Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (penaeus monodon) việt nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm

Ứng dụng kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa hình hệ gen tôm sú .... Các chỉ thị phân tử CTPT cũng như các thông tin khác có được từ việc nghiên cứu về hệ gen và lập b

NGUYỄN THỊ MINH THANH

(Cambria, 14, Bold, căn giữa, chữ In hoa)

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DÒNG

TÔM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM

NHẰM PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG TÔM

(Verdana, 18, Bold, căn giữa, chữ In hoa, giãn dòng Multiple 1.3)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

(Cambria, 14, Bold, căn giữa, chữ In hoa)

HÀ NỘI, 2019

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Minh Thanh

(Times New Roman, 15, Bold, Viết chữ thường)

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DÒNG

TÔM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM NHẰM

PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG TÔM

(Times N

ew Roma, Bold, Viết chữ in)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 PGS.TS Đinh Duy Kháng

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Nguyễn Hữu Ninh

Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III

Hà Nội, 2019

i

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Đinh Duy Kháng - Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS.TS Nguyễn Hữu Ninh - Viện trưởng Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III là những người Thầy

đã tận tình hướng dẫn, động viên và hết lòng giúp đỡ tôi ngay từ những ngày đầu thực hiện luận án cho đến lúc hoàn thành

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền - Phó Viện trưởng, Trưởng Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu tại Phòng vi sinh vật học phân tử và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Vi sinh vật học phân tử đã giúp tôi học hỏi thêm những kiến thức và kỹ thuật về sinh học phân tử và tin sinh học trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Văn Hảo và tập thể nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã giúp đỡ tôi cũng như nhóm thực hiện đề tài trong việc thu mẫu và thực hiện một phần nội dung nghiên cứu quan trọng của luận

án về di truyền số lượng

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Đăng Tôn và tập thể nghiên cứu tại Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện kỹ thuật GBS

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện trong suốt những năm qua

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà đã giúp đỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết trong thời gian học tập và bảo vệ luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Biên tập Tạp chí Công nghệ sinh học đã hỗ trợ tôi và nhóm nghiên cứu đăng tải các công bố liên quan đến luận án

ii

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Đông Á nơi tôi đang công tác đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi làm nghiên cứu sinh để tôi có thể vừa công tác vừa học tập và hoàn thành luận án của mình Tôi cũng xin chân thành cảm ơn và mong muốn nhận được những ý kiến đóng góp quý báu đến từ các chuyên gia, các nhà nghiên cứu và các đồng nghiệp để giúp tôi chỉnh sửa hoàn thiện nội dung luận án

Cuối cùng, tôi xin được nói lời biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình và những người bạn, những đồng nghiệp thân thiết đã luôn bên cạnh, giúp đỡ, động viên, hỗ trợ về mọi mặt và khích lệ để tôi có thể vượt qua mọi khó khăn trong thời gian dài học tập và nghiên cứu để có thể hoàn thành được luận án

Nguyễn Thị Minh Thanh

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong Luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Nguyễn Thị Minh Thanh

iv

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tôm sú Penaeus monodon 5

1.1.1 Đặc điểm sinh học, phân loại và phân bố địa lý 5

1.1.2 Khái quát tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và ở Việt Nam 8

1.2 Các kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử thông dụng 14

1.3 Ứng dụng kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa hình hệ gen tôm sú 23

1.4 Phương pháp GBS và ứng dụng trong chọn giống 30

1.5 Phương pháp PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) và ứng dụng 37

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Vật liệu nghiên cứu 39

2.1.1 Mẫu tôm sú 39

2.1.2 Hóa chất 40

2.1.3 Thiết bị 43

2.2 Phương pháp nghiên cứu 44

2.2.1 Thu mẫu tôm sú tự nhiên phục vụ nghiên cứu đa hình hệ gen 44

2.2.2 Thu mẫu tôm sú tự nhiên làm tôm giống bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh và chăm sóc tôm bố mẹ 45

2.2.3 Thiết lập các gia đình tôm sú tạo thế hệ Go và G1 46

2.2.4 Tách chiết, tinh sạch và xác định nồng độ DNA tổng số từ mô cơ tôm sú 48

v

di mao quản và phần mềm phân tích đoạn 54

2.2.8 Kỹ thuật GBS phân tích hệ gen tôm sú 55

2.2.9 Chú giải các đoạn trình tự và xác định gen liên quan 58

2.2.10 Xác định trình tự amino acid của contig và đánh giá mức độ tương đồng với gen mã hóa protein quan tâm 59

2.2.11 Phương pháp KASP 60

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61

3.1 Đa hình AFLP ở các quần đàn tôm sú Việt Nam 61

3.1.1 Kiểm tra hoạt tính cắt DNA của cặp enzyme EcoRI và MseI 61

3.1.2 Tách DNA tổng số từ tôm sú để thực hiện kỹ thuật AFLP 62

3.1.3 Kết quả thực hiện phản ứng tiền chọn lọc 62

3.1.4 Đa hình AFLP trong các quần đàn và giữa các quần đàn tôm sú 64

3.1.5 Cây phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú Việt Nam 78

3.2 Sản xuất tôm sú thế hệ G o , G 1 79

3.2.1 Sàng lọc nguồn tôm bố mẹ đầu vào 79

3.2.2 Thiết lập các gia đình tôm sú thế hệ Go, G1 81

3.3 Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú 85

3.3.1 Giải trình tự, kết nối các đoạn trình tự và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời 85

3.3.2 Sàng lọc SNP 88

3.3.3 Chú giải gen chức năng từ dữ liệu giải trình tự tôm sú 88

3.3.4 Xác định chỉ thị SNP và tương quan giữa các contig chứa SNP với gen MHC 91 3.3.5 Xác định vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa

protein MHC, xác định codon chứa SNP và vị trí tương ứng của chỉ thị

vi

pháp KASP 97

Chương 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 99

4.1 Chọn địa điểm thu mẫu để nghiên cứu đa hình di truyền 99

4.2 Tách DNA tổng số từ tôm sú tạo vật liệu nghiên cứu 100

4.3 Kết quả phản ứng tiền chọn lọc AFLP 102

4.4 Đa hình AFLP trong các quần đàn tôm sú 104

4.5 Lựa chọn kỹ thuật chỉ thị AFLP để đánh giá đa hình hệ gen tôm sú 107

4.6 Quan hệ phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú 108

4.7 Tạo vật liệu tôm sú thế hệ Go, G1 110

4.8 Ứng dụng kỹ thuật GBS để sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú 112

4.9 Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng phương pháp KASP và tiềm năng ứng dụng trong chọn giống 121

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 125

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 126

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 127

TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length

DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Ethylene-Diamine-TetraAcetic Acid

GBS Genotyping By Sequencing Xác định kiểu gen bằng

phương pháp giải trình tự

Gb GigaByte

KASP Kompetitive Allele Specific PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp

đặc hiệu alen cạnh tranh LMM Light meromyosin Meromyosin chuỗi nhẹ

MAS Marker-assisted selection Chọn giống dựa trên

chỉ thị phân tử MHC Myosin Heavy Chain Myosin chuỗi nặng

mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể

NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ thứ mới PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PCI Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol

CI Chloroform : Isoamyl alcohol

QTL Quantitative Trait Loci Locus tính trạng định lượng

QC Quality control Kiểm soát chất lượng

RFLP Restriction Fragment Length

viii

RNase Ribonuclease

SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotide đơn

TE Tris-EDTA

IHHNV Infectious Hypodermal and

Haematopoietic Necrosis Virus

Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô

LSNV Laem Singh Virus Virus gây Hội chứng

chậm lớn YHV Yellow Head Virus Virus gây bệnh đầu vàng

WSSV White Spot Syndrome Virus Virus gây bệnh đốm trắng

VIE Visible Implant Elastomer Chất màu phát xạ

ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Số lượng cá thể thu thập được của bốn dòng tôm sú sử dụng

làm vật liệu gốc (tôm bố mẹ) 40

Bảng 2.2 Các nhóm tôm sú sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP 40

Bảng 2.3 Thành phần các mồi sử dụng trong kỹ thuật AFLP 42

Bảng 2.4 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ……… 44

Bảng 2.5 Sơ đồ lai tổ hợp toàn phần bốn dòng tôm khác nhau 48

Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc 52

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại chọn lọc 53

Bảng 2.8 Danh sách 22 loại protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở họ giáp xác 59

Bảng 2.9 Chu trình nhiệt của phản ứng KASP 60

Bảng 3.1 Nồng độ DNA trung bình của các mẫu tôm sú sử dụng trong kỹ thuật AFLP 62

Bảng 3.2 Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển BTB 65

Bảng 3.3 Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển NTB 69

Bảng 3.4 Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển NB 72

Bảng 3.5 Kết quả xác định số lượng alen trên các quần đàn tôm sú 76

Bảng 3.6 Kết quả sàng lọc tôm sú bố mẹ đầu vào 80

Bảng 3.7 Số lượng gia đình tôm sú thế hệ Go thả nuôi thành công từ 16 phép lai 81

Bảng 3.8 Tỷ lệ góp vật liệu di truyền theo dòng ở thế hệ Go 83

Bảng 3.9 Số lượng các nhóm gia đình tôm sú thế hệ G1 84

Bảng 3.10 Tóm tắt kết quả xử lý dữ liệu giải trình tự GBS 87

Bảng 3.11 Kết quả chú giải các gen liên quan tính trạng tăng trưởng ở tôm sú 90

Bảng 3.12 Kết quả xác định SNP trên contig83953 và contig260347 91

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Tôm sú Penaeus monodon 5

Hình 1.2 Vòng đời của tôm sú 8

Hình 1.3 Cơ sở phân tử của kỹ thuật RAPD 15

Hình 1.4 Các bước thực hiện kỹ thuật RFLP 16

Hình 1.5 Minh họa đa hình microsatellite 17

Hình 1.6 Minh họa SNP trong một đoạn DNA sợi kép ở ba cá thể giả định 19

Hình 1.7 Các bước chính trong kỹ thuật AFLP 21

Hình 1.8 Các bước cơ bản của kỹ thuật GBS 36

Hình 2.1 Mẫu tôm sú 45

Hình 2.2 Trình tự các adaptor sử dụng trong xây dựng thư viện GBS 55

Hình 2.3 Các bước xây dựng thư viện GBS 57

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng cắt DNA bằng cặp enzyme EcoRI và MseI trên gel agarose 1,5% để kiểm tra hoạt tính của enzyme……… 61

Hình 3.2 Điện di sản phẩm của phản ứng tiền chọn lọc 63

Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại các quần đàn tôm sú thu từ 3 vùng biển Việt Nam 79

Hình 3.4 Kết quả điện di tự động bằng máy 2100 Bioanalyzer đánh giá thư viện DNA 85

Hình 3.5 Phân bố độ dài các contig sau tinh sạch 87

Hình 3.6 Số lượng SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và nhóm tôm sú tăng trưởng chậm

88 Hình 3.7 Kết quả chú giải gen chức năng 89 Hình 3.8 Vùng tương đồng nucleotide giữa mạch bổ sung của

contig83953 của tôm sú P monodon so với trình tự gen MHCa

xii

ở tôm he Nhật Bản P japonicas 95

Hình 3.9 Vùng tương đồng trình tự amino acid giữa contig83953 của

tôm sú P monodon với protein MHCa ở tôm he Nhật Bản P

japonicas 95

Hình 3.10 Vùng tương đồng nucleotide giữa contig260347 so với trình tự

gen MHC1 ở tôm sú P monodon 96

Hình 3.11 Vùng tương đồng trình tự amino acid giữa contig260347 với

protein MHC1 ở tôm sú P monodon 96

Hình 3.12 Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh quang trong kỹ thuật KASP

đánh giá tương quan giữa SNP G>A thuộc gen MHC1 với tính

trạng tăng trưởng nhanh ở tôm sú 98

MỞ ĐẦU

 Đặt vấn đề

Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) là một trong những loài tôm có

kích thước lớn và được coi là loài thủy sản nuôi kinh tế quan trọng ở nhiều nước trên thế giới Ở Việt Nam, tôm sú đã và sẽ tiếp tục là một trong những đối tượng nuôi chủ lực cho xuất khẩu thủy sản đem về ngoại tệ cho đất nước Diện tích và sản lượng tôm nước lợ của nước ta ngày càng tăng Nhu cầu tôm giống hằng năm là 130

tỷ con (trong đó có 30 tỷ con giống tôm sú) Năm 2016, diện tích nuôi tôm là 649.645 ha với sản lượng 657.282 tấn, giá trị xuất khẩu đạt trên 3,15 tỷ USD Đến

năm 2025, mục tiêu xuất khẩu tôm của Việt Nam đạt 10 tỷ USD; sản lượng 1,1 triệu

tấn trên quy mô 750.000 ha; nhu cầu tôm bố mẹ khoảng 500.000 - 600.000 con, trong đó nhu cầu tôm sú bố mẹ là 100.000 con/năm (https://laodong.vn)

Chiến lược phát triển ngành nuôi tôm sú ở Việt Nam cũng như ở các quốc gia nuôi tôm trên thế giới là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường, sinh thái Nền tảng cho chiến lược này là chú trọng phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen tôm sú là vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng Những nghiên cứu chi tiết về genome, transcriptome, proteome và bản đồ gen tôm sú sẽ cung cấp những thông tin sinh học quan trọng giúp cho việc xác định các tính trạng cần thiết như tính kháng bệnh, tính chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, tính trạng quyết định năng suất và chất lượng của tôm Các chỉ thị phân tử (CTPT) cũng như các thông tin khác có được từ việc nghiên cứu về hệ gen và lập bản đồ gen tôm sú có vai trò rất quan trọng đối với công tác chọn giống và phát triển ngành công nghiệp nuôi tôm thương phẩm Trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen tôm sú để phục vụ cho các mục tiêu nói trên, nghiên cứu đa dạng di truyền là một trong những hướng nghiên cứu được quan tâm và có ý nghĩa ứng dụng thiết thực đối với thành công của chiến lược quản lý lâu dài và bền vững nguồn lợi thủy sản

Ngày nay, các CTPT đang ngày càng trở thành công cụ hữu hiệu được ứng dụng rộng rãi để đánh giá đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền, ứng dụng trong nghiên cứu cải tạo, chọn giống tôm chất lượng tốt, sạch bệnh Trong số đó, chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại chọn lọc (AFLP) được xem là một trong những kỹ thuật hiện đại và hiệu quả cho phép đưa ra nhanh chóng và chính xác một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau Nhiều kỹ thuật CTPT khác cũng được xây dựng để phát triển các chỉ thị DNA sử dụng rộng rãi cho nhiều mục đích nghiên cứu Tùy thuộc vào mục đích cụ thể để lựa chọn loại CTPT phù hợp Đối với mục tiêu chọn giống, đa hình nucleotide đơn (SNP) được xem là một trong những loại CTPT hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay

để chọn được các tính trạng quan trọng liên quan đến năng suất và chất lượng giống Với những thế mạnh vượt trội, các CTPT ngày nay được sử dụng như những công cụ chọn lọc đắc lực đối với các tính trạng quan tâm trong các chương trình chọn giống ở nhiều loài vật nuôi, cây trồng và các loài thủy sản Việc ứng dụng các CTPT giúp cho các nhà chọn giống nhận diện chính xác các gen quan tâm nhằm rút ngắn thời gian chọn giống Hiệu quả cải tiến giống sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với các phương pháp chọn giống cổ điển nhờ thực hiện việc chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn mà thông qua CTPT liên kết với tính trạng đó Hiện nay, các nghiên cứu về di truyền phân tử trên đối tượng tôm sú vẫn còn ít

và chưa tương xứng với vai trò của một đối tượng nuôi kinh tế quan trọng Thông tin về các locus tính trạng định lượng (QTLs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng hầu như rất hiếm Vì vậy, việc nghiên cứu xác định mối tương quan giữa các SNP - loại biến dị phổ biến nhất trong hệ gen - với tính trạng tăng trưởng ở tôm sú để tạo

cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về chọn giống dựa trên CTPT là hướng nghiên cứu hết sức quan trọng và thiết thực đối với ngành công nghiệp nuôi tôm sú

Trong khuôn khổ của Đề tài “Lập bản đồ bộ gen tôm sú (Penaeus monodon)”

thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước, chúng tôi đã thực hiện

đề tài “Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm”

 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm

 Nội dung nghiên cứu

(1) Đánh giá đa hình hệ gen ba quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển khác nhau của Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP;

(2) Lai hỗn hợp 4 dòng tôm sú bố mẹ khác nhau về nguồn gốc địa lý để tạo vật liệu nghiên cứu thế hệ Go và G1;

(3) Áp dụng kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự (GBS)

để phân tích hệ gen tôm sú thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm thế hệ Go và G1 nhằm sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng;

(4) Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) để đánh giá tiềm năng ứng dụng của SNP này đối với việc đánh giá nhanh chóng và chính xác các cá thể tôm nhằm hỗ trợ trong công tác chọn giống tôm sú

 Những đóng góp mới của luận án về mặt khoa học và thực tiễn

(1) Luận án là nghiên cứu đầu tiên đưa ra đánh giá về đa dạng di truyền của ba quần đàn tôm sú tự nhiên từ các vùng biển Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP

(2) Sàng lọc được bộ chỉ thị SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh làm cơ sở cho việc tìm kiếm chỉ thị SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tôm sú Hai chỉ thị SNP được xác định trong nghiên cứu của luận án là phát hiện đầu tiên về chỉ thị SNP nằm trong exon của gen MHC ở họ giáp xác Những kết quả này cung cấp dẫn liệu khoa học hữu ích cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống tôm sú

Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu

BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

1 Thiết kế mồi đặc hiệu dựa trên trình tự chứa SNP G>A của gen MHC

2 Kiểm tra trên 40 cá thể tôm sú tăng trưởng nhanh thuộc thế hệ G 1

1 Thu mẫu tôm sú từ 3 quần đàn BTB, NTB, NB

2 Kỹ thuật AFLP đánh giá

đa hình hệ gen

1 Thu mẫu 4 dòng tôm sú: A, T, G, N

2 Thiết lập các gia đình tạo thế hệ G o, G 1

1 Tách chiết DNA tôm sú

G o , G 1

2.Giải trình tự bằng GBS

3 Sàng lọc SNPs

4 Chú giải gen chức năng

5 Xác định tương quan giữa các contig chứa SNP so với gen MHC

6 Xác định: vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC, codon chứa SNP, vị trí tương ứng của chỉ thị SNP trên gen MHC

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 DNA tổng số từ các mẫu tôm sú

2 Đa hình AFLP trong các quần đàn và giữa các quần đàn tôm sú

3 Cây phát sinh chủng loại

28 mẫu đồng hợp tử A:A;

2 mẫu đồng hợp tử G:G;

10 mẫu dị hợp tử G:A.

1 Tôm sú bố mẹ sạch bệnh

2 Tôm sú thế hệ G o , G 1

1 Bộ dữ liệu SNP của 2 nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm

2 Hai chỉ thị SNP nằm trong vùng exon của gen MHC:

 SNP

Contig83953:g.20T>C trên

gen MHC a biến đổi codon

AA A AA G, không làm thay đổi acid amin Lysine;

 SNP Contig260347:g.19G>A trên gen MHC 1 biến đổi

codon G G A (mã hóa acid

amin Glycine)  G A A (mã

hóa acid amin Glutamic)

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÔM SÚ Penaeus monodon

1.1.1 Đặc điểm sinh học, phân loại và phân bố địa lý

Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon do Fabricius mô tả và đặt tên

năm 1798 Tôm sú là một trong số các loài tôm nuôi quan trọng và được phân loại

như sau (Brusca et al., 1990):

Hình 1.1 Tôm sú Penaeus monodon

(Nguồn: Nguyễn Hữu Ninh, 2012)

Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thước lớn (có thể dài đến 270 mm,

nặng 260g hoặc lớn hơn) và là loài tôm thương mại quan trọng (Motoh, 1985)

Tôm có các bộ phận: chủy (cứng, có răng cưa, phía trên chủy có 7-8 răng,

dưới chủy có 3 răng); mũi khứu giác và râu (cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm); 3 cặp chân hàm (lấy thức ăn và bơi lội); 5 cặp chân ngực (lấy thức ăn và bò); cặp chân bụng (rf); đuôi (nhảy xa, điều chỉnh bơi lên cao, xuống thấp); bộ

phận sinh dục (Motoh, 1985)

Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng về kích thước và khối lượng Sau mỗi lần lột xác, cơ thể tôm sú tăng nhanh về kích thước Quá trình này phụ thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và giai đoạn phát triển của cá thể Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước lớn hơn con đực ở cùng độ tuổi Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái thông qua cơ quan sinh dục phụ bên ngoài Cơ quan sinh dục chính của con đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2,

lỗ sinh dục đực mở ra hốc háng đôi chân ngực thứ 5 Tinh trùng thuộc dạng chứa

trong túi Con cái có buồng trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn

trứng mở ra ở khớp háng đôi chân ngực thứ 3 Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dưới bụng tôm Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái trong tự nhiên là từ tháng thứ tám trở đi (Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009)

Vùng phân bố: Tôm sú thuộc loài rộng muối nên chúng có mặt rộng từ Ấn Ðộ

Dương sang hướng Nhật Bản, Ðài Loan, phía Ðông Tahiti, phía Tây Châu Phi và phía Nam Châu Úc Ở nước ta, tôm sú xuất hiện dọc theo bờ biển Ðông và vùng đảo Phú Quốc Nhìn chung, loài này phân bố từ kinh độ 30oE đến 155oE và từ vĩ độ

35oN đến 35oS xung quanh các vùng xích đạo như: Philipines, Malaysia, Indonesia

và Việt Nam Tôm bột (Postlarve), tôm giống (Juvenile) và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và rừng ngập mặn ven bờ Khi tôm trưởng thành di

chuyển xa bờ (Motoh, 1985)

Vòng đời của tôm sú: Tôm sú từ 8 - 10 tháng tuổi đã có thể tham gia sinh sản

Chúng đẻ quanh năm nhưng chủ yếu tập trung ở 2 thời kỳ chính là tháng 3 - 4 và tháng 7 - 10 hàng năm Tôm cái đẻ trứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng của buồng trứng và trọng lượng của cơ thể (Phạm Văn Tình, 2004) Vòng đời của tôm sú được chia ra làm các giai đoạn: phôi, ấu trùng, hậu ấu trùng, tôm giống, tôm tiền trưởng thành và trưởng thành (Hình 1.2)

- Giai đoạn phôi: giai đoạn này bắt đầu từ khi trứng thụ tinh và phân cắt thành

2, 4, 8, 16, 32, 64 tế bào, phôi dâu, phôi nang, phôi vị đến khi nở Thời gian hoàn tất giai đoạn này khoảng 12 đến 15 giờ tùy thuộc điều kiện nhiệt độ nước

- Nauplius: chia làm 6 giai đoạn phụ (N1- N6) kéo dài 2 đến 3 ngày, dinh dưỡng bằng noãn hoàng

- Zoae: chia làm 3 giai đoạn phụ (Z1-Z3) kéo dài 4 - 5 ngày, dinh dưỡng chủ yếu bằng tảo khuê

- Mysis: chia làm 3 giai đoạn phụ (M1-M3) kéo dài 3 - 4 ngày, tôm ăn chủ yếu

là phiêu sinh động vật như ấu trùng Artemia, Branchionus plicatilis

Hầu hết giai đoạn ấu trùng mất khoảng 9 - 10 ngày, sau đó biến thái sang giai đoạn hậu ấu trùng (Postlarvae) Giai đoạn này tôm bám thành bể, sống đáy, có hình dạng giống như tôm trưởng thành Ngoài động vật phù du tôm ăn cả mùn bã hữu cơ, sinh vật đáy, 5 - 6 tuần sau trở thành tôm giống Tôm giống 6 - 8 tháng sau đạt tiêu

chuẩn tôm trưởng thành và có thể tham gia sinh sản (Nguyễn Thanh Phương et al.,

1999) Tôm đẻ trứng vào ban đêm từ 22 giờ đến 3 giờ sáng ngày hôm sau Trong tự

nhiên tôm thường đẻ một lần trong mỗi chu kỳ lột xác, trong điều kiện nuôi vỗ tôm

có thể đẻ nhiều lần (có thể đến 6 lần) (Thạch Thanh et al., 2005) Trong nghề nuôi

tôm, mùa vụ nuôi và thời gian thu hoạch tôm sú thương phẩm trong năm tùy thuộc

vào điều kiện khí hậu thời tiết của từng vùng (Bộ Thủy sản, 2000)

Trong chu kỳ sống, tôm sú có khả năng thích ứng với độ mặn từ 2‰ - 40‰ tùy thuộc vào giai đoạn phát triển Giai đoạn ấu trùng và thời kỳ đầu của tôm giống, chúng thích nghi độ mặn từ 28 - 32‰ Lớn lên, tôm sú thích ứng với độ mặn giảm dần từ 10 - 15‰, đến cỡ tôm 50 - 70 gam, chúng có thể sống và sinh trưởng nhanh

ở độ mặn dưới 5‰ Khi trưởng thành đến thời kỳ sinh sản, chúng lại có nhu cầu sống trong độ mặn cao của nước biển Do đặc điểm này, trong tự nhiên tôm sú sinh sản ở vùng biển sâu, nơi có độ mặn cao, phát triển thành tôm giống và di cư vào vùng ven bờ, vùng cửa sông nơi có độ mặn thấp Đến thời kỳ sinh sản chúng lại

quay ra biển (Vũ Văn Toàn, 2001)

1.1.2 Khái quát tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và ở Việt Nam

* Trên thế giới: Những tiến bộ đầu tiên trong công nghệ nuôi tôm diễn ra theo

hướng hoàn thành vòng đời của tôm nuôi vào năm 1934 tại Nhật Bản khi tiến sỹ Motosaku Fujinaga thành công trong việc kích thích sinh sản cho tôm he Nhật Bản

(Penaeus japonicus) từ ấp nở trứng và ương nuôi ấu trùng từ giai đoạn Nauplii sang

Mysis nhờ sử dụng tảo silic Những thành tựu của tiến sỹ Fujinaga và các cộng sự

có tầm ảnh hưởng to lớn đối với ngành nuôi tôm Thành công này cho phép sản xuất tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng ở quy mô thương mại cho các chương trình nuôi và tái tạo Những năm 1963, làn sóng phát triển thứ hai của ngành tôm bắt đầu trỗi dậy khi các nhà khoa học cố gắng chuyển giao các phương pháp của Tiến sỹ Fujinaga sang các khu vực khác và nhiều loài khác Địa điểm chuyển giao ban đầu là Mỹ và

Đài Loan (Kungvankij, 1984)

Hình 1.2: Vòng đời của tôm sú

(Nguồn: Motoh, 1985)

Trong số các loài tôm thuộc họ tôm he (Penaeid) thì tôm sú (Penaeus

monodon) là loài tăng trưởng nhanh nhất và khả năng thích ứng tốt nhất với các

điều kiện canh tác Kỹ thuật nuôi thâm canh tôm sú đã nhanh chóng lan rộng khắp châu Á và trở thành loài thống trị của tôm nuôi Trong những năm 1980, năng suất nuôi tôm sú thâm canh đạt trên 10 tấn/ha, cỡ tôm khoảng 30 gram/con, sử dụng tôm

bố mẹ tự nhiên Ecuador và Đài Loan (đại diện cho châu Mỹ và châu Á) là những quốc gia đi đầu trong giai đoạn xuất phát, nhưng Trung Quốc sau đó lại nổi lên

chiếm ưu thế (Kungvankij, 1984)

Ở châu Á, nghề nuôi tôm he có từ lâu với mô hình nuôi truyền thống, năng suất thấp và chủ yếu tiêu thụ nội địa Việc xuất khẩu sản phẩm tôm nuôi bắt đầu hình thành trong những năm giữa thập kỷ 70 Với những tiến bộ về kỹ thuật nuôi và công nghệ chế biến thức ăn thủy sản thì công nghiệp nuôi thủy sản bắt đầu phát triển mạnh ở những thập kỷ tiếp theo Năm 1975, sản lượng tôm nuôi công nghiệp chỉ chiếm 2,5% tổng sản lượng tôm của thế giới Trong những năm của thập kỷ 90, sản lượng tôm nuôi công nghiệp đã tăng lên 30% Các nước châu Á như Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Ấn độ, Việt Nam là những nước sản xuất tôm chủ yếu, sản xuất 80% sản lượng tôm và Nam Mỹ (chủ yếu là Ecuador) sản xuất khoảng 20%

sản lượng Khoảng hơn một nửa sản lượng tôm là sản phẩm từ Penaeus monodon, ngoài ra còn có sản phẩm của các loài tôm khác như: P vannamei, P indicus, P

merguiensis, P chinensis (Rönnbäck, 2001)

Năm 1999, năng suất nuôi tôm trung bình của thế giới là 0,65 tấn/ha với hình thức nuôi bán thâm canh là chủ yếu (Rönnbäck, 2001) Tuy nhiên, sự phát triển của ngành nuôi tôm, đặc biệt ở các nước Đông Nam Á, đã suy giảm với sản lượng dưới

600.000 tấn vào năm 2007 (Aziz et al., 2011) Hiện tượng phát triển bùng nổ nghề

nuôi tôm sau đó suy giảm đã diễn ra như một quy luật ở nhiều quốc gia, đầu tiên xảy ra ở Đài Loan vào năm 1988, ở Trung Quốc vào năm 1994 (Chanratchakool, 2003) Các quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển khác như Thái Lan, Indonesia và Ecuador cũng xảy ra hiện tượng tương tự chỉ 5-10 năm sau khi phát triển nghề nuôi

tôm thâm canh (Aziz et al., 2011)

Trong những năm 1990, bệnh đốm trắng lan rộng trên toàn cầu Đúng lúc đó,

Hiệp hội nuôi tôm biển Mỹ đã phát triển một dòng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus

vannamei), tên gọi trước đây là Penaeus vannamei (tôm he Nam Mỹ) sạch bệnh

mới và giới thiệu sang châu Á Loại tôm sạch bệnh này được nuôi trong ao và cho năng suất cao Nông dân nhanh chóng chuyển từ tôm sú tự nhiên, mang nhiều bệnh sang nuôi tôm thẻ chân trắng sạch bệnh, đồng thời thay đổi phương pháp sản xuất

để giảm nguy cơ dịch bệnh bằng cách giảm thay nước, khử trùng nước và không sử dụng sinh vật tự nhiên làm thức ăn(Briggs et al., 2005)

Sự du nhập ồ ạt của tôm he Nam Mỹ vào các nước châu Á để thay thế tôm sú

đã làm thay đổi đáng kể tỷ trọng của hai loại tôm nuôi này (Nguyễn Hữu Ninh, 2010) Các chuyên gia cho rằng, sở dĩ tôm chân trắng được nuôi rộng rãi ở các nước trên thế giới là do công nghệ gia hoá thành công cũng như một đàn lớn tôm bố mẹ được lọc sạch một số bệnh nguy hiểm, chúng dễ sinh sản và thuần dưỡng, dễ nuôi ở mật độ cao, đòi hỏi hàm lượng protein trong thức ăn thấp hơn so với tôm sú, chịu được nhiệt độ thấp và chịu được nước có chất lượng kém hơn so với tôm sú (Vũ Dũng Tiến và Don Griffiths, 2012) Cùng lúc, sản lượng tôm sú (có nguồn gốc chủ yếu từ châu Á) lại liên tục giảm, mặc dù hơn 20 năm qua, kinh nghiệm và kết quả nuôi tôm sú của các nước châu Á đã thu được nhiều thành công đáng kể, giá cả luôn cao hơn và được nhiều thị trường ưa chuộng hơn Sự giảm sút sản lượng cũng như việc các nước châu Á dần từ bỏ đối tượng bản địa quan trọng này, theo các chuyên gia, chủ yếu là do chưa gia hoá và kiểm soát được dịch bệnh nên không đảm bảo chất lượng tốt của con giống Trong lịch sử phát triển ngành nuôi tôm sú, có ba quốc gia và vùng lãnh thổ là Đài loan, Trung Quốc, Thái Lan đã từng đạt đỉnh cao của công nghệ nuôi tôm sú, sản lượng cao nhất nhưng cuối cùng cũng bị đổ vỡ và chuyển sang nuôi tôm chân trắng

Trong số các hướng nghiên cứu về lĩnh vực nuôi tôm được thực hiện trong hơn bốn thập niên qua, có lẽ nghiên cứu công nghệ sản xuất tôm giống nhằm chủ động con giống cho nuôi thương phẩm, giảm thiểu sự phụ thuộc vào nguồn tôm tự nhiên được triển khai sớm nhất và cũng đạt được nhiều thành công (Aquacop, 1979;

Primavera, 1985; Chamberlain & Gervais 1984; Chong & Khoo, 1988;

Withyachumnarnkul et al., 1998; Coman et al., 2007…) Nhờ vậy nguồn tôm giống

hầu như đã đáp ứng được nhu cầu của sản xuất Nhìn chung, xu thế hiện nay ở các quốc gia trên thế giới trong sản xuất tôm giống là từng bước gia hóa đàn tôm, tiến hành các giải pháp công nghệ để khép kín vòng đời, chọn giống, tạo ra các dòng mới chất lượng cao và tăng trưởng tốt, áp dụng các giải pháp an toàn sinh học để tạo

ra con giống sạch bệnh Những nỗ lực trong vấn đề gia hoá (tạo tôm bố mẹ) trong điều kiện giám sát môi trường chặt chẽ và nâng cao chất lượng di truyền được coi là những vấn đề mấu chốt nhằm đảm bảo được nhiều ưu thế, đồng thời giúp ổn định cho nghề nuôi tôm, nâng cao hiệu quả và đảm bảo an toàn môi trường

Theo dự báo của nhóm nghiên cứu về thị trường tôm tại Hội nghị thị trường thủy sản toàn cầu (GSMC) ở Miami (Mỹ) cuối tháng 1/2018, sản lượng tôm của các nước sản xuất chính trên thế giới sẽ phục hồi với sản lượng có thể vượt qua 3,5 triệu tấn năm 2018 Tổng sản lượng này được đánh giá là vượt lên mức cao nhất trong 10 năm qua (2008 - 2018) GSMC ước tính: sản lượng tôm của Ấn Độ có thể đạt 697.000 tấn năm 2018; sản lượng tôm của Ecuador dự kiến tăng từ 469.000 tấn năm

2017 lên 531.000 tấn năm 2018; sản lượng ở Trung Quốc “chạm đáy” năm 2017 với 525.000 tấn và dự kiến sản lượng đạt 625.000 tấn năm 2018 Indonesia cũng dự kiến tăng sản lượng tôm trong năm 2018 lên 335.000 tấn (Seaman, 2018)

* Ở Việt Nam: Việt Nam nằm trong nhóm gồm các quốc gia sản xuất tôm sú

hàng hoá lớn nhất thế giới Nghề nuôi tôm ở Việt Nam đã có từ lâu với hình thức nuôi quảng canh truyền thống, nguồn giống và thức ăn hoàn toàn từ tự nhiên Tuy nhiên, nghề nuôi tôm mới chỉ phát triển mạnh vào những năm cuối thập kỷ 80 khi sản phẩm tôm được xuất khẩu ra thị trường thế giới Cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm, rừng ngập mặn bị phá dẫn đến nguồn giống tự nhiên bị giảm sút, lúc này người nuôi mới bắt đầu sử dụng giống nhân tạo thả bổ sung vào ao tôm, từ đó hình thành hình thức nuôi tôm quảng canh cải tiến Sau đợt dịch bệnh tôm vào năm

1994 - 1995, hình thức nuôi quảng canh truyền thống không còn hiệu quả và gần như được thay thế hoàn toàn bằng hình thức quảng canh cải tiến Từ sau khi kỹ

thuật nuôi tôm ít thay nước được giới thiệu vào Việt Nam năm 1996 (Trương Quốc

Phú et al., 1997) thì hình thức nuôi bán thâm canh và thâm canh bắt đầu phát triển,

đặc biệt là sau khi chính sách chuyển đổi cơ cấu sản xuất của Nhà nước được ban hành Kỹ thuật nuôi tôm ở độ mặn thấp cũng được giới thiệu vào Việt Nam cuối thập kỷ 90 (Nguyễn Văn Vượng, 2003)

Khác với các nước châu Á láng giềng (chủ yếu nuôi tôm chân trắng), ở Việt Nam hiện nay, tôm sú vẫn chiếm 50 - 60% sản lượng tôm nuôi Nguyên nhân chính

là khu vực nuôi tôm chủ yếu là miền Nam, nơi nhiệt độ nước cho phép nuôi hai vụ trong năm, và vì hình thức nuôi quảng canh vẫn chiếm ưu thế Nhờ vậy, Việt Nam

là một trong số ít các nước vẫn đang sản xuất tôm sú cỡ to, chất lượng cao Tôm

chân trắng (Penaeus vannamei) Nam Mỹ, được du nhập vào Việt Nam vào khoảng

các năm 1997 - 2000 Kể từ đó, việc nuôi tôm chân trắng đã phát triển nhanh, chủ yếu tại các tỉnh miền Trung và miền Bắc Việt Nam Việc phát triển nuôi tôm chân trắng đã được Bộ Thủy sản kiểm soát chặt chẽ Từ đầu năm 2008, tôm chân trắng đã được phép nuôi tại các ao thâm canh trong các vùng nuôi an toàn Do đó, sản lượng tôm chân trắng ở vùng ĐBSCL đã tăng lên nhanh chóng (Vũ Dũng Tiến và Don Griffiths, 2012)

Theo số liệu từ Tổng cục Thủy sản năm 2018: diện tích thả nuôi tôm nước lợ 5 tháng đầu năm 2018 gần 637.000 ha, bằng 102,5% so với cùng kỳ 2017 Trong đó, diện tích thả nuôi tôm sú là hơn 582.000 ha, tôm thẻ chân trắng 54.500 ha Sản lượng thu hoạch gần 195.000 tấn, trong đó sản lượng tôm sú 85.655 tấn Theo số liệu từ Tổng cục Hải quan năm 2018: kim ngạch xuất khẩu tôm 4 tháng đầu năm đạt trên 1 tỷ USD (tăng 13,8% so với cùng kỳ 2017), trong đó tôm nước lợ đạt hơn 916 triệu USD (tôm thẻ chân trắng: 687 triệu USD, tôm sú: 229 triệu USD), còn lại là tôm biển Các thị trường nhập khẩu chính của tôm Việt Nam như: EU (18,6%), Nhật Bản (17,2%), Hoa Kỳ (15,7%), Trung Quốc (14,9%), Hàn Quốc (11,7%) (https://tongcucthuysan.gov.vn)

Từ những năm đầu của thập niên 80, Việt Nam đã có những dự án nghiên cứu phát triển về công nghệ sản xuất giống tôm sú do Chương trình phát triển liên hợp

quốc (UNDP) tài trợ Dự án này đã mở ra triển vọng lớn cho việc hình thành công nghệ sản xuất giống và tạo lập cơ sở khoa học cho việc phát triển nuôi tôm thương phẩm trên phạm vi cả nước Trong suốt gần ba thập niên qua, Việt Nam đã trở thành quốc gia có sản lượng tôm nuôi đáng kể trong khu vực và thế giới Cũng trong thời gian đó, nhiều đề tài nghiên cứu về tôm như công nghệ nuôi, đánh giá tác động môi trường, công nghệ sản xuất giống, các nghiên cứu về bệnh tôm và các giải pháp phòng trị bệnh đã được đầu tư kinh phí và triển khai rộng rãi

Tuy nhiên, nghề nuôi tôm của Việt Nam hiện nay đang gặp một số trở ngại, trong đó có tác động tiêu cực của việc phát triển nhanh chóng diện tích nuôi tôm ở vùng nước lợ, làm mặn hóa nước ngầm ở một số khu vực, gây nghẽn bùn ở một số khu vực nội địa và giảm diện tích rừng ngập mặn Hiện nay nghề nuôi tôm sú ở nước ta vẫn phụ thuộc chủ yếu vào việc đánh bắt tôm mẹ đã thành thục ngoài tự nhiên để sản xuất tôm giống Với nhu cầu ngày càng tăng trong khi số lượng có thể khai thác lại giảm, giá thành tôm sú mẹ thành thục có khi lên đến hàng chục triệu đồng/con Ngoài ra, người ta cũng lo ngại rằng, việc đưa tôm chân trắng vào nuôi ở vùng ĐBSCL sẽ làm tăng số lượng tôm chân trắng trong tự nhiên do tôm thoát ra khỏi ao nuôi và có thể có sự truyền bệnh từ tôm chân trắng sang tôm sú và ngược lại (Vũ Dũng Tiến & Don Griffiths, 2012) Để phục vụ sản xuất, Việt Nam hiện rất cần nguồn tôm sú giống tăng trưởng nhanh, thích nghi hoặc kháng bệnh, có sức chống chịu tốt để phục vụ vùng nuôi quảng canh; đồng thời có nhu cầu lớn về nguồn giống tôm chân trắng sạch bệnh, tăng trưởng nhanh cung ứng cho sản xuất theo phương thức nuôi công nghệ cao, nhằm tạo ra sản lượng lớn và đáp ứng yêu cầu khắt khe về

an toàn thực phẩm và kiểm dịch của các thị trường nhập khẩu Với nhu cầu trên, nhiệm vụ nghiên cứu, chọn tạo, gia hóa và sản xuất tôm bố mẹ và tôm giống là nhiệm vụ đặc biệt quan trọng, cấp bách hiện nay của ngành tôm Việt Nam Việc nghiên cứu công nghệ sản xuất giống, áp dụng thành công các nghiên cứu vào thực tiễn nuôi trồng sao cho vừa đảm bảo năng suất, chất lượng tôm nuôi nhưng vẫn phải đảm bảo an toàn sinh thái, môi trường là những vấn đề cần được quan tâm nhằm đảm bảo cho ngành nuôi tôm phát triển bền vững

1.2 CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CHỈ THỊ PHÂN TỬ THÔNG DỤNG

Các CTPT (chỉ thị DNA) được hình thành từ các loại đột biến DNA khác nhau

và được ứng dụng rộng rãi do số lượng lớn, có nhiều ưu điểm hơn so với chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái, chỉ thị tế bào, chỉ thị sinh hóa…) Chỉ thị DNA thường nằm ở các vùng không phiên mã, không giới hạn về số lượng, không bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và giai đoạn phát triển của cá thể (Nguyễn Đức Thành, 2014) Chỉ thị DNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu về quần thể, quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen, nghiên cứu hệ phiên mã (transcriptome) và trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, năng suất và phẩm chất

giống (Khedkar et al., 2013; Baranski et al., 2014; Nguyễn Giang Thu et al., 2015; Nguyễn Hải Bằng et al., 2017; Orosco và Lluisma, 2017; Qiu et al., 2017; Rumisha et al., 2017; Yu et al., 2017; Qiu et al, 2018; Kundu et al., 2018; Zhao et

al., 2018; Santos et al., 2018; Siddique et al., 2018)

Mỗi loại chỉ thị DNA được phát triển bằng một kỹ thuật tương ứng Các kỹ thuật chỉ thị DNA được chia thành các nhóm chính là: các kỹ thuật không sử dụng phản ứng PCR và các kỹ thuật sử dụng phản ứng PCR

 Kỹ thuật phân tích đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên (RAPD)

Sự phát triển của PCR đã dẫn đến những tiến bộ vượt bậc trong việc cải tiến các kỹ thuật phân tích chỉ thị DNA Trong số các kỹ thuật phân tích chỉ thị DNA sử dụng PCR, RAPD và AFLP được sử dụng rộng rãi nhất (Nguyễn Đức Thành, 2014) Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc mất

nucleotide ở vị trí bắt cặp của mồi (Williams et al., 1990) Nói cách khác, đây là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên các locus chưa biết bằng PCR (Vaseeharan et

al., 2013) Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thường là 10

nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34 - 37oC) Mặc dù trình tự mồi RAPD

là ngẫu nhiên nhưng phải đạt được hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu là 40% (thường

là 50-80%) và không có trình tự base đầu xuôi và ngược giống nhau Sản phẩm

PCR-RAPD thường được phân tách trên gel agarose 1,5 - 2,0 (Vaseeharan et al.,

2013) Cơ sở phân tử của kỹ thuật RAPD được thể hiện ở Hình 1.3

Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và

có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung Kỹ thuật này đơn giản

và dễ thực hiện Điểm hạn chế là sản phẩm PCR không ổn định do mồi ngắn, nhiệt

độ bắt mồi thấp Ngoài ra, kỹ thuật này tạo ra các chỉ thị trội do đó không phân biệt được các cá thể dị hợp tử với các cá thể đồng hợp tử RADP được sử dụng nhiều

trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các loài thực vật (Kawa et al., 2009; Khan

et al., 2010; Nguyen Duc Thanh et al., 2009a; Nguyễn Đức Thành et al., 2009b;

Nguyễn Đức Thành et al., 2000; Nguyen Duc Thanh et al., 2012; Tivang et al.,

1996), trong nghiên cứu đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền (Martin

et al., 2002), trong xác định loài (Fouly et al., 1996; Rossi et al., 2000) và xác định

con lai (Baird et al., 1992; Rokkan et al., 1994)

 Kỹ thuật phân tích đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (RFLP)

RFLP là loại kỹ thuật phân tích chỉ thị DNA không sử dụng PCR Trong kỹ thuật RFLP, đa hình DNA được xác định bằng cách lai đoạn dò DNA đánh dấu

Hình 1.3 Cơ sở phân tử của kỹ thuật RAPD

(Nguồn: Liu & Cordes, 2004)

A Sự thay thế base tại các vị trí liên kết mồi

Đột biến base đơn

B Sự chèn/xóa giữa hai RAPD primer

(DNA probe) với DNA sau khi cắt bằng enzyme cắt hạn chế và được thấm truyền lên màng lai bằng phương pháp Southern Kết quả tạo ra hình ảnh các phân đoạn DNA khác nhau Việc xác định các phân đoạn DNA được tiến hành bằng cách lai các phân đoạn DNA này với đoạn dò được đánh dấu huỳnh quang hoặc phóng xạ để

có thể phát hiện bằng phản ứng huỳnh quang hoặc phim chụp phóng xạ (Hình 1.4)

(Nguyễn Đức Thành, 2014; Vaseeharan et al., 2013)

Các chỉ thị RFLP có mức đa hình cao, đồng trội (nên có thể phân biệt được các cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử) và khả năng lặp lại cao Kỹ thuật RFLP cũng cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu Tuy nhiên, kỹ thuật này không được dùng rộng rãi vì một số hạn chế như: cần nhiều DNA chất lượng cao, phải phát triển thư viện đoạn dò cho từng loài, cần thông tin về trình tự để tạo đoạn dò, không thuận tiện cho việc tự động hóa, mức độ đa hình và số lượng locus đối với mỗi lần phân tích thấp, đòi hỏi nhiều thời gian, tốn kém Trong những thập niên 80 và 90 của thế

kỷ trước, kỹ thuật RFLP được sử dụng trong lập bản đồ genome (Graner et al.,

1991; Lander & Botstain, 1989), xác định giống (Karp et al., 1998) RFLP được

dùng trong nghiên cứu quan hệ giữa các nhóm phân loại gần (Miller & Tanksley,

1990), đa dạng di truyền (Dubreuil et al., 1996), trong lai tạo và chuyển gen vào cá

thể khác (introgression) bao gồm cả chuyển gen giữa cây trồng và cỏ dại (Clausen

& Spooner, 1998)

Hình 1.4 Các bước thực hiện kỹ thuật RFLP

(Nguồn: Nguyễn Đức Thành, 2014)

 Kỹ thuật phân tích đa hình vi vệ tinh (microsatellite)

Đây là nhóm kỹ thuật sử dụng các cặp mồi đặc trưng để nhân các vùng genome có các nucleotide lặp lại ở các vị trí khác nhau Chỉ thị microsatellite được

ưa chuộng trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền vì chúng thể hiện mức độ biến đổi rất cao ở cá thể và quần thể Microsatellite có thể là các trình tự lặp lại đơn giản (như: TGTGTGTGTG) hoặc phức tạp (như: GAA (GA)17 GAA) của các trình tự DNA ngắn, được tìm thấy rải rác hàng chục thậm chí hàng trăm, hàng ngàn lần trong toàn bộ hệ gen của hầu hết các loài eukaryote Đây là loại trình tự lặp quan trọng nhất Chúng lặp lại trước sau và thay đổi về số lượng ở các locus khác nhau

cũng như ở các cá thể khác nhau (Vaseeharan et al., 2013) Microsatellite có

khuynh hướng phân bố đồng đều trong hệ gen trên tất cả các nhiễm sắc thể và tất cả các vùng của nhiễm sắc thể Chúng được tìm thấy bên trong các vùng gen mã hóa

(Liu et al., 2001c), các intron và trong các trình tự không chứa gen Hầu hết các

locus microsatellite tương đối nhỏ Đặc điểm này rất quan trọng đối với kỹ thuật gen sử dụng PCR Nói chung, các microsatellite chứa một số lượng lớn đoạn lặp lại thì tính đa hình cao hơn, mặc dù sự đa hình cũng đã được quan sát thấy ở các

microsatellite chỉ có 5 lần lặp lại (Karsi et al., 2002b; Liu & Cordes, 2004)

Hình 1.5 Minh họa đa hình microsatellite

Đa hình microsatellite dựa trên cơ sở sự khác nhau về kích thước Sự khác nhau này gây ra do số lượng khác nhau của các đơn vị lặp chứa trong các alen tại một locus nhất định Tỉ lệ đột biến khoảng 10-2

trên mỗi thế hệ (Weber & Wong, 1993; Crawford & Cuthbertson, 1996) và nguyên nhân được cho là do sai sót của enzyme polymerase trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến những khác biệt về số lượng các đơn vị lặp lại (Liu & Cordes, 2004) Hình 1.5 minh họa đa hình microsatellite

 Kỹ thuật phân tích đa hình nucleotide đơn (SNP)

SNP là các đa hình được tạo ra bởi các đột biến điểm làm xuất hiện các alen khác nhau do sự thay thế nucleotide hoặc chèn/xóa nucleotide đơn ở một vị trí nhất định bên trong một locus Những khác biệt về trình tự đó đã được mô tả từ khi DNA bắt đầu được giải trình tự vào năm 1977 Tuy nhiên, khả năng phân tích SNP nhanh chóng trong một số lượng lớn mẫu chỉ được thực hiện khi có ứng dụng của công nghệ chip gen vào cuối những năm 1990 SNP trở thành tiêu điểm trong việc phát triển marker phân tử vì chúng là loại đa hình phong phú nhất trong bất kỳ sinh vật nào, thích hợp với việc tự động hóa và chỉ ra được các đa hình bị ẩn đi hoặc không

phát hiện được bởi các marker và các phương pháp khác (Vaseeharan et al., 2013;

Liu & Cordes, 2004)

Về lý thuyết, một SNP bên trong một locus có thể tạo ra 4 alen Tuy nhiên trong thực tế, hầu hết các SNP thường chỉ hạn chế từ một đến hai alen (thường là hai pyrimidine C/T hoặc hai purin A/G) và được coi như là hai alen Tuy giá trị thông tin đa hình (PIC) của các SNP không cao bằng các microsatellite đa alen, nhưng hạn chế này lại được cân bằng bởi số lượng rất lớn của chúng Các marker SNP được di truyền theo kiểu marker đồng trội (Liu & Cordes, 2004) Ở ngô cứ 60

đến 100 bp có một SNP (Ching et al., 2002), ở người 90% thay đổi trình tự là thay đổi nucleotide đơn và cứ 1000 bp có một SNP (Sachidanandam et al., 2001;

Nguyễn Đức Thành, 2014)

Trong những năm gần đây, SNP được ứng dụng rộng rãi như một loại CTPT hiệu quả trong các chương trình chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (MAS) (Majeed

et al., 2019) Các ứng dụng chủ yếu của SNP trong thủy sản là các nghiên cứu hệ

gen và được sử dụng như là các marker chẩn đoán bệnh Vì là phần chính của các chip gen nên chúng được coi như là các marker thế hệ mới trong lĩnh vực thủy sản

(Vaseeharan et al., 2013) Hình 1.6 minh họa chỉ thị đa hình SNP

Có nhiều phương pháp phát hiện SNP, trong đó giải trình tự DNA là phương pháp chính xác nhất và được sử dụng nhiều nhất (Liu & Cordes, 2004) Việc phân tích trực tiếp sự khác nhau trong trình tự giữa nhiều cá thể với số lượng lớn các locus có thể được thực hiện bởi công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) (Nguyễn

Đức Thành, 2014) SNP thường được sử dụng trong lập bản đồ di truyền (Kim et

al., 2010; Raman et al., 2014; Wu et al., 2014), trong nghiên cứu đa dạng di truyền

(Frascaroli et al., 2013; Kaur et al., 2014) và trong chọn giống (Ha et al., 2007)

 Kỹ thuật phân tích đa hình độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP)

Kỹ thuật AFLP được sử dụng để phân tích sự đa hình DNA bằng cách nhận biết đồng thời hàng trăm phân đoạn DNA đã được khuếch đại chọn lọc Kỹ thuật

này được giới thiệu lần đầu tiên bởi Vos et al (1995) Quy trình thực hiện AFLP

gồm các bước: cắt DNA hệ gen, gắn các phân đoạn DNA với các adaptor thích hợp, phản ứng PCR tiền khuếch đại và khuếch đại chọn lọc Hai enzyme cắt hạn chế

thường được sử dụng phối hợp là EcoRI (có trình tự nhận biết 6 base) và MseI (có

trình tự nhận biết 4 base) Một số mồi đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng

b

c

a

Hình 1.6 Minh họa SNP trong một đoạn DNA sợi kép ở ba cá thể giả định

Cây 1 (a) dạng dị hợp tử, Cây 2 và Cây 3 (b và c) dạng đồng hợp tử

(Nguồn: http://www.treeimprovement.org/content/figure-1)

cho phản ứng khuếch đại chọn lọc AFLP như: EcoRI-ACT FAM, EcoRI-ACA FAM, EcoRI-AAC NED, EcoRI-ACC NED, EcoRI-AGC NED, EcoRI-AAG JOE, EcoRI-AGG JOE, EcoRI-ACG JOE Các sản phẩm khuếch đại AFLP (các đoạn DNA có kích thước khác nhau) được phân tách bằng điện di và nhận diện các đoạn

có mặt hay vắng mặt trong số các mẫu dựa vào các tín hiệu huỳnh quang trên các thiết bị chuyên biệt AFLP có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như: kiểm tra tính đồng nhất hay mức độ tương đồng về mặt di truyền, xác định các locus, xác định kiểu di truyền của các cá thể hoặc phân biệt các cá thể dựa trên các

alen (Applied Biosystems, 2010 AFLP® Plant Mapping Protocol)

Ưu điểm nổi bật của AFLP là khả năng sàng lọc đồng thời nhiều vùng DNA khác nhau phân bố ngẫu nhiên trên toàn hệ gen AFLP kết hợp được những thế mạnh của cả RFLP và RAPD và khắc phục được những hạn chế của chúng Phương pháp này dựa trên cơ sở PCR và không cần biết trước thông tin về trình tự như đối với RFLP Đây là phương pháp đáng tin cậy vì tính nghiêm ngặt cao của PCR, trái với nhược điểm về độ lặp lại thấp của RAPD Ưu điểm chính của AFLP là một số lượng lớn các đa hình có thể được ghi nhận trên một bản gel polyacrylamide duy nhất mà không cần bất kỳ nghiên cứu hay phát triển nào trước đó Tương tự như đối với RAPD, việc phân tích AFLP cho phép sàng lọc nhiều locus bên trong hệ gen

trong một thời gian tương đối ngắn và không đắt tiền (Vaseeharan et al., 2013)

Cũng giống như RAPD, các marker AFLP được di truyền dưới dạng các marker trội: Nếu bố mẹ là đồng hợp tử thì tất cả các băng tổng hợp từ bố và mẹ sẽ thể hiện

ở thế hệ F1, trong khi đó các băng dị hợp tử sẽ tách biệt (Liu et al., 1998; 1999)

Hạn chế chính của AFLP là cần có thiết bị chuyên biệt như máy giải trình tự tự động để phân tích các tín hiệu huỳnh quang, các phương pháp điện di truyền thống cũng có thể được sử dụng nhưng chúng lại đòi hỏi phải sử dụng các đánh dấu phóng

xạ hoặc các kỹ thuật nhuộm đặc biệt như nhuộm bạc (Liu & Cordes, 2004) Hạn chế khác của AFLP về mặt phương pháp luận là khó để phân tích do số lượng lớn các phân đoạn không liên quan cũng được quan sát thấy (trên gel) cùng với các phân

đoạn đa hình (như đối với RAPD) (Vaseeharan et al., 2013) Các bước chính của kỹ

thuật AFLP được mô tả ở Hình 1.7

(a) Chuẩn bị mẫu

DNA tổng số

Enzyme cắt hạn chế (MseI và EcoRI)

và DNA ligase

Hình 1.7 Các bước chính của kỹ thuật AFLP

(Nguồn: Mueller & Wolfenbarger, 1999)

(a) Chuẩn bị mẫu: Hỗn hợp phản ứng chứa DNA tổng số, các enzyme cắt hạn

chế và các adaptor; (b) Phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme cắt hạn

chế và gắn các adaptor; (c) Phản ứng khuếch đại chọn lọc

Thiết bị phân tích: Máy xác định trình tự tự động sử dụng điện di mao quản

ABI3100 (ABI3100 Genetic Analyzer) được sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu phân tích AFLP để đánh giá tính đa hình hệ gen Loại thiết bị này có nhiều tính năng vượt trội như: mẫu được phân tích hoàn toàn tự động, hiệu suất cao, nguyên lý phát hiện dựa trên tín hiệu huỳnh quang, hệ thống bao gồm nhiều mao quản (multi-capillary) có thể phân tích đồng thời 4, 16, 48 hoặc 96 mẫu Việc phân tích được thực hiện tự động, không cần giám sát từ bước tải mẫu, phân tách, phát hiện tín hiệu, tạo lập và lưu trữ dữ liệu (www.appliedbiosystems.com)

Phần mềm phân tích dữ liệu AFLP: Để hoàn thành thí nghiệm phân tích AFLP

một cách thành công thì yếu tố quan trọng là phần mềm phân tích phải có khả năng ghi nhận một cách chính xác và có độ lặp lại cao đối với các mẫu phân tích Phần mềm GeneMapper® Software Version 4.1 hoặc một số phiên bản khác có tính năng tương tự hoặc cao hơn cho phép phân tích dữ liệu điện di và dữ liệu giải trình tự các băng AFLP trên máy xác định trình tự tự động theo một phương pháp mới với những tính năng đảm bảo cho việc phân tính chính xác và đảm bảo độ lặp lại Những tính năng này bao gồm khả năng sử dụng các file dữ liệu của các mẫu phân tích để tạo ra tập hợp thông tin di truyền của các mẫu đó Ngoài ra, phần mềm còn

có tính năng xuất biểu đồ tùy chọn cho phép các biểu đồ (với mỗi biểu đồ được biểu thị bằng một màu duy nhất) được chồng lên nhau

Phần mềm này sử dụng các thuật toán phân tích tiên tiến có thể xác định nhanh chóng và chính xác các peak đa hình và các peak phổ biến trong một lượng lớn các mẫu Tính năng đánh giá chất lượng phân tích (GQ) cho phép ghi nhận các dữ liệu mẫu không rõ ràng/các tín hiệu bị mờ có chất lượng thấp để kiểm tra lại bằng phương pháp thủ công Khi hoàn thành bước phân tích dữ liệu, phần mềm tự động tập hợp các kết quả theo một định dạng chuẩn gồm 2 phần, từ đó có thể xuất dữ liệu cho các bước phân tích tiếp theo Phần mềm còn có một tính năng thuận tiện khác là

“Report Manager” cho phép tạo ra các báo cáo chứa các kết quả phân tích cuối cùng

có thể được in ra hoặc được xuất ra cho các bước phân tích khác Người sử dụng có thể tùy chỉnh định dạng của các báo cáo này phù hợp với từng nghiên cứu cụ thể

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN TÔM SÚ

Thông tin về đa dạng di truyền của các quần thể tôm tự nhiên và nuôi trồng rất cần thiết đối với việc quản lý bền vững nguồn tài nguyên thủy sản, duy trì nòi giống, góp phần bảo tồn tính đa dạng của thủy vực và phục vụ công tác chọn giống Đối với lĩnh vực nghiên cứu đa hình di truyền ở sinh vật nói chung và ở tôm sú nói riêng, ngoài các đặc điểm về hình thái, sinh hóa của loài thì các CTPT là công cụ hữu hiệu để khảo sát đa hình hệ gen, xác định chính xác nhóm phân loại cũng như phân biệt giữa hai loài giống nhau về đặc điểm hình thái và xác định các biến dị di

truyền (Aziz et al., 2011) Việc ứng dụng công nghệ gen trong lĩnh vực thủy sản đã

tạo nên những thành tựu đáng kể giúp tăng năng suất và bảo tồn đa dạng sinh học

(Wenne, 2018; McAndrew & Napier, 2010; Abdelrahman et al., 2017; Macqueen et

al., 2017) Nhiều công trình nghiên cứu về đa hình hệ gen của các quần thể tôm sú

đã được công bố

Benzie (2000) đã khảo sát các loài tôm thuộc họ tôm he (Penaeid) và kết luận:

ở quần thể tôm tự nhiên, việc đánh giá biến dị sử dụng các chỉ thị DNA cho thấy mức độ đa dạng cao hơn so với các chỉ thị allozyme Tuy nhiên, các chỉ thị DNA có

xu hướng củng cố kết quả quan sát được dựa trên các số liệu về allozyme Từ năm

1997, nhóm nghiên cứu của giáo sư Tassanakajon (Thái Lan) đã sử dụng các chỉ thị RAPD để xác định đa dạng di truyền ở ba quần thể tự nhiên của tôm sú Thái Lan

Sử dụng 200 primer để sàng lọc, trong đó 84 primer cho sản phẩm khuếch đại Kết

quả cho thấy mức độ đa hình khác nhau đáng kể giữa các quần thể (Tassanakajon et

al., 1997) Trước đó, trong một nghiên cứu khác vào năm 1995, Garcia & Benzie đã

phát hiện tỷ lệ đa hình 6-7 % ở các quần thể P monodon và cho rằng phương pháp

RAPD rất hữu ích trong việc cung cấp chỉ thị cho việc tạo giống tôm Penaeid (Garcia & Benzie, 1995)

Trong nghiên cứu của Pan et al (2004), 23 chỉ thị microsatellite đa hình đã được sử dụng để đánh giá đa hình hệ gen ở tôm sú P monodon Microsatellite cũng

đã được sử dụng trong nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể tôm sú ở Australia và

Thái Lan (Brooker et al., 2000; Tassanakajon et al., 2003) Nghiên cứu trên 312 mẫu tôm, Brooker et al đã xác định được số lượng các alen có mặt ở các locus

Pmo9, Pmo25 và Pmo27 lần lượt là 84, 34 và 35 Phân tích đa dạng về độ dài của 3 locus microsatellite ở 5 quần thể khác nhau đã cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa các quần thể ở vùng bờ biển phía Tây so với các quần thể ở vùng bờ biển phía Đông

và phía Nam (Brooker et al 2000)

AFLP thường được sử dụng cùng với microsatellite để đánh giá đa dạng di truyền và lập bản đồ hệ gen tôm sú và các loài thủy sản Nhiều công trình nghiên

cứu quần thể tôm sử dụng kỹ thuật AFLP đã được công bố (Liu et al., 1998, 1999; Wuthisuthimethavee et al., 2005; Zhang et al., 2007; Staelens et al., 2018…) Bản

đồ CTPT mật độ thấp của các loài thủy sản như cá rô phi, cá da trơn, tôm sú, cá bơn Nhật Bản và cá hồi Đại Tây Dương đã được xây dựng Bản đồ CTPT mật độ cao ở

cá hồi đã được công bố vào năm 2003 Theo Nichols et al (2003), phần lớn các

CTPT ở cá (khoảng 1300 chỉ thị) trải rộng khắp toàn bộ hệ gen của chúng là chỉ thị AFLP và có khoảng 200 chỉ thị là microsatellite dạng nguyên gốc (Maqsood & Ahmad, 2017) Điều này cho thấy phạm vi ứng dụng rộng rãi và hiệu quả của chỉ thị AFLP trong lĩnh vực nghiên cứu đa hình di truyền các loài thủy sản

Benzie et al (2002) đã sử dụng kết hợp các chỉ thị mtDNA và RFLP để nghiên cứu quần thể tôm sú P monodon ở vùng Ấn Độ Dương - Thái Bình Dương Kết quả

nghiên cứu cho thấy đa dạng di truyền cao nhất thể hiện ở quần thể vùng Indonesia, thấp hơn ở các quần thể vùng Philippine và Australia và thấp rõ rệt ở các quần thể Đông Nam châu Phi và Tây Australia Đa dạng di truyền thấp ở các quần thể ranh giới về mặt địa lý ở vùng Đông Nam châu Phi và Tây Australia được xem là do các trở ngại về địa lý

Kết hợp kỹ thuật RAPD và đa hình mtDNA (DNA ribosome 16S và một tổ

hợp gồm 2 gen COI-COII), Klinbunga et al (2001) đã nghiên cứu các quần thể tôm

sú P monodon thu nhận từ 5 khu vực, bao gồm Chumphon và Trat (Vịnh Thailand),

Phangnga, Satun và Trang (Andaman Sea) Trong nghiên cứu phân tích mtDNA, các tác giả đã chỉ ra các dạng đơn bội tổ hợp của 37 mtDNA, tính đa dạng cao của

thể đơn bội (0,855) và tính đa dạng nucleotide (3,328 %) đối với P monodon Khác biệt về quần thể của P monodon giữa vùng biển Andaman và vùng Vịnh Thái Lan được thể hiện rõ rệt (p < 0,0001) Các kết quả khác biệt quần thể là có ý nghĩa về di

truyền giữa các quần thể vùng Chumphon và Trat khi sử dụng RAPD Trái lại khi phân tích đa hình mtDNA thì các kết quả thu được không cho thấy được sự khác biệt giữa các mẫu này Từ những phát hiện này, các tác giả đã kết luận rằng với giả định về tính trung lập chọn lọc của marker ty thể, có thể tồn tại dòng chảy gen thiên

về giới tính cái giữa các quần thể P monodon vùng Trat và Chumphon và tạo nên

một dạng khác biệt có tính bất thường

Khamnamtong et al (2009) đã nghiên cứu các quần thể tôm P monodon ở các

vùng biển Thái Lan (Satun, Trang, Phangnaga và Raong ở biển Andaman; Chumphon và Trat ở vịnh Thailand) bằng cách kiểm tra sự đa hình của COI ty thể Mức độ đa dạng nucleotide trung bình giữa một cặp mitotype COI trên tất cả các mẫu là 6,604%; cho thấy sự đa dạng di truyền cao Sự đa dạng di truyền cao ở tôm

P monodon Thái Lan cho thấy rằng mỗi quần thể di truyền là một đơn vị quản lý

riêng biệt vì nó thể hiện các đặc điểm về động học và thành phần quần thể duy nhất đối với sự cải thiện di truyền các tính trạng quan trọng về mặt kinh tế thông qua

chương trình chọn lọc sinh sản (Vaseeharan et al., 2013)

Wuthisuthimethavee et al (2005) đã xây dựng một bản đồ liên kết dựa trên microsatellite ở P monodon, sử dụng 57 chỉ thị SSLP (Single Sequence Length

Polymorphism), 1 chỉ thị EST (Expressed Sequence Tag), 1 chỉ thị SCAR (một chỉ

thị PCR bắt nguồn từ AFLP dựa trên đa hình về tăng trưởng của P monodon) và 76

cá thể của một gia đình giao phối chéo F1 Sự phân ly các chỉ thị được ghi nhận và phân tích bằng chương trình Join-Map 2.0 Tổng số 50 locus chỉ thị được xác định tuân theo tỷ lệ phân ly Mendel đã được nhóm lại với chỉ số LOD (Logarithm base

10 of the odds - Logarithm cơ số 10 của độ lệch) là 5.0 Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra 9 nhóm liên kết với 27 locus và 23 locus không liên kết Bản đồ liên kết này bao phủ khoảng cách di truyền tổng cộng là 103,6 cM (CentiMorgan) Bản đồ liên

kết di truyền này đã sắp xếp nhiều chỉ thị hơn trên hệ gen của P monodon đối với các họ liên quan (Vaseeharan et al., 2013)

Năm 2011, Aziz và các cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu để đánh giá đa dạng di truyền của các quần thể tôm sú ở Malaysia, sử dụng các microsatellite Sử dụng 30 cặp mồi đa hình, các tác giả đã xác định được tổng số alen trên locus dao động trong khoảng 3 - 36 với kích thước các alen dao động từ 100 - 275 cặp base Các quần thể tôm sú ở vùng Lawas và Pulau Sayak có mức sai khác di truyền cao nhất trong khi các quần thể ở vùng Endau Rompin và Sedili có mức sai khác di

truyền thấp hơn (Aziz et al., 2011) Nghiên cứu của Rumisha et al (2017) về đa

dạng di truyền của 159 cá thể tôm sú liên quan đến ô nhiễm kim loại thu từ tám địa điểm khác nhau ở bờ biển Tanzania, sử dụng 7 microsatellite đã cho thấy mức độ

đa hình cao (4 - 44 alen)

Sự phát triển của công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới cho phép phát hiện lượng lớn các CTPT, đặc biệt là các SNP trên toàn bộ hệ gen, đã mở ra tiềm năng

ứng dụng to lớn trong lĩnh vực thủy sản, chẳng hạn như ở cá (Abdelrahman et al.,

2017; Kumar & Kocour, 2017) SNP đã được sử dụng để xác định các tính trạng,

các gen ứng viên và các QTL trong NTTS (Oyarzún et al., 2013; Yáñez et al.,

2015) Phân tích di truyền quần thể cá hồi Đại Tây Dương đã cho thấy có sự giảm

sút về đa dạng di truyền ở các dòng thuần hóa (Makinen et al., 2015) Sự khác biệt

di truyền ở cá hồi Đại Tây Dương Na Uy giữa dòng hoang dã so với dòng cá nuôi

đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng SNP-chip 7K (Karlsson et al., 2011) Bản

đồ liên kết di truyền dựa trên chỉ thị SNP cũng đã được xây dựng ở tôm sú P

monodon (Baranski et al., 2014), tôm thẻ chân trắng L vannamei (Du et al., 2010),

tôm Marsupenaeus japonicas (Lu et al., 2016) và nhiều loài thủy sản khác (Tsigenopoulos et al., 2014; Wang et al., 2015a,b; Sun et al., 2017; Castaño- Sánchez et al., 2010; Shao et al., 2015; Ao et al., 2015; Qi et al., 2010; Vervalle et

al., 2013; Jones et al., 2013; Yue, 2014; Abdelrahman et al., 2017) Sự đa hình SNP

tại thụ thể vitellogenin (PmVtgr) gắn liền với các kiểu hình liên quan đến sinh sản

(chỉ số gonadosomatic và trọng lượng buồng trứng) của tôm sú P monodon đã được