc đẩy quá trình phục hồi DNA) do đ làm tăng khả

năng phục hồi của DNA b l i Cụ thể, ở nồng đ 28 µg/mL các hợp chất stelliferin

riboside (37) và 3-epi-29-acetoxystelliferin E (38) và hợp chất mới stellettin J (39) làm

tăng cường n đ nh tương t c giữa DNA và enzyme DNA-polymerase β lên 29%,

23%, 5% Hợp chất stellettin K (40) không nhận thấy có ảnh hưởng đến tương t c

DNA và enzyme DNA-polymerase β [8] Ho t tính g y đ c tế bào của các hợp chất

rhabdastrellin A-F (48-53) đã được thể hiện trong thử nghiệm trên m t số dòng tế bào

ung thư ở người bao gồm HL-60, BGC-823 và MDAMB-435 Kết quả cho thấy hợp

chất 48 có ho t tính ức chế v a phải đối với HL-60 với giá tr IC50 là 4 2 μg/mL, trong

khi các hợp chất 49-53 không thể hiện ho t tính g y đ c tế bào đối với các dòng tế bào

ung thư thử nghiệm với giá tr IC50> 10 μg/mL [9] Ho t tính g y đ c tế bào của các

hợp chất (54-60) đối với dòng tế bào ung thư b ch cầu HL-60 được đ nh gi bằng

Trang 35

phương ph p MTT Các hợp chất 57, 58, 60 có vòng cyclopentane ở m ch nhánh thể

hiện ho t tính với giá tr IC50 là 21, 29, 44 và 11 μM trong khi c c hợp chất không có

vòng cyclopentane ở m ch nhánh (54, 55 và 56) không thể hiện ho t tính [16]

Các hợp chất 61-71 đã được thử ho t tính g y đ c tế bào đối với các dòng tế

bào ung thư ở người (A-549, BGC-823, HCT-8, Bel-7402 và A-2780) Hầu hết trong

số chúng cho thấy các ho t đ ng ức chế chọn lọc chống l i dòng tế bào ung thư c tử cung ở người A2780 và tùy thu c vào chi u dài của m ch nhánh mà các hợp chất thể

hiện khả năng ức chế khác nhau Các hợp chất 1 và 71 với năm li n kết đôi cho thấy

ho t đ ng ức chế m nh đối với dòng tế bào ung thư c tử cung A2780 với giá tr IC50lần lượt là 4,23 µM và nhỏ hơn 0,5 µM Và tỷ lệ ức chế giảm đ ng kể khi số lượng các

liên kết đôi trong m ch nhánh giảm như trong trường hợp 62, 65 và 66 thể hiện khả

năng ức chế yếu Ngoài ra, 13Z-isomalabaricane (69-71) có ho t tính ức chế m nh hơn

so với c c đồng phân 13E (1, 67-68) Đối với c c đồng phân hình học stellettin C và D (14, 15), cấu trúc 13Z cũng cho thấy các tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào HL-

60 (IC50 = 0,01 µM) và các tế bào HeLa (IC50 = 7,5 µM) m nh hơn nhi u so với đồng

phân 13E (IC50 = 3,6l µM đối với HL-60 và 16 µM đối với HeLa) So sánh tác dụng

g y đ c tế bào của các hợp chất 63/ 64 với các hợp chất 65/ 66 cho thấy phần m ch

nhánh chứa nhóm aldehyde thể hiện ho t tính g y đ c tế bào m nh hơn so với nhóm

carboxylic [10] Trong m t nghiên cứu khác các hợp chất stelliferins L (73) và N (75)

có ho t tính kháng khuẩn chống l i Bacillus subtilis (với giá tr IC50 = 8 µg/mL) Các

hợp chất stelliferin J-N (71-75) không thể hiện ho t tính g y đ c tế bào đối với dòng tế

bào b ch cầu lympho L-1210 (IC50> 10 µg/mL) [17]

Như vậy c thể thấy cho đến nay c khoảng 84 hợp chất isomalabaricane và

isomalabaricane analog đã được phân lập t giống Rhabdastrella và các hợp chất này

đ u được đ nh gi t c dụng g y đ c tế bào ung thư Tùy thu c vào sự thay đ i v cấu trúc mà các hợp chất này thể hiện khả năng g y đ c tế bào khác nhau: các hợp chất với phần cấu trúc m ch nhánh chứa nhi u liên kết đôi c t c dụng g y đ c tế bào ung thư

m nh hơn hẳn so với các hợp chất có ít liên kết đôi hơn hay c c đồng phân cấu hình

13Z thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư m nh hơn c c đồng phân 13E Nhi u hợp chất được phát hiện là các hợp chất dẫn đường ti m năng trong

việc nghiên cứu phát triển thành thuốc đi u tr ung thư điển hình là hợp chất 1 với tác

dụng gây ra apoptosis theo nhi u cơ chế kh c nhau như ức chế đương dẫn PI3K/Akt,

Trang 36

kích ho t ho t đ ng enzyme caspase-3 hay ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào

HL-60 trong pha G2/M Vì vậy trong tương lai cần có thêm những nghiên cứu s u hơn v

thành phần hóa học và ho t tính sinh học của các loài hải miên giống Rhabdastrella

nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có ho t tính m nh làm sáng tỏ mối quan hệ cấu trúc –

ho t tính của các ho t chất, phục vụ công tác nghiên cứu dược phẩm

1.3 Tổng quan về hải miên thuộc giống Xestospongia

1.3.1 Giới thiệu chung về hải miên thuộc giống Xestospongia

Các loài hải miên thu c giống Xestospongia thu c họ Petrosiidae b

Haplosclerida lớp Desmospongia Đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã công bố

trên 30 loài thu c giống Xestospongia: X arenosa, X bergquistia, X bocatorensis , X caminata, X clavata, X coralloides, X delaubenfelsi, X deweerdtae, X diprosopia, Chúng thường được biết đến là m t lo i hải mi n d ng th ng c kích

thước lớn ph n bố r ng rãi với trữ lượng lớn ở c c r n san hô ở đ s u lớn hơn 10 m

tr n c c v ng biển nhiệt đới M t vài hình ảnh đặc điểm hình th i và ph n bố của m t

số loài hải mi n giống Xestospongia đã được tìm thấy như Bảng 1.2 [20]

Bảng 1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của một số loài hải miên giống Xestospongia

X muta (Schmidt, 1870)

Đặc điểm: hình th ng với lớp vỏ bao quanh dày màu sắc t tím đến đỏ x m b n trong B mặt nhi u vân tròn hoặc dài sần s i L ở b n trong r ng 2-3 mm

Ph n bố: chủ yếu tr n r n san hô sống ở đ s u tr n

5 m Đã được tìm thấy ở Bocas del Toro, biển Caribe

X proxyma (Duchassaing & Michelotti,1864)

Đặc điểm: lớp vỏ dày (1-4 cm), các nhánh có thùy Màu đỏ đến hồng b n ngoài b n trong t x m đến vàng L th n đường kính 3-10 mm b mặt m n th n cứng và mảnh

Ph n bố: chủ yếu sống tr n môi trường r n san hô rong tảo ở c c v ng biển Colombia Brazil Peurto Rico quần đảo Virgin Bocas del Toro

Trang 37

X rosariensis (Zea & Rutzler, 1983)

Đặc điểm: hình ống trụ cao 4-78 cm r ng 2-13 cm

b n ngoài màu đỏ b n trong màu n u cứng và dày

b mặt m n tr n b mặt b n trong ống c c c l nhỏ đường kính 0,6-3,4 mm

Ph n bố: sống tr n c c r n san hô ở c c v ng biển Nuestra Señora del Rosario Archipelago, Colombia, Bocas del Toro, Panama

X ubtriangularis (Duchassaing, 1850)

Đặc điểm: C nhi u cành nh nh m i cành c đường kính 1-2cm cao hơn 20 cm cứng và mảnh B mặt nhẵn c nhi u l nhỏ đường kính 2-5 mm

Ph n bố: sống tr n c c r n san hô thảm cỏ biển và bãi c t ở đ s u tr n 3m r ng khắp v ng biển Caribe

X carbonaria (Lamark, 1814)

Đặc điểm: lớn c nhi u th y đen cả trong và ngoài

m m b mặt nhẵn với nhi u l nhỏ 3-5 mm trên đỉnh m i khối hình núi lửa

Ph n bố: Rất ph biến ở v ng biển nông tr n c c r n san hô thảm cỏ biển và r ng ngập mặn Caribe và

Th i Bình Dương

1.3.2 Tình hình nghiên cứu về hải miên thuộc giống Xestospongia trên thế giới

Theo cơ sở dữ liệu Scifinder ở Việt Nam đã c 4 công bố v thành phần h a

học và ho t tính sinh học của loài hải mi n X testudinaria nhưng chưa c công bố nào

v loài X muta Tr n thế giới c khoảng hơn 10 công bố v thành phần h a học và

ho t tính sinh học của loài hải mi n X muta C c hợp chất ph n lập được t loài này

thu c hai lớp chất chính steroid và brom acetylenic acid

Đến năm 2018 c khoảng 350 nghi n cứu v hải mi n thu c giống

Xestospongia C c công bố được thực hiện chủ yếu bởi c c nhà khoa học ở M Nhật Bản và Úc C c nghi n cứu đã chỉ ra rằng hải mi n thu c giống Xestospongia là m t

Trang 38

nguồn giàu c c chất chuyển h a thứ cấp đặc trưng ở c c lớp chất bao gồm: alkaloid quinone, terpenoid, sterol và dẫn xuất brom acetylenic acid C c hợp chất ph n lập

được t hải mi n Xestospongia thể hiện ho t tính sinh học quan trọng như: khả năng

g y đ c tế bào ức chế enzyme giãn m ch

1.3.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của hải miên giống Xestospongia

T những năm 1970 đến nay, các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã ph n lập

hoặc phát hiện được khoảng 400 hợp chất t 11 loài đã được đ nh danh bao gồm: X muta, X ingens, X exigua, X sapra, X vanilla, X testudinaria, X wiedenmayeri, X caycedoi, X ashmorica, X cf carbonaria và X bergquistia và m t số loài chưa đ nh danh Xestospongia sp Các hợp chất phân lập được thu c 5 lớp chất chính sau:

alkaloid (hơn 100 hợp chất), quinone (khoảng 40 hợp chất), terpenoid (khoảng 20 hợp chất), sterol (khoảng 70 hợp chất) và dẫn xuất brom acetylenic acid (khoảng 120 hợp chất) Trong đ n i bật là lớp chất alkaloid với nhi u cấu trúc đa d ng và ho t tính hay Vì thế, trong khuôn kh luận án, tác giả tập trung t ng quan v các hợp chất

alkaloid được phân lập t giống Xestospongia và ho t tính của chúng

Alkaloid là những hợp chất hữu cơ c chứa d tố nitơ nhi u hợp chất có ảnh hưởng sinh h a cao đối với cơ thể con người và đ ng vật, nhất là đối với hệ thần kinh Với m t lượng nhỏ alkaloid có thể là chất đ c gây chết người nhưng c khi n l i là thần dược tr bệnh đặc hiệu Alkaloid thường được tìm thấy ở trong nhi u loài thực vật

và ít tìm thấy trong đ ng vật Nhưng đối với hải miên giống Xestospongia các hợp

chất alkaloid l i rất ph biến chiếm gần m t phần ba số lượng các hợp chất phân lập được Hiện c hơn 100 hợp chất alkaloid đã được phân lập t các loài hải miên giống

Xestospongia Cấu trúc hóa học của các alkaloid này có thể chia thành bốn nhóm khung chính: isoquinoline quinone, 3-alkylpyridine, β-carboline và quinolizidine

Gần đ y nhất, t m t loài hải mi n chưa x c đ nh tên Xestospongia sp., các nhà

khoa học đã ph n lập được các hợp chất alkaloid mới khung renieramycin đặt tên là

renieramycin S (85), fennebricin A-B (86-87) và N-formyl-1,2-dyhydrorenierol (88) [21, 22] Mười m t hợp chất có cấu trúc isoquinoline quinone (89-99) và d ng dime

(100-104) được phân lập t loài hải miên X caycedoi ở Fiji và loài hải miên khác ở

Philippin Xestospongia sp [23-28] T ba loài hải miên Xestospongia sp., X ingens và

X wiedenmayeri các nhà khoa học đã ph n lập được các alkyldihydropyridine alkaloid

d ng đơn dime và đa vòng bao gồm: tám hợp chất alkaloid khung

Trang 39

3-alkyldihydropyridine với tên gọi N-methylniphatync A (105), xestamine A-C 108) và hachijidine A-D (109-112); bốn hợp chất d ng dime vòng lớn bis- alkyldihydropyridine 113-116; và mười sáu hợp chất d ng đa vòng 117-132 [29-39]

Các hợp chất β-cacboline alkaloid t hải miên Xestospongia có thể kể đến như

xestoamine, xestomanzamine A-B, hay m t số hợp chất manzamine và N-oxide của nó

133-145 được phân lập t loài hải miên X ashmorica thu ở biển Philippin và m t loài

Trang 40

chưa x c đ nh tên Xestospongia sp ở biển Okinawa Trong đ c c hợp chất

manzamine có cấu trúc đặc trưng bởi d ng diamine năm vòng phức t p đính với khung

β-cacboline ở C-1 [40-43]

T loài hải miên X exigua thu ở vùng biển Australia và biển Đỏ và m t loài

chưa được x c đ nh tên thu ở biển Okinawa hai mươi mốt hợp chất quinolizidine và

Định dạng
Số trang	316
Dung lượng	16,87 MB