Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu chuyển gen cry8db có tính kháng côn trùng vào cây mía

Việc cải thiện các đặc t nh nông sinh học ở cây m a đã được nghiên cứu trong những n m qua nhằm t ng trữ lượng đường, t ng khả n ng chống ch u các điều kiện stress như: hạn hán, ngập, m

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN cry8Db

i

LỜI Đ

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả

Phan Thị Thu Hiền

ii

LỜI CẢ Ơ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Bích Ngọc và PGS.TS Chu Hoàng Hà đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, các cán bộ Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận Quản lý đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng khoa học và công nghệ và Hợp tác quốc tế, phòng Sau Đại học, Phòng tài vụ trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Lê Trần Bình, TS Đ Xuân Đồng, ThS Lê Thu Ngọc, ThS Hồ Th Thương, ThS Nguy n Thu iang Phòng ông nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp

đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành đề tài này Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng ông nghệ ADN ứng dụng và Phòng Th nghiệm trọng điểm ông nghệ gen, Viện ông nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn mọi người đã tận tình chỉ bảo trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, các đồng nghiệp, những người đã luôn động viên và góp ý cho tôi trong thời gian vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Thu Hiền

iii

MỤC LỤC

Ở ĐẦU 1

1 T nh cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa lý luận và thực ti n 3

5 Đóng góp mới của luận án 3

ƯƠ 1: TỔ QU T I IỆU 4

1.1 Y M V N TR N H M 4

1 1 1 Nguồn gốc và v tr phân loại 4

1 1 2 Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền 5

1 1 3 iá tr của cây m a và tình hình sản xuất m a đường 7

1 1 4 Bọ hung hại m a và biện pháp phòng trừ 10

1.2 ỨN N N N H S NH H TRON H N T O Y M B N Đ N 13

1 2 1 Hệ thống nuôi cấy in vitro của cây m a 13

1 2 2 ác nghiên cứu tạo cây m a chuyển gen 21

1.3 C NH M N BACILLUS THURINGIENSIS (BT T N TR N 26

1 3 1 Nguồn gen kháng côn trùng của Bt 26

1 3 2 ơ chế gây độc của các độc tố Bt lên sâu hại 27

1.3.3 Nhóm gen cry8 và đặc t nh kháng bọ hung gây hại cây trồng 28

ƯƠ 2: VẬT IỆU V P ƯƠ P P IÊ ỨU 36

2.1 VẬT L U N H ÊN ỨU 36

2 1 1 ác giống m a 36

2 1 2 Vector và chủng khuẩn 36

iv

2 1 3 ặp mồi sử dụng 37

2.1.4 Hóa chất và thiết b máy móc 37

2 1 5 Đ a điểm và thời gian nghiên cứu 37

2.2 PHƯƠN PH P N H ÊN ỨU 38

2 2 1 Biểu hiện protein độc tố ry8 b trong vi khuẩn E.coli Rossetta amy- B và thử hoạt t nh kháng ấu trùng L signata Fabricius 39

2 2 2 Thiết kế vector chuyển gen vào cây m a 42

2 2 3 Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro ở cây m a 43

2 2 4 Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây m a thông qua chuyển gen gus 45

2.2.5 Phương pháp tạo cây m a mang gen cry8Db thông qua A tumefaciens 48

2 2 6 Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng phản ứng P R 48

2 2 7 Phân t ch sự t ch lũy protein ry8 b tái tổ hợp trong các dòng m a mang gen chuyển bằng kĩ thuật L S 48

2 2 8 Phương pháp Western blot 49

2 2 9 Thử nghiệm sinh học đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L signata abricius của các dòng m a chuyển gen 49

CHƯƠ 3: ẾT QUẢ IÊ ỨU 51

3.1 B ỂU H N PROT N ry8Db TRON V KHUẨN E.COLI ROSSETTA GAMY B VÀ THỬ HO T T NH T ẤU TRÙNG L SIGNATA FABRICIUS 51

3 1 1 Thiết kế vector biểu hiện p T -21a (+) mang gen cry8Db 51

3 1 2 Biểu hiện gen cry8Db trong tế bào E.coli Rossetta Gamy B 52

v

3 1 3 Tối ƣu sự biểu hiện gen cry8Db trong vi khuẩn E.coli Rossetta

gamy B 53

3.1.4 Tinh sạch và kiểm tra bằng Western Blot protein tái tổ hợp Cry8Db 54

3 1 5 Đánh giá tình hình phân bố của L signata abricius thu đƣợc ở vùng nguyên liệu m a Sơn Nam, Tuyên Quang 56

3 1 6 Đánh giá hoạt lực kháng ấu trùng L signata Fabricius của protein ry8 b tái tổ hợp 57

3.2 TH T K V TOR HUYỂN N cry8Db VÀO CÂY MÍA 59

3 2 1 Thiết kế vector pB 121/35S/cry8 b/NOST 59

3 2 2 Thiết kế vector p MB 1300/ aMV35S/cry8 b/NOST 61

3.3 TH T LẬP H THỐN TÁI SINH IN VITRO Ở Y M 63

3 3 1 Sự tái sinh in vitro qua chồi đỉnh 63

3 3 2 Sự tái sinh in vitro qua chồi nách 65

3 3 3 Sự tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn lá non 67

3 3 4 Sự tái sinh chồi in vitro thông qua phôi soma cây m a 72

3.4 TỐ ƢU QUY TR NH HUYỂN N V O Y M 80

3 4 1 Quy trình chuyển gen gus in vitro vào cây mía 80

3 4 2 Quy trình chuyển gen gus ex vitro vào cây mía 86

3.5 Đ NH KHẢ NĂN KH N ẤU TR N B HUN Ủ ÒN M B ỂU H N N cry8Db 91

3.5.1 Kết quả chuyển gen cry8Db vào cây m a trong điều kiện in vitro 91

3.5.2 Kết quả chuyển gen cry8Db vào cây m a trong điều kiện ex vitro 96

3.5.3 Western blot 99

3 5 4 Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L signata abricius của các dòng m a chuyển gen 100

vi

ƯƠ 4 : B UẬ ẾT QUẢ 104

4.1 B ỂU H N PROT N ĐỘ TỐ Cry8Db TRONG E.COLI

ROSETTA GAMY B VÀ THỬ HO T T NH KH N ẤU

TRÙNG L SIGNATA FABRICIUS 104 4.2 X Y ỰN H THỐN T I SINH IN VITRO MÍA 105 4.3 TỐ ƢU H H QUY TR NH HUYỂN N IN VITRO VÀ EX

VITRO V O ỐN M RO 22 TH N QU V KHUẨN A TUMEFACIENS 111

4.4 T O ÒN M B ỂU H N PROT N Cry8Db THEO

QUY TR NH HUYỂN N IN VITRO VÀ EX VITRO Đ ĐƢ

TỐ ƢU HO 115 4.5 W ST RN BLOT V THỬ N H M S NH H Đ NH

KHẢ NĂN KH N ẤU TR N L SIGNATA BR US Ở

dNTP Deoxyribo nucleotide triphotphate

Đtg, et al., Đồng tác giả

FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức Liên

Hợp Quốc về lương thực và nông nghiệp)

CaMV35S Cauliflower Mosaic Virus

IPTG sopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

Kinetin 6 – fufuryl amino purin

mg/L; mg/mL; ng/g Miligam/l t; miligam/mililit; nanogam/gam

viii

Môi trường LB Môi trường Luria và Bertani

Picloram 4 – amino – 3,5,6 tricloro pyridine – 2- carboxylic acid

scFv single-chain variable fragment

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis

Taq ADN polymerase Thermus aquaticus ADN polymerase

Vip Vegetative Insecticidal Protein

X – gluc 5- bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Đặc điểm di truyền của các loài m a là tổ tiên của các giống m a

thương mại ngày nay 7

Bảng 1.2: iện t ch, n ng suất, sản lượng của m a trên thế giới n m 2013, 2014 9

Bảng 1.3: Tình hình sản xuất m a ở Việt Nam n m 2009 – 2014 10

Bảng 1.4: Một số công trình nghiên cứu tái sinh in vitro ở cây m a (2001 – 2015) 19

Bảng 1.5: Một số kết quả tạo cây m a chuyển gen (1992 – 2015) 21

Bảng 2.1: ác cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu 37

Bảng 3.1: ác đặc điểm của ấu trùng L signata Fabricius thu thập được ở Sơn ương, Tuyên Quang 57

Bảng 3.2: iá tr L 50 khi bổ sung protein ry8 b vào thức n của ấu trùng L signata Fabricius (sau 14 ngày 58

Bảng 3.3: Khả n ng tái sinh và số chồi hình thành của các giống m a trên các môi trường khác nhau từ chồi đỉnh 64

Bảng 3.4: Khả n ng tái sinh và số chồi hình thành của các giống m a trên các môi trường khác nhau từ chồi nách 66

Bảng 3.5: Khả n ng tái sinh từ cuộn lá non và số chồi hình thành trung bình của các giống m a trên các môi trường khác nhau 69

Bảng 3.6: Tỷ lệ tạo mô sẹo của 3 giống m a trên môi trường MS có bổ sung 2,4 -D 72

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4– tới sự hình thành phôi soma từ mô sẹo của các giống m a sau 2 tuần nuôi cấy 74

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tổ hợp k ch th ch sinh trưởng B P và kinetin đến tỷ lệ tái sinh tạo đa chồi từ phôi soma của các giống m a 75

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của tổ hợp chất k ch th ch sinh trưởng BAP và kinetin lên số lượng chồi hình thành (số chồi/0,5 g cụm phôi soma ch n của các giống m a 76

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của N đến khả n ng ra r 77

x

Bảng 3.11: Khả n ng tái sinh từ cụm phôi soma giống m a RO 22 trên môi

trường tái sinh bổ sung hygromycin 81

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến khả n ng tái sinh ex-

vitro của giống m a RO 22 trong điều kiện tưới 86

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến khả n ng sống sót của

giống m a RO 22 trong điều kiện phun ex vitro 87

Bảng 3.14: Hiệu quả chuyển gen trong điều kiện ex vitro thông qua A

tumefaciens giống m a RO 22 89

Bảng 3.15: Kết quả chuyển cấu trúc p MB 1300/ aMV35S/cry8 b/NOST vào

giống m a RO 22 thông qua A tumefaciens trong điều kiện in vitro 92

Bảng 3.16: Kết quả chuyển cấu trúc p MB 1300/ aMV35S/cry8 b/NOST vào

giống m a RO 22 thông qua A tumefaciens trong điều kiện ex vitro 96

Bảng 3.17: Đánh giá khả n ng tác động của m a chuyển gen biểu hiện protein

ry8 b đến sự phát triển của ấu trùng (sau 14 ngày khảo sát ở nhà lưới 103

xi

DANH MỤC HÌNH Ả ĐỒ T Ị

Hình 1.1: ác loài m a tổ tiên của các giống m a thương mại ngày nay 4

Hình 1.2: Sơ đồ hệ thống nuôi cấy in vitro ở m a 15

Hình 1.3: Sự tái sinh trực tiếp các cơ quan của cây m a 16

Hình 1.4: Quá trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây m a 18

Hình 1.5: Mô hình phương thức hoạt động của nội độc tố ry 28

Hình 1.6: Sơ đồ phát sinh chủng loại của protein ry8 được phân lập từ Bt chủng Q52-7 31

Hình 1.7: ấu trúc 3- của protein có ba vùng độc của protein ry8 b 33

nh 1.8: Hình thái loài L signata abricius ở hai giai đoạn thu thập được ở vùng m a Sơn Nam, Sơn ương, Tuyên Quang 35

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu 38

Hình 3.1: Thiết kế vector biểu hiện p T -21a/cry8Db 51

Hình 3.2: Biểu hiện protein ry8 b tái tổ hợp 52

Hình 3.3: Kết quả tối ưu sự biểu hiện của protein ry8 b tái tổ hợp 54

Hình 3.4: Đánh giá protein ry8 b tinh sạch bằng điện di S S-PAGE và Western blot 55

Hình 3.5: Khảo sát sơ bộ mức độ phá hại m a của ấu trùng L signata Fabricius vùng nguyên liệu m a Sơn Nam, Sơn ương, Tuyên Quang 56

Hình 3.6: Ấu trùng L signata Fabricius hại m a 57

Hình 3.7: Ấu trùng L signata Fabricius chết sau 14 ngày cho n thức n nhân tạo có bổ sung protein ry8 b 58

Hình 3.8: Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen p MB 1300/P-35S/cry8Db/T-35S 59

Hình 3.9: Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector pBI121/35S/cry8Db/NOST 60

Hình 3.10 Hình ảnh điện di kết quả thiết kế vector pCAMBIA1300/35S/cry8Db/NOST 61

xii

Hình 3.11: Quá trình tái sinh chồi trực tiếp in vitro từ chồi đỉnh cây m a 64

Hình 3.12: Quá trình tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ chồi nách cây m a 66

Hình 3.13: Quá trình tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn lá non 70

nh 3.14: Hiện tượng r mọc ưu thế so với sự tái sinh chồi khi nuôi cấy mảnh cắt cuộn lá non ở m a 71

Hình 3.15: ác dạng mô sẹo khác nhau thu được sau khi nuôi cấy 73

Hình 3.16: Tái sinh tạo đa chồi từ cụm phôi soma 75

Hình 3.17: Kết quả tạo r cây m a in vitro 77

Hình 3.18: Tái sinh cây mía in vitro qua các giai đoạn khác nhau 79

Bảng 3.11: Khả n ng tái sinh từ cụm phôi soma giống m a RO 22 trên môi trường tái sinh bổ sung hygromycin 81

Hình 3.20: Biểu đồ phân t ch ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (O 600 nm , nồng độ cetosyringone đến hiệu quả chuyển gen vào giống m a ROC22 83

nh 3.21: Biểu đồ phân t ch ảnh hưởng thời gian lây nhi m đến hiệu quả chuyển gen vào giống m a RO 22 84

Hình 3.22: Quá trình biểu hiện gen gus các giai đoạn tái sinh m a in vitro khác nhau 84

Hình 3.23: Sơ đồ các bước chuyển gen in vitro vào giống m a RO 22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 85

Hình 3.24: Quá trình chuyển gen gus trong điều kiện ex vitro thông qua A tumefaciens 88

Hình 3.25: Kiểm tra cây chuyển gen gus 89

Hình 3.26: Sơ đồ các bước chuyển gen ex vitro vào giống m a RO 22 thông qua vi khuẩn A tumefaciens 91

Hình 3.27: Quá trình tái sinh các dòng m a chuyển gen cry8Db thông qua A tumefaciens trong điều kiện in vitro 92

Hình 3.28: Hình ảnh điện di kiểm tra một số dòng m a chuyển gen cry8Db bằng kĩ thuật P R trên gel agarose 0,8% 93

xiii

Hình 3.29: Kết quả L S đ nh lượng tương đối sự biểu hiện của protein

ry8 b của các dòng m a chuyển gen trong điều kiện in vitro 95

Hình 3.30: ác dòng m a mang gen chuyển cry8Db trong điều kiện ex vitro

trồng ở nhà lưới 96

Hình 3.31: Kết quả điện di sản phẩm P R kiểm tra sự có mặt của gen

cry8Db các dòng m a chuyển gen trong điều kiện ex vitro 97

Hình 3.32: Kết quả L S đ nh lượng tương đối sự biểu hiện của protein

ry8 b của các dòng m a chuyển gen ex vitro 98

nh 3.33: Sự biểu hiện của protein ry8 b trong một số dòng m a

chuyển gen 99

nh 3.34: Kết quả thử nghiệm sinh học kiểm tra tính kháng ấu trùng L

signata abricius của các dòng m a trong điều kiện nhà lưới sau

14 ngày 101

nh 3.35: Biểu đồ đánh giá khả n ng kháng ấu trùng L signata

abricius của các dòng m a chuyển gen cry8Db (sau 14 ngày

trong điều kiện nhà lưới 102

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp được trồng rộng rãi nhất trên thế giới (Dotaniya, Datta, 2014; Choudhary et al., 2017)

được canh tác ở 109 quốc gia với diện tích 26,9 triệu ha, sản lượng đạt 1,91 tỷ tấn (Factfish, 2015) ây m a được sử dụng vào nhiều mục đ ch: cung cấp thực phẩm: sucrose, fructose, mật m a; làm sợi: cung cấp vật liệu cenlullose, thức n gia súc: lá, thân đã được ép đường; tạo n ng lượng: n ng lượng sinh học tái tạo từ rỉ đường…;

công nghiệp hóa chất: ethanol sinh học, chất mùn (Dotaniya et al., 2016) Việc cải

thiện các đặc t nh nông sinh học ở cây m a đã được nghiên cứu trong những n m qua nhằm t ng trữ lượng đường, t ng khả n ng chống ch u các điều kiện stress như: hạn hán, ngập, mặn, kháng sâu hại, thuốc diệt cỏ, nấm gây bệnh… Tuy nhiên do một số đặc thù của cây m a như: k ch thước hệ gen lớn (985 Mbp), bộ nhi m sắc thể phức tạp (2n 70-140 , và sự tương tác phức tạp của cây mía với các điều kiện môi trường

(Zhang et al., 2012)… khiến cho thời gian để tạo ra một giống mía mới theo phương

pháp truyền thống lên tới 10-12 n m Kỹ thuật chuyển gen có thể xem là phương pháp tối ưu nhất để tạo ra giống mía mới trong thời gian ngắn nhất

ây m a được biết là vật chủ của hơn 1500 loài côn trùng và 80 bệnh hại, trong đó đặc biệt gây hại trên diện rộng và khó kiểm soát là các loài bọ cánh cứng (bọ hung, xén tóc , sâu đục thân, rệp nhưng phần lớn chúng thường b giới hạn bởi sự phân bố đ a lý Tuy nhiên, hiện nay sự phát triển của du l ch, thương mại giữa các nước cùng với thay đổi điều kiện khí hậu làm t ng nguy cơ sâu bệnh hại xâm nhập và bùng phát trong nhiều hệ thống nông nghiệp, trong đó sâu bệnh gây hại trên mía ngày càng khó kiểm soát Khả n ng th ch ứng của một số loài gây hại

và xâm nhập vào các khu vực trồng mía rất nhanh, gây thiệt hại đặc biệt nghiêm trọng ôn trùng bọ cánh cứng ảnh hưởng xấu đến n ng suất cây mía vì chúng phá hoại m a ở giai đoạn ấu trùng và trưởng thành

Các nghiên cứu tạo cây chuyển gen biểu hiện protein độc tố diệt côn trùng gây

hại của Bt đã phát triển trên khắp thế giới từ n m 1996 Việc tạo ra cây trồng biến đổi

gen là bước đột phá nhằm: (i): giảm thiểu tác hại của thuốc trừ sâu hóa học, (ii): t ng cường hiệu quả, t nh đặc hiệu trong diệt trừ sâu đ ch; (iii): giảm chi phí, ít ảnh hưởng tới môi trường, sức khỏe con người và các loài sinh vật khác (James, 2014)

Ở Việt Nam, cây m a cũng là một trong số các cây trồng ch u sự phá hoại lớn

từ côn trùng thuộc Bộ cánh cứng trong đó có họ bọ hung Scarabaeidae Ấu trùng bọ hung thường đục thân, phá hoại r , còn giai đoạn trưởng thành chúng n các bộ phận như thân, lá cây m a Sự phá hại do bọ hung gây ra có thể làm chết cây hoặc

giảm đáng kể n ng suất cây m a (Shu et al., 2009a) Kết quả nghiên cứu cho thấy,

không có giống mía nào hệ gen tự nhiên mang gen biểu hiện t nh kháng côn trùng gây hại (James, 2014) Vì vậy, việc tạo giống m a chuyển gen có khả n ng kháng côn trùng nói chung và bọ hung nói riêng đang là vấn đề cấp thiết hiện nay Nhóm

protein ry8 là một trong những nhóm protein độc tố Bt được mã hóa bởi các gen thuộc họ cry8 đã được chứng minh có độc t nh với ấu trùng của bọ cánh cứng trong

đó có bọ hung (Zhang et al., 2013)

ho đến nay, cây mía chuyển gen chủ yếu được tạo ra nhờ sử dụng hai

phương pháp ch nh là súng bắn gen và chuyển gen đ ch thông qua A tumefaciens Với điều kiện thực tế ở Việt Nam, sử dụng A tumefaciens để chuyển gen thực vật là

phương pháp đơn giản và mang lại hiệu quả cao Xuất phát từ cơ sở khoa học và

thực ti n, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hu n g n r D t nh kháng n tr ng v o m ”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được các dòng m a chuyển gen cry8Db có hoạt t nh kháng ấu trùng bọ

hung hại m a

3 Nội dung nghiên cứu

1 Đánh giá thiệt hại bọ hung gây ra trên mía và thử hoạt tính kháng ấu trùng loài

bọ hung điển hình của Cry8Db tái tổ hợp

2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300 chứa gen chuyển cry8Db

3 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả ở cây m a

4 Tối ưu hóa quy trình chuyển gen in vitro và ex vitro thông qua A tumefaciens

5 Đánh giá khả n ng kháng ấu trùng bọ hung của các dòng mía biểu hiện

gen cry8Db

4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn

Kết quả đạt được của luận án có giá tr khoa học và thực ti n trong tiếp cận nghiên cứu t ng cường khả n ng kháng bọ hung hại m a bằng kỹ thuật chuyển gen

thông qua A tumefaciens

4.1.Ý nghĩ lý luận

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu

và thực nghiệm tạo giống mía kháng bọ hung bằng chuyển gen Bt

4.2 Ý nghĩ thực tiễn

1 Tạo được protein tái tổ hợp Cry8Db quy mô phòng thí nghiệm thông qua

vi khuẩn E.coli Rosetta - amy B, chứng minh được protein tinh sạch có khả n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius – một loài thuộc họ bọ hung hại m a thu

được ở Sơn Nam, Sơn ương, Tuyên Quang

2 Tạo được các dòng mía chuyển gen cry8Db có khả n ng biểu hiện độc tố có

tính kháng ấu trùng bọ hung thu thập được ở Sơn Nam, Sơn ương, Tuyên Quang

Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm nâng cao khả n ng kháng côn trùng gây hại ở cây m a, mở

ra triển vọng ứng dụng mới trong thực ti n tạo giống m a kháng côn trùng hại m a

5 Đóng góp mới của luận án

1 Đã chứng minh được protein ry8 b k ch thước phân tử khoảng 73 K a

có khả n ng diệt ấu trùng Lepidiota signata Fabricius ở các giai đoạn khác nhau

Đối với ấu trùng tuổi 1, nồng độ gây chết 50% số cá thể là LC50 = 183,5 ng/g, ấu trùng tuổi 2 LC50 = 270,8 ng/g và ấu trùng tuổi 3 nồng độ này ở ngưỡng cao nhất với giá tr LC50 = 345,4 ng/g

2 Đây là công trình đầu tiên sử dụng song song 2 quy trình chuyển gen vào

cây m a (trong điều kiện in vitro và ex vitro để tạo ra các dòng mía chuyển gen cry8Db ông trình đã tạo được 13 dòng m a chuyển gen cry8Db Protein Cry8Db ở

các dòng mía chuyển gen đã được kiểm tra bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ protein tái tổ hợp ở các dòng mía chuyển gen dao động từ 1.62 - 21,73 ng/µg protein tổng số Thử nghiệm sinh học cho thấy dòng m a chuyển gen S3 có khả

n ng kháng ấu trùng Lepidiota signata abricius tốt nhất với tỷ lệ b phá hại thấp (12,91% , khối lượng ấu trùng b giảm 2,85 lần sau 14 ngày

ƯƠ 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Y V TR ẠI

1.1.1 guồn gốc và vị trí phân loại

Cây mía (Saccharum officinarum Linn.) trồng hiện nay thuộc chi Saccharum,

họ Gramineae, lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành thực vật hạt kín

(Magnoliophyta) (Đ N ng V nh, 2006)

Việc phân loại cây mía gặp rất nhiều vấn đề phức tạp, vì ngoài chi

Saccharum còn có các chi khác thuộc cùng một nhóm giao phấn gọi là „„phức hợp Saccharum” bao gồm: Erianthus, Ripidium, Miscanthus, Diandra, Narenga và Sclerostachya (Office of Gene Technology Regulator, 2011)

Chi Saccharum gồm có sáu loài khác nhau: S barberi L., S edule L., S officinarum L., S robustum L., S sinense L., và S spontaneum L Trong số này, S officinarum L (loài được thuần hóa để canh tác và cung cấp đường) và S spontaneum

L (loài hoang dại với bộ NST thể d bội được cho là tổ tiên của mía trồng ngày nay (Sandhu et al., 2012) Các giống m a thương mại ngày nay là con lai giữa S officinarum L (chiếm 80 – 90% hệ gen) và S spontaneum L (chiếm 10–20% hệ gen) (Hoarau et al., 2002) (Hình 1.1)

Hình 1.1: C c loài mía tổ ti n của c c giống mía th ng mại ngày nay

A: Loài S officinarum L.; B: loài S spontaneum L

(Nguồn: Aditya, Jitendra, 2014)

Loài S spontaneum L được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới đến cận

nhiệt đới ở châu và châu Phi, có môi trường sống đa dạng Đây là một loài trong

tự nhiên có hình thái biến đổi, có thể rậm ngắn hoặc cao lớn (có thể cao tới 5 m

Hầu hết loài S spontaneum L có lá và cuống lá mỏng, hàm lượng đường thấp, và tỷ

lệ xơ cao (Aditya, Jitendra, 2014) ác ngành công nghiệp m a đường trên thế giới

đã thuần hóa và phát triển các giống m a thuộc loài S officinarum L , đặc trưng của

loài này là hàm lượng đường cao, lượng xơ thấp, dày cuống và lá rộng và có nguồn

gốc từ New uinea hoặc Melanesian (Grivet et al., 1996)

1.1.2 Đặc điểm h nh th i sinh th i và di truyền

Đặc điểm hình thái

M a là cây một lá mầm, thân thảo Thân m a là nguyên liệu chế biến đường

và làm giống cho vụ sau Trên biểu bì thân m a có chứa nhiều chlorophin và xantophin hợp thành màu sắc đặc trưng của từng giống m a iữa các dóng thân là các đốt m a chứa bốn bộ phận gồm đai sinh trưởng, r , chồi bên và sẹo lá

Trên thân có các bẹ lá bao bọc, lá mọc thành hai hàng so le, đối nhau hoặc theo đường vòng trên thân m a Là thực vật thuộc nhóm 4, lá m a dài 1-2 m, rộng

5 -7 cm (Taparia et al., 2012) Lá m a có hai bộ phận ch nh: phiến lá và bẹ lá h

tiếp giáp giữa bẹ lá và phiến lá gọi là cổ lá, thường thì khi cây phát triển đến lá thật thứ 12 -15, mới đạt đến độ to và chiều dài tiêu chuẩn tương ứng với m i giống Ngoài ra, còn có lớp phấn và lông nơi bẹ lá

M a thuộc loại r chùm R m a nói chung được chia thành hai loại: r sơ cấp

và r thứ cấp R sơ cấp còn gọi là r tạm thời, là loại r mọc từ hom giống hoặc hạt giống, đây là loại r đường k nh bé, phân nhánh nhiều, t n sâu, chỉ đảm bảo nuôi cây đến khoảng 4-7 tuần đầu R thứ cấp còn gọi là r vĩnh cửu, xuất hiện khi cây con có từ 3-5 lá thật Loại này tồn tại lâu hơn và n sâu hơn trong đất và có ba dạng (r hấp thu, r n sâu và r chống đổ , m i dạng có vai trò khác nhau trong việc cung cấp chất dinh dưỡng và đảm bảo sự sinh tồn của cây m a khi có điều kiện bất lợi về thời tiết xảy ra (Trần V n Sỏi, 2003)

Khi kết thúc thời kỳ sinh trưởng, cây m a sẽ chuyển sang giai đoạn sinh thực (ra hoa Mầm hoa được hình thành từ đỉnh sinh trưởng và được bao bọc bởi chiếc

lá cuối cùng của bộ lá (lá đòng Bông hoa m a gồm trục ch nh và các nhánh cấp 1, cấp 2, có chứa nhiều hoa nhỏ Hoa m a lưỡng t nh, có ba nh đực và một bầu noãn, quá trình thụ tinh được tiến hành như cây thuộc họ Hòa thảo khác (lúa, ngô… Hạt

m a rất bé, k ch thước khoảng 1-1,25 mm, chỉ nặng 0,15 – 0,25 mg, hình thoi, bên trong có chứa albumin, tinh bột và phôi mầm Trong công tác cải tạo giống m a, lai hữu t nh là một phương pháp truyền thống đã được áp dụng (Trần V n Sỏi, 2003

Đặc điểm sinh thái

M a thuộc nhóm thực vật 4 th ch nghi với kh hậu vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Nhiệt độ tối th ch cho phát triển của m a là từ 30-34o Nếu trên 38o

C thì

sự sinh trưởng của m a b đình trệ vì quá trình đồng hóa cao hơn d hóa òn nhiệt

độ thấp dưới 0o kéo dài, cây m a sẽ b chết và đông nhựa Tuy nhiên, nhiệt độ tối

th ch cho việc phát triển cây m a còn tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển và bản chất giống Trong thân cây m a, nước chiếm tỷ lệ 70% Tùy từng thời kỳ sinh trưởng, cây m a th ch nghi với độ ẩm nhất đ nh Thời kì đẻ nhánh, m a tiêu hao nước nhiều hơn, độ ẩm th ch hợp tối đa trong đất là 55–70% Thời kì vươn lóng, cây m a đòi hỏi tiêu hao nước nhiều nhất (60-80% Đến thời kỳ t ch lũy đường, yêu cầu nước giảm xuống và độ ẩm tối th ch trong đất chỉ còn 50-60% Đất phù hợp để trồng m a là đất cát pha, đất th t nhẹ và trung bình, trong đất có chất hữu cơ, chất mùn

Độ pH 5,5-7,5, không b nhi m mặn (Trần V n Sỏi, 2003

Đặc điểm di truyền

Bộ gen của cây m a hiện nay được cho là phức tạp nhất trong tất cả các loài cây trồng và được hình thành từ những loài đa bội thuộc chi m a Số lượng nhi m sắc thể của các loài m a hiện nay biến đổi từ 36 đến 200 (Office of Gene Technology Regulator, 2011) Trong khi đó, Zhang và đtg (2012 cho rằng hai loài

S officinarum L có số lượng NST 2n 70–140 và S spontaneum L có số lượng NST 2n 40–128 (Bảng 1 1 Bộ nhi m sắc thể của các loài thuộc chi Saccharum

không chỉ đa bội cùng loài autopolyploid (mang hơn hai bộ nhi m sắc thể đồng hợp từ một loài mà còn đa bội khác loài allopolyploid (mang hai hoặc hơn hai bộ nhi m sắc thể từ các loài khác nhau, vì vậy hệ gen m a rất phức tạp ây m a có bộ nhi m sắc thể

cơ bản là x 6; x 8 hoặc x 10 Sự biến động số lượng nhi m sắc thể ở m a do các nguyên nhân sau: (i lai giữa các loài; (ii một số dòng có tần số biến d số lượng nhi m sắc thể lớn trong quá trình phân bào giảm nhi m; (iii biến d tế bào soma xảy ra trong quá trình nhân giống vô t nh hoặc do sự xâm nhi m của gen từ loài này

sang loài khác (Đ N ng V nh, 2006 Hai loài S officinarum L và S spontaneum L

có số lượng nhi m sắc thể khác nhau, lai với nhau để tạo nên các giống m a thương

mại ngày nay Trong đó loài S officinarum L có k ch thước bộ gen lớn hơn (985

Mbp (Bảng 1 1

Bảng 1.1: Đặc điểm di truyền của các loài mía là tổ tiên

của các giống mía th ng mại ngày nay

Số lượng nhiễm sắ

th (2n)

h thướ

h g n (Mbp)

Tá giả

Các loài mía trồng và mía hoang dại nói chung đều có khả n ng nhân giống hữu tính bằng hạt và nhân giống vô t nh ác đặc tính này ở mía có liên quan mật thiết với di truyền nhi m sắc thể Nhân giống hữu tính cho phép lai chéo giữa các loài, tạo ra con lai, sau đó tiến hành nhân giống vô tính bảo tồn các đặc tính sau lai (Đ N ng V nh, 2006)

1.1.3 i trị của cây mía và t nh h nh sản xuất mía đ ờng

Giá trị kinh tế

Cây mía hiện nay là nguyên liệu để sản xuất ra 80% sản lượng đường

sucrose trên thế giới (Dotaniya et al.,2016) Lượng đường bình quân đầu người sử

dụng đường từ 10 – 12 kg/n m và dự kiến sẽ t ng trong những n m tới

Cây mía với thành phần sinh hóa phong phú nên ngày càng được các ngành công nghiệp quan tâm khai thác, chủ yếu là sản xuất đường sucrose ây m a còn cung cấp nguyên liệu để sản xuất ethanol sinh học, góp phần phát triển n ng lượng sinh học thay thế cho nguồn n ng lượng hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt Xenlulose trong bã

mía là nguyên liệu rẻ được ứng dụng để sản xuất bột giấy, g ép, có thể làm sợi nhân tạo trong công nghiệp dệt Công nghiệp hóa chất sử dụng đường thông qua các phản ứng hóa học để tạo ra các chất như: sobitol, manitol, glixerol, phenol formandehit…Mật rỉ qua quá trình lên men, chưng cất đã tạo nên rượu, cồn công nghiệp, acid lactic, acid xitric, men thực phẩm, men thức n gia súc Như vậy, cây m a

là cây trồng có giá tr cao Hơn nữa, mía là một trong những cây cao sản, chỉ số diện tích lá của mía rất lớn, gấp 6 -7 lần diện t ch đất M a có hiệu quả quang hợp cao, nếu

ch m bón tốt có thể cung cấp 200 – 250 tấn sinh khối/ha/n m – n ng suất kỉ lục mà cây trồng khác không đạt được Vì vậy, nếu tận dụng hết được các nguồn lợi mà cây mía đem lại, thì sẽ mang lợi ích gấp 2 – 3 lần so với cây trồng khác (Pippo, Luengo, 2013)

Tình hình sản xuất mía đường trên thế giới và Việt Nam

Mía là cây công nghiệp phân bố khá rộng, thích nghi tốt ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, được thu hoạch sản lượng lớn nhất so với các cây trồng khác

trên toàn cầu (http://faostat.fao.org Hơn 100 quốc gia đang trồng và phát triển

các giống m a thương mại có n ng suất cao, đứng đầu thế giới về sản xuất mía có

ba nước: Brazil, Ấn Độ và Trung Quốc M i n m có hơn 1,5 tỷ tấn m a được thu hoạch và chế biến Việc mở rộng sản xuất mía ở Brazil đã làm cho sản lượng mía toàn thế giới t ng gấp đôi trong 25 n m qua Sự mở rộng này đã tạo ra một xu thế

t ng lượng đường tiêu thụ toàn cầu m i n m 2% một cách bền vững Theo thống

kê của O n m 2013, tổng sản lượng thu hoạch toàn cầu đạt lần lượt 1,9 tỷ tấn Trong đó, tổng sản lượng m a đường chủ yếu tập trung ở châu Mỹ với xấp xỉ 1,04

tỷ tấn/n m, trong đó, Brazil là nước có sản lượng m a đường cao nhất thế giới đạt xấp xỉ 768,1 triệu tấn/n m và n ng suất là 75,34 tấn/ ha Châu Á đứng thứ hai trên thế giới về tổng sản lượng m a, ước t nh đạt xấp xỉ 747,1 triệu tấn (Bảng 1 2 trong đó

có hai nước là Ấn Độ và Trung Quốc đại lục là các nước sản xuất m a đường mạnh thứ hai, thứ ba thế giới, sản lượng lần lượt đạt 341,2 triệu tấn/n m và 128,2 triệu tấn/n m hâu Phi và hâu Đại dương đạt mức sản lượng khá cao (97,4 và 29,1 triệu tấn/n m

N ng suất m a đường ở các châu lục tương đối đồng đều Ở châu Âu, diện tích canh tác mía chỉ 64 ha, sản lượng đạt xấp xỉ 5,5 nghìn tấn/n m, tuy không mở rộng diện tích

nhưng n m suất đạt cao nhất trong tất cả các châu lục (85,16 tấn/ha , cao hơn với mức trung bình chung của n ng suất toàn thế giới (Bảng 1.2)

Bảng 1.2: Diện tích năng suất, sản l ợng của mía trên thế giới năm 2013, 2014

hu vự Năm Di n t h (h ) Năng suất (tấn/h ) Sản lượng (tấn/năm)

N m 2014, diện t ch, n ng suất và sản lượng của m a trên thế giới có thay đổi

ụ thể diện t ch canh tác toàn thế giới t ng so với 2013, đạt xấp xỉ 27,12 triệu ha, tuy nhiên do n ng suất chỉ đạt 69,50 tấn/ha nên sản lượng toàn thế giới đạt xấp xỉ 1,88 tỷ tấn, thấp hơn so với sản lượng n m 2013 hâu Mỹ và châu vẫn tiếp tục là các châu lục dẫn đầu về sản xuất m a trên thế giới, sản lượng đạt lần lượt xấp xỉ 1 tỷ tấn, 0,75 tỷ tấn, không chênh lệch nhiều so với sản lượng n m 2013 iện t ch và sản lượng m a ở châu Phi b sụt giảm đáng kể so với 2013 hâu u và châu Đại ương đều t ng diện

t ch canh tác và n ng suất m a, tuy vậy hai châu lục này vẫn chưa phát triển được cây

m a thành cây công nghiệp chủ lực, cụ thể diện t ch canh tác m a còn rất thấp, châu u:

73 ha, châu Đại ương: 426,35 nghìn ha (Bảng 1 2

M a là cây trồng phù hợp với điều kiện sinh thái ở nước ta nên thích nghi được với nhiều vùng, miền Chính phủ Việt Nam đã ban hành quyết đ nh số 26/2007/QĐTTg về

“Quy hoạch phát triển mía đường đến năm 2010 và định hướng đến năm 2020” đã có

quan điểm rõ ràng nhằm khuyến khích các thành phần kinh tế đầu tư phát triển m a đường, gắn lợi ích giữa nhà chế biến và người sản xuất nguyên liệu, thúc đẩy xây dựng nông thôn mới Đây ch nh là tiền đề để các vùng miền trong nước đẩy mạnh sản xuất nhằm t ng n ng suất và sản lượng cây mía, cải thiện kinh tế

Bảng 1.3: Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam năm 2009 – 2014

Năm Di n t h (ha) Năng suất (tấn/h ) Sản lượng (tấn/năm)

1.1.4 Bọ hung hại mía và biện ph p phòng trừ

Tình hình nghiên cứu về bọ hung

Trên toàn thế giới, bọ hung là một trong những côn trùng phá hoại mạnh nhất trong nông nghiệp và lâm nghiệp đặc biệt là châu u và châu , ấu trùng của chúng

phá hại thực vật và làm giảm n ng suất đáng kể (Liu et al., 2010) Ở Trung Quốc, Holotrichia parallela và Anomala corpulenta là hai loài thuộc họ bọ hung gây hại

nghiêm trọng cho sản xuất nông nghiệp trên các đối tượng cây trồng như lạc, đậu

tương, khoai tây, cỏ ch n nuôi và m a (Luo et al., 2008), làm giảm 15 – 20% n ng

suất trung bình m i n m Bọ hung hại m a đã làm giảm 39% n ng suất mía ở USA

(faostat.fao.org)

Trên thế giới đã phát hiện được hơn 300 000 loài thuộc Bộ cánh cứng Coleoptera, chiếm tới 40% các loài côn trùng và khoảng 30% các loài động vật đã biết Họ bọ hung Scarabaeidae có khoảng 27.800 loài thuộc 600 giống và chia thành 13 phân họ đã được

phát hiện (http://www-museum.unl.edu/research/entomology) Ở vùng Đông phương và

lân cận, có nhiều công trình nghiên cứu về họ bọ hung (Arrow, 1931; Ttot, 2003; Chandra, Gupta, 2013)

Ở nước ta, số liệu thu được hầu hết chỉ ghi nhận ở các đ a danh các miền hoặc là chỉ đến các tỉnh ựa trên các tài liệu của Sakai và Nagai (1998 đã thống kê được ở Việt Nam đã có 423 loài thuộc họ bọ hung Scarabaeidae được công bố và theo đánh giá thì số loài chưa được phát hiện còn rất nhiều

Theo Phạm Th Vượng và đtg (2011 , thành phần sâu hại m a được ghi nhận gồm 26 loài thuộc 8 bộ côn trùng Trong đó có bộ cánh cứng (Coleoptera có số loài nhiều nhất là 13 loài, chiếm 50% tổng số loài gây hại m a Về tần suất xuất hiện và gây hại ngoài hiện trường sản xuất, bọ hung là một trong những đối tượng gây hại nghiêm trọng trong đất, làm giảm n ng suất tại nhiều vùng m a trọng điểm Bọ hung gây hại nặng trên các nhóm thuộc giống m a RO được trồng trên đất có thành phần cơ giới nhẹ và m a trồng lưu gốc lâu n m

Lê Quang Khải và đtg (2017 đã sử dụng ba biện pháp ch nh để diệt trừ loài

bọ hung hại m a Lepidiota signata Fabricius: thuốc Regent 0,3 ; thuốc iazan 10H, chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae Kết quả cho thấy hiệu quả diệt trừ Lepidiota signata Fabricius hại m a bằng thuốc Regent 0,3 đạt cao nhất 38,4% sau

một tháng xử lý, thời gian hiệu lực nhanh Tuy vậy, nhược điểm của thuốc hoá học

là sau 6 tháng không còn hiệu lực trừ sâu hế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium anisopliae kéo dài hiệu lực diệt ấu trùng này nhưng hiệu quả thấp hơn sử dụng

thuốc hóa học, chỉ đạt 26,7%

Bọ hung hại mía thuộc họ bọ hung (Scarabaeidae), bộ Cánh cứng (Coleoptera)

Ở Việt Nam, đã xác nhận có khoảng 10 loài bọ hung gây hại bao gồm bọ hung đen

(Alissonotum impressicolle Arrow), bọ hung nâu lớn (Holotrichia pruinose Wide), bọ hung nâu lớn (Holotrichia sp1), bọ hung nâu lớn (Holotrichia sp2), bọ dừa (bọ đa (Lepidiota signata Fabricius), bọ hung nâu nhỏ (Meladera sp1), bọ cánh cam loài Anomala expensa Bates, bọ cánh cam loài Anomala cupries Hope và bọ cánh cam loài Anomala sp… (Đinh V n Đức, 2011; Nguy n V n Đĩnh et al., 2012) Thành phần bọ

hung hại mía rất đa dạng nhưng trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi tập trung nghiên

cứu về loài Lepidiota signata Fabricius hại m a ở khu vực Sơn Nam, Sơn ương,

Tuyên Quang

ng d ng c ng nghệ sinh học trong ph ng trừ ọ hung hại mía

ho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài bọ hung hại mía ở Việt Nam Nghiên cứu của Nguy n Đức Khiêm (1996) về loại bọ hung nâu hại mía ở vùng m a đồi Thanh Hóa, nghiên cứu của Đinh V n Đức (2011), Phạm Th Vượng và đtg (2006 về loại bọ hung đen hại mía

ở phía Bắc… ác biện pháp phòng ngừa tác hại của bọ hung khá đa dạng: sử dụng

chế phẩm tuyến trùng sinh học của Lại Phú Hoàng và đtg (2003), Vũ Tứ Mỹ và đtg

(2004), biện pháp thủ công cơ giới kết hợp thuốc hóa học của Nguy n Đức Khiêm (1996), hay kết hợp cả biện pháp sinh học, hóa học và canh tác của Đinh V n Đức (2011)… Trong số các biện pháp nói trên, biện pháp sinh học có hiệu quả lâu dài và

rõ rệt, song yêu cầu phải áp dụng rộng rãi liên tục và hiệu quả chỉ đạt được sau một thời gian dài áp dụng Các biện pháp khác như sử dụng thuốc hóa học, biện pháp thủ công đang được nông dân áp dụng phổ biến ở các vùng d ch song hiệu quả phòng trừ đôi khi không đạt như mong muốn, chi phí cao nên khó áp dụng cho tất

cả các vùng chuyên canh cây mía

Những n m gần đây, việc sử dụng Baccillus thuringiensis (Bt) là biện pháp

hiệu quả nhằm giảm sự phá hại từ côn trùng trong ngành trồng trọt mà không ảnh hưởng xấu đến môi trường Tại Trung Quốc, Liu và đtg (2010 đã phân lập được

chủng BT185 mang gen cry8Ca2 có t nh kháng hai loài thuộc họ bọ hung hại mía là Holotrichia parallela và Anomala corpulenta Hiện đã có công trình phân lập gen cry8Da từ các chủng Bt bản đ a ở Việt Nam chuyển vào thuốc lá, và đã chứng minh diệt được loài bọ hung nhỏ Anomala cuprea (Lê Th Minh Thành et al., 2012)

Trên cơ sở tổng quan, việc ứng dụng công nghệ sinh học chuyển gen cry8Db (được phân lập và tối ưu mã di truyền từ Bt) thông qua A tumefaciens tạo cây mía

chuyển gen có tính kháng bọ hung là vấn đề có cơ sở lý thuyết và thực ti n vững chắc

1.2 Ứ Ụ Ệ SI Ọ TR Ọ TẠ Y BIẾ ĐỔI

Một trong những yêu cầu nền tảng để chuyển gen trong điều kiện in vitro

thành công là xây dựng được tái sinh cây hiệu quả sau đó mới tiến hành chuyển gen vào cây mía ây m a đã được chuyển gen thành công chủ yếu nhờ hai phương pháp chính: chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông

qua trung gian A tumefaciens Với mục đ ch cải biến nhằm tạo ra các giống mía

mới có n ng suất cao, có tính kháng lại các stress do biến đổi khí hậu và do sâu bệnh, sử dụng cây m a như một “nhà máy sinh học” để tạo ra các t nh trạng phục vụ lợi ch cho con người, nhiều công trình khoa học công phu nghiên cứu về công nghệ chuyển gen vào cây mía

1.2.1 ệ thống nu i cấy in vitro của cây mía

1.2.1.1 Phương thức nuôi cấy in vitro cây mía

Phương thức tái sinh cây mía in vitro có thể thông qua sự phát sinh cơ quan trực

tiếp (mảnh lá, chồi đỉnh, chồi nách) hoặc tái sinh thông qua mô sẹo (callus), phôi soma (somatic embryos , phương thức nuôi cấy tế bào huyền phù rất ít sử dụng

1.2.1.2 Nguyên li u thực vật sử dụng trong nuôi cấy in vitro

Trong số các nguyên liệu ban đầu nuôi cấy, chồi đỉnh, chồi nách, hạt, cuộn lá non của cây m a khoẻ mạnh, không nhi m sâu bệnh đều được sử dụng Tùy vào mục

đ ch nghiên cứu mà các công trình sử dụng nguyên liệu thực vật khác nhau Với mục

đ ch là nhân nhanh chồi sạch bệnh hoặc bảo tồn nguồn gen, thường sử dụng chồi đỉnh

và chồi nách Với mục đ ch xây dựng hệ thống tái sinh để áp dụng công nghệ chuyển

gen, quá trình nuôi cấy m a in vitro được tiến hành thành hai giai đoạn: (i): giai đoạn

tạo mô sẹo: các mô cấy được đặt trên môi trường có bổ sung auxin với nồng độ thích hợp để tạo mô sẹo phôi hóa, (ii): mô sẹo phôi hóa đặt lên môi trường có cytokinin hoặc kết hợp các chất kích thích khác cho hiệu quả tái sinh cao nhất, trong đó B P và

kinetin là hai chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có tác dụng kích thích

rõ rệt đến sự hình thành chồi bất đ nh đồng thời ức chế mạnh sự tạo r của chồi nuôi cấy (Vũ V n Vụ, 2007), (iii): chồi đạt chiều cao phù hợp được cấy chuyển sang môi trường ra r có bổ sung auxin với nồng độ thích hợp Tùy vào đặc tính của từng giống

để sử dụng các chất k ch th ch sinh trưởng với nồng độ khác nhau trong các giai đoạn khác nhau để t ng tối đa hiệu suất tái sinh của mô cấy

Nguyên liệu thực vật dùng để nuôi cấy in vitro rất đa dạng, có thể từ mảnh cắt cuộn lá non (Geeth, Padmanabhan, 2001; Suprasanna, Bapat, 2006; Pandey et al., 2011; Belintani et al., 2012; Kumar et al., 2014; Kaur, Kapoor, 2016), từ phân đoạn hoa non (Desai et al., 2004; Suprasanna, Bapat, 2006), từ chồi đỉnh và chồi nách (Biradar et al., 2009), từ hạt (Mayavan et al., 2013) Hệ thống tái sinh mía in vitro đã được tiến hành và nghiên cứu trên nhiều giống mía, chủ yếu sử dụng để tái

sinh cây chuyển gen

1.2.1.3 Thành phần m i trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở m a, môi trường được dùng phố biến nhất

là môi trường MS cơ bản (Murashige, Skoog, 1962), có bổ sung các chất kích thích

sinh trưởng tùy vào mục đ ch cuối cùng của nuôi cấy in vitro Trên thực tế, để tạo

mô sẹo thường dùng môi trường MS cơ bản bổ sung chất k ch th ch sinh trưởng thuộc nhóm auxin như 2,4 –D, TDZ hoặc Picloram Tạo mô sẹo phôi hóa (phôi soma) thì sử dụng các chất thuộc nhóm auxin nhưng nồng độ thấp hơn trong điều kiện tối hoàn toàn Mô sẹo phôi hóa được tái sinh trên môi trường bổ sung các nhóm chất thuộc cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin với tỷ lệ thích hợp

Trong quá trình nuôi cấy in vitro ở mía hiện tượng mẫu tiết ra các hợp chất

phenolic, làm môi trường hóa nâu và gây ức chế sự phát triển của mẫu, để hạn chế hiện tượng này, có thể dùng than hoạt tính, sobitol kết hợp cấy chuyển 07 ngày/lần

để làm giảm tác hại của hiện tượng này (Dobariya, 1994; Gosal et al., 1998; Jaganath et al., 2014)

1.2.1.4 Điều ki n nuôi cấy

Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển ở các loài không như nhau Tuy vậy, nhiệt độ phòng thí nghiệm luôn được duy trì 25-28oC (Vũ V n Vụ, 2007)

Đối với nuôi cấy mô ở cây mía, nhiệt độ tối ưu là 25 ± 2o và độ ẩm thích hợp là 70- 80% (Kaur, Kapoor, 2016)

Ánh sáng ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy ường độ ánh sáng phổ biến cho nhiều loại thực vật dao động 1000-5000 lux Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì chồi sinh trưởng chậm lại và t ng cường quá trình tạo r Đối với quá trình nuôi cấy tạo mô sẹo hay phôi soma của mía, các công trình đều ghi nhận trong điều kiện tối hoàn toàn, đến giai đoạn tái sinh và ra r thì phôi soma được nuôi cấy trong điều kiện sáng (Kaur, Kapoor, 2016)

1.2.1.5 H thống nuôi cấy in vitro ở cây mía

Hệ thống tái sinh cây trực tiếp

Cây mía có thể được tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh, từ chồi nách hoặc từ hạt mía Mục đ ch ch nh của quá trình tái sinh sử dụng phương thức này là nhân nhanh chồi và bảo tồn nguồn gen Nếu muốn lưu trữ nguồn gen lâu dài thì sử dụng biện

pháp làm chậm quá trình t ng trưởng của cây in vitro (Chandran, 2011) và bảo quản

lạnh mẫu (Gonzalez-Arnao, Engelmann, 2006) Trong thực tế, việc bảo tồn nguồn gen ở cây m a đã được tiến hành để duy trì các dòng ưu tú, duy trì nguyên liệu biến đổi gen và đột biến trước khi cho cây ra đồng ruộng (Hình 1.2)

nh 1.2: S đồ hệ thống nuôi cấy in vitro ở mía

hồi đỉnh là nguyên liệu tái sinh rất phổ biến, Biradar và đtg (2009 đã sử dụng chồi đỉnh của giống mía CoC-671 làm nguyên liệu nuôi cấy Quá trình nuôi cấy khởi đầu, chồi đỉnh trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/L BAP, sau 7 -10 ngày, đa chồi bắt đầu xuất hiện và nhân nhanh cá thể Đây là một cách tái sinh rất

Hệ thống

nuôi cấy in

vitro cây mía

Tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh, chồi nách, cuộn lá non và

hạt

Tái sinh thông qua phôi soma

- Công nghệ nhân giống sạch bệnh

- Lưu trữ nguồn gen

- Công nghệ chuyển gen

đơn giản nhưng gặp một hạn chế là trong quá trình phát sinh chồi, mẫu luôn tiết ra phenolic làm ức chế sự phát triển của chồi, để giảm tác hại của hiện tượng này, mẫu

được cấy chuyển 07 ngày/lần (Biradar et al., 2009)

Hình 1.3: Sự tái sinh trực tiếp c c c quan của cây mía

A: Tái sinh từ chồi đỉnh, B: Tái sinh từ chồi nách, C: Tái sinh từ hạt

(Nguồn: A, B: Manickavasagam et al., 2004, C: Mayavan et al., 2013)

Chồi nách cũng là nguồn nguyên liệu được sử dụng tái sinh trực tiếp Chồi nách của giống m a o92061 được đặt trên môi trường MS có bổ sung 3 mg/L BAP, sau 3 tuần nuôi cấy, các chồi mới sẽ được phát sinh từ chồi nách ban đầu

Để hiệu quả tạo đa chồi cao hơn, tác giả sử dụng các chồi mới đặt lên môi trường nhân chồi MS có bổ sung ba chất k ch th ch sinh trưởng 2 mg/L BAP, 1 mg/L

kinetin và 0,5 mg/L NAA (Manickavasagam et al., 2004) (Hình 1.3)

Hạt m a cũng được dùng làm nguyên liệu tái sinh nhưng không phổ biến Một trong những nguyên nhân ch nh là m a thường được thu hoạch sớm hơn lúc ra hoa để giữ được hàm lượng đường tốt nhất Hạt mía của 5 giống CoC671, o86032, o09014, o94012 và o86056 được đặt trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L GA3 với điều kiện nhiệt độ 25 ± 2o để tái sinh tạo chồi (Mayavan

et al., 2013) (Hình 1.3)

Hệ thống nuôi cấy tái sinh cây thông qua mô sẹo và phôi soma

Phôi soma là sản phẩm của quá trình biệt hóa tế bào thành các dạng cấu trúc đặc trưng, có khả n ng tái sinh thành chồi mà không cần qua giai đoạn thụ phấn (sinh sản hữu tính) ho đến nay, hầu hết các công trình nghiên cứu chuyển gen đều dựa trên hiệu quả tái sinh thông qua phôi soma (Kaur, Kapoor, 2016), ngoài ra phôi soma được ứng dụng trong việc lựa chọn các biến d soma, trong kỹ thuật tạo đột biến gen (Suprasanna, Bapat, 2006)

Phôi soma được tạo thành trên môi trường có bổ sung auxin với nồng độ thấp hơn so với quá trình hình thành mô sẹo Sau quá trình tái sinh, số lượng chồi được t ng theo cấp số nhân Trong các công trình chuyển gen, một trong những yếu tố quan trọng nhất để chuyển gen thành công là phải có hệ thống tái

sinh in vitro hiệu quả Hệ thống tái sinh qua phôi soma ở cây m a được ứng

dụng nhiều nhất trong công nghệ chuyển gen Phôi soma ở thực vật nói chung được chứng minh tạo ra số lượng lớn trong một thời gian ngắn và có khả n ng tái sinh tạo đa chồi cao trong các điều kiện chuyển gen khác nhau làm t ng xác suất nhận được thể mang gen chuyển nên được sử dụng nhiều trong các quy

trình chuyển gen thực vật (Đ Xuân Đồng et al., 2012)

Về cơ bản, đặc t nh sinh lý mô cấy càng giống tế bào phôi thì khả n ng tái sinh

thành công càng cao vì vậy mô non là mô cấy triển vọng nhất (Lê Trần Bình et al.,

1997) Thật vậy, với công trình nghiên cứu đầu tiên về m a cũng cho thấy, sử dụng cuộn lá non thì khả n ng tạo phôi và tái sinh sẽ cao hơn so với sử dụng phiến lá để nuôi cấy uộn lá non được đặt trên môi trường MS cơ bản, có bổ sung 0,5 – 3 mg/L 2,4 Phôi soma được hình thành khi mô sẹo đặt trên môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4 – với nồng độ thấp hơn giai đoạn hình thành mô sẹo từ mẫu cấy ban đầu (0,25 – 0,5 mg/L Mô sẹo phôi hóa (phôi soma hình thành do sự phân hóa của các tế bào gân lá và th t lá Trong quá trình nuôi cấy, đã có ba loại mô sẹo khác nhau được hình thành: (i): mô sẹo không tạo phôi soma nhầy, ẩm ướt và có màu nâu đặc trưng, (ii): mô sẹo rắn, chắc, có màu nâu nhạt không có phôi, (iii): mô sẹo xốp, có màu vàng sáng, có các dạng phôi soma chứa các dạng cấu trúc hình cầu màu trắng hoặc màu kem hỉ có dạng mô sẹo thứ ba sẽ phát triển tạo phôi soma và tái sinh chồi (Ho,

Vasil, 1983; Desai et al., 2004) Như vậy, hầu hết các công trình nghiên cứu tái sinh

cây m a thông qua phôi soma được tiến hành theo các bước thể hiện ở sơ đồ hình 1 4

Hình 1.4: Quá trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây mía

Mẫu cấy ban đầu có thể là từ phân đoạn hoa non, cụm hoa non hoặc cuộn

lá non Các nguyên liệu này được đặt trên môi trường có bổ sung 2,4-D hoặc

T Z để tạo mô sẹo Hạt m a non đã được sử dụng làm nguyên liệu để tạo mô sẹo Nghiên cứu này đã dùng đồng thời ba chất thuộc nhóm auxin là 2,4-D (4,5-

45 µM), TDZ (2,3–45 µM) và picloram (4,1–41,3 µM để khảo sát khả n ng tạo

mô sẹo Trong đó, môi trường sử dụng 2,4–D và Picloram cho thấy sự nảy mầm muộn của hạt Môi trường có bổ sung 45 µM TDZ cho khả n ng nảy mầm hạt tốt nhất Tuy nhiên, môi trường có 2,4–D và Picloram cho thấy sự xuất hiện mô sẹo, môi trường có TDZ không tạo mô sẹo Để tái sinh chồi, mô sẹo được cấy chuyển trên môi trường tái sinh MS cơ bản Tất cả các chồi đều khỏe mạnh và được ra r

trên môi trường có bổ sung 24,6 µM IBA (Chengalrayan et al., 2005)

Basnayake và đtg (2011 đã sử dụng cuộn lá non của 16 giống mía tạo mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 3 mg/L 2,4– , 10% nước dừa trong điều kiện tối (28oC), sau 6 tuần mô sẹo phát triển, cấy chuyển lên môi trường tạo phôi có bổ sung 2,4-D nồng độ thấp hơn để tạo phôi soma, sau đó phôi soma được cấy

Mẫu cấy thực vật (Từ cây mía khỏe mạnh 4-6 tháng tuổi )

Tạo mô sẹo trên môi trường bổ sung auxin

Trong điều kiện tối

Tạo phôi soma trên môi trường bổ sung auxin nồng độ thấp

Trong điều kiện tối

Tái sinh cây Môi trường bổ sung các chất thuộc nhóm cytokinin, điều kiện sáng

Ra r (bổ sung auxin) Trong điều kiện sáng

chuyển lên môi trường tái sinh MS không bổ sung chất k ch th ch sinh trưởng

Thời gian của một chu kì nuôi cấy kéo dài từ 11–15 tuần (Basnayake et al., 2011)

Gần đây, Kaur và Sandhu (2015 đã nghiên cứu về quá trình tái sinh thông qua phôi soma ở mía với hiệu quả tái sinh rất cao Cuộn lá non của giống mía oJ64, oJ83 và oJ86 được đặt trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D (4,0 mg/L và kinetin (0,5 mg/L trong điều kiện tối hoàn toàn Sau 6 tuần, mô sẹo được tạo thành Mô sẹo được nhận thấy có màu trắng, kem, xốp được hình thành

Mô sẹo chuyển sang môi trường tạo phôi soma MS có bổ sung 2,4 – D nồng độ thấp hơn (2,0 mg/L , kinetin (0,5 mg/L , mantose 3%, proline (560 mg/L , than hoạt tính (2,0 g/L), ABA (2,0 mg/L), cefotaxime (250 ppm) Sau 4 tuần, phôi

ch n được chuyển lên môi trường tái sinh MS có bổ sung các chất thuộc nhóm cytokinin BAP (0,5 mg/L) và kinetin (0,5 mg/L) Thời gian tái sinh chồi trong khoảng 6 tuần Các chồi khỏe mạnh được chuyển sang môi trường ra r MS có

bổ sung NAA (5,0 mg/L) và sucrose nồng độ cao (70 g/L) (Kaur, Kapoor, 2016)

Phôi soma đã được dùng để làm thể nhận gen trong nhiều thí nghiệm chuyển

gen (Snyman et al., 2006; Christy et al., 2009; Van Der Vyver, 2010; Zhu et al., 2011; Taparia et al., 2012) Vật liệu ban đầu có thể là cuộn lá non, cụm hoa non… đặt

lên môi trường 2,4– tạo mô sẹo huyển mô sẹo lên môi trường có bổ sung 2,4–D với nồng độ thấp hơn để tạo phôi soma, phôi soma đã được sử dụng là nguyên liệu

chuyển gen thông qua súng bắn gen hoặc A tumefaciens

Bảng 1.4: Một số công trình nghiên cứu tái sinh in vitro ở cây mía (2001 – 2015)

CoS96268 Bản mỏng cuộn lá

Co J 64, Co J 83, Co

CoJ64, CoJ83 &

16 giống mía

Australia

Bản mỏng cuộn lá non

Tái sinh qua phôi

non

Tái sinh qua phôi soma và tái sinh trực tiếp cuộn lá non

Tái sinh qua phôi

o86032, o09014,

o 671, o94012

và o86056

( o 62175, o

6304, o 8021, o

86032, và o 6907

Chồi nách Tái sinh trực tiếp Mayavan et al., 2015

Ở nước ta, các nghiên cứu về cây m a mới chỉ tập trung vào việc nhân giống

in vitro để nhân nhanh, duy trì t nh trạng tốt, sạch bệnh nhằm tạo ra số lượng lớn

m a m a giống đáp ứng yêu cầu của các nhà trồng trọt (Nguy n Th Nhẫn, 2006 Một số t nghiên cứu bước đầu về kỹ thuật nuôi cấy mô, tái sinh và chuyển gen chỉ

th gus, gen cry1Ab vào một số giống m a để t ng khả n ng kháng côn trùng cánh vảy (Lưu Th ư et al., 2009; Phan Tường Lộc et al., 2012; Phan Tường Lộc et al.,

2014) Vì vậy, kết quả chọn tạo giống m a mới biến đổi gen còn rất khiêm tốn, đặc biệt là chuyển gen kháng sâu vào m a

1.2.2 c nghi n cứu tạo cây mía chuyển gen

1.2.2.1 Các tính trạng đ h trong tạo cây mía chuy n gen

Những công trình nghiên cứu chuyển gen ở m a đầu tiên được xây dựng với nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp dùng súng bắn gen (Bower and

Birch, 1992), phương pháp xung điện (Arencibia et al., 1997) và chuyển gen nhờ

A tumefaciens (Arencibia et al., 1998) đã được nghiên cứu thành công Những

nghiên cứu đầu tiên về cây m a chuyển gen đã sử dụng phương pháp chuyển gen trực tiếp (dùng súng bắn gen và xung điện Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là phải xử l mô/tế bào trước khi thao tác dẫn tới tỉ lệ tái sinh sau chuyển gen thấp Hơn nữa, khả n ng chèn vào bộ gen thấp nên gen chuyển thường có nhiều bản sao và khả n ng di truyền cho thế hệ tiếp theo thấp Phương

pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens dựa trên một cơ chế tự nhiên, gen

chuyển được đ nh hướng gắn vào bộ gen, thao tác đơn giản đang được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật, trong đó có cây m a

Bảng 1.5: ột số ết quả tạo cây mía chuyển gen (1992 – 2015)

phosphotransferase hpt Agrobacterium Arencibia et al., 1998

reen fluorescent protein gfp Agrobacterium Elliott et al., 1998

Phosphinothricin acetyl

Manickavasagam et al.,

2004 Phosphomannose isomerase manA Súng bắn gen Jain et al., 2007

Luciferase,amino-

glycoside phosphotransferase 2 luc, aphA2 Agrobacterium Zilberman et al., 2012

Neopmycin phosphotransferase npt-II Súng bắn gen Taparia et al., 2012

Neopmycin phosphotransferase npt-II Súng bắn gen Kim et al., 2012

Phosphinothricin acetyl

transferase, β-Glucuronidase bar, gus A Agrobacterium Mayavan et al., 2015

Luciferase luc Súng bắn gen Basnayake et al., 2011

Chuyển gen h ng thuốc diệt c

Bialophos bar Súng bắn gen Gallo-Meagher, Irvine,

1996 Phosphinothricine bar Agrobacterium Enríquez-Obregón et al.,

1998 Glufosinate ammonium pat Súng bắn gen Leibbrandt, Snyman, 2003 Phosphinothricin acetyl Bar Agrobacterium Mayavan et al., 2013

transferase, B-Glucuronidase

Chuyển gen kháng bệnh

Bệnh khảm lá (SrMV) SrMV-CP Súng bắn gen Ingelbrecht et al., 1999

Bệnh vàng lá SCYLV-CP Súng bắn gen Gilbert et al., 2005

ORF 1 Súng bắn gen McQualter et al., 2004

Bệnh khảm lá (SrMV) cp4-epsps Agrobacterium Guo et al., 2015

Chuyển gen kháng côn trùng

Sâu đục thân cry1A Súng bắn gen Arencibia et al., 1999

Sâu đục thân cry1Ab Súng bắn gen Braga et al., 2003

Sâu đục thân cry1Ab Súng bắn gen Arvinth et al., 2010

Sâu đục thân cry1Aa3 Agrobacterium Kalunke et al., 2009

Sâu đục thân bốn vạch cry1Ac Súng bắn gen Weng et al., 2011

Sâu đục thân mình trắng Aprotinin Súng bắn gen Christy et al., 2009

Rệp bông gna Agrobacterium Zhangsun et al., 2007

Chuyển gen tạo các sản phẩm thay thế

Tạo Polyphenol oxidase ppo Súng bắn gen Vickers et al., 2005

Tạo Polyhydroxybutyrate

phaA, phaB, phaC

Súng bắn gen Brumbley et al., 2007

Tạo p-Hydroxybenzoic acid hch1 and

cp1 Súng bắn gen McQualter et al., 2004

Tạo Mannose manA Súng bắn gen Jain et al., 2007

Tạo Isomaltulose SI Súng bắn gen Wu, Birch, 2007

Tạo Proline P5CS Súng bắn gen Molinari et al., 2007

Chuyển gen h ng c c điều kiện stress phi

lạnh) ipt Súng bắn gen Belintani et al., 2012

Glyoxalase II (kháng mặn) Osgly II Súng bắn gen Rani et al., 2012

Từ sự thành công của các công trình chuyển gen đầu tiên, về sau có rất nhiều công trình chuyển gen vào m a theo các hướng tạo ra t nh trạng khác nhau (Bảng

1 5 ác công trình nghiên cứu trên hầu hết đều sử dụng vật liệu thực vật (thể nhận gen) là phôi soma Vì vậy, phôi soma có thể là vật liệu thực vật hữu hiệu nhất, có thể tái sinh tốt khi sử dụng các phương pháp chuyển gen khác nhau

ác gen đ ch được chuyển vào cây m a được sử dụng: nptII, gus, luc, ar… đã có nhiều tác giả nghiên cứu thành công (Bower, Birch, 1992; Arencibia et al., 1998; Elliott

et al., 1998; Manickavasagam et al., 2004; Jain et al., 2007; Basnayake et al., 2011; Kim

et al., 2012; Taparia et al., 2012; Mayavan et al., 2015) với hiệu suất chuyển gen cao Trong đó rencibia và đtg (1998 đã thực hiện quá trình chuyển gen thông qua A tumefaciens, kết quả tạo ra được các dòng chuyển gen với một bản sao duy nhất

Một số công trình đã chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây mía

(Gallo-Meaghe, Irvin, 1996, Enriquez-Obregon et al., 1998, Leibbrandt et al., 2006) Ngoài

ra, một số đặc tính kháng bệnh đặc trưng ở cây m a như bệnh gỉ sắt, bệnh vàng lá,

bệnh khảm lá… đã được chuyển vào mía (Ingelbrecht et al., 1999; McQualter et al., 2004; Gilbert et al., 2005) (Bảng 1.5) Gần đây, uo và đtg (2015 đã thực hiện chuyển gen kháng bệnh khảm lá vào mô sẹo của giống mía ROC22 thông qua A tumefaciens chủng EHA105 mang vector nh thể pGII00-HACP chứa gen cp4-epsps

dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S

Nhiều công trình nghiên cứu phát triển giống mía chuyển gen có tính kháng với các stress phi sinh học để thích nghi với sự biến đổi khí hậu hiện nay Các công trình nghiên cứu chuyển gen quy đ nh tính kháng mặn, kháng lạnh, kháng nóng vào

các giống mía khác nhau (Belintani et al., 2012; Rani et al., 2012; Kumar et al., 2014; Augustine et al., 2015) ugustien và đtg (2015 đã chuyển gen P H45 dưới

sự điều khiển của promoter Port Ubi 2.3 bằng phương pháp súng bắn gen Các cây chuyển gen được sử dụng để thử khả n ng kháng hạn, kết quả cho thấy các tế bào của cây chuyển gen chống ch u tốt hơn so với cây không chuyển gen trong điều kiện hạn, 70% tế bào tổn thương do hạn sẽ hồi phục lại màng sinh chất sau khi được tưới nước, trong khi số tế bào tổn thương ở cây không chuyển gen là 95,5% và không thấy hiện tượng hồi phục sau khi được tưới nước

Với sự phát triển không ngừng của công nghệ chuyển gen, cây mía là một

“nhà máy sinh học” bằng cách chuyển gen vào cây m a để sản xuất ra các sản phẩm

mới như protein có dược tính (Molinari et al., 2007; Wu, Birch, 2007), polyme sinh học (McQualter et al., 2004; Vickers et al., 2005; Brumbley et al., 2007; Tilbrook et al., 2011) và nguồn thực phẩm thay thế đường (O'Neill, 2011; Basnayake et al., 2012; Bauer et al., 2012; Paterson et al., 2013)

ây m a được biết là vật chủ của rất nhiều loại côn trùng gây hại vì vậy

hướng nghiên cứu chuyển gen tạo cây m a có t nh kháng côn trùng đang là hướng rất quan trọng Đã có khá nhiều công trình nghiên cứu tạo giống mía kháng côn

trùng, đối tượng ch nh là sâu đục thân và rệp bông (Arencibia et al., 1998; Arencibia et al., 1999; Braga et al., 2003; Zhangsun et al., 2007; Christy et al., 2009; Kalunke et al., 2009; Arvinth et al., 2010; Weng et al., 2011) Trong đó, Kalunke và đtg (2009 đã sử dụng tumefaciens chủng EHA105 mang vector chuyển gen thực vật pBinAR chứa gen cry1Aa3 được điều khiển bởi CaMV35S promoter, gen nptII là marker chọn lọc dưới sự kiểm soát của promoter NOSP, các cây có khả

n ng có gen cry1Aa3 được kiểm tra bằng kĩ thuật PCR Các cây chuyển gen T0

được kiểm tra sự có mặt của gen đ ch bằng P R và Southern blot Ở Việt Nam,

Phan Tường Lộc và đtg (2012, 2014 đã chuyển thành công gen cry1Ab và cry1Ab (gen lai) vào hai giống mía ở Việt Nam VN 844137 và Suphanbury 7 tạo

cry1B-được các dòng mía chuyển gen kháng côn trùng bộ cánh vảy

Ngoài phương pháp chuyển gen in vitro, Mayavan và đtg (2015 đã sử dụng

A tumefaciens chủng 58 1 và L1 mang cấu trúc gen p MB 1301–bar-hpt,

được điều khiển bởi promoter MV35S vào đoạn m a chứa chồi nách của 5 giống

m a o 62175, o 6304, o 8021, o 86032, và o 6907 trong điều kiện ex vitro

Để giảm thiểu hiện tượng tạo biến d soma thường phát sinh trong nuôi cấy in vitro,

nhóm nghiên cứu đã thực hiện việc tái sinh chồi nách chuyển gen trong nước cất khử trùng có bổ sung kháng sinh chọn lọc và cefotaxime diệt khuẩn trong điều kiện ngoài ống nghiệm Sau 52 ngày được chọn lọc bằng kháng sinh bằng hai hình thức tưới và phun Basta nồng độ khác nhau, cây m a sống sót được kiểm tra bằng phương pháp Southern blot, kết quả cho thấy giống m a o 6907 đạt hiệu quả

chuyển gen cao (Mayavan et al., 2015)

1.2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuy n gen ở mía

Quá trình chuyển gen hiệu quả cần sự kết hợp của nhiều yếu tố, ngoài việc phải xây dựng được quy trình tái sinh hiệu quả, còn có rất nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen

Hệ thống vector chuyển gen và hệ thống chọn lọc cây chuyển gen

Trong hệ thống vector chuyển gen, có thể sử dụng nhiều promoter khác nhau

để điều khiển sự hoạt động của gen đ ch và gen chỉ th Một số công trình sử dụng

promoter Maize – Ubi1 (Weng et al., 2006; Deng et al., 2008; Christy et al., 2009; Arvinth et al., 2010; Weng et al., 2011) Một số công trình khác sử dụng promoter CaMV35S (Arencibia et al., 1998; Kalunke et al., 2009; Rani et al., 2012; Mayavan

et al., 2013; Lian et al., 2014; Mayavan et al., 2015) Tùy vào marker chọn lọc của

hệ thống vector chuyển gen thực vật, có thể là hpt, bar, nptII mà sử dụng các kháng

sinh chọn lọc khác nhau như hygromycin, basta, kanamycin với nồng độ phù hợp Trên thực tế, mía là cây một lá mầm, có tính kháng tự nhiên với kanamycin nên các

công trình chuyển gen m a chủ yếu sử dụng hygromycin nồng độ 50 mg/L (Christy

et al., 2009; Joyce et al., 2010) và basta lúc nuôi cấy chọn lọc là 2 mg/L, lúc phun chọn lọc cây chuyển gen, nồng độ kháng sinh chọn lọc cao hơn 2 g/L (Mayavan et al., 2013; Mayavan et al., 2015) để chọn lọc cây m a chuyển gen

Phương pháp cải biến nguồn gen chuyển vào thực v t

Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen chuyển

là tỷ lệ - và thành phần codon gen chuyển (Estruch et al., 1997; Zhang et al., 1997)

Một số nghiên cứu cho thấy, vùng giàu - có t nh linh hoạt cao, có khả n ng phiên

mã tốt do có khả n ng mở cấu trúc chromatin nhi m sắc thể ở thực vật và động vật Trong khi đó, vùng giàu –T làm ngưng tụ nhi m sắc thể, cản trở quá trình phiên mã (Herbert, Rich, 1999; Vinogradov, 2003) Phân t ch trình tự bộ gen cho thấy, m i sinh

vật có tỷ lệ vùng giàu G- khác nhau, chẳng hạn thành phần - ở vi khuẩn Bt chiếm

khoảng 37%, trong khi đó ở m a lên đến 55% (www.kazusa.or.jp/codon/) Thực

nghiệm đã chứng minh rằng, việc t ng tỷ lệ -C lên 37,4 – 47,5% trong gen m -cry1Ac

đã làm t ng sự biểu hiện protein trong các cây m a chuyển gen 2 – 3 lần Kiểm tra hoạt

t nh sinh học ngoài nhà lưới cho thấy, cây m a mang gen chuyển m -cry1Ac có khả

n ng biểu hiện tốt hơn so với cây mang gen chuyển ban đầu s -cry1Ac – có thành phần G- thấp hơn (Weng et al., 2006) Weng và đtg (2011 đã cải biến gen cry1Ac bằng

cách t ng tỷ lệ - từ 37,4 – 54,8%, tỷ lệ - ở v tr thứ ba của codon t ng từ

23,1 đến 64,5%, trong đó tỷ lệ codon giống với codon trên cây m a chiếm 66%, kết quả thực nghiệm bio – test cho thấy, cây m a chuyển gen t ng cường - trong cấu trúc cho nồng độ protein biểu hiện t ng từ 2,2 – 50 ng/mL protein tổng số hòa tan so với cây chuyển gen bình thường Tiếp đó, nhóm nghiên cứu khác đã chuyển ba gen

vào mía cry1Aa, cry1Ab và cry1Ac kháng côn trùng thuộc nhóm Chilo infuscatellus

Sự biểu hiện của gen cry1Ab tương đối cao của protein hòa tan trong lá, kết quả đó được quyết đ nh bởi quá trình thiết kế gen, tỷ lệ -C cao 48,5% (Arvinth et al.,

2010) Như vậy, để có được dòng thực vật biểu hiện protein đ ch tốt thì cần hai yếu tố: thành phần - trong gen cao và mức độ tương th ch codon của gen chuyển phù hợp với codon thực vật đ ch

1.3 C BACILLUS THURINGIENSIS (BT IỆT TR

Do đặc tính sinh protein độc tố có khả n ng diệt côn trùng hại cây trồng của

vi khuẩn Bt nên Bt được sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học và là vi sinh vật được

ứng dụng nhiều nhất trong việc chọn tạo các giống cây trồng biến đổi gen kháng lại sâu hại (Sansinenea, 2012) Hiện nay, các cây trồng chuyển gen kháng côn trùng

đều sử dụng nguồn gen chủ yếu từ vi khuẩn này (James, 2014)

1.3.1 guồn gen h ng c n trùng của Bt

Bt có khả n ng sinh ra 3 loại protein độc tố diệt côn trùng chính là Cry

(Crystal -endotoxin), Cyt (Cytolysin), Vip (Vegetative Insecticidal Protein) và một

số độc tố khác như hemolysin, enterotoxin, chitinase, phospholipase Các protein độc tố này gây độc hệ tiêu hóa của côn trùng mẫn cảm và thường được sử dụng để khống chế các côn trùng Bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Bộ Hai cánh (Diptera), Bộ

Cánh cứng (Coleoptera), Bộ Cánh màng (Hymenoptera), tuyến trùng, ve bét Trong

đó, gen cry mã hóa protein tinh thể độc tố có hoạt tính diệt côn trùng của Bt được sử

dụng phổ biến nhất để chuyển và biểu hiện ở rất nhiều cây trồng quan trọng (World Health Organization, 1999)

Theo báo cáo cập nhật tháng 11 n m 2016, đã xác đ nh được hơn 700 gen mã hoá cho tổng hợp protein Cry và 130 gen mã hoá tổng hợp protein Vip được đọc trình

tự và phân loại dựa trên sự tương đồng về trình tự sắp xếp các axit amin Bt có 74 gen

mã hoá nhóm protein ry ( ry1-Cry74), 03 gen mã hoá nhóm protein yt (