Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật dứa dại (pandanus odoratissimus), nhó đông (morinda longissima), chùm ruột (phyllanthus acidus) việt nam

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ... Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN CÔNG THÙY TRÂM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA BA LOÀI THỰC VẬT DỨA DẠI

(PANDANUS ODORATISSIMUS), NHÓ ĐÔNG (MORINDA LONGISSIMA), CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2019

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN CÔNG THÙY TRÂM

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA BA LOÀI THỰC VẬT DỨA DẠI

(PANDANUS ODORATISSIMUS), NHÓ ĐÔNG (MORINDA LONGISSIMA), CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Mã số: 942 01 04

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 PGS.TS Đỗ Thị Thảo

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường

Hà Nội, 2019

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án hoàn toàn trung thực, một phần

đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Nguyễn Công Thùy Trâm

ii

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Phòng thử nghiệm sinh học, viện Công nghệ sinh học và phòng Hoạt chất sinh học, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Thị Thảo

và PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường là những người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện Công nghệ sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm và Khoa học Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết

bị, hỗ trợ kinh phí hóa chất và thực hiện các thí nghiệm liên quan trong quá trình làm luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS Ninh Thế Sơn (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên), ThS Nguyễn Thị Cúc, ThS Nguyễn Thị Nga, ThS Đỗ Thị Phương (Viện Công nghệ Sinh học) đã giúp tôi tách chiết và nuôi cấy tế bào trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc đại học Đà Nẵng, Ban Giám hiệu trường đại học Sư Phạm, Đà Nẵng đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận án

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày tháng năm 2019

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Công Thùy Trâm

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Gan và một số bệnh về gan 4

1.1.1 Cấu trúc của gan 4

1.1.2 Chức năng và một số hoạt động sinh lý của gan 6

1.1.3 Một số dạng bệnh lý thường gặp của gan 7

1.2 Stress oxy hóa trong các bệnh gan 9

1.2.1 Gốc tự do 9

1.2.2 Stress oxy hóa trong bệnh gan 10

1.2.3 Chống oxy hóa và bảo vệ gan 10

1.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trong bảo vệ gan in vitro, ex vivo 13

1.3 Vai trò của một số cytokine và hệ chuyển đổi tín hiệu hoạt hóa phiên mã 3 (signal transducer and activator of transcription 3- stat3) trong bệnh gan 14

1.3.1 Một số cytokine liên quan đến sinh học bệnh gan 14

1.3.2 Tín hiệu hoạt hóa phiên mã 3 (Signal transducer and activator of transcription 3 – STAT3) trong tế bào Kupffer và trong bệnh gan 18

1.4 Các loài thực vật sử dụng trong nghiên cứu 19

1.4.1 Cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f) 19

1.4.2 Cây Nhó đông(Morinda longissima Y.Z.Ruan) 22

1.4.3 Cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus L Skeels) 26

Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Vật liệu nghiên cứu 31

2.1.1 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 31

2.1.2 Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu 32

2.1.3 Thiết bị 32

2.2 Các phương pháp nghiên cứu hóa học 33

2.2.1 Phương pháp điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan 33

iv

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 37

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 37

2.3 Các phương pháp nghiên cứu sinh học 38

2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH 38

2.3.2 Phương pháp xác định khả năng ức chế peroxyl hóa lipid (thử nghiệm MDA) 39

2.3.3 Phương pháp xác định khả năng bảo vệ tế bào gan 40

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính cảm ứng/ức chế cytokine 41

2.3.5 Phương pháp xử lí số liệu 42

Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43

3.1 Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và phân tích sơ bộ thành phần hóa học các phân đoạn của quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá Chùm ruột 43

3.1.1 Điều chế các phần chiết từ quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột 43

3.1.2 Sơ bộ phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn tách chiết từ quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá Chùm ruột 43

3.1.3 Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột 45

3.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ các phân đoạn PO-B;ML-B và PA-C 49

3.2.1 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PO-B của quả Dứa dại 49

3.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn ML-B của rễ cây Nhó đông 51

3.2.3 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PA-C của lá cây Chùm ruột 54

3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột 60

3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PO-B quả cây Dứa dại 60

3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông 65

3.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột 69

Chương 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 85

v

4.1 Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của quả Dứa dại, rễ cây

Nhó đông và lá cây Chùm ruột 85 4.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ các phân đoạn PO-B; ML-B

và PA-C 86

4.2.1 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PO-D của quả cây Dứa dại 86 4.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn ML-B của rễ cây Nhó đông 90 4.2.3 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PA-E của lá Chùm ruột 92

4.3 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất đƣợc tách

chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột 106

4.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ

phân đoạn PO-B quả cây Dứa dại 106 4.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ

phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông 108 4.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ

phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột 109

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 116 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 118 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐLIÊN QUAN ĐẾN

ĐỀ TÀI 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

ATP Adenosine triphosphate

ADN Deoxyribonucleic acid

Bcl-xl B-cell lymphoma-extra large

CCl4 Carbon tetrachloride

C-NMR Carbon nuclear magnetic res

COSY Correlation spectroscopy

EtOAc Ethyl acetate

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation

H-NMR Proton nuclear magnetic resonance

HSQC Heteronuclear singlet quantum coherence

vii

NF-B Nuclear factor kappa B

NOESY Nuclear overhause effect

ROS Reactive oxygen species

STAT3 Signal transducer and activation of transcription 3

TNF- Tumor necrosis factors

C Carbon chemicalshift ( độ dịch chuyển hóa học

Carbon)

H Proton chemicalshifrt (độ dịch chuyển hóa học

Proton)

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các phân đoạn chiết của quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây

Chùm ruột 43

Bảng 3.2.Kết quả định tính nhóm các hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn

chiết xuất từ quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột 44

Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ

quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột 46

Bảng 3.4.Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa thông qua ức chế peroxy hóa

lipid (thử nghiệm MDA) của quả Dứa dạiquả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột 47

Bảng 3.5.Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất

được tách chiết từ phân đoạn PO-B quả Dứa dại 63

Bảng 3.6.Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất

được tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông 68

Bảng 3.7.Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất

được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột 73

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào RAW 264.7 của các hợp

chất được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột 77

Bảng 4.1 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất PA5 và PA8 (500 & 125

MHz, MeOD) 101

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ con đường tác động của TNF-α trong tế bào gan 16

Hình 1.2 Tính hiệu STAT3 trong tế bào Kupffer 19

Hình 1.3 Cây Dứa dại 20

Hình 1.4 Cây Nhó đông 23

Hình 1.5 Cây Chùm ruột 26

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn PO-B quả Dứa dại 50

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn PO-B rễ cây Nhó đông 52

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột 55

Hình 3.4 Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất PO1: Vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)-medioresinol phân lập từ phân đoạn chiết PO-B quả Dứa dại và acid ascorbic 61

Hình 3.5 Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất PO1: Vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)-medioresinol 62

Hình 3.6 Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây ra của các hợp chất PO1: vanillin; PO2: pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)-medioresinol được tách chiết từ phân đoạn PO-B của quả Dứa dại 65

Hình 3.7 Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol phân lập từ phân đoạn chiết ML-B rễ cây Nhó đông và acid ascorbic 66

Hình 3.8 Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol phân lập từ phân đoạn chiết ML-B rễ cây Nhó đông 67

Hình 3.9 Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây ra của các hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol được tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông 69

x

Hình 3.10 Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất PA1:

kaempferol; PA2: kaempferol -3-O-β-D-glucopyranoside; PA3: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-

galactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8:

kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester;

PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C lá cây Chùm ruột và acid ascorbic 70

2)-α-L-Hình 3.11 Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất PA1:

kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside; PA3:

quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4:

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA5: L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-

kaempferol-3-O-[α-galactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8:

kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester;

PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C của lá cây Chùm ruột 71

2)-α-L-Hình 3.12 Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây ra của

các hợp chất PA1: kaempferol; PA2: kaempferol 3-O-

β-D-glucopyranoside; PA3: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA5:

xi

ester; PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột 76

2)-α-L-Hình 3.13 Kết quả ức chế sản xuất TNF-α từ tế bào RAW của các hợp chất PA5:

kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucuronopyranoside;

PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12galactopyranoside; PA8: kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-ß-D- glucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C lá cây Chùm ruột tại thời điểm 24 giờ và 48 giờ 80

)]-β-D-Hình 3.14 Kết quả tác động của các hợp chất PA5:

kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-

galactopyranoside; PA8:

kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin

phân lập từ phân đoạn chiết PA-C lá cây Chùm ruột đến quá trình sản sinh IL-6 từ tế bào RAW tại thời điểm 24 giờ và 48 giờ 81

Hình 3.15.Kết quả tác động của các hợp chất PA5:

kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-

galactopyranoside; PA8:

kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin

phân lập từ phân đoạn chiết PA-C lá cây Chùm ruột đến quá trình sản sinh IL-10 từ tế bào RAW 264.7 tại thời điểm 24 giờ và 48 giờ 83

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiêt của đề tài

Gan là một nội quan lớn của cơ thể người và động vật, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình trao đổi chất, thải độc và là cơ quan miễn dịch quan trọng của cơ thể

Máu cung cấp cho gan từ hai nguồn, khoảng 75% lưu lượng máu đi đến gan là

từ các bộ phận của hệ tiêu hóa, lách thông qua tĩnh mạch cửa và 25% còn lại từ động mạch gan Chính vì vậy, áp suất riêng phần của oxi trong máu mang đến cung cấp cho gan rất thấp Ngoài ra, gan nhận các chất, trao đổi chất và chuyển hóa các chất từ máu mang đến Do đó gan thường xuyên tiếp xúc với nội độc tố, các chất độc, vi khuẩn, virut đây là những nguyên nhân làm gan tổn thương và dẫn đến các bệnh về gan (Higuchi và Gores, 2003)

Các độc tố khi vào gan, kích thích tế bào gan sản xuất các cytokine tiền viêm như yếu tố hoại tử khối u (TNF-), interleukin-6 (IL-6) và interleukin-10 (IL-10)…đóng vai trò quan trọng trong quá trình miễn dịch và gây chết tế bào Các cytokine tiền viêm gây ra phản ứng viêm gan, khởi động cho quá trình tự điều chỉnh

để chữa bệnh Tuy nhiên nếu tình trạng viêm không giảm sau một thời gian ngắn, việc sản xuất các cytokine liên tục sẽ dẫn đến sự hình thành xơ hóa và xơ gan (Mannaa và Abdel-Wahhab, 2016) Do đó, có thể thông qua việc điều chỉnh quá trình sản xuất và hoạt động của các cytokine để bảo vệ gan

Bên cạnh đó, stress oxy hóa cũng là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến tổn thương và hoại tử tế bào gây ra trong bệnh về gan Các gốc oxy hóa như hydroxyl, anion superoxide và hidrogen peroxide… phá hủy mô gan, gây tổn thương tế bào thông qua quá trình peroxy hóa lipid màng, đột biến ADN (Cochrane, 1991) Vì vậy, việc tìm ra các tác nhân có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp có hoạt tính chống oxy hóa được đề xuất để ngăn ngừa và điều trị bệnh gan do stress oxy hóa

Cây thảo dược đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người Các loại thuốc được chiết xuất từ thảo dược được dùng phổ biến trong điều trị bệnh, trong đó có bệnh gan do hiệu quả, mức an toàn và chi phí hợp lý Cơ chế bảo vệ gan

của các loại thảo dược thường thông qua hoạt động chống oxy hóa, kháng virus, chống viêm, chống xơ và các hoạt động miễn dịch Tuy nhiên, chỉ có một số các dịch chiết và một số các hợp chất được phân lập từ các loài thảo dược đã được khảo sát, đánh giá

hiệu quả hoạt tính bảo vệ gan trong các mô hình in vitro, ex vivo và in vivo Hầu hết các

loại thảo dược đều chưa được thử nghiệm để chứng minh hiệu quả bảo vệ gan mặc dù được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và trong dân gian (Dhiman và Chawla, 2005)

Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 5.117 loài và dưới loài thực vật bậc cao có mạch được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa bệnh (Viện Dược liệu, 2017) Đây

là nguồn dược liệu quý cần được nghiên cứu, khai thác sử dụng có hiệu quả và bảo tồn, phát triển bền vững cho cộng đồng Trong số những loài đã được phát hiện, cây Dứa

dại (Pandanus odoratissimus), cây Nhó đông (Morinda longissima), cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus) là những cây được sử dụng nhiều trong các bài thuốc dân gian để

điều trị bệnh trong đó có bệnh gan Tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ gan của ba loại cây này sẽ bổ sung thêm nguồn nguyên liệu dược liệu sử dụng trong quá trình hỗ trợ, điều trị bệnh gan

Xuất phát từ nhữnglý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên

cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật Dứa dại (Pandanus odoratissimus), Nhó đông (Morinda longissima), Chùm ruột (Phyllanthus

1 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa từ các dịch chiết của quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông, lá cây Chùm ruột phân bố ở Việt Nam

2 Chiết tách và phân lập một số hợp chất từ 3 loài thực vật này, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập

3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan in vitro của các hợp chất

được phân lập

Đề tài này là cần thiết, đóng góp vào việc nghiên cứu về hoạt tính bảo vệ gan, chống oxy hóa của các dịch chiết, phát hiện các hợp chất tinh khiết có tác

dụng bảo vệ gan được tách chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột phân bố ở Việt Nam Các kết quả của đề tài góp phần giải thích về hoạt tính bảo vệ gan của các bài thuốc dân gian, nâng cao giá trị sử dụng của các loài cây này

2 Những đóng góp mới của luận án

Lần đầu tiên 4 hợp chất được phân lập từ quả Dứa dại và 3 hợp chất được phân lập rễ cây Nhó đông được tiến khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan HepG2 chống lại tác động gây độc của CCl4

11 hợp chất được phân lập từ lá Chùm ruột phân bố ở Việt Nam đã được xác định cấu trúc trong đó có một hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi

Phyllanthus và một hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên là kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl

Các hợp chất được tách chiết từ lá Chùm ruột đã được khảo sát hoạt tính chốg oxy hóa bảo vệ gan, trong đó hợp chất myricitrin thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào gan mạnh nhất thông qua hoạt động chống oxy hóa Đặc biệt hợp chất mới kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-ß-D- glucuronopyranosyl methyl ester có hoạt tính bảo vệ gan mạnh thông qua tác dụng ức chế các cytokine tiền viêm, hoạt động điều chỉnh hàm lượng các cytokine theo thời gian như TNF-α, IL-6, IL-10 trong con đường signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GAN VÀ MỘT SỐ BỆNH VỀ GAN

1.1.1 Cấu trúc của gan

Gan là một tạng lớn nhất của cơ thể với trọng lượng trung bình khoảng 1500g, chiếm khoảng 2,5% trọng lượng cơ thể Gan nằm bên dưới cơ hoành, ở vị trí một phần tư bên phải khoang bụng, giữa dạ dày và tim Mặt ngoài được phủ bởi phúc mạc Dưới phúc mạc là áo xơ (tunica fibrosa) Ở cửa gan, áo xơ đi vào trong gan cùng các mạch tạo nên bao xơ quanh mạch (bao Glisson) (Robin và cs., 2012)

Gan được chia thành 4 thùy chính và 50.000-100.000 tiểu thùy (được xem là đơn vị chức năng) Mỗi tiểu thùy có dạng hình trụ có chiều dài vài milimet (mm) và đường kính có khi lên đến 2 mm Ở mỗi góc tiểu thùy có một khoảng mô liên kết gọi là khoảng cửa chứa nhánh tĩnh mạch cửa, nhánh động mạch gan và ống dẫn mật Ở trung tâm của mỗi tiểu thùy gan có tĩnh mạch trung tâm Từ tĩnh mạch trung tâm có những đôi dây tế bào gan hình lập phương tỏa ra ngoại vi Giữa hai đôi dây

tế bào gan liền nhau là những mao mạch dạng xoang dẫn máu từ nhánh tĩnh mạch cửa và nhánh động mạch gan ở khoảng cửa tới tĩnh mạch trung tâm Thành của mao mạch dạng xoang được tạo ra bởi các tế bào nội mô Tĩnh mạch trung tâm của các tiểu thùy hợp lại thành tĩnh mạch lớn hơn và cuối cùng tạo thành tĩnh mạch gan chạy ra khỏi gan và đổ vào tĩnh mạch chủ dưới Ngoài ra, giữa các đôi dây tế bào gan là các vi quản mật, có đầu ngoại vi đổ vào ống mật ở khoảng cửa (ống gian tiểu thùy) Các ống mật ở khoảng cửa hợp nên những ống mật lớn dần và cuối cùng thành các ống gan phải và ống gan trái đi ra khỏi gan (Nguyễn Văn Huy và cs., 2007; Robin và cs., 2012) Gan được cấu tạo bởi tế bào nhu mô gan hay còn gọi là

tế bào gan và các tế bào không phải là tế bào nhu mô như tế bào Kupffer, tế bào hình sao, tế bào nội mô xoang, tế bào đuôi gai (Robin và cs., 2012)

Tế bào gan chiếm khoảng 70-80% số lượng tế bào có trong gan và tham gia hầu hết các chức năng quan trọng, đặc trưng của gan như: chuyển hóa glucid, lipid,

protein, dự trữ các chất dinh dưỡng, giải độc trong máu trước khi chất độc tham gia vào vòng tuần hoàn và tạo mật (Duncan và cs., 2009) Ngoài ra, tế bào gan tham gia tổng hợp hormon, thrombopoietin, ethythropoientin và chúng còn tổng hợp các cytokine như IL-8, IL-6 trong giai đoạn viêm cấp tính Tuy nhiên, khi hoạt động bảo vệ không thể chống trả lại tác động của các yếu tố gây hại, tế bào nhu mô gan bắt đầu tổng hợp chemokine nhằm thu hút các tế bào kháng viêm như bạch cầu có hạt, đại thực bào đơn nhân và kích hoạt các đại thực bào cư trú tại gan (Ramadori và cs., 2008) Khi tế bào nhu mô gan dày lên là biểu hiện hoạt động tái sinh, tuy nhiên trong trường hợp tổn thương gan, sự dày lên của tế bào gan dấu hiệu của việc xuất hiện các khối u Ngoài ra, các tế bào gan nằm sát với cửa tĩnh mạch tạo thành một lớp màng và sẽ biểu hiện các hoạt động viêm, trong tình trạng tổn thương hay viêm (Krithika,1013)

Tế bào Kupffer là tế bào miễn dịch nằm trong huyết quản chiếm khoảng 90% loại tế bào đại thực bào trong hệ thống lưới nội mô, khoảng 15% trong tổng số

80-tế bào gan (Suraweera và cs., 2015) Tế bào Kupffer đóng vai trò quan trọng trong hoạt động chức năng sinh lý và cân bằng nội môi của gan, cũng như tham gia vào các phản ứng cấp và mạn tính của gan Tế bào này có khả năng loại bỏ vi khuẩn, virus, phức hợp fibrin – fibrinnogen, hồng cầu bị hư hỏng (Canbay và cs., 2003; Roberts và cs., 2007) Tế bào Kupffer có thể hoạt động như tế bào trình diện kháng nguyên (antigen - presenting cell) và tham gia kiểm soát khối u cũng như quá trình tái sinh gan, nó đóng vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch bẩm sinh và bảo

vệ gan thông qua sự sản xuất, bài tiết các chất trung gian gây phản ứng viêm (Kolios và cs., 2006)

Tế bào hình sao (Hepatic Stellate Cell: HSC) là những tế bào trung mô đặc trưng ở gan nằm trong khoảng Disse (khoảng giữa tế bào gan và tế bào nội mô xoang mạch), chiếm khoảng từ 5-8% tổng số tế bào gan Các tế bào này là nơi dự trữ vitamin

A đầu tiên của cơ thể.Tế bào hình sao đóng vai trò chủ yếu trong việc phát triển tế bào, tái tạo gan, trao đổi lipoprotein và retinoid trong gan, quy định quá trình miễn dịch ở gan trong trạng thái sinh lý bình thường và tạo xơ đáp ứng với sự tổn thương gan (Yin

và cs., 2013; Mallat và Lotersztajn, 2013; Lingwal và cs., 2015;)

Tế bào nội mô xoang (Hepatic sinusoidal endothelia cell: HSEC) chiếm khoảng 15-20% tế bào gan và khoảng 70% tổng số tế bào không phải là tế bào nhu

mô của gan, lót bên trong các xoang gan tạo thành lớp nội mô cho phép tế bào máu, huyết tương và các thành phần khác có đường kính nhỏ hơn đường kính lỗ có thể khuếch tán vào bên trong khoảng Disse, tạo điều kiện cho quá trình trao đổi chất và

quá trình miễn dịch (Svistounov và cs., 2012; Xing và cs., 2016) Tế bào nội mô

xoang có khả năng thực bào và có các kháng nguyên thực hiện chức năng sinh lý và

có khả năng đáp ứng miễn dịch và sự biểu hiện của kháng nguyên này giống sự biểu hiện của tế bào đuôi gai (Braet và Wisse, 2002, Xing và cs., 2016)

Tế bào đuôi gai (Dendritic cell: DC) phân bố chủ yếu ở ngoại vi vùng tĩnh mạch cửa và một số ít trong nhu mô gan Tế bào đuôi gai đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng và điều chỉnh các phản ứng miễn dịch cũng như thực hiện chức năng

thực bào, kích thích tế bào T (Lau và Thomson, 2003; Geissmann và cs., 2010)

1.1.2 Chức năng và một số hoạt động sinh lý của gan

Gan thực hiện hơn 500 chức năng khác nhau và gắn liền với các quá trình sinh

lý xảy ra trong cơ thể Gan nhận máu từ hệ tiêu hóa thông qua tĩnh mạch cửa Vì vậy gan là cơ quan đầu tiên, kiểm soát, tiếp nhận các chất dinh dưỡng, trao đổi, chuyển hóa các chất và loại bỏ độc tố ra khỏi các chất dinh dưỡng trước khi các chất dinh dưỡng này được vận chuyển đến cung cấp cho các cơ quan, mô, tế bào trong cơ thể Do đó, khi hoạt động chức năng của gan bị rối loạn sẽ dẫn đến rối loạn các quá trình sinh lý khác xảy ra trong cơ thể (Higuchi và Gores, 2003; Robin và cs., 2012)

Gan đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất, cung cấp năng lượng cần thiết cho cơ thể Gan quy định việc sản xuất, lưu trữ và giải phóng glucid, lipid, protid của cơ thể Gan duy trì đường huyết ở mức tương đối ổn định, chịu trách nhiệm cho oxi hóa khử gốc amin và chuyển hóa amin để tạo nguyên liệu cho

sự tổng hợp axit amin và tổng hợp carbohydrat Thông qua chu trình urê, gan đào thải nitơ ở dạng urê Gan tổng hợp khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể từ acetyl-CoA và loại bỏ cholesterol thông qua hệ tuần hoàn Gan còn tham gia vào quá trình tổng hợp, lưu trữ và bài tiết triglyceride, gan chuyển đổi các axit amin dư

thừa thành axit béo và sau đó chuyển chúng thành ketone tạo năng lượng cho gan Gan tham gia vào quá trình tổng hợp các protein quan trọng của cơ thể như các protein huyết tương (albumin, globulin), các yếu tố đông máu như fibrinogen, prothrombin Ngoài ra, gan còn dự trữ nhiều chất quan trọng cho cơ thể như vitamin (A,D,K, E và B12), sắt, đồng (Robin và cs., 2012)

Gan là cơ quan sản xuất mật Mỗi ngày, tế bào gan tiết ra khoảng 1000ml mật Thành phần của mật gồm nước, muối mật, cholesterol, lecithin, sắc tố mật và một số ion Sau khi được tạo ra mật được chuyển đến dự trữ ở túi mật Tại đây, mật được cô đặc lại và dưới tác dụng của một số kích thích, túi mật sẽ co bóp

800-và đưa mật 800-vào tá tràng qua cơ vòng Oddi Mật có vai trò nhũ tương hóa 800-và phân hủy lipid (Robin và cs., 2012)

Bên cạnh các chức năng trên, gan còn được xem là hàng rào bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các yếu tố độc hại Chức năng này do tế bào gan và tế bào Kupffer đảm nhiệm Tế bào gan có thể giữ lại một số kim loại nặng như đồng, chì, thủy ngân và một số chất màu, sau đó các chất này được thải ra ngoài Bên cạnh đó, các tế bào gan chuyển hóa các chất độc thành các chất ít độc hơn và thải ra ngoài qua đường mật NH3 được tạo ra trong cơ thể thông qua quá trình tạo amin hoặc hấp thu từ ruột già sẽ được tế bào gan chuyển hóa thành urê qua chu trình ornithine và sau đó urê được thải ra ngoài trong nước tiểu (Robin và cs., 2012)

1.1.3 Một số dạng bệnh lý thường gặp của gan

Bệnh gan là một khái niệm rộng bao gồm tất các vấn đề tiềm ẩn gây ra, dẫn đến gan suy giảm chức năng hoặc không thể thực hiện được chức năng của nó Thông thường khoảng hơn ¾ mô gan bị ảnh hưởng trước khi xảy ra quá trình giảm chức năng hoạt động Dựa vào nguyên nhân và sự tiến triển của bệnh, bệnh gan thường được chia thành các dạng bệnh như: viêm gan, bệnh gan nhiễm mỡ, xơ gan (Ramadori và cs., 2008)

Viêm gan

Viêm gan là một bệnh của gan đặc trưng bởi sự xuất hiện của viêm tế bào trong các mô gan mà nguyên nhân chính là do nhiễm virus, do thuốc hay do nhiễm độc (Ramadori và cs., 2008)

Trong những điều kiện nhất định viêm gan sẽ tiến triển thành gan nhiễm mỡ hoặc xơ gan Viêm gan có thể không có các triệu chứng hoặc có các triệu chứng như vàng da, chán ăn, mệt mỏi Viêm gan có thể được chia thành viêm gan cấp tính

Xơ gan

Xơ gan là hậu quả của bệnh viêm gan mãn tính đặc trưng bởi sự thoái hóa và hoại tử tế bào gan không phục hồi và thay thế các nhu mô gan bằng mô xơ, mô sẹo, các nốt tân tạo cản trở quá trình lưu thông máu trong gan dẫn đến suy giảm và mất chức năng gan Xơ hóa là quá trình bệnh lý quan trọng trong tiến triển của tất cả các bệnh gan mãn tính dẫn đến xơ gan Nguyên nhân dẫn đến xơ gan là do nghiện rượu,

do nhiễm vi rút viêm gan B và C, gan nhiễm mỡ và có thể do nhiều nguyên nhân khác như viêm gan tự miễn, bất thường về di truyền (Lee và cs., 2014; Zhou và cs., 2014)

Như vậy, có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến các bệnh về gan do tác động của các yếu tố bên ngoài hay ngay trong chính bản thân các tế bào gan Các yếu tố này dẫn đến xáo trộn sự cân bằng nội tế bào gồm có phá hủy ADN, hoạt hóa glutathion

của các chu trình oxy hóa khử, giảm ATP, NADH hay quá peroxid hóa màng tế bào Hiểu rõ các nguyên nhân, cơ chế gây bệnh gan là cần thiết để từ đó tìm ra hướng điều trị bệnh cũng như các loại thuốc điều trị và bảo vệ gan

1.2 STRESS OXY HÓA TRONG CÁC BỆNH GAN

1.2.1 Gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử ở lớp ngoài cùng có những electron không ghép đôi Gốc tự do có thể tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại ngắn và dễ dàng tham vào các phản ứng hóa học với các phân tử như protein, lipid, carbohydrate, ADN… trong cơ thể Các phân tử này sau khi nhường electron cũng sẽ giành electron từ các phân tử khác, do đó dẫn đến phản ứng dây chuyền không kiểm soát được và làm tổn thương, mất chức năng của các tế bào và mô, đây là một trong những nguồn gốc phát sinh bệnh tật Gốc tự do có thể được phân thành dạng hoạt động của nitrogen (reactive nitrogen species – RNS) và dạng hoạt động của oxygen (reactive oxygen species – ROS), trong đó ROS là gốc

tự do đóng vai trò quan trọng trong cơ thể (ValKo và cs., 2006)

Gốc tự do trong cơ thể sinh vật có hai nguồn gốc phát sinh gồm nội sinh và ngoại sinh Trong đó, gốc tự do có nguồn nội sinh được chính cơ thể tạo ra qua những quá trình chuyển hóa tự nhiên như hô hấp tế bào, quá trình trao đổi chất (Bergendi và cs., 1999) Các gốc tự do có nguồn gốc nội sinh còn được tạo ra trong các phản ứng hóa sinh có sự tham gia của các phân tử oxy và được xúc tác bởi các phân tử CYP450 Số lượng gốc tự do được tạo ra tùy thuộc vào các hợp chất bị phân hủy và loại phân tử CYP450 tham gia xúc tác Trong đó, đáng chú ý là các phản ứng có sự tham gia của phân tử CYP450 2E1 (Lieber, 1996)

Trong cơ thể, sau khi được tạo ra, ROS góp phần tiêu diệt các vi sinh vật có hại xâm nhập vào cơ thể, thu dọn các tế bào già, các tế bào chết trong cơ thể, tạo điều kiện cho các tế bào mới được sinh ra và phát triển, góp phần tiêu diệt các tế bào bất thường như tế bào ung thư Ngoài ra, ROS còn đóng vai trò là tín hiệu tế bào, là chất dẫn truyền thần kinh và cần thiết cho việc hình thành một số hormon như thyroxin (Hancock và cs., 2001) Tuy nhiên, khi được sinh ra với nồng độ cao,

vượt qua sự kiểm soát của cơ thể, ROS gây ra những bất lợi đối với cơ thể như quá trình stress oxy hóa (Meister và cs., 1992; Katalinic và cs., 2006), quá trình peroxy hóa lipid (Meister và cs., 1992), làm hư hỏng protein (Gebicki và cs., 2000), phá hủy ADN (Dizdaroglu và cs., 2002) và là nguyên nhân của quá trình lão hóa (Varga, 1991), đây là một trong những nguyên nhân gây bệnh cho cơ thể, trong đó

có bệnh gan

1.2.2 Stress oxy hóa trong bệnh gan

Stress oxy hóa (oxidative stress) là kết quả của sự mất cân bằng giữa sự hình thành số lượng gốc tự do và lượng các chất chống oxy hóa nội sinh Điều này xảy ra khi các gốc tự do được sinh ra với lượng lớn, các chất chống oxy hóa có hàm lượng thấp, không đủ để trung hòa các gốc tự do Kết quả là các phân tử sinh học như lipid, protein, acid nucleic có thể bị oxy hóa nghiêm trọng, sự chuyển đổi tín hiệu và biểu hiện gen bị rối loạn dẫn đến tổn thương, sự chết tế bào thông qua cơ chế hoại

tử hoặc apoptosis Stress oxi hóa dẫn đến hậu quả phát sinh nhiều bệnh trong đó đó

và cs., 2015)

1.2.3 Chống oxy hóa và bảo vệ gan

Stress oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong các bệnh về gan, như vậy sử dụng các chất chống oxy hóa được xem là một trong những phương pháp hỗ trợ điều trị các bệnh về gan Chất chống oxy hóa là những hợp chất có thể loại bỏ các gốc tự do, ngăn cản sự hình thành hoặc ức chế hoạt động gây hại của các gốc tự do Hiện nay các chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật đang được các nhà khoa học chú ý nghiên cứu, tìm kiếm để đưa vào hỗ trợ điều trị bệnh Các chất chống oxy hóa này giúp loại bỏ các gốc tự do thông qua nhiều con đường khác nhau

Các phân tử chống oxy hóa có thể phản ứng trực tiếp với các gốc tự do để loại bỏ chúng và trở thành các gốc tự do mới ít hoạt hóa, ít gây tác hại hơn so với các gốc tự do mà chúng vô hiệu hóa Các gốc tự do mới này có thể bị loại bỏ tình trạng oxy hóa của chúng bởi các chất chống oxy hóa khác hoặc thông qua các cơ chế khác (Lü và cs., 2010) Vitamin E là một chất chống oxy hóa hòa tan trong lipit được nghiên cứu nhiều nhất Nó có chức năng ngăn chặn gốc lipid peroxyl (LOO*)

để chấm dứt chuỗi phản ứng peroxy hóa lipid trên màng tế bào (Nimse và Pal, 2015) Trong gan, vitamin E có thể ức chế sự sao chép virut viêm gan B Ngoài ra, vitamin E còn ức chế hoạt động của gen TGG beta (gen ức chế sự tiến triển của ung thư) trên mô hình chuột bị gây viêm gan nhiễm mỡ không do rượu và ngăn cản sự tiến triển của bệnh viêm gan mạn tính thông qua hoạt động chống oxy hóa (Ha và cs., 2010; Mukaddes, 2012; Sumida và cs., 2013) Vitamin C (axit ascorbic) là chất chống oxy hóa hòa tan trong nước và nó có thể trở thành gốc tự do ascorbate bằng cách nhường điện tử cho gốc lipid để chấm dứt chuỗi phản ứng peroxyl hóa lipid (Nimse và Pal, 2015) Vitamin C có tác dụng tốt ở những bệnh nhân nhiễm virut viêm gan C (Ha và cs., 2010) Các hợp chất là phenolic có đặc tính chống oxy hóa, dập tắt các gốc tự do thông qua việc nhường nguyên tử Hydro Trong quá trình này các nhóm phenolic được biến đổi thành phenoxyl do sự nhường điện tử của định khu trong các vòng benzene hoặc các liên kết đôi, các phenoxyl ít có hại và không phản ứng với các phân tử chất nền do đó, các hợp chất phenolic thường được chú trong nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan (Nagababu và cs., 2010) Flavonoid là hợp chất quan trọng có tác dụng bảo vệ gan thông qua hoạt động chống oxy, làm giảm các gốc tự do bằng cách nhường Hydro cho gốc tự do, giảm quá trình peroxy hóa lipid, bảo vệ tế bào gan, giải độc gan, bảo vệ chức năng gan, chống quá trình lão hóa và chống viêm Hoạt tính của flavonoid nhờ cấu trúc hóa học của nó gồm vòng thơm, hệ nối đôi liên hợp carbonyl, nhóm OH phenol (Bùi Thị Hằng, 2008) Catechin có tác dụng kích thích miễn dịch, bảo vệ chức năng gan ở bệnh nhân viêm gan B thông qua hoạt tính chống oxi hóa Các dẫn xuất của catechin như gallocatechin, epigallocatechin cũng có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn

thương gan bởi D-galactosamin và lipopolysaccharid ở chuột nhắt trắng (Bùi thị Hằng, 2008)

Một chức năng quan trọng khác của các chất chống oxy hóa là điều chỉnh các enzym liên quan đến ROS Các chất chống oxy hóa có thể làm giảm số lượng gốc tự

do trong tế bào bằng cách ức chế hoạt động của các enzym xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử như NADPH oxidase, xanthine oxidase (XO) hay tăng cường hoạt động của các enzym chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD), catatlase (CAT) và peroxidase glutathione (Lü và cs., 2010) L-teanine là một amino acid được tách chiết từ trà xanh đã được chứng minh có khả năng chống oxy hóa thông qua khả phục hồi hoạt động của enzym SOD và gluctathione (GSH) (Li và cs., 2012) Axit betulinic là một pentacyclic lupane thuộc loại triterpene có mặt trong nhiều loại thực vật có khả năng làm tăng hoạt động của các enzym chống oxy hóa trong gan thông qua hoạt động tăng cường hệ thống oxi hóa khử mô bào và bảo vệ

hệ thống oxi hóa khử trong gan (Yi và cs, 2011) Quercetin là một flavonoid polyphenolic được tìm thấy với số lượng lớn trong một số thực phẩm có khả năng làm tăng hoạt động của enzym glutathione S-transferase (GST) chống quá trình oxy hóa, bảo vệ gan (Ansar và cs., 2016)

Ngoài hai con đường trên, các hợp chất chống oxy hóa còn đóng vai trò là tác nhân xúc tác phản ứng cạnh tranh để loại bỏ gốc tự do Với cấu trúc đặc biệt chứa cả nhóm cation và catechol, demethyleneberberine chất chống oxy hóa tự

nhiên có nguồn từ loài thảo mộc Cortex Phellodendri chinensis có khả năng xâm

nhập và tích tụ vào màng ti thể Chất này đã có tác dụng làm giảm sự rối loạn chức năng của ti thể do đó là giảm stress (Zhang và cs., 2015) Anthocyanin được tách chiết từ khoai lang tím là một flavonoid chống oxi hóa tiềm năng Anthocyanin có hoạt tính bảo vệ gan tránh những tác động có hại do paracetamol gây ra như điều hòa nồng độ GSH, cũng như hoạt động của GSH S-transferase trong gan Bên cạnh

đó, anthocyanin còn có tác dụng chống oxy hóa lipid do FeCl2/ascorbate gây ra trong dịch đồng thể gan (Choi và cs., 2009)

Như vậy, các chất chống oxy hóa bằng những con đường khác nhau có thể loại bỏ các gốc tự do, giảm thiệt hại do các gốc tự do gây ra

1.2.4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trong bảo vệ gan in vitro, ex vivo

Các gốc tự do gây hại cho gan chủ yếu thông qua con đường peroxy hóa lipid và những tổn thương stress oxi hóa gây gây ra Chất chống oxy hóa có khả năng ngăn chặn sự peroxy hóa lipid nên nó là nhân tố bảo vệ sức khỏe quan trọng ngăn ngừa một số bệnh trong đó có bệnh gan (Singal và cs., 2011) Có nhiều phương pháp khác nhau để đo khả năng chống oxy hóa Trong đó, phương pháp loại

bỏ gốc tự do DPPH (1,1,-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và phương pháp đo khả năng

ức chế quá trình peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) là một trong những phương pháp có thể sử dụng để xác định hoạt tính chất chống oxi hóa của chiết xuất thực vật hoặc hợp chất phân lập tinh khiết

Phương pháp đánh giá khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH là một phương pháp thường được sử dụng để xác định khả năng thu dọn gốc tự do Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và ổn định vì vậy được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các chất chống oxi hóa (Fukumoto và Mazza, 2000; Alam và cs., 2013) DPPH là một gốc tự

do có bước sóng cực đại hấp thu tại 517nm và có màu tím Các chất có khả năng chống oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt (Molyneux, 2004; Alam và cs., 2013)

Phương pháp xác định khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) là phương pháp thuận tiện, có độ nhạy cao giúp cho việc đánh giá nồng độ peroxy lipid trong nhiều mẫu khác nhau như thuốc, thực phẩm, mô sinh học từ người và động vật (Calyniuk và cs., 2016) Đây là phương pháp dựa vào phản ứng giữa malondialdehyd (MDA) - sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid với axit thiobarbituric ở 90oC trong môi trường axit tạo phức có màu hồng, 2 mol axit thiobarbituric kết hợp với một mol MDA Phức màu được hòa tan trong dung môi hữu cơ như butanol và sau đó đo phổ hấp thụ ở bước sóng 532nm (Sochor và

cs 2012; Alam và cs., 2013)

1.3 VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ CYTOKINE VÀ HỆ CHUYỂN ĐỔI TÍN HIỆU HOẠT HÓA PHIÊN MÃ 3 (SIGNAL TRANSDUCER AND

ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION3- STAT3) TRONG BỆNH GAN

1.3.1 Một số cytokine liên quan đến sinh học bệnh gan

Cytokine là những protein hay glycoprotein được tạo ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau trong đó có tế bào gan Cytokine bao gồm chemokine, interferon, interleukin, lymphokine và yếu tố hoại tử khối u Chúng đóng vai trò đặc trưng trong sự tác động qua lại và truyền thông tin giữa các tế bào

Trong điều kiện bình thường, các tế bào gan như tế bào nhu mô gan, tế bào Kupffer, tế bào hình sao…sản xuất một lượng các cytokine tối thiểu nhưng khi tiếp xúc với các yếu tố độc hại, chúng sẽ bị kích thích, dẫn đến quá trình sản sinh, giải phóng các cytokine tăng lên và gây ra phản ứng viêm ở gan Việc tăng các cytokine được coi là điều kiện cần thiết khởi đầu cho quá trình điều trị bệnh (Losser và Payen, 1996; Oppenheim, 2001) Tuy nhiên, nếu lượng cytokine được sản sinh quá mức và diễn ra trong một thời gian dài sẽ dẫn đến những tác hại cho gan Trong đó, đáng chú ý là sự thay đổi nồng độ của các cytokine như TNF-, interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10)…, là các cytokine liên quan đến sinh bệnh học của gan trong hầu hết các bệnh liên quan đến tổn thương gan (Tilg và cs., 1992, Niederreiter

và Tilg, 2018)

TNF- là một cytokine xuất hiện sớm nhất khi gan bị tổn thương, gây ra sự sản sinh các cytokine khác, gây viêm, tham gia vào sinh lý bệnh học của viêm gan siêu vi, bệnh gan do rượu, bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu và chứng tổn thương thiếu máu cục bộ TNF- là chất trung gian trong sự chết của tế bào, đồng thời gây nên quá trình tăng sinh tế bào và tái tạo gan (McClain và cs., 2004, Schwabe và Brenner, 2006) Sau khi được tạo ra, TNF- tác động đến tế bào gan thông qua các thụ thể TNF đặc hiệu trên màng tế bào (TNF-R1 và TNF-R2) TNF- liên kết với TNF-R làm thay đổi cấu trúc của TNF-R, cho phép chúng bổ sung thêm phân tử và bắt đầu con đường truyền tín hiệu tế bào Sau khi liên kết với TNF-, trong môi

trường nội bào, TNF-R1 liên kết với adaptor protein để gắn với thụ thể nhân tố hoại

tử khối u (TNF receptor-associated death domain - TRADD) và qua đó liên kết với các adaptor protein khác như thụ thể tương tác (receptor interacting protein 1 - RIP1), yếu tố kết hợp TNF-R (TNFR associated factor 2 - TRAF2), các phân tử tiếp hợp (Fas-associated death domain - FADD) để tạo phức hợp TRADD-RIP1-TRAF2 Sau đó, phức hợp này được giải phóng ra khỏi TNF-R1 Trong khi đó, TNF-R2 tương tác trực tiếp với TRAF2 không cần thông qua TRADD Sau khi được hoạt hóa, RIP1 và TRAF2 sẽ kích hoạt yếu tố nhân kappa B (Nuclear factor kappa B - NF-B), Jun N-terminal kinase (JNK) và p38, còn FADD sẽ kích hoạt các caspase và quá trình chết theo chương trình (Schwabe và Brenner, 2006; Parameswaran và Patial, 2010)

Trong tế bào chất, NF-B kết hợp với protein ức chế I-kappa-B (IB) và ở dạng không hoạt động RIP1 và TRAF2 dạng hoạt hóa sẽ kích hoạt IB kinase (IKK) và dẫn đến quá trình phosphoryl hóa IB khiến IB bị phân hủy bởi các protein phân giải Kết quả NF-B được giải phóng ra khỏi IB và được hoạt hóa NF-B hoạt hóa sẽ gây ra sự hoạt động một số protein ức chế quá trình tự chết của

tế bào (apoptotic) như cIAPs, c-FLIP, A1, A20, TRAF2 và Bcl-xl Yếu tố NF-B đã hoạt hóa sẽ di chuyển đến nhân và kích hoạt quá trình phiên mã của các gen thuộc con đường tín hiệu do NF-B quy định Các gen này mã hóa cho các yếu tố có khả năng ức chế hoạt động của JNK trong đó có enzyme SOD2, giữ vai trò ức chế quá trình oxi hóa trong tế bào do đó ngăn chặn hiện tượng chết tế bào gan do TNF-

gây ra (Schwabe và Brenner 2006; Papa và cs, 2009)

Bên cạnh quá trình hoạt hóa NF-B, RIP1 và TRAF2 khi liên kết với TRADD sẽ phosphoryl hóa các kinase mang tín hiệu gây chết theo chương trình của

tế bào (apoptosis singaling kinase 1- ASK1) Tiếp sau đó, ASK1 hoạt hóa kinase kinase protein được hoạt hóa bởi tác nhân phân bào (mitogen-activated protein kinase kinase - MKK) như MKK4 và MKK7 và dẫn đến quá trình phosphoryl hóa JNK Ngoài ra, TNF- còn gây nên quá trình tạo ra ROS và ROS góp phần kích hoạt JNK, bất hoạt MAPK phosphatases (MKP) do đó kéo dài quá trình kích hoạt JNK (Schwabe và Brenner, 2006; Papa và cs, 2009; Seki và cs, 2012)

Khi được kích hoạt, JNK gây phosphryl hóa c-Jun dẫn đến quá trình tăng sinh tế bào gan Tuy nhiên, nếu bị kích thích kéo dài, JNK gây phosphoryl hóa E3 ligase Itch, sau đó ubiquitin hóa và làm suy biến c-FLIP dẫn đến tăng tính nhạy cảm của TNF- gây chết tế bào (Schwabe và Brenner, 2006) Quá trình này được mô tả

cụ thể trong sơ đồ hình 1.1

Hình 1.1 Sơ đồ con đường tác động của TNF-α trong tế bào gan

(Nguồn: Schwabe và Brenner, 2006)

Như vậy, JNK hoạt động kéo dài sẽ dẫn đến quá trình chết theo chương trình của tế bào gan Quá trình chết theo chương trình của tế bào khi diễn ra cần một lượng lớn ATP Tuy nhiên, trong giai đoạn đầu của quá trình chết theo chương trình của tế bào gan diễn ra sự kích hoạt quá mức poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)-1- (đây là quá trình đóng vai trò quan trọng trong tín hiệu chết theo chương trình) do đó tiêu hao nhiều NAD+, vì vậy đòi hỏi sự tổng hợp NAD+ và gây nên sự suy giảm ATP Chính sự suy giảm ATP dẫn đến lượng ATP cung cấp cho quá trình chết theo chương trình của tế bào bị thiếu hụt, vì vậy tế bào gan chuyển từ quá trình chết theo chương trình sang hoại tử (Ha và Snyder, 1999)

Ty thể cũng là mục tiêu quan trọng đối với tín hiệu tử vong do TNF- Thông qua con đường truyền tín hiệu tế bào, TNF- tác động đến ty thể trong tế bào gan làm thoái hóa mào ty thể hình thành các không bào trong chất nền ty thể do đó thay đổi hình thái ty thể Ngoài ra, TNF- còn làm tăng sự thủy phân glycogen, giảm tốc độ tổng hợp ATP, ức chế quá trình vận chuyển electron, ảnh hưởng đến khả năng oxy hóa các chất nền succinate và NADH Bên cạnh đó, trong trạng thái sinh lý bình thường, khoảng 1-2% lượng oxy tiêu thụ trong ty thể được sử dụng để hình thành các các gốc oxy hóa tự do nhưng khi tín hiệu TNF- tác động đến ty thể, sự phát sinh các gốc tự do này năng lên gấp đôi dẫn dến strsess oxi hóa, quá trình peroxyl hóa lipid màng tế bào diễn ra, gây hoại tử tế bào gan (Schulze-Osthoff và cs., 1992)

nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào Kupffer, tế bào nội mô xoang, tế bào hình sao, tế bào lympho Những tín hiệu của các yếu tố nội và ngoại sinh như stress oxi hóa, tăng các gốc tự do, TNF-, catecholamine thông qua con đường cAMP/protein kinase A/CREB-1/ATF-1 kích thích những tế bào trên để sản xuất IL-10 và gan được coi là nguồn sản xuất IL-10 chính (Zhang và Wang, 2006; Kawaratani và cs., 2013) IL-10 tác động đến tế bào gan thông qua thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào IL-10R Sự tương tác giữa IL-10/ IL-10R kích hoạt tyrosine kinase Jak1 và Tyk2, ức chế hoạt động của NF-B, dẫn đến sự hoạt hóa phiên mã của các gen trong tế bào (Driessler và cs., 2004; Zhang và Wang, 2006) IL-10 làm giảm sản xuất các cytokine tiền viêm như TNF-α, IL-1β và IL-6 từ đại thực bào hoạt hóa hoặc bạch cầu đơn nhân IL-10 ức chế sự tổng hợp cytokine của tế bào lympho T CD4+ thông qua việc gây một số tác động trực tiếp đến tế bào lympho T CD4+ (Zhang và Wang, 2006) IL-10 ngăn chặn quá trình chết theo chương trình và tăng cường sự phát triển biệt hóa của các tế bào plasma cũng như quá trình tổng hợp IgM, ức chế quá trình sản xuất các chemokine khác nhau của bạch cầu trung tính IL-10 còn có tác dụng bảo vệ gan bằng sự tăng sinh tế bào gan (Louis và cs., 2003)

1.3.2 Tín hiệu hoạt hóa phiên mã 3 (Signal transducer and activator of transcription 3 – STAT3) trong tế bào Kupffer và trong bệnh gan

STAT3 là một loại protein của nhóm protein STAT, được kích hoạt bởi các tín hiệu cytokine khác nhau (IL-6, IL-10…), đóng vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch, tạo máu, viêm và phát sinh ung thư

Sau khi gan bị tổn thương, các tế bào gan như tế bào Kupffer, tế bào nhu mô gan, tế bào lympho, các tế bào đuôi gai bài tiết các cytokine tiền viêm và cytokine bảo

vệ gan Các cytokine như IL-6, IL-11, IL-22, IFN-γ, IFN-/β… sau khi được tiết ra có khả năng kích hoạt STAT3 trong các tế bào gan (Gao, 2005)

Ở tế bào Kupffer, IL-6 và IL-10 có khả năng kích hoạt STAT3, với chức năng đối lập nhau Trong khi, IL-6 kích hoạt STAT3 tạo phản ứng tiền viêm trên màng của đại thực bào, thì IL-10 kích hoạt STAT3 dẫn đến quá trình ức chế TNF-

, IL-6 v.v., do đó gây ức chế phản ứng viêm trong đại thực bào và tế bào Kupffer

(Mandal và cs., 2010, Campana và cs., 2018) IL-6 và IL-10 thông qua quá trình hoạt hóa STAT3, sẽ hoạt hóa protein dẫn truyền tín hiệu cytokine (cytokine signaling 3 – SOCS3) trong đại thực bào Sau khi được hoạt hóa ức chế tín hiệu IL-6 thông qua gp130, dẫn tới ức chế chức năng hoạt hóa STAT3 của IL-6 và gây phản ứng viêm chỉ diễn ra trong một khoảng thời gian ngắn Tuy nhiên, SOCS3 không ngăn chặn chức năng hoạt hóa STAT3 của IL-10, vì vậy, IL-10 gây nên sự kích hoạt STAT3 kéo dài và ức chế phản ứng viêm trong đại thực bào (Yasukawa

và cs., 2003) Tín hiệu STAT3 trong mối liên hệ với IL-6, IL-10 được mô tả qua

sơ đồ hình 1.2

Hình 1.2 Tính hiệu STAT3 trong tế bào Kupffer

(Nguồn: Wang và cs., 2011)

1.4 CÁC LOÀI THỰC VẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

1.4.1 Cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f)

1.4.1.1.Tổng quan về cây Dứa dại

Cây Dứa dại có tên khoa học Pandanus odoratissimus L.f thuộc chi Pandanus, họ Pandanaceae

Ở Việt Nam, Dứa dại thường phân bố trên các bãi ẩm có cát, trong các rú bụi ven biển, dọc bờ ngòi nước mặn, rừng ngập mặn, cũng phân bố trong đất liền, ở vĩ

độ thấp, dọc theo các sông, từ Hoà Bình, Quảng Ninh, Hà Nam tới Quảng Nam-Đà Nẵng, Khánh Hoà, Bình Thuận, Đồng Nai, Kiên Giang

Cây Dứa dạilà dạng cây thảo mộc lâu năm Cây nhỏ, phân nhánh ở ngọn, cao

2-4m, với rất nhiều rễ phụ trong không khí Lá ở ngọn các nhánh, hình dải, dài 2m, trên gân chính và 2 bên mép có gai nhọn Bông mo đực ở ngọn cây, thõng xuống, với những mo màu trắng, rời nhau Hoa rất thơm, bông mo cái đơn độc, gồm rất nhiều lá noãn Cụm quả tạo thành một khối hình trứng dài 16-22cm, có cuống màu da cam, gồm những quả hạch có góc, xẻ thành nhiều ô, ra hoa và quả vào mùa

1-hè (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Hình 1.3 Cây Dứa dại

Theo đông y, lá Dứa dại có vị đắng, cay, thơm với công năng sát khuẩn, hạ nhiệt làm long đờm, lợi niệu Rễ Dứa dại được sử dụng làm thuốc nhiều hơn, có vị ngọt nhạt, tính mát, công hiệu lương huyết, lợi tiểu, tiêu độc, trừ đàm, phát hãn (ra

mồ hôi), nên dùng trị cảm mạo, phát sốt, viêm thận, thủy thũng, viêm đường tiết niệu, viêm gan, xơ gan cổ trướng, viêm kết mạc mắt Ngoài ra còn dùng quả Dứa dại trị lỵ, ho, hạt quả trị viêm tinh hoàn hay trĩ…(Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.4.1.2 Thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ gan của cây Dứa dại

Bằng các phương pháp sắc ký và phương pháp phân tích hợp chất hữu cơ bằng quang phổ, các nhà khoa học đã nghiên cứu tách chiết xác lập cấu trúc hóa học, định danh các hợp chất có trong loài Dứa dại Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần hợp chất chính có trong Dứa dại là các alkaloid, steroid, terpenoid, phenol, glycoside, carbonhydrate, protein, flavonoid (Kusuma và cs., 2012)

Từ lá phân lập được các alkaloid dạng piperidine gốc lactone như pandamarilactone-1, pandamarilactone-31, pandamarilactone-32 Ngoài ra các hợp chất glycoside, triterpenoid, steroid, flavonoid và tannin cũng được tìm thấy ở lá (Kusuma và cs., 2012)

Từ rễ tách chiết được các hợp chất phenolic, hợp chất loại lignan và dẫn xuất

bezofuran Trong đó, nhóm hợp chất phenolic: như vanillin,

-từ rễ cây của loài P.odoratissimus Trong số các hợp chất được phân lập -từ rễ,

stigmast-5,22-dien-3β-ol có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, còn pinoresinol và bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl) tetrahydrofuran có hoạt tính chống oxy hóa mạnh (Jong và Châu, 1998; Adkar và Bhaskar, 2014; Sahu và cs., 2016)

3,4-Ngoài ra còn có một số hợp chất khác được tách chiết từ các bộ phận khác của cây Dứa dại, như từ thân tách chiết được các hợp chất như physion, cirsilineol, n-triacontanol, -sitosterol, compesterol, daucesterol và aicdpalmitic và stearicacid (Kusuma và cs., 2012) Từ quả và lá, các tinh thể calcium oxalate hình kim cũng được tìm thấy (Ariffin và cs., 2012) Các hợp chất như 3-4-(3-(4-(dimethylamino)cinnamoyyl)-4-hydroxycomarin; 3,3'-methylenebis (4-hydroxycomarin) và erythro-9, 10-dihydroxyoctadecanoic acid; octadecanedioic acid; dihydroagathic acid cũng được phân lập từ dịch chiết methanol của cây Dứa dại (Mahalingam và cs., 2012)

Bên cạnh các nghiên cứu phân lập thành phần hóa học, hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan và các hoạt tính sinh học khác của cây Dứa dại cũng được tiến hành khảo

sát Theo kết quả đã được công bố của các công trình nghiên cứu in vivo cho thấy cây

Dứa dại có hoạt tính bảo vệ gan chống lại các tổn thương gây ra do các chất độc Dịch chiết từ các bộ phận của cây Dứa dại như rễ, hoa có hoạt tính bảo vệ gan thông qua hoạt động làm giảm nồng độ các enzym GOT, GPT, trong huyết thanh chuột bị gây nhiễm độc gan bằng paracetamol (Mishra và cs., 2015; El-Shaibany và cs., 2016)

Dịch chiết từ lá của cây Dứa dại thông qua con đường chống oxy hóa, hoạt động ức chế sự tạo thành gốc tự do và loại bỏ các gốc tự do đã có tác dụng bảo vệ gan chống lại những tổn thương gan do CCl4 gây ra (Londonkar và Kamble, 2009; Londonkar và Kamble, 2011)

Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ rễ cây Dứa dại có thể do một số hợp chất như pinoresinol và 3,4-bis(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)tetrahydrofuran… quy định (Jong và Châu, 1998) Ngoài ra, dịch chiết từ rễ cây Dứa dại còn có hoạt tính điều trị bệnh gan trên chuột bị gây tổn thương gan bằng CCl4 (IIanchezhian và Roshy, 2010)

Như vậy, kết quả của các công trình nghiên cứu đã cho thấy dịch chiết từ các

bộ phận khác nhau cây Dứa dại đã có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu chủ yếu được tiến hành trên các dịch chiết được chiết xuất từ rễ và lá, các công trình nghiên cứu về hoạt tính của dịch chiết, phân đoạn và chất tinh sạch từ quả còn rất ít Vì vậy, trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của dịch chiết, các phân đoạn và chất tinh

sạch từ quả Dứa dại

1.4.2 Cây Nhó đông(Morinda longissima Y.Z.Ruan)

1.4.2.1 Tổng quan về cây Nhó đông

Cây Nhó đông tên khoa học Morinda longissimaY.Z.Ruan thuộc chi Morinda, họ Rubiaceae là loại cây bụi, mọc thẳng đứng, cao khoảng 2-4m, rễ có

màu vàng, vị đắng Cành non có 4 cạnh, màu xanh lục nhạt Lá mọc đối, cuống dài 2-3cm, hình bầu dục thuôn hoặc hình mác đảo, gốc thuôn, đầu nhọn, dài khoảng 12-18cm, rộng khoảng 6-10cm, hai mặt lá lúc còn non gần như không có lông, nhưng khi già mặt dưới lá có ít lông ngắn, mềm, gân giữa nổi rõ ở cả hai mặt, gân bên có 8-10 đôi mọc xiên lên đầu lá, gân mạng lưới không rõ, lá kèm 2 mọc đối, hình bán nguyệt hoặc gần hình tim, đỉnh nhọn sắc hoặc chia thành hai thùy Cây Nhó đông ra hoa vào khoảng tháng 4 đến thàng 6 và ra quả khoảng từ tháng 6 đến tháng 12 Hoa

nhỏ, hình ống, không cuống, mọc sít nhau, thành cụm ở đầu cành hay kẽ lá, gốc mỗi hoa có 1-2 hàng phiến bào hình giùi, phiến bao giữa lớn hơn Lúc đầu, các lá đài không dính nhau, sau đó biến đổi thành dạng vòng, có khoảng 4-5 cánh hoa, màu trắng, ống tràng dài 2,5-3cm, họng không có lông, có 4-5 nhị dính ở 2/5 phần trên ống tràng, chỉ nhị ngắn khoảng 1mm, không vươn ra khỏi ống tràng, bao phấn thuôn, 2 ô, mở dọc, bầu 4 ô, vòi nhụy xuất phát từ chỗ lõm của bầu, dài khoảng 7mm, đầu nhụy xẻ thành 2 thùy dạng sợị Quả nạc gồm nhiều quả mọng (Ngô Văn Trại và cs., 2004)

Hình 1.4 Cây Nhó đông

Loài này phân bố ở phía nam tỉnh Vân Nam, Trung Quốc và ở Sơn La, Lào Cai, Quảng Nam, Thừa Thiên – Huế, Việt Nam Cây Nhó đông mọc rải rác ở rừng thứ sinh, ven rừng nguyên sinh hoặc trên nương rẫy cũ ở độ cao dưới 800m so với mặt nước biển(Ngô văn Trại và cs., 2004)

Cây Nhó đông, theo kinh nghiệm cổ truyền, toàn cây hoặc chủ yếu là phần rễ cây Nhó đông đã được đồng bào các vùng Sơn la, Lai châu sử dụng, dạng nước sắc hoặc cao mềm, để chữa bệnh vàng da, viêm gan, xơ gan, viêm đại tràng, phù

thũng.Bộ phận dùng làm thuốc của Nhó đông là rễ, thu hái quanh năm, tốt nhất vào

mùa thu Dược liệu có vị đắng, màu vàng, tính bình, không độc, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, kiện tỳ, hoạt huyết, tiêu viêm, tán ứ, chữa viêm gan, vàng da, xơ gan Đồng bào ở xã Chiềng An, thị xã Sơn La còn dùng rễ hoặc thân già (phần sát

gốc rễ của cây nhó đông phối hợp với rễ cây hé mọ (Psychotria) để chữa bệnh viêm

đại tràng và gan cho kết quả tốt Thuốc giúp người bệnh ăn ngủ tốt, hết vàng da, vàng mắt, đầy bụng (Ngô Văn Trại và cs., 2004)

1.4.2.2 Thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ gan của cây Nhó đông

Các phân tích định tính về thành phần hóa học cây Nhó đông cho thấy thân,

lá và rễ cây Nhó đông đều chứa anthronoid, coumarin, carotenoid, đường khử tự do

và acid hữu cơ

Từ rễ cây Nhó đông, các hợp chất anthranoid đã được phân lập và tách chiết Hợp chất 1,3-dihydroxy, 4-methyl ethyl ether anthraquinon đã được phân lập và xác định cấu trúc từ cao khô anthranoid toàn phần của rễ cây nhó đông Đây là hợp chất

tự nhiên được phát hiện đầu tiên trong rễ cây Nhó đông (Nguyễn Duy Thuần và Phạm Minh Hưng, 2004)

Từ cao chiết của rễ cây Nhó đông, năm 2013, 7 hợp chất anthraquione cũng được tách chiết và xác định cấu trúc Các hợp chất này bao gồm soranjidiol, rubiadin, rubiadin-3-methyl ether; morindon, lucidin-ω-methyl ether; damnacanthal

và damnacanthol (Nguyễn Mạnh Cường và cs., 2013) Cũng từ rễ cây Nhó đông,

các hợp chất mới morinlongoside A- C, geniposidic acid,

(3R)-3-O-[β-D-xylopyranosyl-(16)-β-D-glucopyranosyl]-1-octen-3-ol; primeveroside và morindone-6-O-β-gentiobiosite cũng đã được phân lập và xác

lucidin-3-O-β-định cấu trúc (Cuong và cs., 2016)

Sau đó một loạt các hợp chất anthraquinoid như 1-hydroxy-athraquinone; tectoquinone; rubiadin-dimethyl ether; 1-hydroxy-2-methyl-9,10-anthraquinone; rubiadin-3-methyl ether; 1-methoxy-2,2-dimethyl-dioxine-(5,6:2,3)-anthraquinone; madasima A cũng được phân lập từ rễ Trong đó, các hợp chất tectoquinone; 1-methoxy-2,2-dimethyl-dioxine-(5,6:2,3)-anthraquinone; modasima A có khả năng làm tăng sự hấp thu glucose của tế bào adipocytes và điều hòa quá trình phosphoryl hóa các enzym đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa năng lượng, cân bằng nhu cầu năng lượng - protein kinase được hoạt hóa AMP (AMP activated protein kinase) Còn các hợp chất lucidin--butyl ether và modasima A lại có hoạt tính chống oxi hóa, chống viêm gan … (Nguyen và cs, 2017)

Với những ứng dụng trong điều trị bệnh trong y học cổ truyền, hoạt tính sinh học trong đó có hoạt tính bảo vệ gan của cây Nhó đông cũng được tiến hành khảo sát cùng với các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học

Trong mô hình nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan trên chuột bị gây tổn thương gan bằng CCl4, cao chiết từ cây Nhó đông (Morinla sp., Rubiaceae) có tác dụng bảo

vệ gan thông qua các hoạt động làm giảm hoạt độ GOT và GPT huyết tương, làm giảm MDA tạo ra ở gan, đồng thời làm tăng GSH trong gan và giảm tổn thương gan trên nhóm chuột nhắt trắng được uống cao chiết so với nhóm đối chứng bệnh lý (Nguyễn Xuân Khu, 2011)

Cao chiết methanol và cao chiết nước từ rễ cây Nhó đông có tác dụng bảo vệ gan tránh những tổn thương do CCl4 gây ra Hoạt động bảo vệ gan được biểu hiện bằng giảm hoạt độ GOT và GPT trong huyết thanh, khôi phục lại nồng độ cholesterol và tăng hàm lượng protein toàn phần trong máu chuột, đồng thời các biểu hiện giảm tổn thương, hoại tử tế bào trong mô bệnh học so với nhóm bệnh lý Các cao chiết từ rễ Nhó đông cũng có hoạt tính chống oxy hóa thông qua tác động trung hòa các gốc tự do do CCl4 sinh ra, ngăn cản tác dụng gây độc của CCl4 và các chất chuyển hóa chúng, trong đó cao chiết từ methanol có hoạt tính chống oxi hóa tốt hơn Ngoài ra cao chiết methanol còn có tác dụng lợi mật và chống viêm gan mạn tính rõ rệt (Phạm Minh Hưng, 2005)

Trong nghiên cứu in vitro, các sản phẩm tạo ra từ cao chiết cồn của rễ cây

Nhó đông có tác dụng ức chế sự nhân lên của tế bào ung thư gan Hep3B nhiễm HBV, kết quả này được thể hiện qua kết quả định lượng trực tiếp HBV-DNA trong

tế bào Hep3B bằng phương pháp Realtime-PCR Ngoài ra, nếu kéo dài thời gian tác động của các sản phẩm từ rễ cây Nhó đông có thể làm giảm lượng virut trong tế bào Hep3B (Nguyễn Lĩnh Toàn và cs., 2016; Đặng Thành Chung và cs., 2016)

Như vậy, các nghiên cứu dược lý và tiền lâm sàng cho thấy rễ cây Nhó đông

có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh gan, đặc biệt viêm gan virut B Đề tài này sẽ kế thừa và phát triển các nghiên cứu trước đây, nghiên cứu phát hiện hoạt chất, nhóm hoạt chất từ cây Nhó đông có tác dụng dược lý trong quá trình hỗ trợ, bảo vệ gan

1.4.3 Cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus L Skeels)

1.4.3.1 Tổng quan về cây Chùm ruột

5 và ra quả từ tháng 6 đến tháng 8 Hoa nở thành từng chùm và có màu hồng Quả Chùm ruột có dạng hình tròn, chia thành 6 múi, màu xanh non đến vàng nhạt, đường kính khoảng 2-2,5cm, có hạt cứng to nằm trung tâm của quả (Đỗ Huy Bích và cs., 2004; Jagessar và cs., 2008; Devi và Paul, 2011)

Trong y học cổ truyền, các bộ phận khác nhau của Cây chùm ruột được sử dụng làm thuốc để chữa các bệnh ngoài da như: lá được dùng để chữa lở ngứa và

mề đay, vỏ thân cây chùm ruột được dùng để tiêu hạch độc, ung nhọt, tiêu đờm trừ tích ở phổi, chữa ghẻ, loét, vết thương ngoài da, chữa đau răng, đau họng Dịch ngâm từ bột vỏ thân được dùng để chữa bệnh trĩ Rễ và vỏ cây Chùm ruột được người dân Malaysia dùng đun sôi, xông hơi chữa ho, đau đầu và người dân đảo Giava dùng để chữa hen suyễn Vỏ rễ ngâm trong rượu hoặc sắc đặc được sử dụng

để chữa vảy nến (Đỗ Huy Bích và cs., 2004; Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.4.3.2 Thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ gan của cây Chùm ruột

Với tác dụng điều trị bệnh, cây Chùm ruột đã được các nhà khoa học chú ý nghiên cứu với mục đích bổ sung thêm nguồn nguyên liệu dược liệu Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa dược của cây Chùm ruộtcho thấy trong dịch chiết từ

lá có chứa alkaloid, flavonoid, steroid và phenol, còn trong dịch chiết từ vỏ, rễ cây

có chứa alkaloid, glycosides, tannin, flavonoid, steroid, carbohydrate, nhựa (Biswas

và cs., 2011; Habib và cs., 2011; Vasanthi và cs., 2013; Wahed và cs., 2014)

Từ cây Chùm ruột, các hợp chất triterpene đã được được tách chiết Các hợp chất này thuộc bộ khung oleane như β-amyrin, bộ khung lupane như lupeol hay bộ khung cyclopropyl-hexacyclic triterpenoid như phyllanthol Trong đó, các hợp chất sterol chủ yếu có khung stosterol và các glycoside của chúng (Sengupta và Mukhopadhyay, 1966; Calixto và cs., 1998)

Từ rễ cây Chùm ruột, các hợp chất norbisabolane sesquiterpenoid đã được tách chiết và xác định cấu trúc Đây là thành phần chính có trong rễ cây chùm ruột với hàm lượng khoảng 1mg/g khối lượng rễ chưa khô Hai hợp chất phyllanthusol

A, B được phân lập, xác định cấu trúc và công bố vào năm 2000 Phyllanthusol A

và B có bộ khung serquiterpenoid loại norbisabolane gắn các phân tử đường glucosyl và mannosamine-N-acetate Năm 2014, hai hợp chất này cũng đã được phân lập lại nhưng phân tử đường được xác nhận là glucosamine-N-acetale và được đổi tên thành phyllanthacidoids A và B (Vongvanich và cs., 2000; Lv và cs., 2014)

19 hợp chất khác cũng có bộ khung norbisabolane cũng đã được tách chiết và xác định cấu trúc từ rễ đó là phyllanthacidoid acid methyl ester và các hợp chất phyllanthacidoids C-T, trong đó hai hợp chất phyllanthacidoid S và T có bộ khung khác với những hợp chất phyllanthacidoid khác Phyllanthacidoid S và T có bộ khung dạng tricyclo [3.1.1.1] với cầu nối oxi và được tạo thành bởi sự kết hợp của các diketal trong cấu trúc của chúng (Lv và cs., 2014) Từ dịch chiết EtOH rễ cây chùm ruột các hợp chất acidoflavanone, acidoauronol, 5-O-methylacidoauronol, acidoaurone, acidoisoflavone, và acidoflavonol, đây là những sulfonic acid có chứa flavonoid (Duong và cs., 2018)