Xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotics

Nhiệm vụ yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu: ➢ Phân lập và định danh đến cấp giống các vi khuẩn lên men lactic theo phương pháp cổ điển ➢ Kiểm tra hoạt tính probiotics của các chủng

Trang 1

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Lời mở đầu 1

Chương 1: GIỚI THIỆU 3

1.1 Đặt vấn đề 3

1.2 Mục đích đề tài 4

1.3 Nội dung đề tài 4

1.4 Ứng dụng của đề tài 5

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1 Tổng Quan Về Probiotics 6

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu Probiotics 6

2.1.2 Định nghĩa về Probiotics 9

2.1.3 Probiotic, prebiotic và synbiotic 10

2.1.4 Thành phần vi sinh của probiotics 12

2.1.5 Cơ chế hoạt động và lợi ích của probiotics 13

2.1.5.1 Tác động kháng khuẩn của probiotics 14

2.1.5.2.Tác động của probiotics trên biểu mô ruột 16

2.1.5.3.Tác động lên hệ miễn dịch của probiotics 17

2.1.5.4.Tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột 19

2.1.6 Hạn chế của probiotic 22

2.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB) 22

2.2.1 Khái niệm 22

2.2.2 Đặc tính chung 24

2.2.3 Đặc điểm hình thái một số giống LAB chủ yếu 26

Trang 2

2.2.3.1 Giống Lactobacillus 26

2.2.3.2 Giống Streptococcus 28

2.2.3.3 Giống Leuconostoc 30

2.2.3.4 Giống Pediococcus 31

2.2.4 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa 32

2.2.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 32

2.2.4.2 Quá trình trao đổi chất 34

a Lên men lactic đồng hình b Lên men lactic dị hình 2.2.5 Sản phẩm của quá trình lên men và khả năng sinh các chất kháng khuẩn ở vi khuẩn lactic 38

2.3 Tổng Quan Về Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi khuẩn Lactic 40

2.3.1 Nhu cầu tìm kíếm các nguồn probiotics mới 40

2.3.2 Các tiêu chí để chọn các chủng probiotics 40

2.3.3 Phương pháp tìm kiếm các nguồn probiotics mới 41

2.3.4 Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập 42

2.3.4.1 Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển 42

2.3.4.2 Sự phân loại LAB đến cấp giống 43

2.3.4.3 Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại 46

2.4 Ứng Dụng Của probiotics 47

2.4.1 Các dạng chế phẩm probiotics trong thương mại 47

2.4.2 Những chủng vi khuẩn probiotics đã được thương mại hóa 48

2.5 Các nghiên cứu về probiotics trong nước 54

Chương 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56

3.1 Địa điểm nghiên cứu 56

3.2 Thời gian thực hiện 56

3.3 Vật liệu 56

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ 56

3.3.2 Hóa chất 57

Trang 3

3.4 Phương pháp luận 57

3.5 Phương pháp thí nghiệm 60

3.5.1 Thu thập mẫu 60

3.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 61

3.5.2.1 Tăng sinh 61

3.5.2.2 Phân lập 61

3.5.3 Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic 62

3.5.3.1 Nhuộm Gram 62

3.5.3.2 Nhuộm bào tử .62

3.5.3.3 Nhuộm kháng acid 62

3.5.3.4 Thử nghiệm catalasa 63

3.5.3.5 Thử nghiệm khả năng sinh acid 63

3.5.3.6 Thử nghiệm khả năng di động 63

3.5.3.7 Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 63

3.6 Thử nghiệm khả năng sinh H2O2 64

3.7 Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục (turbidimetric method) 65

3.8 Thử nghiệm khả năng chịu acid và muối mật 67

3.8.1 Khả năng chịu acid 67

3.8.2 Khả năng chịu muối mật 67

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 69

4.1 Phân lập vi khuẩn lên men lactic 69

4.2 Định danh các chủng phân lập 71

4.2 1 Nhuộm Gram 71

4.2.2 Kết quả nhuộm bào tử 80

4.2.3 Nhuộm kháng acid 81

4.2.4 Thử nghiệm catalase 82

4.2.5 Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann 83

4.2.6 Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm 84

Trang 4

4.2.8 Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 86 4.3 Thử nghiệm khả năng sinh H2O2 91

4.4 Kiểm tra khả năng kháng E.coli và Salmonella

bằng phương pháp đo độ đục 92 4.5 Kết quả kiểm tra khả năng chịu acid và muối mật 101

4.5.1 Kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật

của 3 chủng vi khuẩn phân lập 103 4.5.2 Kết quả kiểm tra khả năng chịu acid

của 3 chủng vi khuẩn phân lập 104

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤC LỤC

Trang 5

1 Đầu đề Đồ án tốt nghiệp:

XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP GIỐNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTICS

2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu):

➢ Phân lập và định danh đến cấp giống các vi khuẩn lên men lactic theo phương pháp cổ điển

➢ Kiểm tra hoạt tính probiotics của các chủng vi khuẩn đã phân lập

- Khả năng kháng vi sinh vật chỉ thị E.coli và Salmonella

- Khả năng chịu acid và muối mật của một số chủng

3 Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: 5/4/2010

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 28/6/2010

5 Họ tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn:

TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Toàn bộ

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn

Ngày tháng năm 2010

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ):

Đơn vị:

Ngày bảo vệ:

Điểm tổng kết:

Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KTCN TPHCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC -

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHOA: MT và CNSH BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HỌ VÀ TÊN: DƯƠNG THÚY VY MSSV : 106111042

NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP : 06DSH

Trang 6

Danh sách các chữ viết tắt

ATP : Adenosine triphosphate

Cfu : Colony forming units

GOS : Galactooligosaccharides

GRAS : Generally recognized as safe

LAB : (Lactic acid bacteria) Vi khuẩn lên men lactic NAD : Nicotinamid adenine dinucleotide dạng oxy hóa NADH : Nicotinamid adenine dinucleotide dạng khử OEI : Oligofructose-Enriched Inulin

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Ví dụ về thành phần của prebiotic 12

Bảng 2.2 : Những vi sinh vật được xem như là probiotic 13

Bảng 2.3: Sự chiếm ngụ của vi sinh trong đường tiêu hóa của người 21

Bảng 2.4 : Phân loại khoa học giống Lactobacillus 26

Bảng 2.5: Phân loại khoa học Giống Streptococcus 28

Bảng 2.6: Phân loại khoa học giống Leuconostoc 30

Bảng 2.7: Phân loại khoa học giống Pediococcus 31

Bảng 2.8: Sản phẩm biến dưỡng và kiểu hoạt động đối kháng 39

Bảng 2.9: Các đề tài nghiên cứu probiotics ở Việt nam từ 2008 đến nay 54

Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các nguồn phân lập 60

Bảng 4.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập 70

Bảng 4.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x10 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x100…… 73

Bảng 4.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn 88

Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra khả năng kháng E.coli và Salmonella của 23 chủng vi khuẩn phân lập 95

Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra khả năng chịu muối mật của 3 chủng vi khuẩn 103

Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra chịu acid của 3 chủng vi khuẩn 105

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 2.1: Cơ chế kháng vi sinh vật của bacteriocin 16

Hình 2.2 : Cơ chế tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột 19

Hình 2.3 : Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic 24

Hình 2.4 : Lactobacillus species 26

Hình 2.5: Streptococcus 28

Hình 2.6: Leuconostoc 30

Hình 2.7: Pediococcus sp 32

Hình 2.8: Con đường lên men glucose 37

Hình 2.9: Các hướng an toàn của probiotics 41

Hình 3.1: Sơ đồ phân lọai vi khuẩn theo kết quả nhuộm Gram và hình thái (theo khóa phân lọai của Bergey) 58

Hình 3.2: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic 59

Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic 70

Hình 4.2: Vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương bắt màu tím 71

Hình 4.3: Vi khuẩn E coli Gram âm bắt màu đỏ 71

Hình 4.4: Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử 80

Hình 4.5: vi khuẩn E.coli không sinh bào tử 81

Hình 4.6: mẫu vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 81

Hình 4.7: Vi khuẩn Mycobacterium smegmatis có tính kháng acid 82

Hình 4.8: Mẫu vi khuẩn không có tính kháng acid 82

Hình 4.9: Mẫu vi khuẩn có catalase âm tính 83

Hình 4.10: Chủng Bacillus sb có catalase dương tính 83

Hình 4.11: vi khuẩn Bacillus không sinh acid lactic 84

Hình 4.12: mẫu vi khuẩn sinh acid lactic 84

Trang 9

Hình 4.13: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn 85

Hình 4.14: Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường 87

Hình 4.15: Kiểm tra khả năng sinh H2O2 92

Hình 4.16: Thí nghiệm ủ E coli và Salmonella với dịch nuôi cấy LAB ly tâm 95

Hình 4.17: Thử nghiệm khả năng chịu acid 104

Đồ thi 4.1: Khả năng ức chế vi khuẩn E.coli của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa 97

Đồ thi 4.2: khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic không trung hòa và sau khi trung hòa 99

Đồ thị 4.3 Biểu điễn khả năng chịu muối mật của 3 chủng vi khuẩn 103

Đồ thị 4.4 Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng Na8 105

Đồ thị 4.5 Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng E2 106

Đồ thị 4.6 Biểu điễn khả năng chịu acid của chủng Y1 106

Trang 10

GVHD: Ts Nguyễn Hoài Hương Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

SVTH: Dương Thúy Vy 56

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Hoc trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM

3.2 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ ngày 5/04/2009 đến ngày 28/06/2010

3.3 Vật liệu

3.3.1 Thiết bị và dụng cụ

- Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)

- Máy đo pH Horiba (Nhật Bản)

- Autoclave (Memmert – Đức),

- Kính hiển vi quang học Olympus – (Nhật Bản)

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức)

- Pipetman 100 – 1000 l

- Bếp điện

- Bông thấm nước, bong không thấm nước

- Giấy lọc, lame, lamell…

- Cá dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đền cồn, bình định mức, ống đông, becher, pipette, crucible, giấy lọc

Trang 11

3.3.2 Hóa chất

+ Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm : Tím kết tinh (Crystal violet), ethanol 95%, ammonoxalat, iod, KI, thuốc nhuộm fushin, lục malachite, xanh metylen, etanol, KOH, dung dịch acid carbolic, dung dịch acid tannic, FeCL3, formalin, NaOH, AgNO3,NH4OH, H2O2, dung dịch Tetramethy-p-phenylene diamine dihydrochloride, + Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS (phụ lục 5) Đây là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là: de Man, Rogosa and

Sharpe (Robinson 2007)

+ Thuốc thử Uffelmann: Cho 2% dung dịch phenol tinh chất vào trong nước thêm dung dịch FeCl3 cho tới khi dung dịch phenol chuyển thành màu tím

+ Thuốc thử xanh bromophenol (BPB): 2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M,

nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml

3.4 Phương pháp luận

Theo tiêu chí an tòan sinh học là trên hết, cho nên đề tài chủ yếu tiến hành phân lập các vi khuẩn lên men lactic (LAB) vì chúng được xếp vào lọai GRAS (generally recognized as safe)

Để phân lập trước hết cần chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống như nem, các loại sữa chua và các nguồn đã được nghiên cứu là có chứa hệ

vi sinh vật đường ruột để phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và phân lập bằng phương pháp phân lập giống thuần khiết phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh

Như đã đề cập ở mục 2.3.4.1, việc định danh LAB chủ yếu dựa vào các phương

pháp cổ điển (như dựa vào hình thái, cấu trúc, sinh lý, sinh hóa) theo Bergey’s Manual (Benson Lab Manual, 2001) cùng với việc kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau và so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến

cấp giống (hình 3.1 và 3.2)

Chọn môi trường sử dụng trong suốt quá trình phân lập là môi trường MRS trong

đó có bổ sung thêm 0.02% natri azide (NaN3) do chất này gây ức chế quá trình hô hấp

Trang 12

kháng trực tiếp với sinh vật chỉ thị là E coli và Salmonella bằng phương pháp đo độ đục

(Turbidometric assay method)

Nếu xác định được các chủng phân lập được có tính kháng khuẩn cao thì đã đạt được mục tiêu của đề tài

Hình 3.1: Sơ đồ phân lọai vi khuẩn theo kết quả nhuộm Gram và hình thái

(theo khóa phân lọai của Bergey)

Trang 13

Hình 3.2: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic

Hình cầu Hình que

Nhuộm bào tử

+

Cấy truyền sang MRS agar

Phân lập giống thuần khiết

Nhuộm Gram Quan sát hình thái tế bào

Tăng sinh trong MRS broth

_

Đều

Quan sát đều, không đều

Nhuộm kháng acid

Catalase

+ Định tính acid lactic

Kiểm tra khả năng di động

_

Lên men đường

Vi khuẩn lên men lactic

Lên men dị hình Lên men đồng hình

MRS bổ sung 0,02% NaN3 loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc

Quan sát hình thái khuẩn lạc

Loại VK sinh bào tử

Môi trường thuận

lợi cho LAB

_

Trang 14

bé Mẫu được kí hiệu theo bảng sau:

Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các nguồn phân lập

Nguồn phân lập Tên sản phẩm Kí hiệu các nguồn

phân lập

Trong đó :

• Nem Đồng Tháp được mua tại Lai Vung, Đồng Tháp

• Nem Tiền Giang được mua tại Tiền Giang

• Sữa chua men sống Yakult được công bố là có chứa vi khuẩn Lactobacillus casei

Shirota ở dạng sống

• Cứt xu em bé được lấy từ em bé sau khi vừa sinh tại bệnh viện Từ Dũ, thành phố

Hồ Chí Minh

Trang 15

3.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic

3.5.2.1 Tăng sinh

Mục đích: kích hoạt các vi khuẩn có trong mẫu phát triển lại bình thường vì

chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản của các mẫu Trong đó các vi khuẩn lactic có khả năng phát triển nhiều hơn vì ta đã sử dụng môi trường chọn lọc đối với vi

khuẩn lactic (mục 3.4) Đồng thời đây cũng là bước đầu giúp thu lượng sinh khối vi

khuẩn phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo

Môi trường sử dụng MRS broth có bổ sung 0,02% NaN3, đã khử trùng ở 1210C, trong 15 phút

Với các mẫu là dạng dịch như: sữa chua, sữa chua men sống, hút 1ml cho vào ống nghiệm chứa khoảng 10ml MRS broth, còn lại đối với các với các mẫu là dạng rắn lấy khoảng 2g, đánh tơi cho vào ống nghiệm chứa MRS broth

Quấn màng PVC (màng bọc thực phẩm) quanh nấp ống nghiệm cho kín đem ủ ở

Các mẫu sau khi tăng sinh đem pha loãng tới độ pha loãng là 10-9

Gieo cấy mẫu để tách khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ: sử dụng môi trường phân lập

là môi trường MRS agar Tiến hành cấy trang ở các độ pha loãng từ 10-5 ÷ 10-9 kết hợp với phương pháp cấy ria để tách các khuẩn khác nhau, sau đó cấy truyền các khuẩn lạc

đã đồng nhất vào các ống thạch nghiêng ủ ở 370C, 24 giờ, bảo quản ống giống ở nhiệt

độ 40C

Trang 16

(Gram-Sau khi thu được các chủng vi khuẩn đồng nhất, ta tiến hành nhuộm Gram và loại

bỏ các vi khuẩn Gram âm, giúp sàng lọc ra các vi khuẩn Gram dương có khả năng là vi khuẩn lactic

3.5.3.2 Nhuộm bào tử

Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử : dày, chắc, khó bắt màu,

chứa nhiều lipit Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung Nhờ đó

tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ

Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước trên được tiếp tục kiểm tra khả năng sinh bào tử Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già để nhuộm bào tử Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương nhưng không sinh bào tử

3.5.3.3 Nhuộm kháng acid

Vi khuẩn kháng acid có vỏ bên ngoài chống được cồn và acid nên nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch cồn và acid, vì vậy nó được phân loại là vi khuẩn kháng acid Còn những vi khuẩn không mang đặc tính kháng acid màu nhuộm ban đầu sẽ bị rửa trôi và bắt màu thuốc nhuộm bổ xung Trong đó vi khuẩn kháng acid

sẽ bắt màu đỏ Vi khuẩn không kháng acid bắt màu xanh

Mục đích: nhuộm kháng acid để loại bỏ những vi khuẩn kháng acid như

Mycobacterium Chúng không phải là vi khuẩn lactic mà ta mong muốn vì chúng là

những chủng có khả năng gây bệnh cho người Các chủng phân lập là Gram dương

Trang 17

3.5.3.5 Thử nghiệm khả năng sinh acid

Mục đích: kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất

3.5.3.7 Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí

* Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào Các loại

đường được sử dụng là: glucose, lactose, saccharose, maltose và mannitol Kết quả từ

Trang 18

- Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí

CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường Khử trùng trong 15 phút ở

1210C

- Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 37 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày Trường hợp dùng nút bông cần quấn bằng màng PVC (màng bọc thực phẩm) để bịt kín miệng ống nghiệm

* Kết quả:

- Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị xanh bromophenol (BPB) sẽ chuyển màu đỏ

- Nếu có bọt khí bên trong ống durham thì chủng vi khuẩn đó lên men có sinh khí

- Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong ống durham thì ta cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí

3.6 Thử nghiệm khả năng sinh H 2 O 2

* Mục đích : kiểm tra khả năng sinh , là một chất tham gia vào hoạt động kháng khuẩn

của của vi sinh vật

* Nguyên tắc : H2O2 là một chất vưa có tính khử vừa có tính oxy hóa

Trong môi trường acid, H2O2 có tính oxy hóa mạnh, khi tác dụng với chất khử KI tạo ra I2 , nhận biết phản ứng bằng cho thêm hồ tinh bột

H2O2 + 2KI I2 + 2KOH

* Tiến hành :

- Nuôi ủ các chủng vi khuẩn trong môi trường lỏng 24 giờ

Trang 19

- Lấy mỗi mẫu 5ml dịch nuôi cấy, thêm 1ml H2SO4 1M và 1ml KI, sau đó thêm 3 giọt hồ tinh bột Quan sát sự chuyển màu và ghi kết quả

* Kết quả:

- Dung dịch chuyển thành màu xanh tím : có H2O2

- Dung dịch không đổi màu : không có H2O2

3.7 Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục (turbidimetric method)

* Mục đích:

Những vi sinh vật mang đặc tính probiotic phải là những sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh nên trong thí nghiệm này cần phải kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh của những chủng vi khuẩn LAB phân lập

được nhằm tuyển chọn những chủng mang đặc tính probiotic trong đó vi khuẩn E coli

và Salmonella được chọn làm vi sinh vật chỉ thị

* Nguyên tắc:

Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trưởng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào Do đó, thông qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kể ở bước sóng 610nm của dịch huyền phù tế bào ta có thể định tính được mật độ vi sinh vật ở điều kiện cần khảo sát

Dựa trên khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm trao đổi chất của LAB đối với

vi sinh vật chỉ thị trong môi trường lỏng Vi sinh vật chỉ thị bị ức chế tăng trưởng dẫn đến nồng độ tế bào giảm so với đối chứng

Ống đối chứng là sự phát triển bình thường của VK chỉ chị E coli Ống kiểm tra

là ống có chứa dịch nuôi LAB đã ly tâm, nếu vi khuẩn LAB có tính kháng khuẩn thì ống kiểm tra sẽ có mật độ tế bào thấp hơn ống đối chứng

Trang 20

Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức :

+ Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và Salmonella bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB + Nghiệm thức 2 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và Salmonella bằng các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB nhưng đã được loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N

Ống đối chứng : giống ống thí nghiệm, nhưng 1 ml dịch ly tâm LAB được thay bằng 1ml MRS broth đã tiệt trùng

Ống trắng : gồm 9ml môi trường cao thịt-peptone và 1ml MRS broth đã tiệt

Trang 21

ODTN : giá trị OD của ống thí nghiệm

% vi sinh vật chỉ thị bị ức chế được tính như sau:

D% = 100% - %OD , thể hiện khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó, D% càng lớn, khả năng kháng vi sinh vật càng cao

Chú ý: kết quả thu được là số liệu trung bình của 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa thống kê 95%

3.8 Thử nghiệm khả năng chịu acid và muối mật

3.8.1 Khả năng chịu acid :

Bên trong hệ tiêu hóa của chúng ta dạ dày là nơi có pH rất thấp do và ruột thường rất thấp (pH<3) do sự có mặt của acid như acid hydrochloric nhằm tạo điều kiện acid cho các protease hoạt đông tiêu hóa thức ăn Chính vì vậy các vi khuẩn probiotics cần phải chịu được điều kiện pH thấp trong 1 thời gian nhất định để có thể đi qua dạ dày tới ruột và phát huy được tác dụng probiotics của mình

Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotics trên môi trường MRS với điều kiện pH là 2, 3, 4, 5 và đối chứng trên môi trường MRS thông thường có pH = 6.5 - 7 Do môt trường MRS có màu nâu tương đối đậm nên muốn thu kết quả chính xác ta cần phải tiến hành ly tâm và thu sinh khối vi khuẩn vào trong nước muối sinh lý với thể tích tương ứng để đo quang xác định mật độ của tế bào ở bước sóng

là 610 nm

3.8.2 Khả năng chịu muối mật

Có 2 loại muối mật là glycochalat natri và taruocholat natri Muối mật có chức năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo theo sự hấp thu các vitamin tan trong lipid như A, D, E, K Vì thế muối mật có ảnh hưởng đến vi sinh vật do tác động lên màng phospholipid của chúng Khi xuống đến hồi tràng, 95% muối mật được tái hấp thu rồi theo tĩnh mạch chủ trở về gan và được tái bài tiết, gọi là chu trình ruột gan Còn 5% muối mật được đào thải theo phân có tác dụng giữ nước trong phân và duy trì nhu động ruột già Chính vì thế mà khả năng chịu được muối mật cũng là một

Trang 22

Trang 23

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KẾT LUẬN

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

4.1 Phân lập vi khuẩn lên men lactic:

Việc phân lập vi khuẩn lactic được tiến hành trên nhiều nguồn khác nhau Các

nguồn phân lập chủ yếu là các loại thực phẩm lên men truyền thống như sữa chua và

nem chua Đây là những nguồn phổ biến đã được sử dụng trong rất nhiều đề tài phân

lập hay nghiên cứu về vi khuẩn lactic, và cụ thể hơn là các nguồn được chọn lựa để phân

lập trong đề tài này hoàn toàn khác với các nguồn đã được chọn trong đề tài tốt nghiệp

“PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN LACTIC CÓ NGUỒN GỐC THỰC PHẨM VÀ DƯỢC

PHẨM MANG HOẠT TÍNH PROBIOTIC” của khóa 2005, khoa Môi Trường và Công

Nghệ Sinh Học, Hutech Nguồn phân lập được chọn ở đây là các sản phẩm mới, có

nguồn gốc, xuất xứ và mang tính địa phương khác nhau với mong muốn thu thập được

những chủng vi khuẩn lactic mới, đóng góp thêm vào bộ sưu tập giống

Cùng với việc chọn lựa từ những nguồn mới, việc phân lập cũng tiến hành trên

các sản phẩm lên men đã được công nhận và tận dụng những kết quả nghiên cứu có sẵn

với ý nghĩa chắc chắn có sự hiện diện của vi khuẩn lactic với sự đảm bảo của nhà sản

xuất như các sản phẩm sữa chua uống men sống yakult được công bố là có chứa lợi

khuẩn Lactobacillus casei Shirota ở dạng sống do tiến sĩ Nhật Bản Minoru Shirota

(1899-1982) nuôi cấy được vào năm 1930 Một nguồn phân lập khác nữa là từ phân của

trẻ sơ sinh đã được nghiên cứu là có chứa hệ vi khuẩn đường ruột sống do cơ thể trẻ

nhận được trong lúc quá trình bào thai và sau khi bú sữa mẹ (Rocío Martín et al, 2003),

(E Vlková et al, 2003), (J Agric, 2002)

Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều

thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960)

Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí ta sẽ loại bỏ được vi khuẩn hiếu khí

và ngược lại Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms) và

không hô hấp nên để tăng khả năng chọn lọc, nên em đã bổ sung natri azide (NaN3)vào

môi trường MRS với nồng độ 0.02% nhằm ức chế vi khuẩn hiếu khí và tăng điều kiện

Trang 24

kỵ khí bằng cách dán kín các đĩa pettri bằng màng nhựa PVC Vi khuẩn xuất hiện trên

đĩa thạch với các khuẩn lạc màu trắng, nhỏ (Sharpe, 1979) sẽ được chọn (hình 4.1) Từ

đó em đã chọn lựa và nuôi cấy được 38 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng nhất có khả

năng là vi khuẩn lactic

Các chủng tuyển chọn được kí hiệu theo bảng 4.1

Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic Bảng 4.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập

Sản phẩm Tên sản phẩm Kí hiệu các chủng phân lập

Nem Nem Đồng Tháp Na1, Na2, Na3, Na4, Na5,

Na6, Na7, Na8 Nem Tiền Giang Nb1, Nb2, Nb3, Nb5, Nb8,

Nb9, Nb10, Nb11 Sữa chua

men sống

Probi (Vinamilk) P1, P2 Sữa chua Long Thành L1, L2, L3

Cứt xu em bé E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7,

E8, E9, E10

Trang 25

4.2 Định danh các chủng phân lập

Sau khi đã có được các chủng vi khuẩn đồng nhất, em tiến hành định danh các

chủng phân lập bằng phương pháp cổ điển: khảo sát hình thái, sinh lý và sinh hóa như

đã nêu ở mục 2.3.4

4.2.1 Nhuộm Gram

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương nên bước đầu tiên tiến hành định danh

chúng ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong khoảng 24 giờ nuôi

cấy) vì khi già vi khuẩn lactic đều trở thành Gram âm

Khi tiến hành nhuộm Gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là

vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương (hình 4.2) và vi khuẩn E coli Gram âm (hình

4.3) có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng Sau đó tiến hành nhuộm Gram 38 chủng

đã phân lập và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận

Trong số 38 chủng phân lập, 5 chủng thể hiện Gram âm (Na7, Nb9, L3, E5, E7)

10/30 chủng Gram dương còn lại có hình thái, kích thước tế bào trùng với các chủng

khác có cùng nguồn, nên số chủng Gram dương rút xuống còn 23

Ở bước nhuộm Gram này ta đã tăng tính an toàn cho các chủng vi khuẩn được

chọn vì đã loại bỏ một số chủng vi khuẩn gây bệnh là Gram âm ví dụ như vi khuẩn E

coli

Hình 4.2: Vi khuẩn Bacillus subtilis

Gram dương bắt màu tím

Hình 4.3: Vi khuẩn E coli

Gram âm bắt màu đỏ

Trang 26

Từ việc nhuộm Gram, ngoài việc xác định vi khuẩn là Gram âm hay Gram dương

ta còn có thể quan sát hình thái của vi khuẩn và mô tả hình dạng của 23 chủng Gram

dương thì có :

- 20 chủng hình que

- 2 chủng hình cầu

- 1 chủng hình ovan

Kết quả mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn được thể hiện ở bảng 4.2

Sau bước nhuộm Gram, ta thu được 23 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc và

tế bào khác nhau, hoặc một số trong đó giống nhau về hình thái khuẩn lạc nhưng khác

nhau về hình dạng tế bào và khác cả về nguồn phân lập Như vậy, dựa vào kết quả

nhuộm Gram và mô tả hình thái vi khuẩn, từ 38 chủng có khả năng là vi khuẩn lactic

được lựa chọn ban đầu, ta đã rút ra được 23 chủng có nhiều khả năng là vi khuẩn lactic

hơn Tuy nhiên vẫn có một số chủng là vi khuẩn Gram dương những không phải là vi

khuẩn lactic, nên ta phải tiếp tục tiến hành các bước kiểm tra tiếp theo đối với 23 chủng

trên để sàng lọc ra những chủng mang đặc điểm của vi khuẩn lactic dựa vào những mô

tả trong Berger’s manual

Trang 27

Vi khuẩn hình que rất ngắn, đều,

có thắt ở giữa

Na4

Khuẩn lạc tròn, to, lồi nhiều, trắng đục, nhẵn bóng, mép đều, có rìa xung quanh, khuẩn lạc mọc sâu vào thạch

Vi khuẩn hình que rất ngắn, có thắt ở giữa

Trang 28

Vi khuẩn hình que rất ngắn, không có thắt giữa

Nb3

Khuẩn lạc nhỏ, tròn, nàu trắng sữa,

có vành xung quanh, lồi

Vi khuẩn hình que thon, ngắn, không có thắt

Trang 29

Nb11

Khuẩn lạc tròn, to, màu trắng sữa, dẹp

Vi khuẩn hình oval

Trang 30

Y1

Khuẩn lạc rất nhỏ, có mép không đều, dẹp, sau 24 giờ có màu trắng hơi trong, khi già có màu trắng đục

Vi khuẩn hình que rất ngắn

B1

Khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt gợn sóng, hơi nhăn trên bề mặt, có rãnh, màu trắng sữa, dẹp

Vi khuẩn hình que dài, kết đôi hay tạo chuỗi ngắn, có thắt giữa

B2

Khuẩn lạc to, tròn, bờ đều, màu trắng đục, lồi ít

Trang 31

Vi khuẩn hình que thon, rất dài

Trang 32

E1

Khuẩn lạc nhỏ, tròn, láng bóng, có vành xung quanh, dẹp, màu trắng sữa

Vi khuẩn hình que dài, có thắt giữa, có dạng như chữ V

Vi khuẩn hình que ngắn, có thắt giữa

Trang 33

E6

Khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu trắng sữa,bờ gọn, nhẵn bóng, lồi ít

Vi khuẩn hình que ngắn

E8

Khẩn lạc rất to, (quan sát ở vật kính 4X), màu trắng đục, bóng, dẹp

Vi khuẩn hình que, thon dài, có thắt

ở giữa

E10

Khuẩn lạc nhỏ, tròn, bờ đều, bóng, màu trắng đục, lồi ít

Trang 34

4.2.2 Kết quả nhuộm bào tử

Bên cạnh nấm mốc còn có các vi khuẩn cũng có khả năng sinh bào tử, bào tử

được sinh ra khi vi khuẩn sống trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ, áp xuất,

dinh dưỡng…không còn phù hợp cho việc sinh trưởng và phát triển bình thường của

chúng hoặc khi tế bào trở nên già Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên

đây cũng trở thành đặc điểm nhận dạng của chúng

Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp Schaeffer-Fulton, dùng vi

khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy ở 2 tuần làm đối chứng dương, quan sát dưới kính hiển

vi ở vật kính 100X thấy được các chấm nhỏ li ti màu lục nằm rãi rác do các bào tử bắt

màu xanh của thuốc nhuộm malachite (hình 4.4), đồng thời sử dụng vi khuẩn E coli

không sinh bào tử để làm đối chứng âm (hình 4.5)

Nhuộm bào tử, ngoài việc xác định những chủng có khả năng là vi khuẩn lactic,

ta còn loại bỏ được các mầm bệnh có khả năng sinh bào tử ví dụ như Clostridium spp

gây bệnh viêm ruột, là vi khuẩn hình que, Gram dương và có khả năng sinh bào tử

Từ 23 chủng Gram dương, tiến hành nhuộm bào tử mẫu vi khuẩn (hình 4.6) sau

đó so sánh với đối chứng thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.3

Kết quả: Các tế bào của mỗi chủng sau khi nhuộm đều bắt màu đỏ của thuốc

nhuộm bổ sung Như vậy, tất cả 23 chủng vi khuẩn đều không sinh bào tử

Hình 4.4: Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử

Trang 35

4.2.3 Nhuộm kháng acid

Vi khuẩn lactic tuy là những vi khuẩn sinh acid nhưng chúng không có khả năng

kháng acid mà chúng chỉ sinh trưởng tốt ở pH 4-6.5 vì vậy trong quá trình sinh trưởng

phát triển, đến một giai đoạn nào đó, lượng acid sinh ra quá nhiều sẽ ức chế ngược lại sự

phát triển của chúng Dựa vào đặc tính này mà khóa phân loại của Bergey đã sử dụng

làm một trong các yếu tố đặc trưng giúp định danh vi khuẩn lactic Ngoài ra ở giai đoạn

Hình 4.5: vi khuẩn E.coli không sinh bào tử

Hình 4.6: mẫu vi khuẩn phân lập không sinh bào tử

Trang 36

này ta loại bỏ một số vi khuẩn có tính kháng acid gây bệnh như Mycobacterium (hình

4.7) Chúng là những vi khuẩn gây bệnh lao Chúng là những vi khuẩn Gram dương,

hình que và không sinh bào tử Vì vậy nếu chúng có lẫn vào, thì các thao tác trên sẽ

Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa

H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt

khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus sb có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương (hình

4.10) Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm

tính Đồng thời nhờ vào phản ứng catalase ta còn loại được một số vi khuẩn gây bệnh có

thể có mặt trong sản phẩm thực phẩm làm nguồn phân lập, chúng có catalase dương tính

như Staphylococcus là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm; Micrococcus,

Hình 4.7: Vi khuẩn

Mycobacterium smegmatis có

tính kháng acid

Hình 4.8: Mẫu vi khuẩn không có tính kháng acid

Trang 37

Corynebacterium spp…là các vi khuẩn gây nhiễm trùng và cả E coli gây tiêu chảy, rối

loạn tiêu hóa

Kết quả : Khi tiến hành cho H2O2 lên sinh khối của từng chủng vi khuẩn, tất cả 23

chủng đều không tạo bong bóng (O2) chứng tỏ chúng không có hệ enzyme catalase

(hình 4.9) Như vậy, 23 chủng đều cho catalase âm tính

4.2.5 Thử nghiệm tính sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann

Điều kiện tiên quyết của một vi khuẩn lactic là chúng phải có khả năng sinh acid

lactic, vì vậy để đảm bảo ta tiến hành thử nghiệm các chủng vi khuẩn đó có sinh acid

lactic hay không bằng thuốc thử Uffelmann Sử dụng chủng Bacillus sb không acid và

không làm đổi màu tím của thuốc thử, làm đối chứng âm (hình 4.11)

Từ 23 chủng đã qua chọn lọc bằng thử nghiệm catalase, cho thuốc thử trực tiếp

lên khuẩn lạc, hoặc cho vào dịch lên men trong môi trường MRS của các chủng vi

khuẩn Quan sát thấy tất cả các mẫu vi khuẩn phân lập đều làm đổi màu thuốc thử từ

màu tím sang màu vàng (hình 4.12)

Kết quả: tất cả 23 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh acid lactic

Điều này còn được thể hiện qua mùi acid đặc trưng được sinh ra trong tất cả các

môi trường sau khi đã cấy vi khuẩn được 24 giờ

Trang 38

4.2.6 Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm

Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì vậy trong môi trường

thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan sang môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc

theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường hơn khi đem so sánh với môi

trường khi chưa cấy vi khuẩn (ống 1 hình 4.13)

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí chịu oxy nên chúng vừa có thể phát triển ở

phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên

mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy

ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy (ống 2 hình 4.13)

Khi ta ủ vi khuẩn qua 2 ngày, do ống nghiệm được bịt kín nên khí sinh ra sẽ đảy

phần thạch trồi lên so với đáy ống Cho nên ngoài việc xác định vi khuẩn có khả năng di

động hay không ta còn có thể xác định được một số chủng vi khuẩn sinh khí mạnh hay

yếu Trong hình 4.13 vi khuẩn từ ống 4 sinh khí mạnh hơn ống 3

Kết quả thử nghiệm tính di động của 23 chủng đã qua định tính acid lactic dương

tính Quan sát vết cấy và so sánh với môi trường đối chứng, tất cả các chủng đều mọc

theo vết cấy và ko làm đục môi trường xung quanh

Hình 4.12: mẫu vi khuẩn sinh

acid lactic

Hình 4.11: vi khuẩn Bacillus không

sinh acid lactic

Trang 39

Như vậy 23 chủng đều không có khả năng di động

Hình 4.13: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn

(Ống 1: Ống môi trường không cấy vi khuẩn; Ống 2: Vi khuẩn không có khả năng di

động; Ống 3,4: Vi khuẩn không di động và có sinh khí)

Thông qua các bước kiểm tra từ mục 4.3 đến mục 4.7, các bước này được thực

hiện theo sơ đồ 3.2 trong mục 1.1, tất cả 23 chủng vi khuẩn Gram dương phân lập được

đều mang những đặc điểm chung của vi khuẩn lactic đã được mô tả trong Bergey’s

manual như: không sinh bào tử, không có khả năng kháng acid, catalase âm tính, sinh

acid lactic và không di động Như vậy, trong trường hợp này ngay từ việc chọn nguồn

phân lập đảm bảo chắc chắn có chứa vi khuẩn lactic mong muốn, việc chọn những

khuẩn lạc đặc trưng và nhuộm Gram để loại bỏ vi khuẩn Gram âm ở các bước đầu tiên

đã làm tăng lên rất nhiều khả năng thu nhận được nguồn vi khuẩn lactic Mặc dù trình tự

các bước kiểm tra có sự khác biệt so với trình tự kiểm tra trong đồ án phân lập của khóa

2005 nhưng vẫn chung mục đích là nhằm sàng lọc ra các vi khuẩn lactic Đến đây ta

xem như đã hoàn tất việc phân lập các chủng vi khuẩn lactic, tiếp theo nữa ta tiến hành

Trang 40

kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí của từng chủng và so sánh với

khóa phân loại của Bergey để có thể định danh chúng đến cấp giống

4.2.7 Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí

Các chủng vi khuẩn được cấy vào các môi trường chứa các loại đường khác nhau

và được ủ 24 giờ sau đó tiến hành đọc kết quả thông qua các đặc điểm sau:

Nếu các ống nghiệm chứa môi trường bị đục chứng tỏ có hiện diện của sinh khối

và vi khuẩn có khả năng sử dụng loại đường đó

Khi cho thuốc thử xanh bromophenol vào nếu thuốc thử đổi màu đỏ, chứng tỏ vi

khuẩn đó có khả năng lên men đường tạo acid Nếu thuốc thử không đổi màu, điều này

chứng tỏ vi khuẩn không lên men đường (hình 4.14)

Nếu vi khuẩn đó có khả năng lên men đường và trong ống durham có bọt khí tạo

ra, đó chính là khí CO2 Ngoài ra đối với những ống không có bọt khí trong ống durham,

ta khẳng định lại bằng việc nung đỏ que cấy và đặt sát phía trên bề mặt môi trường,

nhưng không chạm vào dung dịch nếu có những bọt khí li ti nổi lên thì ta vẫn kết luận

đó là lên men dị hình Nếu không có bọt khí tạo ra thì đó là lên men đồng hình Kết hợp

với phản ứng sử dụng thuốc thử Uffelmann đã trình bày ở mục 4.6, ta có thể kết luận

đây là những chủng có khả năng lên men loại đường đó tạo acid lactic

Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3 gồm:

- 23 chủng có khả năng lên men đường D-glucose, trong đó có 12 chủng sinh khí

Như vậy, trong 23 chủng phân lập có 12 chủng lên men lactic dị hình và 11 chủng lên

men đồng hình

- 23 chủng có khả năng lên men đường lactose, trong đó có 8 chủng sinh khí

- 23 chủng có khả năng lên men đường sacharose, trong đó có 10 chủng sinh khí

- 11 chủng có khả năng lên men đường D-mannitol, trong đó không có chủng nào

sinh khí

- 23 chủng có khả năng lên men đường maltose, trong đó có 9 chủng sinh khí

- 23 chủng có khả năng lên men đường sucrose, trong đó có 11 chủng sinh khí

Định dạng
Số trang	87
Dung lượng	2,21 MB