Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (m, GP5, GP5ectoM) của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp

Hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm như: Mức độ biểu hiện kháng nguyên cao, có thể sản xuất

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC

NHỜ AGROBACTERIUM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2018

i

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC

NHỜ AGROBACTERIUM

Chuyên ngành: Hoá sinh học

Mã số: 94 20 116

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Nguyễn Trung Nam

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS TS Chu Hoàng Hà

Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI – 2018

ii

LỜI CẢM ƠN

Luận án được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen,Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinhhọc, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và Trung tâm Chẩn đoán Thú

y Trung ương Với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên cứu thườngxuyên của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luônnhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hướng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoahọc, các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban Tôi xin chân thànhcảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của ViệnCông nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy, PGS.TS Chu Hoàng Hà và

TS Nguyễn Trung Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọiđiều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Lê Trần Bình, PGS.TS Phạm Bích Ngọc,PGS.TS Đinh Duy Kháng, PGS.TS Tô Long Thành, TS Nguyễn Tường Vân, ThS

Hồ Thị Thương và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Thínghiệm trọng điểm Công nghệ gen đã luôn giúp đỡ, chia sẻ những kiến thức quýbáu và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, BanLãnh đạo, cùng toàn thể cán bộ của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạomọi điều kiện tốt nhất để cho tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn độngviên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Minh Hằng

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học củaPGS.TS Chu Hoàng Hà, TS Nguyễn Trung Nam và một số kết quả cùng cộng tácvới các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đượccông bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của cácđồng tác giả

Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trìnhnào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hằng

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 6

1.1.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh 6

1.1.2 Bệnh tích của PRRS 8

1.1.3 Virus PRRS 9

1.2 Vaccine phòng PRRS 20

1.2.1 Vaccine sống - nhược độc 21

1.2.2 Vaccine vô hoạt 23

1.2.3 Các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV 24

1.3 Biểu hiện tạm thời kháng nguyên của PRRSV bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium 30

1.3.1 Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ Agrobacterium 30

1.3.2 Quá trình thẩm lọc nhờ A tumefaciens 33

1.3.3 Một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật 35

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1 Vật liệu 43

2.1.1 Chủng vi khuẩn 43

2.1.2 Các vector và vật liệu thực vật, động vật 43

2.1.3 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 44

2.1.4 Hoá chất 45

2.1.5 Thiết bị 45

2.2 Phương pháp nghiên cứu 46

ii

2.2.1 Nhân dòng gen mã hoá protein GP5, M và GP5ectoM của virus PRRS 46

2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen m, gp5opt và gp5ecto-m phục vụ chuyển gen 47

2.2.3 Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá N benthamiana 49

2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong lá cây thuốc lá 50

2.2.5 Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số 52

2.2.6 Điện di SDS-PAGE và lai Western blot 52

2.2.7 Tinh sạch protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP 53

2.2.8 Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên GP5-ELP, GP5ectoM-GP5-ELP, M-ELP trên động vật thí nghiệm 54

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61

3.1 Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ecto-m và tạo chủng A tumefaciens mang vector tương ứng 61

3.1.1 Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp ELP (M-ELP) 61

3.1.2 Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5 dung hợp ELP (GP5-ELP) 65

3.1.3 Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5ectoM dung hợp ELP (GP5ectoM-ELP) 69

3.2 Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M -ELP, GP5 ELP, GP5ectoM-ELP trong cây thuốc lá N benthamiana 74

3.2.1 Ảnh hưởng của vector hỗ trợ 75

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ AS 76

3.2.3 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A tumefaciens 78

3.2.4 Ảnh hưởng của tuổi của lá 79

3.2.5 Ảnh hưởng của tuổi cây 80

iii

3.2.6 So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên M-ELP,

GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong điều kiện đã được tối ưu bằng lai miễn dịch

81

3.3 Tinh sạch kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP 82

3.3.1 Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch thu nhận kháng nguyên .83

3.3.2 Tinh sạch kháng nguyên bằng phương pháp mITC 86

3.4 Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 91

3.4.1 Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột 91

3.4.2 Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên lợn 98

Chương 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 108

4.1 Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium 108

4.1.1 Lựa chọn kháng nguyên trong thiết kế vector biểu hiện 108

4.1.2 Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp 109

4.1.3 Cấu trúc vector biểu hiện và mức độ biểu hiện gen tạm thời ở thực vật 110

4.2 Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột 116

4.3 Tính sinh miễn dịch dịch thể trên lợn 120

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 130

NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 132

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 133

TÀI LIỆU THAM KHẢO 140 PHỤ LỤC I

iv

AS Acetosyringone

aa Amino acid (axit amin)

2b CMV Cucumber mosaic virus (CMV) 2b protein (Protein 2b của virus

khảm dưa chuột)

bp Base pair (Cặp base)

BSA Bovine serum albumin

CaMV Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ)

DNA Deoxyribonucleic acid

ER Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất)

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

ELP Elastin-like polypeptide

HP-PRRSV Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome

virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thể độc lực cao)

LV Lelystad virus

M Matrix/ Membrance protein

MES 2-(N- Morpholino)ethanesulfonic acid

MLV Modified-live virus (Virus sống đã làm biến đổi = virus nhược

độc)mITC Membrane-based Inverse transition cycling (Chu trình chuyển pha

nghịch đảo qua màng)

nptII Gene mã hoá Neomycin phosphotransferase (Gen kháng

kanamycin)Nos Nopaline synthase terminator

nsp Non-structural protein

OD Optical density (Mật độ quang)

ORF Open reading frame (Khung đọc mở)

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Fc Stabilizing domain - "Fragment of crystallizable chain of IgG"

(Vùng hằng định của kháng thể IgG)PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (Virus gây

hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn)RNA Ribonucleic acid

ScFv Single chain variable fragment

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp)

35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã)

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen gp5opt,

gp5ecto-m và gp5ecto-m ……… 44

pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP ……… 47

với vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xEL ……… 47

pCB301 ……… 48

nguyên tái tổ hợp (M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP) trong

lá thuốc lá N benthamiana ……… 82

M-ELP, GP5-M-ELP, GP5ectoM-ELP ……… 91

DANH MỤC CÁC HÌNH

hệ gen PRRS ……… 12

vii

Hình 1.5 Cấu trúc Arterivirus ……… 14

pEAQ bằng phương pháp thẩm lọc A tumefaciens ………… 34

bằng phương pháp hút chân không ……… 50

mang vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP ……… 65

Hình 3.10 Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5ecto-m mã hoá protein

GP5ectoM dung hợp ELP trong vector pRTRA ……… 72

Hình 3.11 Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen mang gen

gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M dung hợp

ELP… ……… ……… ……… …… 72

chuyển gen pCB301

35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP… ……… ……… ……… 73

pIBT-35S-HC-Pro PVY đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp

76

viii

thông qua kết quả lai Western sử dụng kháng thể kháng myc ……… ……… ……… ……

C-Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các protein

tái tổ hợp được xác định bằng Western blot sử dụng kháng thể

kháng Cmyc ……… ……… 77

thời của gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và

GP5ectoM-ELP được xác định bằng Western blot sử dụng

kháng thể kháng Cmyc ……… ……… 80

Hình 3.16 Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá trên cây đến biểu hiện tạm

thời gen mã hoá cho các protein tái tổ hợp được xác định bằng

Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc ……… 79

Hình 3.17 Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời protein tái

tổ hợp được xác định bằng Western blot sử dụng kháng thể

kháng Cmyc ……… ……… 81

kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và ELP bằng lai miễn dịch dựa vào protein chuẩn đã được định lượng H5-pII.……… ……… ……… 82

dịch và điện di SDS-PAGE nhuộm Coomassie blue ……… 88

Hình 3.25 Định lượng protein tái tổ hợp GP5-ELP bằng lai miễn dịch … 89

miễn dịch và điện di SDS-PAGE nhuộm Coomassieblue … 90

dịch ……… ……… …… 90

ix

Hình 3.28 Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết

thanh chuột được tiêm M-ELP bằng kỹ thuật ELISA ……… 92

thanh chuột bằng Western blot ……… ……… 93

thanh chuột được tiêm GP5-ELP bằng kỹ thuật ELISA

… ……… 94

huyết thanh chuột bằng Western blot ……… 95

thanh chuột được tiêm GP5ectoM-ELP bằng kỹ thuật ELISA ……… 96

trong huyết thanh chuột Western blot 97

bằng Western blot dựa vào protein chuẩn đã được định lượng(H5-pII)3 bằng kháng thể kháng cmyc ……… 99

thanh của lợn được tiêm GP5-ELP bằng phản ứng ELISA 100

huyết thanh của lợn bằng Western blot ……… 101

thanh lợn được tiêm GP5ectoM-ELP bằng ELISA ……… 102

trong huyết thanh lợn bằng Western blot ……… 103

trong huyết thanh của lợn được tiêm GP5-ELP, ELP, WT và virus vaccine PRRS nhược độc bằng xét nghiệmmiễn dịch đơn lớp (IPMA) ……… ……… 105

dịch đơn lớp (IPMA) ……… ……… 107

x

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive andrespiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn do virusgây ra Ở Việt Nam, bệnh còn được gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữđại chúng) do lợn mắc bệnh thường bị xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tímxanh PRRS gây thiệt hại kinh tế rất lớn ở những nước có bệnh PRRS được pháthiện ở Mỹ vào năm 1987 Hàng năm nước Mỹ phải chịu những thiệt hại do bệnhnày ước tính khoảng 664 triệu USD cho việc tiêu huỷ lợn chết, lợn ốm, chi phíchống dịch và xử lý môi trường

Ở Việt Nam, dịch PRRS do virus thể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiênvào năm 2007 Từ đó đến nay, dịch đã xuất hiện ở hầu hết các địa phương trong

cả nước Theo thống kê của Cục Thú y, từ cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016,

đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang,Nghệ An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242 con lợn bịtiêu huỷ PRRS đã ảnh hưởng nặng nề tới ngành chăn nuôi lợn trong nước Bệnhvẫn xuất hiện ở một số địa phương và có tính chất 2-3 năm một lần Điều nàycũng cho thấy nguy cơ xuất hiện trở lại của dịch bệnh này trong thời gian tới

Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và nhượcđộc Các vaccine vô hoạt thường an toàn nhưng khả năng bảo hộ thấp Cácvaccine nhược độc bảo hộ tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về tính an toàn củacác loaị vaccine này Vaccine nhược độc có thể giảm dần mức bảo hộ do giảmmức tương đồng với chủng mới (nếu có) và bản thân virus vaccine sau nhiều lầntruyền nhiễm cũng có thể đột biến trở thành cường độc Mặc dù vậy, phòngchống PRRS tại Việt Nam đã đạt hiệu quả cao Hiện nay, dịch chỉ xuất hiện lẻ tẻ,trong những năm gần đây hầu như không có dịch, một phần là nhờ biện pháp chủđộng tiêm phòng cho lợn

Virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ở nước ta hiện nayđược xác định là thể độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị Việc phòng chống dịchchủ yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử

thể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp.Nhu cầu về các loại vaccine PRRS thế hệ mới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, antoàn và hiệu quả là vấn đề cấp thiết

Protein GP5 và M là những protein cấu trúc chính của virus PRRS(PRRSV) được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểuđơn vị chống PRRSV Các kháng thể kháng GP5 và M ở lợn là các kháng thể cókhả năng trung hoà PRRSV Sự kết hợp đoạn peptit miền ngoài của khángnguyên GP5 (Ectodomain, GP5ecto) được cho là chứa các epitope trung hoà củaGP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo được protein tái tổ hợp heterodimerGP5ectoM có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch mạnh và trở thành mộttrong những ứng viên tiềm năng làm nguyên liệu để phát triển sản xuất vaccinechống PRRSV

Kháng nguyên của virus PRRS có thể được sản xuất trong hệ thống thựcvật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS thông qua phương phápbiểu hiện gen tạm thời Hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương

pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu

điểm như: Mức độ biểu hiện kháng nguyên cao, có thể sản xuất protein với sốlượng lớn, phương pháp thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị ảnhhưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiệntrong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá, cung cấp kháng nguyên cho mục đíchsản xuất vaccine chống chủng virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng khidịch bệnh xảy ra

Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án

được thực hiện với đề tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong

cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium” với mục đích tạo

cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên củachủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở

định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung

Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyêntái tổ hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợntai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụcho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới

Mục tiêu cụ thể

 Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize

(gp5opt) và gp5ecto-m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối

loạn sinh sản và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoterCaMV 35S

 Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M,GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá vàtinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốclá

 Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 vàGP5ectoM trên động vật thí nghiệm

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m, gp5opt và gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP,

GP5ectoM-ELP và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng.

Nội dung 2: Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m, gp5opt và gp5ecto-m ở lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana Biểu hiện tạm thời và tinh sạch

các kháng nguyên tái tổ hợp

Nội dung 3: Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể của kháng nguyên

M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm

4 Đóng góp mới của luận án

Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kếvector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh

tinh sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổhợp trên động vật thí nghiệm

Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về việc

thiết kế vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã

hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng virus

PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá N.

benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium

Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợpM-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích sinh kháng thể đặchiệu kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm Trong đó, kháng nguyên GP5ecto(vùng ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM-ELP) kíchthích đáp ứng kháng thể đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP riêng lẻ.Kháng nguyên GP5ectoM-ELP và GP5-ELP là hai ứng viên tiềm năng để sản xuấtvaccine tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc

vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto-m mã hóa cho các kháng nguyên tái

tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin - like polypeptide(ELP); biểu hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương

pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích

thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vậtthí nghiệm Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việcsản xuất, phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật

Ý nghĩa thực tiễn

Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto-m mã

hóa các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng

virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng A tumefaciens mang các

vector này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triểnvaccine tiểu đơn vị phòng PRRS

lọc nhờ A tumefaciens với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng

để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP hoặccác protein tái tổ hợp khác

Kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được tạo ra trong đềtài luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnhlợn tai xanh ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

1.1.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome - PRRS) còn được gọi là Bệnh lợn tai xanh (theo ngôn ngữđại chúng), lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987, với các biểu hiện bệnh

ở cơ quan sinh sản và hô hấp Lợn nái mắc hội chứng này bị sảy thai ở thai kỳ cuối,thai lưu, đẻ non, lợn con sinh ra yếu hoặc bị chết, tỷ lệ đẻ thấp, chậm động dục trởlại Lợn con đang bú sữa hoặc lợn con đã cai sữa có biểu hiện rối loạn hô hấpnghiêm trọng Sau đó, dịch PRRS đã lây lan nhanh sang nhiều quốc gia khác baogồm: Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991) và ở Pháp(1992) (Rossow, 1998) Đến năm 1991, nguyên nhân gây bệnh “bí hiểm” được xácđịnh là do một loại virus RNA gây ra Ngay sau đó, virus này cũng đã được phân

lập ở Mỹ (Collins et al., 1992), Canada (Dea et al., 1992a,1992b) và nhiều nước

trên thế giới Năm 1992, hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St Paul,Minnesota đã thống nhất tên gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợnPRRS và được tổ chức Thú y thế giới (OIE) công nhận Từ đó, virus gây bệnh cũngđược gọi là PRRSV

Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt lợnbệnh Năm 2006, PRRS lại bùng phát trong vòng ba tháng, làm trên 2 triệu lợn mắcbệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỷ lệ chết khoảng 20% Bệnh có tốc độ lây lannhanh, chỉ sau 3 - 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao 40 -

420C, vì vậy năm 2006 bệnh này còn có tên là “bệnh sốt cao” Năm 2007, dịch lại

tiếp tục bùng phát, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 257.000 con mắc, làm chết hơn 68.000con, tiêu huỷ 175.000 con Các chủng PRRSV thể độc lực thấp và thể độc lực caothuộc dòng Bắc Mỹ đều đã được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh

Từ đó đến nay, bệnh vẫn diễn biến phức tạp Ở Philippines, PRRS xuất hiện từ năm

2006, trong năm 2007 có 18 ổ dịch, 13.542 con mắc, làm chết 1.743 con Sau đóPRRS lan ra cả nước, gây ốm và chết lợn nái và lợn con theo mẹ (Cục Thú y, 2008)

Tại Thái Lan, PRRS xuất hiện vào năm 1989 bao gồm hai chủng thuộc dòngchâu Âu và Bắc Mỹ Các báo cáo cho thấy, từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước vàvùng lãnh thổ thuộc tất cả các Châu lục trên thế giới đều có PRRSV lưu hành(ngoại trừ châu Úc và Newzeland) đã gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho

người chăn nuôi ở nhiều quốc gia trên khắp thế giới (Han et al., 2006) Ở Mỹ, hàng năm PRRS gây tổn thất ước tính thiệt hại lên đến 664 triệu USD/năm (Holtkamp et

al., 2012)

Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợngiống 51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam Từ cuối 1996 đến đầu năm 2007,không có các thông báo về bệnh lâm sàng hoặc thiệt hại trực tiếp do PRRSV gây ra

mà chỉ có thống kê về trường hợp dương tính với PRRSV của một số mẫu khi kiểmtra 478 mẫu huyết thanh của lợn tại Cần Thơ (Tô Long Thành, 2007) Cuối tháng2/2007, bệnh xảy ra trên các đàn lợn tại Hải Dương được xác định do nhiễmPRRSV thể độc lực cao, là virus PRRS type II tương đồng 99% với các chủng của

Trung Quốc (Feng et al., 2008) Cũng trong năm 2007, các trường hợp lợn mắc

PRRS với tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao lần đầu tiên được ghi nhận xảy ra tại Việt Nam(Cục Thú y, 2007) Dịch có xu hướng trầm trọng hơn do thường phát hiện vi khuẩn

kế phát (Tiêu Quang An et al., 2011) Trong giai đoạn 2007-2012, dịch PRRS liên

tục xảy ra trên diện rộng tại nhiều địa phương, đặc biệt trong các năm 2008, 2010

và 2012, đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho người chăn nuôi lợn, ảnh hưởng tiêu cựcđến an sinh xã hội và gây ô nhiễm môi trường do phải tiêu hủy hàng trăm ngàn conlợn mắc bệnh và chết

Tháng 3/2008, bệnh tiếp tục bùng phát ở Thanh Hoá và Hà Tĩnh, đến tháng7/2008 bệnh lây lan trên 17 tỉnh/thành phố, trong đó có các tỉnh đồng bằng sôngCửu Long gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong nước (Đậu Ngọc

Hào et al., 2008) Dịch có tính chất chu kỳ 2-3 năm một lần (Cục Thú y, 2011)

Theo thống kê của Cục Thú y năm 2016 (Bảng 1.1), từ cuối tháng 4/2016 đếntháng 11/2016, đã xuất hiện 14 ổ dịch PRRS tại 8 huyện của 4 tỉnh là Quảng Trị,Hậu Giang, Nghệ An và Hà Tĩnh làm 3.433 con lợn mắc bệnh, trong đó có 1.242con lợn tiêu huỷ So với năm 2015, diện dịch có giảm nhẹ, nhưng số lợn mắc bệnhphải tiêu hủy là tăng cao hơn Bệnh vẫn còn diễn biến phức tạp do sự biến chủng

nhanh chóng của virus PRRS và sự tồn tại của virus này trong các đàn lợn lànhbệnh Điều này cũng cho thấy nguy cơ bùng phát trở lại của dịch bệnh trong thờigian tới (Cục Thú y, 2016).

Đối với PRRS, bệnh tích đặc trưng nhất là ở phổi Phổi có hiện tượng viêmhoại tử, đặc trưng bởi những đám chắc, đặc Trên các thuỳ phổi bị bệnh có màu xám

đỏ, có mủ, chắc đặc Mặt cắt ngang của các thuỳ phổi bệnh lồi ra, khô Lợn bị viêmphế quản, phổi hóa mủ Bệnh tích vi thể thấy phổi có hiện tượng dịch thẩm xuất vàhiện tượng thâm nhiễm bạch cầu, trong phế nang chứa đầy dịch viêm, đại thực bào.Một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân Một bệnh tích khá đặctrưng ở phổi là hiện tượng phế nang bị nhăn và thấy có hiện tượng đại thực bào bịphân huỷ Ở các bộ phận khác cũng có các dấu hiệu như xuất huyết trên da, thâmtím do chảy máu trong mô, lách nhồi máu, hóa gỗ và nhiều bọt khí Thận có nhiềuđốm máu, tim có nhiều dịch ở màng bao, gan hoại tử, chảy dịch màu trắng ngà.Các mạch máu não mềm và mỏng, hạch não rỉ máu Hạch bạch huyết có những đốmxuất huyết Ngoài bệnh tích ở phổi, một số bệnh tích khác thường gặp tùy theo tìnhtrạng bội nhiễm như viêm màng bao tim, viêm màng phổi, viêm phúc mạc, viêm

màng não khi ghép với Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis (Mateu và

Diaz, 2007)

1.1.3 Virus PRRS

1.1.3.1 Đăc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại PRRSV

Virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, virus

gây Hội trứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn – PRRSV) thuộc chi Arterivirus, họ

Arteriviridae, thuộc bộ Nidovirales, là virus RNA sợi đơn, dương có vỏ bao bọc

(Lunney et al., 2016) PRRSV có hình dạng thay đổi từ hình oval đến hình cầu

(Hình 1.1) PRRSV có vỏ bọc ngoài với đường kính của hạt virus từ 50 – 65 nm(trung bình là 55 nm) Phần lõi nucleocapsid có đường kính khoảng 40 nm, có cấutrúc đối xứng 20 mặt, được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của virus PRRS

Mặt ngoài virus nhẵn với vài điểm lồi lõm do các vùng ngoại bào(ectodomain) của các glycoprotein vỏ tạo thành, cách biệt với vỏ bọc khoảng 2 - 3

nm Bên trong hạt virus là một vòng trống với đường kính trung bình khoảng 39 nm(Hình 1.2) Lớp lipit kép và phần lõi nucleocapsid cách nhau khoảng 3 nm Lớp lõi

nuclecapsid sắp xếp dạng xoắn, không đối xứng (Eric et al., 2013).

Hình 1.2 Ảnh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus

(Nguồn: A: Snijder et al., 1998; B, C: Spilman et al., 2009) (A): Hình ảnh hiển vi điện tử của các hạt PRRSV; (B): Các hạt PRRSV tinh khiết; (C): Hạt PRRSV điển hình với kích thước xác định.

1.1.3.2 Hệ gen và protein cấu trúc của virus PRRS

Hệ gen của PRRSV đã được giải mã thành công và được ghi nhận vào năm

1993 Dựa vào kiểu gen (genotype), PRRSV được chia làm hai loại: kiểu gen Châu

Âu (type I), đại diện tương ứng là chủng Lelystad (LV) và kiểu gen Bắc Mỹ (typeII), đại diện tương ứng là chủng VR2332 Genome của chủng virus VR2332 phânlập tại Mỹ (số đăng ký: AY150564) thuộc type II, đại diện dòng Bắc Mỹ có độ dài

là 15451 bp (Nielsen et al., 2003) Genome của virus PRRS chủng GD (Quảng

Đông, Trung Quốc) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho nhóm độc lực cao phân

lập ở Trung Quốc cũng thuộc type II, có độ dài là 15353 bp (Zhou et al., 2009)

Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 RNA thông tin (mRNA)được tổng hợp Tất cả 6 mRNA đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận được từ đầu5' của hệ gen RNA và tất cả chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA Độ dài các genhoàn toàn khác nhau giữa PRRSV dòng châu Âu và Bắc Mỹ phản ánh sai khác ditruyền và mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng thuộc 2 dòng này.Trong cùng một dòng Bắc Mỹ, các gen mã hoá cho các protein chức năng (ORF 2-7) có độ dài gần như nhau, nhưng có độ khác nhau về kích thước và thành phần gen

mã hoá cho RNA-polymerase (ORF1a và ORF1b) Đặc điểm gen và hệ gen này làyếu tố ảnh hưởng đến độc lực của virus PRRS mới xuất hiện gần đây ở Trung Quốc

từ cuối năm 2006 (Tian, 2007) và có lẽ xâm nhập vào Việt Nam đầu năm 2007 vớiđặc tính hoàn toàn đồng nhất về đặc điểm di truyền và tính gây bệnh (Lê Thanh Hòa

et al., 2009) Sự xuất hiện và lây lan của PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc, Việt

Nam và Nam Á, sự đa nhiễm trộn lẫn các dòng PRRSV trên thế giới sẽ làm phứctạp hoá dịch tễ học và vaccine phòng chống PRRSV

Cấu trúc nucleocapsid của Arterivirus bao gồm genome RNA có chiều dài 13

- 15 kb và protein nucleocapsid (N) Màng lipid kép bao quanh nucleocapsid chứa 7protein vỏ (Hình 1.3) Genome RNA đơn, chuỗi dương của virus chứa 9 khung đọc

mở (ORF - open reading frame) 1a, 1b, 2a, 2b và 3 – 7 (Hình 1.4) Trong đó, ORF1a và 1b mã hóa cho protein phi cấu trúc replicase và polymerase tham gia vào quátrình nhân bản của virus, ORF 2 - 7 mã hóa các protein cấu trúc ORF 1a và ORF 1bchiếm xấp xỉ khoảng 80% genome virus, mã hoá hai polyprotein lớn là protein sao

chép pp1a và pp1b Những protein này được cắt đồng thời hoặc sau khi dịch mã bởi

4 protease thành 14 protein phi cấu trúc (NSPs), NSP1α, NSP1β và NSP2 đếnNSP12 Một vùng đặc biệt thuộc protein NSP11 đóng vai trò quan trọng chu trình

sao chép của tất cả các virus thuộc chi Arterivirus Chức năng sinh học của từng

NSPs ở virus PRRS đến nay cũng chưa được hiểu đầy đủ, ngoại trừ chúng có hoạttính sao chép, protease và polymer hóa (Fang và Snijder, 2010)

ORFs 2a, 2b và 3-7 nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus, sau dịch mã được phân

cắt thành các protein cấu trúc của virus PRRS (Wu et al., 2009) Các protein cấu

trúc được mã hoá bởi các đoạn mRNA nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus và có cùngpromoter nằm ở đầu 5’ (Meulenberg, 2000) Glycoprotein 5 (GP5), protein màng(M) và nucleoprotein (N) được mã hóa bởi các ORF 5-7, là các thành phần chính

của hạt virus (Dea et al., 2000) ORF 2a, 3 và 4 mã hóa cho các protein khác thuộc

hạt virus bao gồm GP2a, GP3 và GP4 Các protein này tương tác với nhau và tậphợp thành virion như một phức hệ đa thành phần và cũng tham gia vào quá trình lây

nhiễm virus (Wissink et al., 2005) ORF 2b mã hóa cho protein vỏ (E) Khi phân

tích hệ gen của PRRSV thấy rằng các khung đọc mở (ORFs) lồng vào nhau

từ 1 - 253 bp Ví dụ: khung đọc mở 4 (ORF4) và 5 (ORF5) lồng vào nhau bởi

1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp Như vậy, các gen sau sử dụngmột phần cuối chuỗi nucleotide của gen trước làm promoter hoạt động (Meng,2000) (Hình 1.3) Glycoprotein GP3 (42 - 45 kDa), glycoprotein vỏ GP5 (24 - 26kDa) và protein màng M (Membrane M, 18 - 19 kDa) và nucleocapsid N (15 kDa)được mã hóa bởi ORF 3, 5, 6 và 7 là những protein cấu trúc chính Protein cấu trúccủa PRRSV mã hóa bởi ORF2 đến ORF7 được biểu hiện từ 6 mRNA ORF2a,ORF2b và ORF 3 - 7 mã hóa lần lượt cho protein cấu trúc virus GP2a, GP2b (E),GP3, GP4, GP5, M và N (Snijder & Meulenberg, 1998) GP2b là một ORF nhỏ ởbên trong và hoàn toàn nằm trong ORF2 GP2a, GP3 và GP4 là các protein vỏ phụ

bị glycosyl hóa ở đầu N, tạo thành dị tam hợp bằng liên kết disulphide (Wieringa et

al., 2003).

ORF 1a và 1b mã hoá enzyme RNA polymerase có chức năng xúc tácsao chép và tổng hợp như các RNA polymerase của các virus RNA khác ORF 2

đến ORF 6 mã hoá cho các protein kết hợp với màng của virus, trong đó cácprotein chính đã xác định bao gồm: Nucleocapsid protein (N, ORF7),Glycoprotein GP5 (ORF 5) và protein M (ORF 6).

Nucleocapsid protein (N, ORF7) có khối lượng phân tử khoảng 14 - 15 kDa,không được glycosyl hóa và chiếm khoảng 20 - 40% protein của virion Protein Ntương tác với hệ gen virus để hình thành nên nucleocapsid Protein N có tính khángnguyên cao Hiện nay, protein N được dùng như là một kháng nguyên để phát hiệnkháng thể trong huyết thanh của lợn

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc hạt PRRSV và các khung đọc mở trên hệ gen của PRRSV

(Nguồn: http://viralzone.expasy.org)

Glycoprotein (GP5) được mã hóa bởi ORF5, là một trong những thànhphần chính của hạt virus với vùng ngoại bào 40 axit amin và vùng nội bào 50 đến

70 axit amin (Dea et al., 2000), có trọng lượng phân tử từ 24 - 25 kDa là protein

liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen Protein GP5 có một đoạn peptide định hướng tạiđầu cuối N của protein và bị glycosyl hóa sau dịch mã GP5 được glycosyl hoá ởđầu N tại vị trí N46 và N53 đối với virus PRRS type I và tại vị trí N44 và N51 đối

với virus PRRS type II (Zhou et al., 2009, Music và Gagnon, 2010) Glycosyl hoá ở

đầu N tại vị trí N44 của virus PRRS type II đã được chứng minh là quan trọng trong

sự truyền nhiễm virus (Ansari et al., 2006) GP5 chứa một epitope trung hòa ở vị trí

axit amin 38-54 đối với virus PRRS type I và ở vị trí axit amin 37 - 47 đối với virus

PRRS type II (Oleksiewicz et al., 2002, Ostrowski et al., 2002, Plagemann, 2004a,

2004b) Vị trí được glycosyl hóa rất quan trọng cho quá trình hình thành cấu trúc

và duy trì hoạt tính của protein GP5 được biết như yếu tố kích thích việc sản sinhkháng thể trung hòa ở lợn và đây là một vấn đề then chốt của miễn dịch dịch thể

Các kháng thể trung hòa chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị trung hòa (Ansari et al., 2006).

Hình 1.4 Đặc điểm GP5

(Nguồn: Thaa et al., 2013)

(A): Sơ đồ mô phỏng của GP5 Các số dưới thanh chỉ ra vị trí của các axit amin trong protein này,

so với các vùng mã hóa; tín hiệu dẫn (Signal peptide, màu cam), vùng ngoại bào (ectodomain, màu đỏ), miền xuyên màng (Transmembrance region, màu nâu) và vùng nội bào (endodomain, màu lam) “N” và “C” được viết tắt cho N-terminus và C-terminus của GP5 Các vị trí N-glycosyl hóa (N33, N44 và N51) được thể hiện bằng màu xanh lá cây "decoy epitope" A ở vị trí axit amin

27 - 31, epitope trung hòa B nằm ở vị trí 37 - 45 (B): Cấu trúc liên kết giả định của GP5 chưa qua

xử lý trên màng virus Màng virus được thể hiện bằng màu tím Các peptide tín hiệu được phân cắt, do đó tách ra khỏi vùng ngoại bào Vùng xuyên màng là kỵ nước và được nhúng vào màng tế bào, trong khi đó vùng nội bào được giả thiết định vị vào bên trong virus.

Những epitope trung hòa này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá Phân tử GP4 và protein M cũng chứa các epitope trung hòa (Meulenberg et al., 1997) và phân tử GP3 cũng chứa một epitope trung hòa Mặc dù vậy, những

protein này có tác dụng kích thích miễn dịch và hoạt tính sinh học nhỏ hơn đáng kể

so với protein GP5 (Cancel -Tirado et al., 2004).

GP5 của chủng PRRSV type II (VR-2332) bao gồm 200 axit amin (aa), kíchthước khoảng 25 kDa được chia thành các vùng: (1) một trình tự tín hiệu đầu N (aa

1 - 32), có thể dẫn protein đến mạng lưới nội chất thô (ER); (2) một vùng ngoại bàoectodomain (aa 33 - 63) chứa các vị trí N-glycosyl hóa (N33, N44 và N51), trong đóN44 và N51 được bảo tồn cao trong các chủng khác nhau; (3) vùng kỵ nước mởrộng (aa 64 - 134) được gọi là vùng xuyên màng; (4) một phần C đầu cuối ưa nước

(aa 135 - 200), được gọi là endodomain, nằm trong cấu trúc của virus (Thaa et al.,

2013) (Hình 1.4)

Hình 1.5 Cấu trúc Arterivirus

(Nguồn: Spilman et al., 2009) A,B: Vị trí giả định của các protein bao gồm GP2 đến GP5, E, và M, protein ORF 5a và protein N được phát hiện gần đây Các protein bao quanh GP5 và M tạo thành một heterodimer liên kết disulfide Các glycoprotein nhỏ GP2, GP3, và GP4 tạo thành một heterotrimer bằng liên kết disulfide

Theo Wang và cộng sự (2016), kháng nguyên GP5 là một glycoprotein loại Iđiển hình và có 200 axit amin, chứa peptit tín hiệu (axit amin 1 - 31), một vùngngoại bào (ectodomain), ba vùng xuyên màng (axit amin 64 - 82, 87 - 99 và 107 -129) và một vùng nội bào (endodomain) Toàn bộ phân tử protein GP5 đã được

chứng minh không thể biểu hiện được trong E coli Rosetta (DE3), có thể là do tính

kỵ nước mạnh của các vùng xuyên màng nằm trên GP5 (Wang et al., 2006).

Protein màng M (Membrane protein M) là một trong những protein cấu trúcchính của virus PRRS được mã hoá bởi khung đọc mở số 6 (ORF6) Protein M làprotein liên kết vỏ bọc, có trọng lượng phân tử khoảng 18 - 19 kDa, bao gồm 173(PRRSV type I) và 174 axit amin (PRRSV type II) Protein M, không đượcglycosyl hoá, mang tính kháng nguyên và có tính bảo thủ cao nhất trong số cácprotein của PRRSV Trong virion, protein M liên kết với protein GP5 bằng cầu nốidisulfide giữa các ectodomain N-terminal của GP5 và M, hình thành nên

heterodimer cần thiết cho việc lắp ráp hạt virus (Wieringa et al., 2004) (Hình 1.5)

Hạt virus sẽ không được giải phóng nếu thiếu protein M hoặc GP5 (Wissink

et al., 2005) Kháng thể kháng protein M có thể trung hòa PRRSV (Yang et al.,

2000) Protein M cũng đã được nghiên cứu như một ứng viên để sản xuất vaccine.Việc tiêm chủng cho lợn đồng thời hai loại protein GP5 và M/PRRSV được biểu

hiện bằng chủng M bovis BCG đã đạt được mức độ bảo vệ nhất định tương quan với sự xuất hiện của kháng thể trung hoà (Bastos et al., 2004)

Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, protein M được làm biến đổimột axit amin đơn (Tyr-10) trong protein M đã tạo ra kháng thể trung hoà trong

huyết thanh lợn kháng lại PRRSV (Trible et al., 2015) Như vậy, protein M của

PRRSV cũng đóng một vai trò nhất định trong việc trung hoà virus ngoài vai tròcủa GP5 Protein M được dùng để thiết kế vaccine tiểu đơn vị tái tổ hợp chống lại

sự xâm nhiễm của virus PRRS, gây đáp ứng miễn dịch tế bào mạnh (Ansari et al.,

2006, Lalit, 2011)

1.1.3.3 Sự biến chủng của PRRSV và các chủng PRRSV lưu hành tại Việt Nam

Gần đây, trong hệ thống phân loại mới, PRRSV type I và type II được phân

loại thành thành hai loại trong chi Porartevirus: PRRSV type I và PRRSV type II (Adams et al., 2016; Kuhn et al., 2016) Biểu hiện bệnh và dấu hiệu lâm sàng tổng

thể, tổ chức hệ gen và thời gian xuất hiện đều giống nhau giữa hai dòng Các dòngPRRSV type I và PRRSV type II có khoảng 60% trình tự nucleotide tương đồng(Forsberg, 2005) Tuy nhiên, kể từ khi PRRSV type I và PRRSV type II được pháthiện và mô tả, các biến thể mới của PRRSV liên tục phát triển và xuất hiện trongcác đợt bùng phát mới với đặc điểm và tính độc ngày càng khác biệt (Kappes và

Faaberg et al., 2015) Ngoài các chủng PRRSV không gây bệnh đang lưu hành ở

đợt bùng phát đầu tiên, chủng PRRSV type II độc lực (VR-2385) đã được phân lập

từ đàn lợn bị nhiễm PRRSV type II chủng VR-2332 (ATCC VR-2332) vào giữa

những năm 1990, khác biệt so với VR-2332 khoảng 8% nucleotide (Meng et al.,

1996) Năm 1998, xuất hiện một chủng PRRSV không điển hình đã gây ra tỷ lệ thai

chết lưu và sảy thai cao ở đàn lợn được tiêm chủng tại Hoa Kỳ (Mengeling et al.,

1998) Sau đó, kể từ năm 2001, nhiều chủng độc lập thuộc cùng một nhóm virus đãđược xác định, trong đó đã phát hiện chủng MN184 có độc tính cao (sai khác > 14.5

% nucleotide) từ các chủng type II (Han et al., 2006)

Năm 2006, khái niệm về chủng virus PRRS độc lực cao đã được công nhận(Highly pathogenic PRRSV strain, HP - PRRSV), thiếu hụt 30 axit amin trongprotein phi cấu trúc nsp2 và tỷ lệ gây chết lợn cao (20 - 100%) ở lợn nái ở các tỉnh

miền nam Trung Quốc và bắc Việt Nam (Tian et al., 2007), sau đó là ở Đông Nam

Á và Ấn Độ (An et al., 2011; Rajkhowa et al., 2015) Ngoài ra, kể từ khi xác định được chủng type II NADC30 ở Hoa Kỳ năm 2008 (Brockmeier et al., 2012), các

chủng giống với NADC30 (với tỷ lệ gây chết 30 - 50%) đã được phân lập ở Trung

Quốc (Zhou et al., 2015; Li et al., 2016) Các loại vaccine thương mại được cấp

phép tại Trung Quốc hầu hết đều mất dần tính bảo hộ khi được thử nghiệm với virus

NADC30 - like (Bai et al., 2016) Mặc dù PRRSV type I ít được chú ý hơn vì trước

đó được cho là ít khác biệt so với PRRSV type II Nhiều nghiên cứu cho thấy sự đadạng di truyền của PRRSV type I thực sự giống với PRRSV type II Hơn nữa,PRRSV type I đã tiến hóa theo cùng hướng với PRRSV type II và trở thành độc lực

cao hơn (Forsberg et al., 2002; Morgan et al., 2013) Trong năm 2010, biến chủng

của PRRSV type I là chủng Lena độc lực cao (phân lập năm 2007), có 87% trình tựnucleotide tương đồng với virus PRRSV type I Lelystad ban đầu Sự đa dạng này

tương tự như của chủng PRRSV type II MN184 và VR-2332 (Karniychuk et al.,

2010) Mặc dù chủng Lena giống với virus PRRSV type I, nhưng vaccine nhượcđộc chủng PRRSV type I (Porcilis® PRRS, Merck) đã không bảo hộ được trước sự

lây nhiễm của chủng virus Lena (Trus et al., 2014) Đáng chú ý, việc tự loại bỏ

NSP2 cũng đã được quan sát thấy trong các chủng Lena PRRSV type I (Karniychuk

et al., 2010; Trus et al., 2014).

Ở Việt nam, dịch bệnh nặng xuất hiện từ năm 2007 đến nay Các kết quảnghiên cứu phân lập, phân tích giải mã hệ gen của PRRSV cho thấy các chủngPRRSV lưu hành tại Việt Nam thuộc dòng Bắc Mỹ type II, tương đồng với chủngvirus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc là 99% trình tự nucleotide, 99 - 99,7%trình tự axit amin và đều bị mất 30 axit amin trong protein phi cấu trúc NSP2 (Feng

et al., 2007) Trình tự amino acid vùng NSP2 có độ tương đồng 95,7 - 99,4% so với

chủng Trung Quốc HUN4, 68 - 69% so với chủng VR-2332 và 58 - 59% so với

chủng MN184 Các tác giả đã tìm thấy sự mất đoạn thuộc gen nsp2, tuy nhiên sự

mất đoạn này không làm thay đổi độc lực của virus Lợn được gây nhiễm chủng

PRRSV cao có triệu chứng sốt, 2 trong số 5 lợn xuất hiện triệu chứng ho, triệuchứng thần kinh và sưng khớp Mổ khám thấy xuất hiện viêm phế quản nhẹ, sưnghạch, viêm màng ngoài tim và viêm đa khớp PRRSV được phân lập lại từ máu, môcủa lợn đã được gây nhiễm Lợn được gây nhiễm với chất nghiền từ mô phổi hoặc

mô lách của lợn Việt Nam nhiễm trùng sẽ xuất hiện triệu chứng rất nặng như sốt,nhiễm virus huyết và chết cấp tính trong vòng 72 giờ Trong khi đó, lợn tiếp xúc

không thấy xuất hiện triệu chứng trong suốt thời gian thí nghiệm (Metwally et al.,

2010)

PRRSV lưu hành ở Việt Nam hiện nay vẫn tồn tại hai dạng là thể cổ điển và

thể độc lực cao Dạng cổ điển: Có độc lực thấp, bệnh đôi khi biểu hiện không rõ

rang, chỉ là các dấu hiệu rối loạn sinh sản và hô hấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnhthì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 – 5% trong tổng đàn Trong 1 số trường hợp, pháthiện dương tính với PRRSV trong huyết thanh lợn nhưng không có biếu hiện bệnh

Thể độc lực cao: Các biểu hiện bệnh trầm trọng, rõ rệt hơn so với thể độc lực thấp.

Virus gây nhiễm và chết nhiều lợn bệnh với tỷ lệ gây chết cao (20 -100%) Bệnh cótốc độ lây lan nhanh, chỉ sau 3 - 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn

Phân tích đoạn gen mã hóa protein vỏ (ORF 5) của 32 chủng PRRSV phânlập từ các vùng khác nhau của Việt Nam trong giai đoạn 2008 - 2012 và so sánhđoạn trình tự giải mã với trình tự công bố trên Ngân hàng gen quốc tế cho thấy sựđồng nhất về nucleotide đạt 94,8 - 100%, độ tương đồng axit amin đạt 94 - 100%.Kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc của cả 32 chủng cho thấy, tất cả các chủngnghiên cứu đều thuộc dòng Bắc Mỹ và thuộc cùng phân nhánh với các chủng

PRRSV độc lực cao lưu hành ở Trung Quốc trong những năm gần đây (Nguyen et

al., 2013).

Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy có sự khác biệt về tính ditruyền g i ữ a các chủng virus phân lập được từ các vùng địa lý khác nhau Bảnthân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotide khácao, đến 20%, đặc biệt là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ Chính sự khác biệt

và sự đa dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên củavirus đã làm tăng thêm những khó khăn trong việc sản xuất vaccine phòng

chống PRRSV (Cục Thú y, 2008; Lê Thanh Hòa et al., 2009)

1.1.3.4 Đáp ứng miễn dịch của vật chủ với PRRSV

Sau khi PRRSV xâm nhập vào cơ thể lợn, hệ miễn dịch sẽ được huy động đểchống lại virus Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm PRRSV ở lợn có hai đặc điểm: Thứnhất, virus có tính hướng tế bào của hệ thống miễn dịch, xâm nhập và nhân lên ở những

tế bào này, làm thay đổi đáp ứng miễn dịch của ký chủ, gây suy giảm miễn dịch làm cholợn dễ mắc nhiễm trùng kế phát Thứ hai, virus kích thích hệ thống miễn dịch chống tái

nhiễm (Tong et al., 2007) Mặc dù virus có thể xâm nhập vào cơ thể lợn từ các con

đường khác nhau như đường mũi, đường miệng, qua tinh dịch hay tiêm bắp nhưng

chúng đều bắt đầu nhân lên ở đại thực bào phế nang (Zhou et al., 2014) Lợn nhiễm

virus PRRS không thải tiết hoặc tiết ở mức rất thấp các cytokine gây viêm, interferon loại

1 (IFN - α/β), interleukin (IL) - 1 và TNF - α (Zhou et al., 2009) Interferon loại 1 là rất quan trọng trong kích hoạt đáp ứng miễn dịch tiên phát (Neumann et al., 2005) Sự giảm

tiết của INF-α có thể có tác động quan trọng đến quá trình sinh bệnh học của PRRSV vìINF - α có thể hạn chế sự nhân lên của virus PRRS Khi đáp ứng miễn dịch khởi phátyếu, PRRSV nhân lên thuận lợi và có cơ hội tồn tại lâu hơn ở động vật cảm nhiễm

(Nauwynck et al., 2012) Virus PRRS có khả năng trốn thoát hệ thống phòng thủ kháng

virus bẩm sinh do chúng có khả năng sản sinh những protein không kích thích hệ thốngthải tiết interferons loại 1 Những protein có tác dụng này bao gồm protein N và 3 proteinphi cấu trúc NSP 1 (Nsp-alpha và Nsp-beta), NSP 2 và NSP 11 Đáp ứng miễn dịch thứcấp của lợn nhiễm PRRSV rất đa dạng, các lớp kháng thể xuất hiện ở những thời điểmkhác nhau, kháng những polypeptide khác nhau của virus, miễn dịch tế bào diễn ra cũng

đa chiều vừa theo hướng thuận lợi cho PRRSV phát triển nhưng cũng đồng thời theo

hướng kháng bệnh (Tong et al., 2007)

Sau nhiễm virus, kháng thể kháng protein Nucleocapsid (N) xuất hiện sớm (ngày

thứ 5 - 9) và ở mức cao nhất (Music et al., 2010) Đáp ứng kháng thể không trung hoà

ban đầu đối với sự xâm nhiễm của PRRSV chủ yếu là nhằm kháng lại protein N Nhữngkháng thể này xuất hiện ít nhất là 5 ngày sau khi bị nhiễm PRRSV và có thể phát hiệnđược bằng phản ứng ELISA Nồng độ kháng thể IgG có thể chống lại PRRSV thườngđạt được sau vài tuần bị nhiễm virus mặc dù các sự trung hoà đã được báo cáo trongvòng chín ngày sau khi nhiễm bệnh và giảm dần trong khoảng 6 - 12 tháng (Mogler,2012) Kháng thể kháng hai protein phi cấu trúc NSP1 và NSP2 được phát hiện ở ngày

thứ 14 và đạt mức cao nhất ở 28-35 ngày sau gây nhiễm Tất cả những kháng thể pha sớmnày đều không có khả năng trung hòa virus, ngược lại, kháng thể trung hòa xuất hiện rất

muộn, 4 tuần sau nhiễm virus, thậm chí muộn hơn (Shi et al., 2013) Đáp ứng kháng thể

trung hòa đối với epitope ở GP5 thường ở mức yếu và chậm, thậm chí không xuất hiện ở

một số cá thể (Dee et al., 2005) Đáp ứng miễn dịch kháng GP5 yếu và chậm là do mức

N-glycosyl hóa bao quanh epitope trung hòa, một hiện tượng gọi là rào chắn N-glycan.Hơn nữa, epitope tại vị trí axit amin 27-30 trên GP5 của PRRSV type II không bịtác động trung hòa mà ngược lại, có chức năng làm giảm đáp ứng miễn dịch dịch

thể, dẫn đến việc làm chậm sản sinh kháng thể trung hòa chống PRRSV (Dee et al.,

2004)

Đáp ứng miễn dịch thích ứng của lợn đối với PRRSV có đặc điểm đặc trưng

là đáp ứng chậm và trí nhớ miễn dịch kém, ở mức thấp, đôi khi không đủ ngăn ngừatái nhiễm và dễ dàng bị nhiễm bởi virus PRRS không tương đồng về tính kháng

nguyên (Zhou et al., 2014) Sau khi phổi nhiễm virus lần thứ hai, các đáp ứng miễn

dịch ở lợn đủ để kháng tái nhiễm Tuy nhiên, hiện nay vấn đề cũng chưa được hiểumột cách rõ ràng, các kháng thể trong đáp ứng miễn dịch dịch thể hay miễn dịch tế

bào hoặc phải phối hợp cả hai loại miễn dịch thì mới có hiệu quả bảo hộ (Tian et al.,

2007) Cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào khi đạt đến ngưỡng nhất định cóthể loại trừ được virus khỏi máu nhưng không loại trừ được virus ở hệ thống tế bào

lympho (Zhou et al., 2014) Sử dụng phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp

IFA, phương pháp miễn dịch enzyme ELISA và phương pháp miễn dịch peroxidasemột lớp IPMA, đã xác định được rằng có sự xuất hiện của kháng thể IgM và IgGtrong huyết thanh của lợn ở thời điểm 7 ngày đối với kháng thể IgM và 14 ngày đốivới kháng thể IgG Kháng thể này đạt ở mức cao sau 30 - 50 ngày Những kháng thểxuất hiện sớm nhất là kháng thể trực tiếp kháng lại protein lõi (N), tiếp theo là

kháng thể kháng protein M và kháng thể kháng glycoprotein 5 (GP5) (Nelson et al., 1994) Protein phi cấu trúc 2 (NSP 2) chứa epitope B không trung hòa và cũng là một trong những protein miễn dịch quan trọng nhất của PRRSV (Oleksiewicz et al.,

2001) Hầu hết các kiểm tra chẩn đoán chủ yếu phát hiện kháng thể kháng protein

N Những kháng thể này xuất hiện trong tuần đầu tiên sau nhiễm virus và tồn tạitrong vài tháng, nhưng không có khả năng bảo hộ chống lại PRRSV Các kháng thể

trung hòa xuất hiện muộn hơn, vào 4 - 5 tuần sau nhiễm PRRSV, đạt tối đa ở thờiđiểm 10 tuần và kéo dài miễn dịch khoảng 1 năm Đối với lợn đực sau 10 tuầnnhiễm PRRSV, cơ thể lợn bắt đầu xuất hiện kháng thể trung hòa và đạt cực đại sau

18 tuần (Nelson et al., 1994) Kháng thể trung hòa đóng vai trò quan trọng trong

đáp ứng miễn dịch với PRRSV và có sự khác biệt giữa lây nhiễm tự nhiên so vớitiêm phòng vaccine Sự xuất hiện sớm của các kháng thể không trung hòa có thểtác động đáng kể đến sự tiến triển của PRRSV Ngoài ra, kháng thể không trunghòa làm tăng sự lây nhiễm của virus trong các túi thực bào của các đại thực bào,

do tăng quá trình đáp ứng phụ thuộc kháng thể Đáp ứng miễn dịch dịch thể củacác kháng thể không trung hòa có thể tác động mạnh mẽ tới PRRSV thông quaviệc thoát vỏ (“cởi áo”) của virus và làm tăng sự bắt giữ các tiểu phần virus trong

các tế bào đại thực bào (Diaz et al., 2006).

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào cũng vô cùng quan trọng trongmiễn dịch chống lại PRRSV Virus PRRS ngăn cản sự trình diện kháng nguyên vàhoạt hoá tế bào lympho T Virus PRRS làm giảm đáp ứng miễn dịch tự nhiênbằng cách thay đổi hình dạng của tế bào thực bào và giảm sự xuất hiện phân tửtrình diện kháng nguyên đi kèm trên bề mặt tế bào đại thực bào trong việc trìnhdiện kháng nguyên Những cá thể lợn đang bình phục có sự đáp ứng tăng sinhmạnh mẽ các tế bào lympho, hiện tượng này không được phát hiện trong 4 tuầnsau nhiễm trùng và cùng với đáp ứng với kháng thể trung hòa Các đáp ứng cóvai trò cytokine, chủ yếu là interferon (IFN - c) và IL - 2 nhưng vai trò

interferon kéo dài ít hơn so với interleukin (Lopez et al., 2007).

1.2 Vaccine phòng PRRS

Virus PRRS là một loại virus RNA không ổn định, thay đổi nhanh chóng cả

về đặc tính di truyền và kháng nguyên, gia tăng khả năng thoát khỏi hệ thống miễndịch, gây bùng phát các đợt dịch lớn dẫn đến thiệt hại nghiêm trọng, dễ biến đổi di

truyền và có tốc độ tiến hóa nhanh nhất trong số các virus RNA (Hanada et al.,

2005) Điều này gây ra nhiều khó khăn cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòngPRRS Hiện nay, trên thế giới đã có hơn 20 loại vaccine thương mại phòng PRRS.Các vaccine được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dướihai dạng chủ yếu là vaccine sống - nhược độc (Modified-live virus vaccine, MLV

vaccine) và vaccine vô hoạt (killed virus vaccine) Vaccine vô hoạt thường an toàn,

có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sàng nhưng hiệu quả bảo hộ không

cao (Nilubol et al., 2004) Vaccine nhược độc tạo ra miễn dịch bảo hộ tốt với các

chủng tương đồng nhưng mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng vớicác chủng mới, có nguy cơ phát triển độc tính trở lại, bản thân virus vaccine saunhiều lần truyền nhiễm có thể đột biến trở thành cường độc, giá thành vaccine còncao, đòi hỏi nghiêm ngặt trong khâu bảo quản và vận chuyển (Meng, 2000)

1.2.1 Vaccine sống - nhược độc

Vaccine sống - nhược độc là loại vaccine được sử dụng rộng rãi nhất hiệnnay Các vaccine sống nhược độc thương mại được sản xuất bằng cách nuôi cấy tếbào và được cấy chuyển nhiều lần dưới áp lực chọn lọc cho tới khi mất độc lực(virulence) của tác nhân gây bệnh ban đầu Các dòng tế bào thận khỉ MA-104, tế

bào MARC - Complimentary cells (Welch et al., 2004), các tế bào PK, FK, và BHK biểu hiện CD163 (Calvert et al., 2007), PK - 15 với CD163 (Wang, 2013), tế bào SJPL (Provost et al., 2012), bạch cầu đơn nhân lợn (Huang et al., 2009) và ZMAC

(Calzada-Nova, 2012) đã được nghiên cứu sử dụng để nuôi cấy và phân lập virusPRRS trong sản xuất vaccine

Các vaccine nhược độc hiện được cấp phép lưu hành rộng rãi trên thế giới.Vaccine được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu (như Porcilis PRRS®(chủng DV; Merck), Amervac-PRRS® (chủng VP046; Hipra) và Pyrsvac-183®(chủng All-183; Syva) hay dòng Bắc Mỹ (như Ingelvac® PRRS MLV; ReproCyc®PRRS-PLE (cả hai đều là chủng VR-2332; Boehringer Ingelheim) và Ingel-vac®PRRS ATP (chủng JA-142; Boehringer Ingelheim) hoặc cả hai dòng này Gần đây,Hanvet đã sản xuất thành công vaccine PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN Cácvaccine nhược độc được sản xuất từ các virus dòng Châu Âu hay Bắc Mỹ có khảnăng tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào tương đốiyếu Kháng thể xuất hiện sau 2 tuần và mạnh nhất là 4 tuần sau khi tiêm chủng.Phần lớn các kháng thể xuất hiện là kháng thể đặc hiệu kháng protein N(nucleocapsid (N) proteins) Protein N là protein cấu trúc phổ biến nhất và có tínhkháng nguyên cao, nhưng sự tương quan của các kháng thể kháng N với đáp ứng

miễn dịch không chặt chẽ Kháng thể trung hòa xuất hiện sau khoảng 4 tuần tiêm

chủng với nồng độ tương đối thấp (Darwich et al., 2010)

Vaccine sống nhược độc được coi là một phương pháp hiệu quả để kiểm soátdịch bệnh, có mức bảo vệ tốt đối với sự tái nhiễm của các chủng tương đồng vàgiảm sự lan truyền của virus, giúp bảo vệ lợn con mới sinh và lợn nái nhiễm virus

trong máu, giúp làm giảm tỷ lệ chết trước và sau khi sinh (Linhares et al., 2012; Zuckermann et al., 2007) Vaccine sống nhược độc làm giảm nồng độ virus, các dấu

hiệu về hô hấp và mức độ tăng trưởng được cải thiện ở lợn đang phát triển

(Alexopoulos et al., 2005) trong thời gian dịch bệnh bùng phát hoặc ở đàn lợn bị nhiễm virus PRRS (Cano et al., 2007) Mặc dù, mức độ bảo vệ của các vaccine

nhược độc được đánh giá là tương đối tốt nhưng vẫn tồn tại một số quan ngại: phảnứng bảo vệ tương đối chậm, thường là 3 - 4 tuần sau khi tiêm chủng (Zuckermann

et al., 2007); chỉ có khả năng bảo vệ tốt đối với các chủng tương đồng; việc tiêm

vaccine có thể ảnh hưởng tới hiệu quả bảo vệ của các vaccine khác ở lợn, ví dụ như

Mycoplasma hyopneumoniae bacterin (Drexler et al., 2010)

Hạn chế lớn nhất của vaccine PRRS nhược độc là khả năng phát triển độctính trở lại do đột biến gen của virus vaccine hoặc do quá trình tái tổ hợp gen Virus

đã giảm độc lực có thể phát triển thành chủng gây độc tính, có khả năng nhân lên vàgây bệnh Điều này đã được ghi nhận ở các nước sử dụng vaccine Ingelvac® virus

PRRS-nhược độc nhiều lần để tiêm chủng (Opriessnig et al., 2002) Hai chủng virus

PRRS phân lập được ở đàn lợn được tiêm chủng nhiều lần với vaccine nhược độc

đã được phân tích và chứng minh là có nguồn gốc từ chính chủng làm vaccinenhưng đã biến đổi, phát triển độc tính trở lại Virus trong vaccine có khả năng vượtqua nhau thai vào giai đoạn cuối của thai kỳ có thể gây chết lưu Lợn con sinh ra từnhững lợn nái được tiêm chủng có thể bị nhiễm virus PRRS và có khả năng lâytruyền cho những con lợn khác Mặt khác, phản ứng bảo vệ đạt được chậm khoảng

4 tuần sau khi tiêm chủng vì thế trong thời gian này lợn đã được tiêm chủng có khả

năng lây lan virus cho lợn chưa bị nhiễm virus khác (Rowland et al., 2010)

Các vaccine nhược độc không thích hợp sử dụng cho lợn nái mang thai, nái

tơ và lợn đực Tiêm phòng vaccin này có thể dẫn đến thải tiết ra virus vaccine trong

tinh dịch Các chủng virus vaccine có thể tồn tại lâu dài ở lợn đã được tiêm phòng

và đã có báo cáo về lây lan virus vaccine sang lợn không tiêm phòng và sau đó gây

ra bệnh do virus vaccine Các vaccine nhược độc có thể bảo vệ lâu dài, nhưngvaccine được sản xuất từ các chủng PRRSV đơn lẻ, vì thế không có khả năng bảo

vệ hoàn toàn trước sự lây nhiễm của PRRSV dị chủng (Kimman et al., 2009) Hơn

nữa, vaccine nhược độc không ngăn ngừa hoàn toàn việc tái nhiễm virus và viruskiểu hoang dại Trong một số trường hợp, không thể phân biệt được giữa các độngvật đã được tiêm chủng và bị nhiễm tự nhiên

Việc tiêm chủng vaccine PRRS nhược độc cho các đàn lợn ở Đan Mạch đãxảy ra các triệu chứng cấp tính suy giảm hô hấp và sinh sản ở lợn, lợn nái xảy thai

và lợn con bị chết trong các đàn lợn được tiêm vaccine do sự phục hồi tính độc củavirus vaccine trở thành dạng độc Trong một số trường hợp, virus vaccine đượctruyền từ lợn đã được tiêm phòng sang lợn đực không được tiêm phòng, kết quả làvirus vaccine xuất hiện trong tinh dịch của các con lợn đực không được tiêm phòng

(Huang et al., 2010)

Virus có nguồn gốc từ vaccine có thể lây lan ở các trang trại chăn nuôi lợn ở

Thái Lan, (Amonsin et al., 2009) Hiện tượng tái tổ hợp của virus có nguồn gốc từ vaccine với virus đang lưu hành đã được phát hiện ở Trung Quốc (Li et al., 2009)

1.2.2 Vaccine vô hoạt

Các vaccine vô hoạt PRRSV hiện được cấp phép sử dụng ở châu Âu vànhiều nước trên thế giới ngoại trừ Mỹ Các vaccine vô hoạt có thể được chế từ haichủng châu Âu và Bắc Mỹ Một số vaccine thương mại phổ biến như Ingelvac®PRRS KV (chủng P120; Boehringer Ingelheim), Suipravac-PRRS (chủng 5710;Hipra), Progressis® (từ chủng độc quyền; Merial), Suivac PRRS-ine (chủng VD-E1

và VD-E2; Dyntec) và Suivac PRRS-IN (chủng VD-E1, VD-E2 và VD-A1;

Dyntec) Trái ngược với vaccine nhược độc PRRSV, vaccine vô hoạt sau khi tiêm

chủng không nhận thấy sự sản sinh kháng thể bằng phương pháp ELISA và virustrong huyết thanh của lợn trong các khảo nghiệm Vaccine vô hoạt cũng không chothấy đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào qua sự tăng sinh tế bào lympho hay

sản sinh IFNγ (Kim et al., 2011) Vaccine vô hoạt được ứng dụng như là một

vaccine trị liệu trong các trại lợn dương tính với virus PRRS (Bassaganya - Riera et

al., 2004) Vacine vô hoạt PRRSV có hiệu quả bảo vệ kém hơn vaccine nhược độc.

Ở lợn dương tính với PRRSV, vaccine giúp cải thiện năng suất sinh sản như tăng tỷ

lệ đẻ, khả năng sống của lợn con sau cai sữa và sức khỏe lợn con sinh ra từ lợn náiđược tiêm phòng Vaccine vô hoạt được đánh giá là an toàn Tính đến nay chưa cóbáo cáo nào về tác động tiêu cực của việc sử dụng vaccine với sức khỏe của lợn

(Zuckermann et al., 2007).

1.2.3 Các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV

Các vaccine tiểu đơn vị dựa trên GP5 đã được sản xuất trong các hệ thống

khác nhau, chẳng hạn như vi khuẩn (Bastos et al., 2002; Prieto et al., 2011; Hu et

al., 2012; Hu et al., 2016; Park et al., 2016), nấm men ( Zhao et al., 2014), các tế

bào côn trùng (Wang et al., 2012; Nam et al., 2013; Binjawadagi et al., 2016), các

tế bào động vật có vú (Gao et al., 2014; Eck et al., 2016) và cây thuốc lá biểu hiện gen gp5 (Chia et al., 2011) Trong số các protein cấu trúc của PRRSV, protein M

và GP5 là hai protein quan trọng, không thể thiếu cho sự giải phóng các hạt virus.Hai loại kháng nguyên M và GP5 cũng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh chống virus

Do đó, protein M và GP5 được nghiên cứu để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chốngvirus PRRS Các nghiên cứu phát triển vaccine chống lại PRRSV đã được ghi nhậntrong hai thập kỷ qua cũng cho thấy việc thiết kế vaccine tiểu đơn vị, tạo ra đápứng miễn dịch tế bào và dịch thể là đặc biệt quan trọng vì cả hai cơ chế này đềuliên quan đến việc bảo vệ chống lại virus Protein M và đặc biệt là protein vỏ GP5được dùng như mục tiêu hàng đầu để thiết kế vaccine tiểu đơn vị chống lại sự xâm

nhiễm của PRRSV (Ansari et al., 2006) Protein GP3, GP4 và GP5 có khả năng kích thích miễn dịch tạo kháng thể trung hòa đáp ứng miễn dịch ở lợn (Jiang et al.,

2008)

GP5 là protein cấu trúc chính của PRRSV và là một ứng viên tiềm năng đểsản xuất vaccine tiểu phần chống PRRSV Các kháng thể kháng GP5 ở lợn là các

kháng thể quan trọng, có khả năng trung hoà PRRSV (Plagemann et al., 2002) Mặt

khác, protein GP5 còn có thể được sử dụng làm kháng nguyên chẩn đoán để sàng

lọc trước sự nhiễm PRRSV và đánh giá hiệu quả của vaccine (Kimman et al.,

2009)

Các dạng vaccine thử nghiệm chính hiện nay gồm có vaccine DNA, vaccinetiểu đơn vị và các vaccine virus vector Vaccine nhược độc và vaccine vô hoạt đãđược cấp phép thương mại Các vaccine thử nghiệm được nghiên cứu bằng nhiều kỹthuật khác nhau Tuy nhiên, hầu hết các vaccine được phát triển bằng cách sử dụngnhững kỹ thuật này vẫn kém hiệu quả hơn so với vaccine nhược độc(Charerntantanakul, 2012) Nhiều loại protein cấu trúc của PRRSV được biểu hiệnbằng baculovirus trong các tế bào côn trùng được tiêm chủng cho lợn cũng chỉ nhận

được sự bảo vệ nhất định (Plana Duran et al., 1997) Vaccine tiểu đơn vị dựa trên

thực vật chuyển gen mã hoá kháng nguyên GP5 chống lại PRRSV cũng đã được thử

nghiệm (Chia et al., 2011) Tuy nhiên, các vaccine này cũng cho hiệu quả bảo hộ không cao ở lợn (Renukaradhya et al., 2015a) Trong khi đó, vector adenovirus và

vector poxvirus như vaccine vector đã được thử nghiệm để chống lại PRRSV đã đạt

được một số thành công (Gagnon et al., 2003 Shen et al., 2007; Zheng et al., 2007; Jiang et al., 2008) Chuột được tiêm chủng bằng vaccine vector dựa trên

andenovirus đã sản sinh kháng thể trung hoà với hiệu giá kháng thể cao và đáp ứng

tăng sinh tế bào lympho mạnh (Gagnon et al., 2003; Jiang et al., 2008) Lợn được

tiêm phòng với vaccine chống PRRSV dựa trên vaccine vector poxvirus đã giảmthân nhiệt đáng kể so với lợn được tiêm PRRSV đối chứng, tuy vậy cũng không

nhận được sự bảo vệ hoàn toàn (Shen et al., 2007; Zheng et al., 2007) Các vaccine

DNA cũng đã được thử nghiệm chống lại PRRSV, nhưng vẫn có những hạn chế

tương tự như các vaccine tiểu đơn vị và vaccine virus vector (Nan et al., 2017).

Một nghiên cứu gần đây cho thấy tiêm chủng DNA mã hóa một đoạn ngắnprotein N của PRRSV 2 tuần trước khi tiêm vaccine nhược độc đã giúp cải thiệnkhả năng miễn dịch, tăng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của PRRSV (tăng hiệu giákháng thể trung hoà và tăng hàm lượng IFN-γ đặc hiệu PRRSV), giảm IL-10

(Sirisereewan et al., 2017) Tiêm vaccine DNA mã hoá GP5 của tế bào T khảm

(trình tự khảm được tối ưu hóa codon dựa trên trình tự GP5 của PRRSV) cho lợn cóthể tạo ra kháng thể đặc hiệu virus cao hơn nhưng cũng không thể bảo vệ đầy đủ

(Cui et al., 2016) Vaccine DNA dựa trên một kháng nguyên PRRSV đơn lẻ có thể

không đủ để bảo vệ hoàn toàn Hiện tại, các vấn đề đang được quan tâm vẫn là tínhhiệu quả và tính an toàn của các vaccine PRRSV nhược độc Do đó, cần phải cóbước đột phá về phương pháp tiếp cận mới trong phát triển vaccine tiềm năng để cóthể ứng dụng trong thực tế thay thế được nhược độc chống lại PRRSV.

Duran et al., 1997) Chuột được tiêm chủng với adenovirutses (rAd) mang GP3

hoặc GP5 đã bị đột biến mất axit amin từ 2 - 64 tạo ra kháng thể trung hòa đặc hiệu

PRRSV (Jiang et al., 2007) Pseudorabies virus tái tổ hợp biểu hiện protein GP5 tạo

ra bảo hộ tốt hơn vaccine bất hoạt có trên thị trường Pseudorabies virus biểu hiệnGP5 bảo vệ lợn con khỏi các triệu chứng lâm sàng, giảm các tổn thương gây bệnh,

mặc dù không có kháng thể chống PRRSV được phát hiện (Qiu et al., 2005) Một

vài hướng mới đã được ứng dụng để phát triển các loại vaccine phòng PRRS khác

nhau (Hou et al., 2008) dựa trên virus vector như adenovirus biểu hiện GP5/M (Jiang et al., 2006a), adenovirus biểu hiện GP3, GP5 (Jiang et al., 2008), virus vaccine tái tổ hợp (virus vector pseudorabies) biểu hiện GP5/PRRSV (Qiu et al., 2005) và coronavirus viêm dạ dày ruột kết tái tổ hợp biểu hiện GP5 và M đã cho

hiệu quả bảo vệ chống lại các biểu hiện lâm sàng cũng như làm giảm tổn thương

của bệnh (Cruz et al., 2010), pseudotype baculovirus biểu hiện GP5/M (Wang et

al., 2007) Canine adenovirus biểu hiện GP5 đã tạo ra kháng thể trung hoà đặc hiệu

PRRSV và tăng sinh tế bào lympho T trên lợn con (Zhou et al., 2010)

Để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên củaPRRSV, các vector tái tổ hợp biểu hiện các protein của virus được gắn với cácprotein khác nhau hoặc cùng biểu hiện đồng thời nhiều protein của virus Chuộttiêm GP5 và M biểu hiện từ virus vector adenovirus có hàm lượng kháng thể trung

hòa cao hơn đáng kể so với chuột chỉ được tiêm vector biểu hiện GP5 hoặc M riêng

rẽ (Jiang et al., 2006) Fowlpox virus tái tổ hợp đồng biểu hiện GP5 và GP3 cũng

làm cho chuột được tiêm giảm sốt và số lượng virus trong các tế bào phổi thấp hơn

so với đối chứng, đã tạo ra kháng thể đặc hiệu, kháng thể trung hoà, tăng sinh tế bào

lympho T, sản xuất IFN-γ trong huyết thanh và trong tế bào lympho T (Shen et al.,

2007) Adenovirus biểu hiện protein dung hợp GP3-GP5 or GP3-GP4-GP5 hình

thành kháng thể trung hoà mạnh hơn từng protein riêng lẻ trên chuột (Jiang et al.,

2008) Modifiedvirus ankara vaccinia đồng biểu hiện protein GP5 và M đã tạo phản

ứng trung hoà mạnh hơn GP5 hoặc M riêng lẻ (Zheng et al., 2007).

Mycobacteriusm bovis BCG biểu hiện protein tái tổ hợp M và một đoạn ngắn GP5

đã tạo ra kháng thể huyết thanh đặc hiệu kháng nguyên, kháng thể trung hoà và sản

xuất IFN-γ trên lợn (Bastoset al., 2004) Tuy nhiên, các vaccine này vẫn trong giai

đoạn nghiên cứu và thử nghiệm và chưa được thương mại hóa Sự không ổn định ditruyền của các gen ngoại lai được đưa vào các vaccine vector này vẫn còn phảiđược tiếp tục nghiên cứu

1.2.3.2 Vaccine DNA

Vaccine DNA chống lại virus PRRS là một dạng được quan tâm nghiên cứuđược xem như là một vaccine an toàn hơn Vaccine DNA chứa ORF5 được thửnghiệm trên chuột bằng đường miệng đã tạo kháng thể trung hòa trong huyết thanhcủa chuột tương đương như trong chuột được tiêm với plasmid DNA mang ORF 5

(Li et al., 2009) Vaccine DNA dựa trên GP5 bị đột biến ở đầu N hoặc đồng biểu

hiện với các protein chức năng khác cũng cho thấy làm tăng miễn dịch của các

vaccine DNA (Li et al., 2009) Protein GP5 được nối với M bằng một trình tự axit

amin glycine-proline-glycine-proline (GPGP) nhằm tạo mối liên kết giúp ổn địnhphân tử protein tái tổ hợp Ba cấu trúc vector plasmid DNA chứa gen mã hoáprotein GP5-M không có GPGP liên kết (pcDNA-56), plasmid DNA chứa gen mãhoá GP5-M được gắn kết bởi liên kết GPGP (pcDNA-5L6) và plasmid DNA mãhóa M/GP5 (pcDNA-6L5) đều có khả năng kích thích sinh ra kháng thể trên lợn.Sau khi thử thách với virus PRRS, lợn được tiêm chủng với cấu trúc pcDNA-5L6

và pcDNA-6L5 có virus trong máu ở mức độ thấp hơn và thời gian ngắn hơn, lượngvirus trong mô cũng thấp hơn so với lợn được tiêm với pcDNA-56 Điều này cho