Luận án tiến sĩ y học nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người

Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh .... Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm chẩn đoá

BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO

BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM

Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI, 2019

BỘ Y TẾ

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO

BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM

Cryptococcusneoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY

Chuyên nga ̀nh: Ký sinh trùng y học

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Cao Trường Sinh, PGS.TS Nguyễn Thị Hương Bình, đã nhiệt tình chỉ dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

PGS.TS Trần Thanh Dương Viện trưởng và Ban Giám đốc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; PGS TS Cao Bá Lợi cùng toàn

bộ cán bộ Phòng Khoa học – Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương;

Ban chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chấn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người” Mã

số CK.10.32/11-15

PGS.TS Nguyễn Khắc Lực, TS Đỗ Ngọc Ánh cùng toàn thể cán bộ bộ môn Ký sinh trùng – Côn trùng Học viện Quân Y; Khoa Sinh học phân tử Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương; Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học Quân sự Học viện Quân Y; Khoa Vi sinh Bệnh Viện Chợ Rẫy; Khoa Vi sinh Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - Thành phố Hồ Chí Minh; Bệnh viện Quân y 103; Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu

GS.TS Lê Bách Quang, PGS.TS Nguyễn Mạnh Hùng, PGS TS Nguyễn Ngọc San,… đã có những ý kiến đóng góp quý báu giúp tôi hoàn thiện luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ, Chồng, Con, anh chị

em trong gia đình và bạn bè đồng nghiệp đã động viên khích lệ tôi vượt qua mọi khó khăn hoàn thành luận án Luận án chỉ là bước đầu trong sự nghiệp khoa học Những lời cảm ơn là chưa đủ vì làm sao kể hết những tình cảm thật

cao quý, những tình cảm đó sẽ theo tôi trong suốt cuộc đời không bao giờ thay đổi!

Trần Thị Quỳnh Liên

LỜI CAM ĐOAN

Đây là một nhánh của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chấn đoán một số vi nấm gây bệnh nội tạng ở người” Mã số CK.10.32/11-15 mà tôi đã trực tiếp tham gia

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các kết quả, số liệu thu được trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ luận án nào khác

Các bước tiến hành thực hiện đề tài đúng như đề cương nghiên cứu, chấp hành đầy đủ các quy định khi tiến hành nghiên cứu

Nếu có sai sót gì tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Trần Thị Quỳnh Liên

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AIDS Acquired immunodeficiency syndrome (Hội chứng suy giảm

miễn dịch mắc phải) ADN

ARV

Acid Deoxyribonucleic Antiretroviral (Liệu pháp kháng retro vi rút) CFU Colony forming units (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

CNS Central nervous system (Hệ Thần kinh Trung ương)

FP False positive (Dương tính giả)

FN False negative (Âm tính giả)

GACA Giuzotia abyssinica creatinin agra (Thạch nuôi cấy GACA) GRHP Ground red hot pepper agar (Thạch ớt đỏ)

HE Hematoxylin eosin (Nhuộm HE)

HIV Human immunodeficinecy Virus (vi rút gây suy giảm miễn

dịch ở người)

K Kappa (Hệ số tương đồng)

LAT Latex agglutination assay test (Thử nghiệm đông kết latex) LFA Lateral flow assay (Thử nghiệm miễn dịch dòng chảy)

MRI Magnetic resonance imaging (Chụp cộng hưởng từ)

NPV Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm)

PCR Polymerase chairn reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) PAS Periodic acid schiff (nhuộm PAS)

PPV Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương)

RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình các đoạn

phân cắt giới hạn)

Se Sensitivity (Độ nhạy)

SOP Standard operating procedure (Quy trình các thao tác chuẩn)

Sp Specificity (Độ đặc hiệu)

TN True negative (dương tính giả)

TP True positive (dương tính thật)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm C neoformans 3

1.1.2 Vai trò y học 5

1.1.3 Tình hình viêm màng não do nấm C neoformans ở trên thế giới và Việt Nam 9

1.2 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans 13

1.2.1 Chẩn đoán trực tiếp 14

1.2.2 Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên 16

1.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử 17

1.3 Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh 23

1.3.1 Thiết kế và chuẩn hóa nồng độ mồi cho phản ứng PCR 25

1.3.2 Chuẩn hóa các điều kiện của phản ứng PCR 27

1.3.3 Xác định ngưỡng phát hiện, xây dựng chuẩn dương của kỹ thuật 31

1.4 Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh 32

1.4.1.Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán 32

1.4.2 So sánh tính tương đồng của bộ sinh phẩm 35

1.4.3 Đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm 36

1.4.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ sinh phẩm 36

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 37

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 38

2.1.3 Thời gian nghiên cứu: 39

2.2 Dụng cụ, vật liệu, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 39

2.2.1 Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc 39

2.2.2 Sinh phẩm hóa chất 39

2.2.3 Các hóa chất, sinh phẩm khác 40

2.2.4 Dụng cụ, phụ tùng, vật tư tiêu hao 40

2.3 Phương pháp nghiên cứu 40

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm 40

2.3.2 Mẫu nghiên cứu 42

2.3.3 Nội dung nghiên cứu 44

2.3.4 Các chỉ số nghiên cứu 50

2.3.5 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 51

2.4 Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu 63

2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 63

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 66

2.7 Nhiễm sai số và cách hạn chế 66

2.8 Hạn chế của đề tài 67

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 68

3.1 Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 68

3.1.1 Kết quả giám định loài vi nấm C neoformans để sử dụng cho nghiên cứu 68

3.1.2 Kết quả thiết kế/lựa chọn mồi cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán

3.2 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm chẩn

đoán nhiễm nấm C neoformans trong dịch não tủy 97

3.2.1 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm 97 3.2.2 Kết quả đánh giá của bộ sinh phẩm trong các mẫu DNT lâm sàng 102 3.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm định chất lượng bộ sinh phẩm chế tạo ra 107 Chương 4 BÀN LUẬN 109 4.1 Về kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR

chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 109 4.1.1 Bàn luận về kết quả giám định loài vi nấm C neoformans để sử dụng

cho nghiên cứu xây dựng quy trình 109 4.1.2 Về kết quả thiết kế/lựa chọn mồi và xác định các điều kiện cho kỹ thuật

nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans 112

4.1.3 Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm

C.neoformans 122

4.2 Bàn luận về độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn

đoán nhiễm nấm C neoformans trong dịch não tủy 124

4.2.1 Bàn luận về kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm 125

4.2.2 Bàn luận về kết quả đánh giá bộ sinh phẩm trong đoán nhiễm C

neoformans ở các mẫu DNT lâm sàng 127

4.2.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu nhiễm C.neoformans phân lập ở Việt Nam 127

KẾT LUẬN 133

1 Xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans 133

2 Về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans dịch não tủy 134

KIẾN NGHỊ 135

TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN TRỰC TIẾP ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nấm C neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi 4

Hình 1.2 Khuẩn lạc C neoformans trên môi trường thạch Sabouraud 5

Hình 1.3.Tổn thương não do C neoformans 7

Hình 1.4 Hình ảnh tổn thương phổi do C neoformans 8

Hình 1.5 Tổn thương da do nấm C neoformans 8

Hình 2.1 Chủng chuẩn nấm C neoformans ATCC@ 90113 37

Hình 2.2 Môi trường thạch Sabouraud trên đĩa thạch và ống thạch nghiêng 53 Hình 2.3 Phương pháp pha loãng dịch não tủy 55

Hình 3.1 Mẫu nấm C neoformans thu thập tại thực địa Việt Nam 69

Hình 3.2 Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS4 của một số mẫu nấm C neoformans 69

Hình 3.3 Kích thước các mảnh cắt giới hạn sản phẩm PCR bằng enzyme MspI của một số mẫu nấm C neoformans 70

Hình 3.4 Minh họa đoạn gen khuếch đại với 02 cặp mồi được lựa chọn 72

Hình 3.5 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi ITS1-ITS4 bằng phần mềm Primer Blast 74

Hình 3.6 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi CN4-CN5 bằng phần mềm Primer Blast 75

Hình 3.7 So sánh trình tự ADN nấm chuẩn được khuếch đại bởi cặp mồi ITS1, ITS4 và các trình tự C neoformans trên ngân hàng gen 76

Hình 3.8 Kết quả PCR theo panel nồng độ 79

Hình 3.9 Kết quả phản ứng PCR1 tiến hành theo quy trình tự xây dựng 83

Hình 3.10 Sản phẩm PCR theo nồng độ Mg2+ 85

Hình 3.11 Phản ứng PCR theo gradien 86

Hình 3.12 Kết quả PCR theo thời gian kéo dài mồi 86

Hình 3.13 Kết quả PCR theo số chu kỳ phản ứng 87

Hình 3.14 Kết quả PCR theo nồng độ ADN khuôn 88

Hình 3.15 Kết quả PCR2 các mẫu N117 và N132 91

Hình 3.16 Bộ sinh phẩm nested - PCR chẩn đoán C neoformans 96

Hình 3.17 Kết quả khuếch đại gen đích của nấm C neoformans bằng kỹ thuật nested-PCR 103

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy với các cách xử lý

mẫu khác nhau 15

Bảng 1.2 Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán C neoformans của hãng Norgen Biotek 23

Bảng 1.3 Thành phần phản ứng PCR thông thường với thể tích 50 µl 29

Bảng 1.4 Chu kỳ nhiệt của một phản ứng PCR thông thường 30

Bảng 2.1 Các mồi chung khuếch đại gen đích vi nấm 40

Bảng 2.2 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR 61

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt PCR1 được thiết lập cho việc nhân bản đoạn gen kích thước khoảng 100bp - 600 bp 61

Bảng 2.4 Minh họa chạy gradient nhiệt độ và nồng độ Mg2+ 62

Bảng 3.1 Kết quả thu thập và phân lập nấm C neoformans 68

Bảng 3.2 Tỷ lệ tương đồng nucleotide của 06 mẫu trong nghiên cứu với các trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen 70

Bảng 3.3 Các phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để định loại nấm C neoformans 1990 - 2014 71

Bảng 3.4 Đánh giá chất lượng của mồi so với tiêu chuẩn 73

Bảng 3.5 Đánh giá tính đặc hiệu của cặp mồi trên các nền mẫu khác nhau 77

Bảng 3.6 Nồng độ AND thu được từ chủng chuẩn C neoformans 78

Bảng 3.7 Kết quả tạo panel chuẩn dương nấm C neoformans 79

Bảng 3.8 Danh mục chứng chuẩn âm 80

Bảng 3.9 Kết quả so sánh phản ứng PCR1 với các điều kiện khác nhau 81

Bảng 3.10 Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1 82

Bảng 3.11 Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 82

Bảng 3.12 Kết quả lựa chọn nồng độ ADN khuôn cho phản ứng PCR2 84

Bảng 3.13 Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR2 84

Bảng 3.14 Điều kiện của phản ứng PCR2 với cặp mồi CN4 và CN5 87

Bảng 3.15 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR2 88

Bảng 3.16 Thử nghiệm đánh giá ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested-PCR 89

Bảng 3.17 Kết quả đánh giá kỹ thuật nested-PCR trên chủng nấm

C neoformans thu thập từ mẫu lâm sàng tại Việt Nam 90

Bảng 3.18 Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX1 92

Bảng 3.19 Thành phần hóa chất của 02 ống dung dịch MX2 92

Bảng 3.20 Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR1 93

Bảng 3.21 Thành phần hóa chất cho ống dung dịch MC-CR2 93

Bảng 3.22 Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR1 93

Bảng 3.23 Thành phần hóa chất của ống dung dịch CR2 94

Bảng 3.24 Kết quả đánh giá hoạt động 02 dạng đóng gói 95

Bảng 3.25.Thành phần bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C.neoformans 96

Bảng 3.26 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên mẫu C neoformans chuẩn 98

Bảng 3.27 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu chuẩn 98

Bảng 3.28 Kết quả đánh giá tính ổn định của bộ sinh phẩm 99

Bảng 3.29 Kết quả phản ứng nested PCR với các mẫu DNT giả định 100

Bảng 3.30 Kết quả đánh giá của trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ 105CFU/ ml 100

Bảng 3.31 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ 102CFU/ ml 101

Bảng 3.32 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các mẫu nhiễm giả định nồng độ từ 102CFU/ ml trở lên 102

Bảng 3.33 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các chủng C.neoformans

phân lập ở Việt Nam 102Bảng 3.34 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm trên các

chủng C neoformans phân lập ở Việt Nam 103

Bảng 3.35 Kết quả thử nghiệm bộ sinh phẩm trên các mẫu DNT của bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng VMN 104Bảng 3.36 Độ nhạy, độ đặc hiệu so với phương pháp nuôi cấy 105Bảng 3.37 Độ tương đồng so với phương pháp soi tươi nhuộm mực tàu 106Bảng 3.38 Độ tương đồng so với bộ sinh phẩm của Norgen 107Bảng 3.39 Tóm tắt tiêu chuẩn cơ sở 107

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm não, màng não là tình trạng nhiễm trùng thần kinh trung ương gây ra bởi các căn nguyên khác nhau như vi khuẩn, virus, vi nấm hoặc ký sinh trùng Trong một số trường hợp biểu hiện lâm sàng của viêm não, màng não

do các căn nguyên khác nhau khá giống nhau nên dựa vào lâm sàng khó phân biệt Do vậy, để xác định căn nguyên gây viêm não, màng não cần phải dựa vào các xét nghiệm cận lâm sàng [1],[2],[3]

Trong số các loài vi nấm gây viêm não màng não, nấm Cryptococcus neoformans được xác định là loài gây viêm màng não phổ biến nhất, đặc biệt

là ở bệnh nhân HIV/AIDS, ung thư, bệnh nhân suy kiệt ,[4],[5],[6] Theo

nghiên cứu của Safdieh.J.E và cs (2008) về nguyên nhân gây viêm não, màng

não ở bệnh nhân ung thư cho thấy: viêm màng não do Cryptococcus chiếm

7%, viêm màng não do vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất với > 75%[5] Ở Việt Nam, điều tra nhiễm trùng cơ hội trên 100 bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TP Hồ Chí Minh năm 2000 của Louie JK và cs (2004)

cho thấy, nhiễm nấm C neoformans ở dịch não tủy chiếm khoảng 9%[6] Bệnh do nấm Cryptococcus là nguyên nhân nhiễm trùng gây tử vong xếp

hàng thứ tư ở những bệnh nhân AIDS và khoảng 1/3 bệnh nhân AIDS có mắc bệnh này [7]

Trên lâm sàng, biểu hiện viêm màng não do nấm C neoformans rất

giống với các căn nguyên vi sinh vật khác Ngoài ra, cũng giống như các vi

nấm gây bệnh khác,viêm màng não do C neoformans thường được nghĩ tới

sau các căn nguyên khác nên thường chẩn đoán muộn, khi các triệu chứng đã

trở nên trầm trọng [10],[11] Trong khi, viêm màng não do nấm C neoformans

là một bệnh nguy hiểm, tiến triển nhanh, nếu không được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời có thể để lại di chứng trầm trọng có khi tử vong nhanh[4],[8] Chẩn đoán muộn, chẩn đoán nhầm, lựa chọn thuốc không đúng chính là

những nguyên nhân khiến bệnh nhân phải chịu những tổn hại nặng nề về cả sức khỏe lẫn kinh tế [9]

Các biện pháp truyền thống như soi tươi cho kết quả nhanh nhưng độ nhạy thấp và dương tính giả có thể xảy ra [8], nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán nhiễm nấm nhưng phải mất ít nhất 2 ngày mới có kết quả và tỷ lệ nuôi cấy dương tính cũng chỉ khoảng 70-90% [8] Nuôi cấy thường cho kết quả âm tính nếu bệnh nhân trước đó sử dụng thuốc chống nấm [4],[13],[14] Kỹ thuật miễn dịch có độ nhạy, độ đặc hiệu cao ≥ 90% [9], nhưng cũng dễ có phản ứng dương tính giả và chưa phổ biến ở Việt Nam Các

kỹ thuật sinh học phân tử với thời gian chẩn đoán nhanh và cùng lúc phát hiện được nhiều mầm bệnh đang được nhiều tác giả nghiên cứu Các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép xác định căn nguyên gây bệnh ngay cả khi kết quả soi tươi, nuôi cấy âm tính, đặc biệt trong trường hợp trước đó bệnh nhân sử dụng kháng sinh, kháng nấm [10], [11], [12]

Trong các kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phản ứng PCR, nested – PCR là một trong những kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhất, do đó chúng tôi lựa

chọn tiến hành đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ

sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C neoformans trong dịch

não tủy"

Với 02 mục tiêu:

1 Xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR

chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy

2 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm được

tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm Cryptococcus neoformans

Giống nấm Cryptococcus có khoảng hơn 70 loài được định loại dựa vào hình thái nhưng loài gây bệnh chủ yếu là C neoformans chiếm 80% [13], [14] Bệnh do nấm C neoformans gây ra gọi là Cryptococcosis Triệu chứng

bệnh được Zenker miêu tả đầu tiên năm 1861, nhưng đến năm 1864, hai nhà

bác học Busse và Buschkle người Đức đã phân lập và nuôi cấy được nấm C neoformans từ bệnh nhân có triệu chứng giống như đã được Zenker miêu tả [18],[20],[21] Ngoài C neoformans, loài C albidus và C laurentii cũng có

khả năng gây bệnh nhưng ít gặp [14]

Trước đây, người ta cho rằng nấm C neoformans có 2 phân loài, đó là C neoformans var neoformans (gồm các tuýp huyết thanh A, D, AD) và C neoformans var gattii (gồm các tuýp B, C) Hiện nay, người ta đã khẳng định

có 3 phân giống C neoformans: grubii (tuýp A), gattii (tuýp B, C) và neoformans (tuýp D) [15] Trong đó C neoformans var gattii được cho là một loài riêng biệt gây bệnh ở những người bình thường với tên là C Bacillisporus [23], [24], [25] Nấm C neoformans var neoformans còn được gọi là Filobasidiella neoformans [16]

1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm C neoformans

1.1.1.1 Đặc điểm hình thể

C neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được

bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước nang thay đổi từ 2-40µm

Hình 1.1 Nấm C neoformans nhuộm mực tàu, quan sát dưới kính hiển vi

(Nguồ n: Day J.N, 2013)

1.1.1.2 Môi trường sống

Giống nấm Cryptococcus tồn tại trong môi trường tự do được Kutzing đặt tên năm 1833, mẫu phân lập được từ bụi kính cửa sổ

C neoformans là sinh vật sống hoại sinh, ngoài cơ thể vật chủ, có thể

sống tự do bên ngoài môi trường Nấm phân bố toàn cầu có thể tìm thấy trong chất thải của gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến Trong các hang động, nước trái cây lên men, sữa, đường ruột của một số động vật ăn cỏ, trên cơ thể dơi, gián, trong đất và các hốc cây khác nhau Nấm còn được tìm thấy trong thân gỗ mục của một số loài cây như: cây bạch đàn, cây cao su màu đỏ [13], [17], [18]

1.1.1.3 Tính chất nuôi cấy

Khinghiên cứu nuôi cấy, phân lập, nấm C neoformans có thể mọc trên

thạch Sabouraud dextrose, thạch máu cừu, thạch chocolate và các môi trường khác ở nhiệt độ từ 20-370C Ở nhiệt độ này nấm bắt đầu mọc trong vòng khoảng

72 giờ, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 300C [19] C neoformans

phát triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5 % CO2, pH hơi kiềm và một lượng nhỏ chất sắt [20]

Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm C neoformans mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem,

đường kính có thể đến vài milimet [20]

Hình 1.2 Khuẩn lạc C neoformans trên môi trường thạch Sabouraud

(Nguồ n: trong nghiên cứu này, 2014) Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ thẩm thấu, nồng độ CO2, độ pH ảnh hưởng tới sự phát triển của các bao ngoài… [21] Nhiệt độ cao từ 39 - 400C hoặc quá thấp ức chế sự tăng trưởng của nấm Nồng độ CO2 ở mức sinh lý làm tăng tổng hợp và kích thước bao ngoài, nồng độ CO2 cao các nang chỉ có kích thước nhỏ Môi trường có độ thẩm thấu cao (chứa glucose 16% hoặc NaCl

2,9%), hoặc pH acid sẽ làm giảm sản xuất các bao nang

1.1.2 Vai trò y học

1.1.2.1 Trên động vật

Nấm C neoformans có khả năng gây bệnh ở động vật, năm 1895 Sanfelice lần đầu tiên đã phát hiện và nuôi cấy được nấm C neoformans từ hệ bạch huyết của bò [13] Năm 1902, Frothingham đã phân lập được nấm C neoformans từ tổn thương trên phổi của ngựa tại Massachuset, Anh

Cùng với ghi nhận của Busse và Buschkle, các tác giả trên đã khẳng

định nấm C neoformans có khả năng gây bệnh cả ở trên người và động vật

Những nghiên cứu hiện nay chỉ ra C neoformans có thể gă ̣p ở mèo,

chó , thỏ, linh trưởng, chuô ̣t và mô ̣t số loa ̣i chim

Ở động vật có vú, bê ̣nh do C neoformans thường liên quan đến tình

trạng suy giảm miễn dịch như: mèo bị nhiễm một loại virus tương tự retrovirus, chuột thí nghiệm bi ̣ gây thiếu hu ̣t miễn di ̣ch… Ở chim bồ câu và

các loài chim thường ít bi ̣ mắc bê ̣nh do C neoformans do nhiệt độ cơ thể của

chim cao 41°C–42°C Tuy nhiên, ngườ i ta có thể tìm thấy tế bào nấm trong phân chim [13], [22]

1.1.2.2 Bệnh trên người

Do tế bào nấm C neoformans có thể có mặt trong không khí, trong đất và

trong phân gia cầm nên người rất dễ bi ̣ nhiễm loa ̣i nấm này khi hít vào qua đường

hô hấp Tuy nhiên, không phải cơ thể nào bi ̣ nhiễm cũng biểu hiê ̣n thành bê ̣nh mà

bệnh thường biểu hiê ̣n ở những cơ thể có hê ̣ thống miễn di ̣ch bi ̣ tổn thương như bệnh nhân AIDS, phải dùng các thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, ghép tạng, ghép tủy xương Mức độ nặng của các triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng suy giảm miễn dịch của cơ thể người nhiễm [3], [13], [15], [22]

- Bệnh gây tổn thương ở hệ thần kinh

- Viêm màng não: Đây là bệnh thường gặp nhất Bệnh thường diễn biến

từ từ, các biểu hiện lâm sàng điển hình bao gồm:

+ Đau đầu, sốt, nôn, rối loạn hành vi, rối loạn cảm giác, đau và cứng gáy [23],[24],[25]

+ Rối loạn tâm thần bao gồm: mất phương hướng, lú lẫn, thay đổi nhân cách, mất trí nhớ, loạn thần, trạng thái sững sờ và hôn mê [23], [24]

+ Các triệu chứng ít gặp hơn bao gồm: mất điều hòa, mất phản xạ, triệu chứng của tổn thương bó tháp, thất ngôn, chứng loạn vận ngôn và động kinh

+ Các triệu chứng về mắt thường gặp là phù gai thị các triệu chứng không phổ biến như nhìn mờ, song thị, sợ ánh sáng và đau sau nhãn cầu, có thể mù [23], [24]

- Viêm màng não - não: Ít gặp, bệnh tiến triển nhanh, thường tiến tới hôn mê và tử vong trong thời gian ngắn, đáp ứng kém với điều trị

- U nấm trong não: Hiếm gặp, các tổn thương giả u rắn, khu trú Triệu chứng giống khối phát triển trong não

Hình 1.3.Tổn thương não do C neoformans

(Nguồ n: British Journal of Radiology, 2009)

A- Tổn thương não do C neoformans trên CT sọ não

B-Tổn thương não do C neoformans trên MRI sọ não

- Bệnh gây tổn thương ở phổi

Đường xâm nhập chính của nấm vào cơ thể vật chủ là qua đường hô hấp, do người bệnh hít phải các bào tử nấm phát tán trong không khí Viêm

phổi do nấm C neoformans có các triệu chứng: Ho, đau ngực, khạc đờm, sút

cân, sốt và ho ra máu [25] Các triệu chứng khác hiếm thấy như khó thở, ra

mồ hôi ban đêm, cản trở gây ứ trệ tĩnh mạch chủ trên

Hình ảnh X-quang của viêm phối do nấm C neoformans: Tổn thương

điển hình là một hoặc nhiều nốt, không canci hóa, thâm nhiễm rốn phổi hoặc trung thất, thỉnh thoảng có tràn dịch màng phổi và đôi khi tạo hang Thăm khám thường không đặc hiệu nhưng đôi khi có thể thấy thở nhanh, phổi có ran, hạch to, lách to…[22]

A B

Hình 1.4 Hình ảnh tổn thương phổi do C neoformans

(Nguồ n: George R Robinson, 1995)

A Tổn thương phổi do nấm C neoformans trên phim X-quang phổi

B Tổn thương phổi do nấm C neoformans trên CT phổi

- Bệnh gây tổn thương ở da

+ Tổn thương nguyên phát: Loét, viêm mô tế bào [26]

+ Tổn thương thứ phát: thường xuất hiện ở đầu, cổ dưới dạng sẩn, cục, mảng loét, áp xe, tổn thương dạng herpet, u mềm lây hoặc u Kaposi [26], [27]

Hình 1.5 Tổn thương da do nấm C neoformans

(Nguồn: Hari Kishan Kumar Yadalla và cs, 2011) [27]

- Bệnh gây tổn thương ở các cơ quan khác:

+ Tổn thương xương: Tổn thương hủy xương, không có phản ứng màng xương,

đau mơ hồ khi vận động, đôi khi có thể viêm khớp nhất là khớp gối [24]

+ Hệ tiết niệu: C neoformans thường phân lập được ở nước tiểu bệnh

nhân bị bệnh lan tràn, đôi khi có dấu hiệu của viêm bể thận, viêm tiền liệt tuyến [24], [26]

+ Tổn thương cơ quan khác: ở vỏ thượng thận, viêm nội tâm mạc, viêm gan, viêm xoang, tổn thương thực quản [24], [26]

1.1.3 Tình hình viêm màng não do nấm C neoformans ở trên thế giới và

Việt Nam

Viêm màng não do nấm C neoformans là một trong những nhiễm trùng

cơ hội quan trọng nhất ở bệnh nhân AIDS Ở những nước có tỉ lệ nhiễm

HIV/AIDS cao, C neoformans là nguyên nhân phổ biến gây viêm màng não,

thường xuyên hơn cả phế cầu, não mô cầu [13], [28]

Ca bệnh viêm màng não do nấm C neoformans đầu tiên trên thế giới

được mô tả vào năm 1905 bởi Von Hansemann khi phát hiện nấm men trong các nang galentin ở não [13]

Như vậy khả năng xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương và gây bệnh

của C neoformans đã được đề tập từ những năm đầu của thế kỷ 20, nhưng nó

đòi hỏi người bác sỹ phải có nhiều năm kinh nghiệm lâm sàng để đánh giá mức độ thực sự xu hướng của bệnh

1.1.3.1 Viêm màng não do nấm C neoformans ở trên thế giới

Năm 1956, Littman và Zimmerman đã xuất bản sách chuyên khảo về

bệnh viêm màng não do nấm C neoformans gây ra với những hiểu biết về đặc

điểm lâm sàng, con đường truyền bệnh sau nửa thế kỷ bệnh được phát hiện Tại thời điểm đó trên toàn thế giới chỉ ghi nhận 300 trường hợp mắc bệnh Trong những năm 1970, cùng với việc sử dụng rộng rãi các thuốc ức chế miễn

dịch trong điều trị bệnh đã làm cho tỷ lệ bệnh này tăng lên nhiều Riêng trong năm 1976, ở Mỹ đã có 338 trường hợp bị mắc bệnh Đặc biệt sau những năm

1980, tỷ lệ Cryptococcosis tăng mạnh cùng với việc xuất hiện của bệnh AIDS

và được xem là yếu tố nguy cơ hàng đầu [13]

Từ cuối những năm 1970 đến đầu những năm 1980, người ta đã chứng

kiến một sự gia tăng mạnh các trường hợp nhiễm nấm C neoformans tại

Kinshasa và ở những người Zairian nhập cư tại Châu Âu

Khi dịch HIV phát triển vào những năm 1980, nhiễm nấm C neoformans

nổi lên như một nhiễm trùng cơ hội quan trọng tại Mỹ, châu Âu và châu Úc, chiếm 5-10% số bệnh nhân AIDS Theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới,

viêm màng não do nấm C neoformans là bệnh chỉ điểm của AIDS Trước khi

có điều trị bằng ARV, thời gian sống trung bình của một bệnh nhân bị viêm

màng não do nấm C.neoformans chỉ khoảng 9 tháng Tỉ lệ nhiễm trùng giảm

đi ở thập niên 1990 do việc điều trị diện rộng nấm Candida (liên quan đến việc sử dụng các thuốc chống nấm, đặc biệt là fluconazole) và do sự phát triển của liệu pháp kháng retrovirus hiệu lực cao Tỉ lệ bệnh hàng năm trong những bệnh nhân AIDS đã giảm từ 66/1000 (1992) xuống còn 7/1000 ( 2000)

Hiện nay, viêm màng não do nấm C neoformans trên bệnh nhân

HIV/AIDS vẫn còn là vấn đề ở các nước phương Tây trong giai đoạn cuối của nhiễm HIV Tại miền Nam và miền Trung châu Phi nhất là vùng sa mạc cận Sahara [9, 29, 30] Ngoài việc là nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não, ở khu vực châu Phi cận Sahara, nó chiếm 13-44% tổng số ca tử vong liên quan

đến AIDS Và tỷ lệ tử vong do C neoformans với tỷ lệ tử vong cao tới 50-

70% [31]

Tại Thái Lan, tỉ lệ nhiễm C neoformans lên tới 20% ở các bệnh nhân

AIDS [46]

Theo kết quả một loạt các nghiên cứu của Park và cs (2009) nhằm ước

tính về gánh nặng của viêm màng não do nấm C neoformans ở bệnh nhân

HIV/AIDS trên toàn cầu đã cho thấy tỉ lệ mắc thay đổi từ 0,04-12% mỗi năm Các nghiên cứu ở một số vùng như Đông Âu, Trung Á, Bắc Phi và Trung Đông được coi là có tỉ lệ tương tự nhau (1,7% mỗi năm) Vùng biển Caribbean và Mỹ Latin có tỉ lệ khoảng 3,4% mỗi năm Dựa vào các tỉ lệ đó người ta cũng dự tính được trên toàn cầu hàng năm có khoảng 957.900 trường hợp nhiễm bệnh (thay đổi từ 371.700 - 1.54 triệu) Khu vực có số mắc cao nhất là khu vực châu Phi cận Sahara, khoảng 720.000 trường hợp (thay đổi từ 144.000 - 1.3 triệu) Vùng Nam và Đông Nam Á là 120.000 (từ 24.000 - 216.000) Các vùng như châu Đại Dương (100 trường hợp), Tây và Trung Âu (500 trường hợp), Bắc Phi và Trung Đông (6.500 trường hợp), Bắc Mỹ (7.800 trường hợp) được coi là những vùng có tỉ lệ mắc ít nhất [30]

Người ta cũng ước tính rằng có khoảng 624.725 ca (từ

124.956-1.124.494) tử vong bởi viêm màng não do nấm C neoformans [30] Châu Đại

Dương được ước tính là có ít nhất (9 ca tử vong) trong khi khu vực châu Phi cận Sahara nhiều nhất (504.000 ca (từ 100.800 - 907.200)) [30]

Theo Rajasingham và cs, (2017) Mặc dù đã được điều trị bằng thuốc chống nấm, nhưng năm 2007 ước tính có đến 223.100 trường hợp viêm màng não do cryptococcus và 181.100 ca tử vong do bệnh này trên toàn thế giới [32], [33]

Hầu hết các trường hợp gây viêm màng não ở bệnh nhân HIV/AIDS

liên quan đến Cryptococcus neoformans var grubii (typ A),trong khi Cryptococcus neoformans var neoformans (typ D) gây bệnh ở châu Âu, và

C neoformans var gatti (typ B, C) là nguyên nhân của một số nhỏ các trường

hợp viêm màng não ở bệnh nhân HIV/AIDS [13], [34], [35] Khoảng 80 %

các nhiễm trùng do C neoformans ở bệnh nhân AIDS là do các typ A và D,

typ B và C chủ yếu gây bệnh ở những cá nhân có hệ miễn dịch đầy đủ nhưng gần đây cũng đã được báo cáo thấy ở bệnh nhân AIDS [13]

1.1.3.2 Viêm màng não do nấm C neoformans ở Việt Nam

Ở Việt Nam, chưa có con số thống kê rõ ràng về tình hình viêm màng

não do nấm C neformans của bệnh nhân AIDS trên cả nước

Năm 1928, tại BV Bệnh Nhiệt Đới có 1 ca nhiễm C neoformans đầu

tiên được báo cáo với biểu hiện viêm màng não; theo thống kê của các bác sĩ Khoa Giải Phẫu Bệnh, BV Chợ Rẫy từ tháng 4/1999 đến tháng 10/2001 tỷ lệ

nhiễm nấm Cryptococcus spp là 5% (2/40 ca) Tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới vào năm 2003, viêm màng não nấm do C neoformans chiếm 12,2%, từ 4/2004 - 4/2005 đã thu thập 147 ca nhiễm C neoformans ở hệ thần kinh trung

ương đi kèm với HIV/AIDS Qua hồi cứu 151 trường hợp bệnh viêm màng não trên bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS tại BV Bệnh Nhiệt Đới có 98% nhiễm

Thực tế tình hình nhiễm nấm nội tạng ở bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện Nhiệt đới Tp HCM năm 2003 có 155/376 ca, năm 2004 có 203/444 ca và 8 tháng đầu năm 2005 có 156/320 ca nhiễm nấm ở hệ thần kinh trung ương, từ

11/2008 đến 6/2009 có 98 trường hợp viêm não, màng não do C neoformans

tại Bệnh viện Nhiệt đới Tp.HCM [36]

Nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn và nấm gây viêm màng não tại bệnh

viện Bạch Mai từ năm 2008 đến 2010 Tỷ lệ mắc viêm màng não do C

neoformans ở bệnh nhân HIV chiếm tỷ lệ 71,4%, ở bệnh nhân không nhiễm

HIV chiếm 28,6%

Theo Lê Tự Phương Thảo, nghiên cứu bệnh nhân HIV/AIDS viêm

màng não điều trị tại BV Bệnh Nhiệt Đới TP Hồ Chí Minh từ 12/2010 đến

7/2011 Trong 450 mẫu cấy từ bệnh phẩm dịch não tủy (DNT, Cerebrospinal

Fluid - CSF) thì có 74/450 ca (chiếm 16,4%) nhiễm C neoformans

Năm 2015, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương ghi nhận có trường

hợp bệnh nhân nữ 35 tuổi không nhiễm HIV viêm màng não do nấm

C neoformans

1.2 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm Cryptococcus neoformans

Như phần trên ta đã thấy viêm màng não do nấm C neoformans là căn

nguyên gây tử vong ước tính đến hơn 600.000 người chết mỗi năm [28], [30]

Ở Châu Phi, viêm màng não do Cryptococcus chiếm 13% đến 42% tổng số ca

tử vong trong số những người nhiễm HIV [30] Một nghiên cứu được thực

hiện tại Cameroon cho thấy 42,2% bệnh nhân viêm màng não do

Cryptococcus đã chết trước 21 ngày sau khi chẩn đoán [37] Do đó việc chẩn

đoán sớm, chính xác và được điều trị kịp là một yêu cầu bức thiết

Bệnh phẩm để chấn đoán nhiễm nấm C neoformans phụ thuộc vào vị

trí nấm ký sinh Bệnh phẩm có thể là máu, dịch não tủy, đờm, dịch soi phế

quản, nước tiểu, mảnh mô bị tổn thương, chất hút từ tổn thương da, chất cạo,

mảnh sinh thiết mô bị tổn thương, dịch khớp, dịch màng tim v.v

Với nghiên cứu để chẩn đoán viêm màng não do C neoformans bệnh

phẩm được sử dụng để chẩn đoán là dịch não tủy

1.2.1 Chẩn đoán trực tiếp

1.2.1.1 Soi phát hiện nang nấm dưới kính hiển vi

Có thể phát hiện nang polysaccharide của nấm Cryptococcus trong mẫu xét nghiệm nước tiểu não, nước tiểu, đờm, mô hoặc các vật liệu bị nhiễm khác bằng cách nhuộm mực tàu hoặc các chế phẩm than keo và soi kiểm tra dưới

kính hiển vi Kết quả quan sát cho hình ảnh nấm C neoformans là những tế

bào nấm men, hình cầu hoặc hình bầu dục, bao quanh là một lớp vỏ dày Độ dày của lớp vỏ rất thay đổi Nhuộm soi là phương pháp đơn giản nhất cho chẩn đoán tìm nấm trong dịch não tủy

Ưu điểm của phương pháp nhuộm mực tàu là kỹ thuật thực hiện đơn giản, thời gian thực hiện nhanh, chỉ mất một vài phút Nhược điểm là độ nhạy kém Độ nhạy của phương pháp nhuộm mực tàu trong chẩn đoán Cryptococcus viêm màng não ở bệnh nhân không nhiễm HIV là xấp xỉ 30 đến 72% so với nuôi cấy Độ nhạy trong chẩn đoán bệnh ở bệnh nhân nhiễm HIV

là dưới 86% Độ nhạy giảm xuốngchỉ còn42% khi thực hiện với các mẫu bệnh phẩm có mật độ < 1000 CFU/mL [38] Giới hạn phát hiện của phương pháp này khoảng 103 đến 104 tế bào nấm/ml dịch não tủy [22], [38] Độ nhạy có thể được tăng lên khi ly tâm dịch não tủy trước khi tiến hành làm tiêu bản và nhuộm mực tàu

Với các lát cắt sinh thiết mô để phát hiện nấm Cryptococcus thường sử dụng các chất nhuộm PAS, HE, hoặc mucicarmine

1.2.1.2 Nuôi cấy phát hiện nấm trên môi trường chọn lọc

Nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán viêm màng não do Cryptococcus, nhưng phương pháp này có một số nhược điểm Các phương pháp nuôi cấy nấm đòi hỏi cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm, điện, và kỹ thuật viên được đào tạo bài bản [39] Nuôi cấy cần 7 ngày để nấm phát triển và ủ lên đến 10 ngày để có được số liệu đáng tin cậy Các phương pháp nuôi cấy

cũng có thể tạo ra kết quả âm tính giả khi mật độ nấm thấp, hiệu suất chẩn đoán có thể được cải thiện bằng cách sử dụng lượng dịch não tủy cao hơn Sử dụng 100 μL dịch não tủy không pha loãng so với 10 μl pha loãng ở tỷ lệ 1:10

đã làm tăng độ nhạy từ 82,4% đến 94,2%, với mức tối thiểu đơn vị khuẩn lạc CFU cần thiết cho sự tăng trưởng giảm từ 100 xuống còn 10 CFU/ml [38]

Nuôi cấy có thể được thực hiện trên nhiều môi trường khác nhau nhưng phổ biến nhất là môi trường thạch Sabouraud dextrose; hoặc thạch máu, ngày nay thạch khác như thạch ớt đỏ (Ground red hot Pepper agar - GRHP) hay thạch GACA (Giuzotia abyssinica Creatinin agra) cũng được sử dụng thường quy để nuôi cấy máu

Các bệnh phẩm máu hoặc dịch não tủy được cấy trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 300C, đọc kết quả hàng ngày cho đến 14 ngày [19], [38] Nấm mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu kem Cấy máu có độ nhạy tới hơn 70% ở các trường hợp bệnh nhân AIDS

Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy khác nhau phụ thuộc vào cách thức tiến hành xử lý trước khi nuôi cấy

Bảng 1.1 Ngưỡng phát hiện của phương pháp nuôi cấy với các cách xử lý

1.2.2 Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên

Sử dụng kháng thể để phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide của nấm trong dịch não tủy được coi là xét nghiệm nhanh có giá trị nhất trong chẩn đoán nấm tại phòng xét nghiệm Việc phát hiện kháng nguyên cryptococcus (CrAg) trong dịch não tủy, huyết thanh hoặc huyết tương đã trở thành một công cụ chẩn đoán thiết yếu để chẩn đoán viêm màng não

do C neoformans hoặc bất kỳ triệu chứng thần kinh trung ương (CNS)

[38] Có rất nhiều phương pháp xét nghiệm để phát hiện CrAg đã được xây dựng và thương mại hóa trên thị trường như các bộ sinh phẩm ELISA, ngưng kết latex Gần đây sự phát triển của các test miễn dịch dòng chảy CrAg (như LFA; Immy Inc., Norman, OK ) đã tạo ra một cuộc cách mạng trong chẩn đoán viêm màng não do Cryptococcus

Độ nhạy của phương pháp này là cao nhất khi xét nghiệm trên mẫu dịch não tủy, đặc biệt là mẫu dịch não tủy của các bệnh nhân nhiễm HIV

Hầu hết các bệnh nhân HIV có nhiễm C neoformans đều có phản ứng

dương tính khi xét nghiệm miễn dịch bằng dịch não tủy [38] Tuy nhiên tỷ lệ này chỉ đạt 60% ở các bệnh nhân nhiễm nẫm không có HIV

Những phương pháp xét nghiệm miễn dịch học thông thường có: Thử nghiệm đông kết latex (Latex agglutination assay - LAT); thử nghiệm miễn dịch enzym (enzym immunoassay – IEA), thử nghiệm miễn dịch dòng chảy (Lateral Flow Assay - LFA)

1.2.2.1 Thử nghiệm ngưng kết latex (LAT)

LAT là thử nghiệm miễn dịch thông dụng nhất để xác định C neoformans Đây là một xét nghiệm nhanh, dễ tiến hành, có thể phát hiện

được tất cả các dạng miễn dịch khác nhau Một số bộ sinh phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường có độ nhạy từ 90-100% và độ đặc hiệu 97-100% so với phương pháp nuôi cấy và chẩn đoán lâm sàng Ngưỡng phát hiện

của hầu hết các bộ sinh phẩm đã được thương mại là khoảng 10 ng polysaccharide/mL Phương pháp này có tỷ lệ dương tính giả khoảng 2-5%;

và có tỷ lệ âm tính giả khá cao đối với các trường hợp có tỷ lệ nhiễm thấp hoặc nhiễm phối hợp nhiều loại nấm khác nhau [40]

1.2.2.2 Thử nghiệm miễn dịch enzym (EIA)

Thử nghiệm theo phương pháp này đắt hơn LAT, yêu cầu có máy đọc, tuy nhiên độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với LAT, có thể phát hiện nhiễm nấm ở giai đoạn sớm hơn Độ nhạy của EIA so với LAT ở các chủng serum dạng A và B có thể lên tới 12 lần, và tương đương ở các chủng serum dạng C và D Độ tương đồng giữa 2 phương pháp này khoảng 92-98% Cũng tương tự như LAT, EIA cũng có tỷ lệ dương tính giả nhất định

1.2.2.3 Thử nghiệm miễn dịch dòng chảy (LFA)

LFA xuất hiện trong vòng 5 năm trở lại đây và được coi là một cuộc cách mạng cho chẩn đoán nấm Không giống như LAT và EIA có sinh phẩm của thử nghiệm: LFA ổn định ở nhiệt độ môi trường, không cần bảo quản lạnh, không cần các hóa chất, trang thiết bị đắt tiền, thời gian thực hiện phản ứng nhanh trong vòng 15 phút là có kết quả CrAg LFA cũng có độ nhạy cao hơn so với LAT và EIA và độ đặc hiệu cao hơn ở những trường hợp nồng độ kháng thể thấp Thử nghiệm tại Uganda và Nam Phi chỉ ra CrAg LFA có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 99,3% và 99,1% trong DNT [38]

1.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Trong hai thập kỷ qua, vô số kỹ thuật phân tử đã được khám phá để phát hiện nấm gây bệnh Nhiều kỹ thuật này, so với các kỹ thuật cổ điển, độ nhạy và

độ đặc hiệu cao xác định đặc điểm của phức hệ loài C neoformans [41]

Sinh học phân tử là một trong những công cụ chẩn đoán bệnh với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian chẩn đoán nhanh Các kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao do việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng nghiên

cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một lượng rất nhỏ (vài picrogam) ADN cũng

có thể cho kết quả chẩn đoán

1.2.3.1 Kỹ thuật PCR cơ bản (conventinal PCR)

Mitchell và cs (1994) là những người đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR

để định loại nấm C.neoformans [42] Prariayachatigul và cs (1996) đã sử dụng

kỹ thuật PCR để định loại nấm này dựa trên trình tự gen đích 18S với ngưỡng phát hiện 5 tế bào/mL dịch não tủy [43] Mirhendi và cs (2001), đã sử dụng

kỹ thuật này để phát hiện nấm C.neoformans dựa trên cơ sở gen CAP59 [44] Paschoal và cs (2004) sử dụng kỹ thuật này để xác định nhiễm nấm C neoformans trong dịch não tủy So với nuôi cấy và soi tươi nhuộm mực tàu,

kỹ thuật này có độ nhạy nhất (92,9% so với 85,7% và 76,8%) [45] Một số sử dụng kỹ thuật này với các cặp mồi đặc hiệu để xác định các serotype hay

genotype của nấm C.neoformans [46]

Kỹ thuật này dễ thực hiện, nhanh nhưng cũng có những nhược điểm nhất định như chỉ phát hiện được một nầm bệnh cùng lúc, nồng độ giới hạn phát hiện cao hơn so với các kỹ thuật PCR lồng (nested PCR)… Những trình

tự gen đích thường được sử dụng để xây dựng cặp mồi là: URA 5, CAP59, ITS, 18S, 5.8S, 28S [39]

1.2.3.2 Kỹ thuật PCR lồng (còn gọi là PCR tổ, nested-PCR, PCR hai vòng)

Trong PCR lồng có hai cặp mồi được thiết kế cho 2 lần phản ứng Sản phẩm khuếch đại của lần phản ứng thứ nhất (PCR1) sẽ được dùng làm khuôn cho lần phản ứng thứ 2 (PCR2) [47], [48] Với cách thiết kế các cặp mồi, sản phẩm sau 2 lần phản ứng là rất đặc hiệu cho một loại mầm bệnh Ngoài ra, do thực hiện hai lần khuếch đại gen nên số lượng đoạn DNA tạo ra sau khi kết thúc phản ứng thứ hai lớn hơn nhiều so với PCR thường Chính vì vậy, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật nested-PCR rất cao, có khi lên đến 100% [40], [48], [49]

Trong số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì PCR lồng được sử

dụng nhiều nhất để phân biệt C.neoformans và C Gattii Theo Shahindokht

Bassiri Jahromi (2006) và Paola Rappelli (1998) ngưỡng phát hiện nấm

C.neoformans trong dịch não tủy là trên 102 tế bào nấm/ml [48], [50]

Bên cạnh những ưu điểm, kỹ thuật nested-PCR có nhược điểm là chỉ xác định được duy nhất một loại mầm bệnh trong lần phân tích Ngoài ra, do thực hiện hai lần chạy PCR để phân tích mẫu nên có thể có nguy cơ bị nhiễm trong các lần tạo hỗn hợp chạy PCR, điều này có thể dẫn tới dương tính giả [48], [51]

1.2.3.3 Kỹ thuật PCR-RFLP (Đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn)

Kỹ thuật này được tiến hành với 2 bước Bước 1 tiến hành phản ứng PCR, bước 2 cắt sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR bằng các enzyme giới hạn Đối với việc xác định loài, cặp mồi thiết kế cho phản ứng PCR thường đại diện cho một giống, hoặc phân giống sinh vật do vậy chưa đủ cơ

sở để xác định, phân biệt nhiều loài với nhau Dựa vào sự khác biệt về trình tự nucleotite của các loài khác nhau, sử dụng các enzymne giới hạn đặc hiệu để cắt sản phẩm PCR thành các đoạn có kích thước khác nhau, là cơ sở để phân biệt các loài [44], [52] SH Mirhendi và cs, (2001) đã nghiên cứu ứng dụng

kỹ thuật RFLP-PCR xác định, phân biệt một số nấm men Candida spp., nấm Aspergillus và nấm C.neoformans gây bệnh ở người, hoặc trong xác định các

subtype, kiểu gen (genotype), kiểu huyết thanh (serotype) của nấm

C.neoformans … [44], [53]

Ở trong nước, một số tác giả đã ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác

định nấm C.neoformans hoặc phân biệt C.neoformans với một số nấm men

phân lập từ người Đỗ Ngọc Ánh và cs, (2015) áp dụng kỹ thuật này để xác

định sự có mặt của nấm C neoformans và Candida spp trong dịch não tủy,

có so sánh với kỹ thuật nuôi cấy [54] Kết quả cho thấy, so với nuôi cấy

RFLP-PCR có độ nhạy 70%, độ đặc hiệu 97,5% Chỉ số Kappa về mức độ phù hợp chẩn đoán so với nuôi cấy là 0,70 [54], [55]

Kỹ thuật này có nhược điểm là muốn nhìn rõ kết quả cắt giới hạn khi điện di thì sản phẩm PCR thu được phải nhiều Trường hợp số lượng sản phẩm PCR ít (trên band điện di mờ) thì có thể không nhìn thấy sản phẩm cắt giới hạn khi chụp hình sản phẩm điện di Ngoài ra, vị trí cắt giới hạn bằng enzyme có thể có biến đổi đa hình, xuất hiện một hoặc một vài nucleotide thay thế làm cho enzyme không cắt giới hạn được dẫn tới kết quả phân tích trở nên sai khác [44], [52], [56]

1.2.3.4 Kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex-PCR)

Đây là kỹ thuật sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại ADN nhằm phát hiện nhiều mầm bệnh trong một lần phản ứng Kỹ thuật này có ưu điểm là giới hạn chẩn đoán nhanh, cùng lúc xác định được sự có mặt của một hoặc nhiều mầm bệnh [57], [58] Tuy nhiên, việc thiết kế để có được cặp mồi

có cùng nhiệt độ gắn mồi dùng cho PCR đa mồi khó Có nhiều nghiên cứu đã

áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán vi nấm gây bệnh nói chung và các nấm Cryptococcus nói riêng [57], [58], [59] Vivians và cs, (2007) sử dụng 2 phản ứng PCR để xác định trực tiếp 6 loại nấm gây bệnh từ môi trường nuôi cấy

tăng sinh, trong đó có nấm C.neoformans Tác giả này cho rằng, đây là kỹ

thuật có ưu điểm nhanh, đơn giản, tin cậy và có thể thay thế cho phương pháp định danh truyền thống bằng nuôi cấy, thử nghiệm sinh hóa Leal AL và cs,

(2008) đã ứng dụng kỹ thuật multiplex-PCR để xác định và phân biệt 2 loài C neoformans và C gattii [59] Theo Leal AL và cs, (2008) có 131 mẫu được

phân tích bằng kỹ thuật multiplex-PCR phù hợp hoàn toàn với kết quả định

danh trước đó, trong khi phân biệt C.neoformans và C gattii bằng môi trường

CGB có 6 chủng kết quả không phù hợp [59] Như vậy, có thể nói PCR có nhiều ưu điểm rõ rệt so với các kỹ thuật truyền thống Tuy nhiên, kỹ

Multiplex-thuật này cũng có một số nhược điểm đó là chi phí thực hiện cao và quá trình xây dựng thiết lập quy trình kỹ thuật mất nhiều thời gian Có sự cạnh tranh giữa các mồi với trình tự đích và các hóa chất có trong thành phần phản ứng Ngoài ra, kỹ thuật này yêu cầu nghiêm ngặt kiểm soát sự tự bắt chéo giữa các mồi tạo ra các dương tính giả

1.2.3.5 Kỹ thuật PCR lồng đa mồi (nested multiplex-PCR)

Kỹ thuật nested multiplex-PCR hay kỹ thuật khuếch gen lồng đa mồi là

sự kết hợp của 2 kỹ thuật PCR lồng và PCR đa mồi Ở phản ứng PCR thứ nhất (PCR1), 01 cặp mồi được thiết kế để khuếch đại được gen của cả 2 hay nhiều loài thuộc cùng nhóm mầm bệnh (mồi chung) Các cặp mồi ở phản ứng PCR thứ hai (PCR2) được thiết kế đặc hiệu cho từng mầm bệnh và khuếch đại đoạn gen nằm trong đoạn DNA được khuếch đại ở phản ứng PCR1 [60] Kỹ thuật này đã được nghiên cứu phát triển trong phát hiện một số vi khuẩn, virut

và vi nấm gây bệnh ở người như Đỗ Ngọc Ánh và cs (2017) đã thiết lập và xây dựng quy trình kỹ thuật nested multiplex-PCR để phát hiện đồng thời 2

nấm C neoformans và C albicans Taira và cs (2014) sử dụng kỹ thuật này

để phát hiện một số nấm Candida gây bệnh nấm máu ở bệnh nhân nhi bị bệnh nặng [60] Theo Nguyễn Trọng Chính và cs (2017), độ nhạy của kỹ thuật

nested multiplex-PCR trong phát hiện C neoformans và C albicans ở dịch

não tủy 77,78%, độ đặc hiệu 99,1% [61]

Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là nguy cơ bị nhiễm trong các lần tạo hỗn hợp chạy PCR rất cao, điều này dẫn tới dễ gây ra dương tính giả …[61]

1.2.3.6 Kỹ thuật PCR thời gian thực (real-time PCR)

Hiện nay, một trong những phương pháp tiên tiến nhất sử dụng để chẩn đoán các mầm bệnh là PCR thời gian thực (real-time PCR) Ở kỹ thuật này quá trình nhuộm màu phát hiện ADN được diễn ra đồng thời với phản ứng PCR [62] Real-time PCR có độ nhạy cao hơn phản ứng PCR và thời gian thực hiện nhanh hơn Đây là một trong những kỹ thuật hiện đại nhất áp dụng cho nghiên

cứu bệnh Cryptococcosis và các tác nhân gây bệnh khác Ngoài ra, kỹ thuật này còn cho phép đánh giá sự biểu hiện của các gen có liên quan đến độc tính vi sinh vật [62]

Trong một nghiên cứu so sánh, Bialek và cs, (2002) cho real-time PCR nhanh hơn PCR lồng để phát hiện nấm, đồng thời cung cấp được kết quả định

lượng [63] Eberling, (2011) đã phân biệt các mẫu Cryptococcus spp và Candida spp thu được từ các mẫu lâm sàng Sử dụng PCR thời gian thực với

các mồi đặc hiệu cho loài và đã chứng minh rằng kỹ thuật này nhanh, nhạy và

đặc hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh [64]

Gần đây, Real-time PCR cũng đã được sử dụng thành công để chẩn

đoán xác nhận viêm màng ngoài tim do nấm C neoformans, với trình tự gen

đích 18S và 28SrRNA [65] Veron và cs, (2009); Satoh và cs, (2011) đã phát triển kỹ thuật PCR thời gian thực TaqMan để chẩn đoán cryptococcosis có độ nhạy và độ đặc hiệu cao [66], [67]

1.2.3.7 Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán nấm C neoformans

Ngày nay, ứng dụng rộng rãi các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán đang được nhiều quốc gia quan tâm [68] Chính vì vậy việc tạo ra các bộ sinh phẩm để có thể áp dụng rộng rãi trong các cơ sở y tế đang là hướng đi mà

nhiều quốc gia, doanh nghiệp nghiên cứu Đối với chẩn đoán nấm C neoformans, nhiều hãng nổi tiếng đã nghiên cứu thành công và thương mại

hóa Các bộ kit chẩn đoán như GENEKAM Biotechnology AG, Norgen Biotek

(Canada) sản xuất 1 loạt các bộ sinh phẩm realtime chẩn đoán C neoformans

(bảng 1.2), hay bộ kit BlackLight® Fungal ID Kit phát hiện các một số loài

nấm của hãng Blackbio (Tây Ban Nha), C.neoformans-EASY, C.neoformans, Path-C.neoformans-standard phát hiện C neoformans của hãng Genesig (Anh); AmpliSens Cryptococcus neoformans-FRT; PCRmax Ltd qPCR test C neoformans của hãng PCRmax; ViPrimePLUS Cryptococcus

Path-neoformans qPCR Kit của hãng Vivantis; Techne™ PrimePRO QPCR DNA detection Kit Cryptococcus neoformans của hãng Fisher sicientific…

Bảng 1.2 Một số bộ sinh phẩm chẩn đoán C neoformans của hãng Norgen

Biotek

phản ứng

C neoformans TaqMan PCR Kit TM42720 24

C neoformans TaqMan Probe/Primer and Control Set TM42730 100

C neoformans End-Point PCR Kit EP42720 24

C neoformans Primer and Control Set EP42730 100 rxns

1.3 Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh

Các bộ sinh phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường có ưu điểm là

đã được chuẩn hóa, xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện đối với các tác nhân gây bệnh, hướng dẫn sử dụng rõ ràng dễ thực hiện nhưng cũng có một

số nhược điểm như giá thành cao, thời gian làm thủ tục nhập khẩu lâu nên hạn sử dụng còn lại ngắn, làm cho các phòng thí không chủ động được các hoạt động của mình Do đó hầu hết các phòng thí nghiệm có xu hướng tự phát triển các bộ sinh phẩm, để có thể chủ động công việc của mình

Nguyên lý chung khi phát triển các bộ sinh phẩm PCR để chẩn đoán tác nhân gây bệnh mong muốn cụ thể như sau [69]:

- Thiết kế mồi để xác định tác nhân gây bệnh mong muốn;

- Xây dựng quy trình tiến hành phản ứng PCR (nhiệt độ bám mồi, thời gian của mỗi giai đoạn trong chu kỳ tiến hành phản ứng, nồng độ của các loại

hóa chất trong cùng một hỗn hợp phản ứng: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, đệm phản ứng);

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR;

- Tạo chuẩn dương cho bộ kit;

- So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của kỹ thuật và bộ sinh phẩm với các phương pháp đã đang được sử dụng với bộ kit chuẩn đã được thương mại hóa trên thị trường;

- Đóng gói bộ sinh phẩm với thành phần và số lượng phù hợp Thông thường đóng gói bộ sinh phẩm cho 25, 50 hoặc 100 phản ứng với các thành phần như:

+ Hỗn hợp phản ứng (PCR master mix);

+ Mồi phản ứng;

+ Chứng cho phản ứng (chứng âm và chứng dương);

+ Thang chuẩn cho phản ứng PCR;

- Đánh giá độ ổn định của bộ sinh phẩm trên mẫu chuẩn

Trong quá trình xây dựng bộ sinh phẩm phải tiến hành đồng thời quá trình chuẩn hóa bộ sinh phẩm bao gồm:

- Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi;

- Tối ưu phản ứng PCR;

+ Thành phần phản ứng

+ Chu trình nhiệt của phản ứng

- Ngưỡng phát hiện;

- Tạo chứng dương chuẩn;

- Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm