Nghiên cứu phát triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI LUẬN ÁN TIẾN SĨ S

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ XUÂN TẠO

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ

ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN

MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ XUÂN TẠO

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC VECTOR NHỊ THỂ

ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS Trần Văn Tuấn và PGS.TS Nguyễn Quang Huy Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí Khoa học, phần còn lại chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019

Tác giả luận án

Vũ Xuân Tạo

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành

và sâu sắc tới TS Trần Văn Tuấn, Trưởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh

học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN là người thầy cho tôi cơ hội được thực hiện luận án, tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Trưởng Khoa

Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người thầy đã tận tình truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh

học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, đặc biệt là PGS.TS Bùi Thị Việt Hà và TS Phạm Thế Hải đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức

mới và luôn luôn tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành được khóa học này Tôi

cũng xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, Giám đốc Phòng thí nghiệm

Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein và tập thể cán bộ Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành các nghiên cứu

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự hỗ trợ từ đề tài NAFOSTED (mã số: 106-NN.04-2014.75 và 106.04-2018.36) Tôi luôn trân trọng sự hỗ trợ này

Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học và Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường

Cuối cùng tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người thân - những người luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2019

Tác giả luận án

Vũ Xuân Tạo

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum VÀ Penicillium digitatum……… 4

1.1.1 Sơ lược về chi nấm Aspergillus 4

1.1.2 Nấm Aspergillus niger 5

1.1.3 Sơ lược về chi nấm Penicillium 7

1.1.4 Nấm Penicillium chrysogenum 9

1.1.5 Nấm Penicillium digitatum 12

1.2 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN A tumefaciens (ATMT) 15

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn A tumefaciens 16

1.2.2 Cơ chế chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens 17

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens 19

1.2.4 Vector dùng trong chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens 20

1.2.5 Marker chọn lọc cho chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 23

1.2.6 Promoter điều hòa biểu hiện gen ở nấm sợi 25

1.2.7 Gen chỉ thị DsRed và GFP dùng trong chuyển gen ở nấm sợi 26

1.2.8 Ưu điểm của phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 28

1.2.9 Sử dụng phương pháp ATMT trong nghiên cứu chuyển gen ở nấm sợi 29

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI 32

1.3.1 Protein LaeA và tương tác trong phức hệ protein velvet ở nấm sợi 32

1.3.2 Nghiên cứu về vai trò của gen laeA ở nấm sợi 33

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 VẬT LIỆU 36

2.1.1 Chủng vi sinh vật 36

2.1.2 Các vector sử dụng trong nghiên cứu 37

2.1.3 Thiết bị và hóa chất 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.2.1 Thu bào tử và hệ sợi nấm 39

2.2.2 Đánh giá khả năng mẫn cảm kháng sinh 40

2.2.3 Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA 40

2.2.4 Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen 41

2.2.5 Tối ưu quy trình chuyển gen ở nấm A niger, P digitatum và P chrysogenum thông qua vi khuẩn A tumefaciens 49

2.2.6 Xóa và phục hồi gen laeA ở các nấm sợi nghiên cứu 50

2.2.7 Sàng lọc và xác nhận các thể chuyển gen 51

2.2.8 Điều tra vai trò của gen laeA ở các loài nấm sợi nghiên cứu 52

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 55

3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng phương pháp ATMT và marker là gen kháng kháng sinh 55

3.1.2 Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu quả cao ở nấm P chrysogenum và P digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh 57

3.2 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ DƯỠNG pyrG Ở A niger VÀ P chrysogenum 68

3.2.1 Tạo thành công chủng A niger N402 và P chrysogenum VTCC-F1172 đột biến khuyết dưỡng uridine/uracil 68

3.2.2 Xây dựng quy trình chuyển gen tối ưu vào A niger và P chrysogenum khuyết dưỡng uridine/uracil 74

3.3 NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A niger, P chrysogenum VÀ P digitatum 80

3.3.1 Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở A niger 80

3.3.2 Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P chrysogenum 94

3.3.3 Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P digitatum 106

KẾT LUẬN 117

KIẾN NGHỊ 119

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 120

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A nidulans Aspergillus nidulans

A niger Aspergillus niger

A oryzae Aspergillus oryzae

A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation

(Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens)

(ADN bổ trợ)

(Protein huỳnh quang đỏ)

E coli Escherichia coli

(Cục Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ)

(Protein huỳnh quang xanh) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid

(Mất biểu hiện aflR)

Left Border (biên trái)

P chrysogenum Penicillium chrysogenum

P digitatum Penicillium digitatum

(Phản ứng chuỗi polymerase)

S aureus Staphylococcus aureus

(Môi trường tổng hợp)

vir Virulence gene (gen gây bệnh /gen độc lực)

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Danh sách các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 36

Bảng 3.1 Kết quả xác định số bản sao của gen laeA ở các chủng A niger

biểu hiện quá mức gen laeA

92

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.3 Hình thái một số nấm mốc thuộc chi Penicillium 8

Hình 1.4 Hình thái khuẩn lạc P chrysogenum trên các môi trường 10

Hình 1.6 Hình thái vi khuẩn A tumefaciens dưới kính hiển vi điện tử 17

Hình 1.7 Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 18 Hình 1.8 Mốc thời gian quan trọng về nghiên cứu phát triển vector từ năm

1970 đến nay

21

Hình 1.10 Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể 23

Hình 1.13 Các protein velvet hình thành các phức hệ phân tử và ảnh hưởng

của chúng đến sự phát triển và sản sinh các chất trao đổi bậc hai ở nấm

33

Hình 3.1 Chuyển gen vào A niger thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử

dụng marker là gen kháng hygromycin

56

Hình 3.2 Sơ đồ và kiểm tra vector pPK2-Red, pGreen3 và pPK2-Red2 bằng

cắt với enzym giới hạn

58

Hình 3.3 Quy trình chuyển gen tối ưu vào nấm P chrysogenum và P

digitatum

60

Hình 3.4 Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed và GFP ở P digitatum PdVN1 63

Hình 3.5 Xác nhận biểu hiện gen GFP ở P chrysogenum VTCC-F1172 64

Hình 3.6 Biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed sử dụng marker là gen

kháng phleomycin ở P digitatum PdVN1 và P chrysogenum VTCC-F1172

65

Hình 3.7 Sự xâm nhiễm của nấm P digitatum PdVN1 mang gen DsRed và

GFP trên cam dưới kính hiển vi huỳnh quang

67

Hình 3.8 Cấu trúc xóa gen pyrG ở A niger và P chrysogenum 69

Hình 3.9 Xác nhận các chủng xóa gen pyrG ở A niger N402 71 Hình 3.10 Khả năng khuyết dưỡng uridine/uracil và kháng 5-FOA của các

chủng P chrysogenum chuyển gen xóa pyrG

73

Hình 3.11 Cấu trúc và cắt kiểm tra vector pEX2A bằng enzym giới hạn 75

Hình 3.12 Quy trình chuyển gen hiệu quả cao cho nấm A niger và P

chrysogenum khuyết dưỡng uridine/uracil

78

Hình 3.13 Biểu hiện gen huỳnh quang đỏ DsRed ở chủng A niger khuyết

dưỡng uridine/uracil

79

Hình 3.14 Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen laeA ở A niger 81

Hình 3.16 Cắt kiểm tra vector phục hồi gen laeA ở A niger 85

Hình 3.18 Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở A niger 87

Hình 3.19 Sự sinh trưởng của các chủng A niger trên các nguồn cacbon 88

Hình 3.20 Sự hình thành bào tử của các chủng A niger trên các nguồn

cacbon

89

Hình 3.21 Sự sinh trưởng và hình thành bào tử của các chủng A niger trên

nguồn nitơ là nitrat và amon

Hình 3.26 Xác nhận chủng xóa gen laeA bằng PCR 96

Hình 3.27 Xác nhận phục hồi gen laeA ở nấm P chrysogenum 98

Hình 3.28 Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở nấm P chrysogenum

khuyết dưỡng uridine/uracil

99

Hình 3.29 Sự hình thành bào tử của các chủng P chrysogenum trên nguồn

nitơ là nitrat và amon

101

Hình 3.30 Khả năng chịu stress của các chủng P chrysogenum trên nguồn

nitơ là nitrat và amon

103

Hình 3.31 Sự sinh trưởng và sinh kháng sinh kháng khuẩn của các chủng P

chrysogenum trên nguồn nitơ là nitrat và amon

104

Hình 3.32 Khả năng sinh kháng sinh kháng khuẩn của các chủng P

chrysogenum biểu hiện quá mức gen laeA

106

Hình 3.33 Sơ đồ tạo vector xóa gen laeA ở nấm sợi P digitatum 107

Hình 3.34 Sơ đồ tạo vector phục hồi gen laeA ở nấm sợi P digitatum 108

Hình 3.35 Xác nhận xóa và phục hồi gen laeA ở P digitatum 110

Hình 3.36 Xác nhận biểu hiện quá mức gen laeA ở P digitatum 111

Hình 3.37 Sự sinh trưởng của các chủng P digitatum trên các nguồn cacbon 112

Hình 3.38 Sự hình thành bào tử của các chủng P digitatum dưới sự tác động

của D-sorbitol

113

Hình 3.39 pH dịch nuôi cấy các chủng nấm P digitatum 114

Hình 3.40 Khả năng gây hỏng cam của các chủng nấm P digitatum 115

Hình 3.41 Khả năng gây hỏng cam của chủng biểu hiện quá mức gen laeA 116

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Nấm sợi là những loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho con người như enzym, protein, chất có hoạt tính sinh học, nhưng chúng cũng gây ra những thiệt hại khôn lường như tàn phá cây trồng, gây hỏng thực phẩm, sinh độc tố, gây bệnh cho người và động vật Các nghiên cứu trên thế giới về nấm sợi đã bước qua nhiều giai đoạn khác nhau từ những điều tra cơ bản sử dụng các phương pháp truyền thống cho đến các nghiên cứu hiện đại ở mức độ gen và protein Nhiều loài nấm có lợi

được xếp vào diện an toàn đã được giải trình tự hệ gen hoàn toàn như Aspergillus

niger và Penicillium chrysogenum Bên cạnh đó, hệ gen của nấm bệnh thực vật Penicillium digitatum cũng đã được giải trình và phân tích Dữ liệu chi tiết về hệ

gen của nấm sẽ giúp chúng ta có một cái nhìn tổng quát về các gen chịu trách nhiệm cho sinh tổng hợp các chất, cũng như các gen giữ những vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm của nấm bệnh thực vật

A niger là một trong những loài phổ biến và quan trọng nhất về mặt công

nghiệp thuộc chi Aspergillus Loài nấm này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất

nhiều loại enzym và axit hữu cơ Gần 99% lượng axit citric được sản xuất trên thế

giới là nhờ A niger Trong số những loài nấm được ứng dụng nhiều trong sản xuất công nghiệp, P chrysogenum nổi tiếng với khả năng sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh đầu tiên thuộc họ β-lactam được phát hiện bởi Alexander Fleming Nhiều chủng P chrysogenum tự nhiên đã được gây đột biến thành công để

tạo ra các chủng công nghiệp có hiệu suất sinh tổng hợp penicillin rất cao Tuy nhiên, năng lực sinh tổng hợp các chất có lợi của các chủng phân lập từ tự nhiên thường tương đối thấp Để nâng cấp năng lực cho các chủng tự nhiên, các kỹ thuật

về cải biến chỉnh sửa hệ gen thường được áp dụng

Bên cạnh những loài nấm mang lại nhiều lợi ích thiết thực, cũng có nhiều loài

gây hại đặc biệt nghiêm trọng đối với sản xuất nông nghiệp Nấm P digitatum là tác

nhân gây hỏng nhiều loại quả có múi ở giai đoạn sau thu hoạch Loài nấm này tồn

tại phổ biến ở các nước nhiệt đới, trong đó có Việt Nam Bên cạnh việc tấn công làm hỏng quả, gây tổn thất về kinh tế, các sản phẩm trao đổi chất bậc hai do nấm sinh ra có thể gây nên những ảnh hưởng tiêu cực đối với sức khỏe người tiêu dùng Nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò của các gen liên quan đến gây bệnh ở vi nấm có thể góp phần tạo dựng nền tảng phục vụ phát triển các giải pháp hiệu quả nhằm kiểm soát các vi nấm gây hại

Để cải biến di truyền vi nấm, nhiều phương pháp chuyển gen đã được phát triển như chuyển gen qua tế bào trần, chuyển gen bằng xung điện và chuyển gen

trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phương pháp chuyển gen qua

tế bào trần và chuyển gen bằng xung điện có nhiều hạn chế như kỹ thuật thực hiện phức tạp, chi phí cao và không ổn định Trong khi đó, phương pháp chuyển gen nhờ

vi khuẩn A tumefaciens được chứng minh là hiệu quả và có tính ổn định cao

Nghiên cứu phát triển được các hệ thống chuyển gen mới với hiệu quả cao, chi phí thấp và có thể sử dụng chung cho nhiều loài nấm sợi là hết sức cần thiết Hệ thống

chuyển gen là sự kết hợp giữa phương pháp chuyển gen tối ưu nhờ vi khuẩn A

tumefaciens và các vector nhị thể mới được thiết lập sẽ hỗ trợ tích cực cho các

nghiên cứu về cải biến di truyền và điều tra vai trò của các gen quan trọng ở vi nấm

Từ những lý do trên, đề tài luận án được tiến hành với tiêu đề: “Nghiên cứu phát triển các vector nhị thể ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi”

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Tạo được các vector nhị thể mới và thiết lập được hệ thống chuyển gen tối

ưu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus

niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum

- Điều tra được vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp

dụng hệ thống chuyển gen tối ưu đã thiết lập

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tạo các vector nhị thể mang marker kháng kháng sinh, marker trợ dưỡng

phục vụ chuyển gen vào ba loài nấm sợi (A niger, P chrysogenum và P digitatum)

sử dụng vi khuẩn A tumefaciens

- Xây dựng hệ thống chuyển gen tối ưu dựa trên cơ chế kháng kháng sinh và

cơ chế trợ dưỡng

- Xóa, phục hồi, biểu hiện quá mức gen laeA và điều tra vai trò của gen laeA

ở cả ba loài nấm sợi

4 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Đây là công trình đầu tiên phát triển được các hệ thống chuyển gen tối ưu

nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với các vector nhị thể mới để phục vụ cho nghiên cứu cải biến di truyền ba loài nấm sợi quan trọng là Aspergillus niger,

Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum Đề tài luận án cũng đã chứng

minh hiệu quả của hệ thống vector nhị thể tạo được bằng cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu hiện gen, xóa gen ở ba loài nấm sợi khác nhau Kết quả nghiên cứu của đề

tài cũng cung cấp thêm các dữ liệu mới về vai trò của gen laeA trong điều hòa biệt

hóa tế bào và trao đổi chất ở các loài nấm sợi nghiên cứu

5 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

* Đã tạo thành công 13 vector nhị thể mới dùng cho biểu hiện gen, xóa gen

và bổ trợ gen ở ba loài nấm sợi gồm A niger, P chrysogenum và P digitatum

* Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu quả cao sử dụng vi khuẩn

A tumefaciens ở ba loài nấm sợi nghiên cứu Lần đầu tiên, hệ thống chuyển gen

hoàn toàn mới dựa trên cơ chế trợ dưỡng uridine/uracil được thiết lập ở nấm sợi A

niger và P chrysogenum Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng

kháng sinh ở P chrysogenum và P digitatum được tối ưu và hiệu quả chuyển gen

đạt được cao hơn từ 10 đến 20 lần so với các nghiên cứu trước đây

* Xóa, phục hồi và biểu hiện quá mức thành công gen laeA ở ba loài nấm sợi

A niger, P chrysogenum và P digitatum nhờ sử dụng phương pháp chuyển gen

thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đặc biệt nghiên cứu này đã phát hiện ra các vai trò hoàn toàn mới của gen laeA liên quan tới biệt hóa hình thái tế bào nấm, trao đổi

chất và kiểm soát khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch

Chương 1

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum

VÀ Penicillium digitatum

1.1.1 Sơ lược về chi nấm Aspergillus

Chi Aspergillus là một trong những nhóm nấm mốc phổ biến và phân bố rộng rãi nhất trên hành tinh và đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp Năm

1729, nhà sinh học người Italia Pier Antonio Micheli đã quan sát cấu tạo cuống sinh bào tử của một số loài nấm và phát hiện chúng có chung đặc điểm hình thái giống

như “bình nước thánh” Từ đó, ông đặt tên chi nấm theo từ Latin spargere [20]

Hình 1.1 Một số đại diện thuộc chi nấm Aspergillus [171]

Về mặt hình thái, khuẩn lạc của các loài thuộc chi Aspergillus có màu sắc đa

dạng, khá đặc trưng (Hình 1.1) Hệ sợi nấm có vách ngăn, có thể dài tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển theo chiều dài từ đỉnh sợi và có thể phân nhánh liên tiếp tạo ra hệ sợi (mycelium) khí sinh xù xì như bông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, có thể quan sát nấm phát triển thành dạng khuẩn lạc đặc trưng Khuẩn lạc thường mang màu sắc của bào tử Việc tạo màu sắc cũng là

đặc điểm quan trọng để phân loại nấm mốc, có khi chỉ xuất hiện ở khuẩn lạc, có khi hòa tan vào trong nước và khuếch tán ra môi trường xung quanh [1]

Nấm Aspergillus sinh sản chủ yếu bằng phương thức hình thành bào tử vô tính Trong số 250 loài thuộc chi Aspergillus, khoảng 64% chưa phát hiện có giai

đoạn sinh sản hữu tính Các loài được biết có sinh sản hữu tính ít gây bệnh cho con người hơn những loài chỉ được phát hiện sinh sản nhờ bào tử vô tính [61]

Chi Aspergillus được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và công nghiệp Trong công nghệ sinh học, một số loài thuộc chi Aspergillus đã và đang được sử dụng: A niger, A oryzae trong sản xuất thực phẩm và enzym Tuy nhiên,

bên cạnh đó, các loài thuộc chi này cũng gây một số bệnh nhất định cho vật nuôi và động vật hoang dã Khả năng phát tán bào tử mạnh mẽ của một vài đại diện trong không khí, nước, hạt sấy khô và nguyên liệu thực vật khiến chúng thường xuyên có

cơ hội tiếp xúc với động vật Chúng có thể gây nhiễm trùng cũng như nhiễm độc

Một số độc tố đáng lưu ý ở Aspergillus là aflatoxin, axit cyclopiazonic, glyotoxin, patulin…[21] Trong chi Aspergillus, A niger là loài nấm được quan tâm nghiên

cứu nhiều nhất

1.1.2 Nấm Aspergillus niger

1.1.2.1 Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm A niger

Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến nhất trong khoảng 250

loài thuộc chi Aspergillus A niger được mô tả vào năm 1867 trong bản thảo

“physiologie des mucédinées” bởi nhà thực vật học người Pháp Philippe Edouard

Léon van Tieghem Ông phân lập loài nấm này với mục đích nghiên cứu việc sản xuất axit gallic từ quá trình lên men của nấm Khi đó, ông phân lập được

Penicillium glaucum và Aspergillus sp có bào tử tương tự Aspergillus glaucus

nhưng có màu đen trên các môi trường khác nhau, tạo ra mùi mốc và một số đặc

điểm khác Ông đã đặt tên nó là A niger [49]

A niger thuộc giới nấm, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ

Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus, nhóm Aspergillus phân nhóm

Nigri, còn gọi là phân nhóm Aspergillus đen Trong phân nhóm này còn có 14 loài

khác cũng có bào tử màu đen, rất dễ nhầm lẫn với A niger [87]

Khuẩn lạc của nấm A niger có màu trắng hoặc vàng, bị che khuất bởi màu

đen của bào tử sinh sản vô tính mọc trên bề mặt Hệ sợi nấm kéo dài, có vách ngăn

và trong suốt (Hình 1.2) Bào tử đính thường dài từ 900-1600 µm và chứa các bọng bào tử dài khoảng 40-60 µm [46]

Hình 1.2 Hình ảnh hiển vi của A niger [80, 136]

A niger có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ với giới hạn nhiệt rộng từ 6-47°C

Khoảng nhiệt độ từ 35 tới 37°C là khoảng mà loài nấm này phát triển mạnh mẽ

nhất Độ ẩm cần thiết cho A niger so với các loài khác cùng chi lại khá cao, đạt

0,88 Khoảng pH cho nấm phát triển rất rộng, trải dài từ 1,4 tới 9,8 Những đặc

điểm trên giúp cho A niger có khả năng sinh trưởng tốt ở nhiều điều kiện khác

nhau, tạo lượng lớn bào tử, phát tán dễ dàng trong không khí, có khả năng lây nhiễm và ức chế nhiều loài nấm khác, đặc biệt là khi ở trong môi trường nóng và

ẩm ướt A niger sinh sản chủ yếu bằng bào tử vô tính Chưa phát hiện thấy giai

đoạn hữu tính tồn tại ở nấm này [148]

A niger là một vi nấm mô hình quan trọng đối với một số lĩnh vực nghiên

cứu, bao gồm nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp protein, enzym, cơ chế phân tử

và các cơ chế liên quan tới việc kiểm soát đặc điểm hình thái nấm Kích thước hệ

gen của A niger được ước tính có kích thước khoảng 35,5-38,5 Mb, chia thành 8

nhiễm sắc thể/nhóm liên kết có kích thước khác nhau (từ 3,5-6,6 Mb) Hiện tại, có

ba dự án khác nhau đang độc lập nghiên cứu về hệ gen của A niger, thể hiện tầm quan trọng của vi nấm này Lượng dữ liệu phong phú từ nhiều trình tự gen của A

niger sẽ được đưa vào các chương trình nghiên cứu cơ bản và ứng dụng cho phát

triển quy trình lên men, hình thái và bệnh học [11] Hiện nay, hệ gen của ba chủng

A niger khác nhau đã được giải trình tự là NRRL 3, CBS 513.88 và ATCC 1015

Hai trong số các chủng được giải trình tự, NRRL 3 và ATCC 1015 là các chủng hoang dại, trong khi đó chủng CBS 513.88 là chủng đột biến để nâng cao khả năng sản xuất glucoamylase [192, 194]

1.1.2.2 Vai trò của nấm A niger

A niger đóng vai trò quan trọng không thể phủ nhận trong công nghiệp Sản

phẩm tiêu biểu của A niger là axit citric được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm

để tạo đồ uống có ga, nước hoa quả, mứt, kẹo và rượu Axit citric do A niger sản

xuất có lượng lớn nhiều hơn hẳn so với những axit hữu cơ khác, ví dụ như axit

gluconic [151] Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã xếp A

niger là một nguồn tạo axit citric tiềm năng [158] Ngoài ra, A niger có khả năng

sản xuất nhiều loại enzym quan trọng như pectinase cho sản xuất nước quả và rượu

để làm giảm độ bột và tăng sự thanh mát, glucose oxidase và catalase để phân giải các thành phần hư hại trong thực phẩm Một số nghiên cứu gần đây khẳng định khả

năng phân giải các cơ chất mạnh mẽ của A niger có thể được ứng dụng trong xử lý

môi trường, bao gồm việc tẩy khoáng cho nước với khả năng hấp thu tới 96,61% lượng ion thừa trong nước và phân giải phốt-pho trong đất trồng dạng đá rắn để làm

tăng năng suất cây trồng [5] Về phương diện nghiên cứu, A niger là sinh vật mô

hình có khả năng ứng dụng hiệu quả như một hệ thống biểu hiện protein ngoại lai

Cải biến di truyền nấm sợi, bắt đầu từ A nidulans và sau đó là A niger đã đạt nhiều

thành tựu, đặc biệt là trong việc biểu hiện phytase công nghiệp [5, 126]

1.1.3 Sơ lược về chi nấm Penicillium

Chi Penicillium thuộc họ Trichocomaceae là một trong những chi nấm rất

phổ biến, phân bố rộng rãi ở nhiều môi trường sống khác nhau trên Trái Đất Tên

Penicillium xuất phát từ những điểm tương đồng của cuống sinh bào tử nấm này với

cây chổi cọ - penicillus trong tiếng La tinh Cho đến nay, có khoảng 200 loài thuộc

chi Penicillium đã được mô tả, nhiều loài trong đó đóng vai trò quan trọng trong hệ

sinh thái cũng như trong cuộc sống của con người [196]

Khuẩn lạc của các loài nấm mốc thuộc chi Penicillium có dải màu sắc rất đa

dạng, có thể là màu trắng pha trộn với đỏ, cam hoặc vàng; tuy nhiên phần lớn là dạng khuẩn lạc có màu xanh lục, vàng lục, lục xám, xám và xanh dương (Hình 1.3) Sau khoảng thời gian nhất định, ở một số loài, khuẩn lạc có thể mất hoàn toàn màu

xanh và ngả sang màu sậm hơn như nâu vàng, nâu đỏ hay xám xanh [146]

Hình 1.3 Hình thái một số nấm mốc thuộc chi Penicillium

(A) P tulipae [84], (B) P sclerotigenum [83], (C) P solitum [85]

Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, gần như không màu, đôi khi quan sát thấy các sắc tố như vàng hay đỏ phân bố rải rác trên bề mặt thành tế bào Mặt khác, khi nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng, sợi nấm có thể mang màu vàng, cam, đỏ, nâu, tím, xanh hoặc đen [146] Cơ quan sinh bào tử của các loài thuộc chi

Penicillium là thể bình Thể bình ở các loài thuộc chi nấm này thường có phần đỉnh

dài hoặc ngắn và thon nhỏ dần phía trên Các bào tử hình thành chuỗi dài trên đầu thể bình, hình cầu hoặc gần cầu, trứng hay elip Khi tồn tại riêng rẽ, các bào tử gần như không màu, nhưng khi tập hợp thành đám, các bào tử mang các màu đặc trưng cho loài

Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của các loài thuộc chi nấm này thường trong

khoảng từ 20ºC đến 30ºC Một số loài như P chrysogenum, P digitatum và P

italicum sinh trưởng thích hợp nhất ở nhiệt độ khoảng 25ºC Trong khi một vài loài

khác có thể tồn tại được nhiệt độ cao từ 37ºC đến 40ºC hoặc ở nhiệt độ thấp từ 5ºC

đến 7ºC Penicillium có xu hướng sinh trưởng tốt ở môi trường axit hơn so với ở

môi trường kiềm, pH tối ưu cho sự phát triển của nấm là 5-5,5 Phần lớn các loài

tồn tại được trong khoảng pH khá rộng từ 3-9 Ngoài ra, một số ít loài như P

glabrum vẫn có thể sống sót ở pH nhỏ hơn 2 hay lớn hơn 10 [122]

Penicillium là chi nấm phổ biến và có mặt ở hầu hết các môi trường sống

Chúng có thể gây ra những ảnh hưởng nhất định đối với cuộc sống của con người Bên cạnh những tác động tiêu cực như gây mốc hỏng, thối rữa thực phẩm, sinh độc

tố nấm (mycotoxin), rất nhiều loài thuộc chi này đã được sử dụng để mang lại những giá trị to lớn, đặc biệt trong ngành sản xuất thuốc và thực phẩm Có thể kể

đến, nấm P roqueforti và P camemberti được biết đến rộng rãi nhờ khả năng thủy

phân chất béo và lên men tạo hương vị đặc trưng cho các loại phô-mát nổi tiếng như

Camembert, Brie và Roquefort [183] P nalgioverse được sử dụng để làm tăng

hương vị của xúc xích và dăm-bông, đồng thời ngăn chặn sự xâm nhiễm của nấm

mốc và vi khuẩn khác [107] Bên cạnh đó, cùng với Aspergillus, một vài loài thuộc chi Penicillium cũng được coi là nhà máy tế bào sản xuất enzym (pectinase, lipase,

amylase, cellulase…) và các đại phân tử quan trọng (axit gluconic, axit citric, axit

tartaric…) Trong vài năm trở lại đây, Penicillium còn được chứng minh có tiềm

năng trong xử lý sinh học bởi khả năng phân hủy nhiều dạng hợp chất xenobiotic

[98] Nhiều loài thuộc chi Penicillium có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Trong

số đó, P chrysogenum là loài nổi tiếng nhờ khả năng sinh kháng sinh penicillin, với

nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao, góp phần tạo nên tiến bộ mới trong sản xuất kháng sinh phục vụ y học hiện đại [203]

1.1.4 Nấm Penicillium chrysogenum

1.1.4.1 Phân loại và đặc điểm sinh học của P chrysogenum

P chrysogenum là loài nấm mốc thuộc chi Penicillium, họ Trichocomaceae,

phân bố phổ biến ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới Loài nấm này từng được mô

tả bởi Dierckx năm 1901 với các tên P griseoroseum, P citreoroseum và P

brunneorubrum [48] và Thom năm 1910 với tên hiện nay là P chrysogenum [182]

Tuy nhiên sau đó các nghiên cứu về hình thái học, sinh lý học và các sản phẩm trao

đổi chất ngoại bào đã chứng minh những loài trên đều là một Khi đó, tên P

chrysogenum đang được sử dụng phổ biến vì vậy đã được chọn làm tên khoa học

chính thức và được công nhận bởi Hiệp hội Nấm và Địa y, những tên khác bị xoá

bỏ [112]

Khuẩn lạc nấm P chrysogenum có kết cấu lì, mịn, mỏng, mang nhiều bào tử,

xuất hiện các rãnh khía sâu và đồng tâm giống hình “bánh xe” Vùng mép khuẩn lạc

có màu trắng, rộng 1-2 mm Vùng trung tâm khuẩn lạc có các sợi nấm màu vàng hoặc vàng kem, bào tử có màu đặc trưng tùy chủng, thường là xanh vàng, xanh xám, xanh lục và ngả sang màu sậm hơn sau 2-3 tuần Ở hầu hết các chủng, các giọt tiết xuất hiện nhiều, thường có màu vàng và làm biến đổi màu tương ứng ở môi trường thạch xung quanh khuẩn lạc (Hình 1.4) Cuống bào tử đính có độ dài ngắn khác nhau, khoảng 150-300 μm với đường kính từ 3,0-3,5 μm, nhẵn, không màu và phân thành một hoặc nhiều nhánh Bào tử đính mọc thành chuỗi dài lên tới 200 μm, phân thành các nhánh dài khoảng 15-25 μm Bào tử thường có dạng tròn hay elip, đường kính 2,8-4,0 μm, trơn nhẵn và mang màu đặc trưng [137]

Hình 1.4 Hình thái khuẩn lạc P chrysogenum trên các môi trường [208]

A: CYA (Czapek Yeast extract Agar), B: CA (Czapek Agar), C: CYAS (Czapek Yeast extract Agar Salt), D: PDA (Potato Dextrose Agar) và E: SDA (Sabouraud Dextrose Agar)

P chrysogenum sinh trưởng thích hợp nhất ở nhiệt độ 25ºC, độ ẩm cao, hoạt

độ nước khoảng 0,97-0,98, pH 4,5-6,2 Trong đó, độ ẩm hay hoạt độ nước có ảnh

hưởng mạnh mẽ nhất tới sự sinh trưởng của nấm, sau đó là nhiệt độ Trái lại, pH môi trường gần như không có tác động đáng kể tới sự sinh trưởng của nấm mốc này bởi chúng có thể tồn tại trong dải pH khá rộng, khoảng 3-9 [122, 156] Nhiệt độ

thích hợp cho việc tổng hợp penicillin của nấm P chrysogenum nằm trong khoảng

23°C-28°C [132]

Đã có nhiều nghiên cứu về nấm P chrysogenum, tuy nhiên năm 2008 hệ gen

của loài nấm này mới được giải trình tự toàn bộ và dữ liệu hệ gen được lưu trữ tại https://mycocosm.jgi.doe.gov/Pench1/Pench1.home.html Hệ gen nhân có kích thước 32,19 Mb, gồm 13653 vùng ORF có kích thước tối thiểu 100 axit amin Hệ gen ty thể có kích thước 31790 bp với 17 vùng ORF xác định Các chuỗi mã hóa

protein dự đoán chiếm tỉ lệ 56,6% bộ gen của P chrysogenum, chiều dài gen trung

bình có kích thước là 1515 bp Hàm lượng GC chiếm 48,9% (52,8% đối với exon, 45,3% đối với intron và 44,4% đối với các vùng liên gen) Trung bình, mỗi gen chứa 3 exon với 83,5% gen chứa intron, 5329 trong số 12943 protein được mã hóa trong nhân được dự đoán có chức năng [193]

1.1.4.2 Vai trò của nấm P chrysogenum

Ứng dụng nổi bật nhất của nấm P chrysogenum là khả năng sinh kháng sinh

penicillin với nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao, đặc biệt sau khi đã được

xử lý đột biến Kể từ khi phát hiện tình cờ vào năm 1928 của Alexander Fleming về

sự có mặt của một loài nấm màu xanh - được cho là một chủng thuộc loài

Penicillium notatum có khả năng ức chế sinh trưởng của tụ cầu khuẩn, P notatum

trở thành loài vi sinh vật đầu tiên được sử dụng cho lên men để sản xuất chất kháng sinh đầu tiên (penicillin), tạo nên bước ngoặt mới trong y học hiện đại Tuy nhiên

phải đến năm 1941, P chrysogenum mới được đặc biệt chú ý bởi phát hiện loài nấm

này cũng cho khả năng sinh penicillin nhưng với hiệu suất cao hơn nhiều lần so với

loài nấm sinh penicillin do Fleming tìm ra năm 1928 [145] Từ đó đến nay, P

chrysogenum đã được khảo sát tỉ mỉ, nghiên cứu tạo đột biến và sàng lọc để tìm ra

các chủng có khả năng lên men và sinh kháng sinh với sản lượng cao Từ những

chủng đầu tiên với năng suất chỉ 60 μg/ml thì đến nay đã đạt tới 85000 μg/ml ở các chủng đang được sử dụng trong công nghiệp [178]

Ngoài khả năng sinh kháng sinh penicillin ưu việt, P chrysogenum còn được

biết đến bởi khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất có giá trị như amylase [50], lipase [13], polyamine oxidase [144], glucose oxidase [89] và

α-xanthocillin X [44] Gần đây, chiết xuất từ sợi nấm P chrysogenum khô được

chứng minh có thể hỗ trợ một số cây trồng như táo, nho, cà chua và hành tây chống lại các tác nhân gây hư hỏng bằng việc kích thích cơ chế phòng vệ của cây, từ đó giúp cây tránh khỏi các bệnh rụng lá và nấm mốc thông thường [184]

1.1.5 Nấm Penicillium digitatum

1.1.5.1 Phân loại và đặc điểm sinh học của nấm P digitatum

Nấm P digitatum gây bệnh mốc xanh trên quả có múi, được miêu tả và phân

loại bởi Saccardo năm 1881 [153] Loài này được xếp vào ngành ascomycota (nấm túi), ngành phụ Pezizomycotina, lớp Eurotiomycetes, lớp phụ Eurotiomycetidae, bộ

Eurotiales, họ Trichocomaceae và chi Penicillium

Hình 1.5 Hình thái nấm P digitatum [15]

A: Nấm P digitatum gây hỏng cam; B: Nấm P digitatum sinh trưởng trên môi trường

PDA; C: Cấu trúc sinh bào tử và bào tử nấm P digitatum

Nấm P digitatum phát triển nhanh trên môi trường MEA (malt extract agar)

và PDA, nhưng lại phát triển chậm trên môi trường CD Bề mặt khuẩn lạc có màu xanh ôliu và mặt sau của khuẩn lạc có màu vàng kem hoặc màu nâu nhạt Mặt trên

khuẩn lạc khá mượt mà không có các giọt tiết P digitatum có khả năng sinh trưởng

ở phổ nhiệt độ khá rộng từ 4-30°C, tối ưu ở nhiệt độ 25-30°C, không sinh trưởng

được trên 37°C Loài nấm này sinh sản bằng cách hình thành bào tử vô tính Bào tử

có thể nảy mầm ở 5°C trong môi trường nhân tạo (Hình 1.5) Nấm có mùi đặc trưng

vì chúng tiết các hợp chất chuyển hóa dễ bay hơi như limonen, valencene, ethylene,

ethyl alcohol, ethyl acetate và methyl acetate Sợi nấm P digitatum không màu,

đường kính 4-20µm, bào tử hình tròn đến hình trứng, thuôn dài, không vách và có kích thước từ 4-7 x 6-8 µm [134]

P digitatum là nấm gây bệnh thực vật đầu tiên thuộc chi Penicillium được

giải mã toàn bộ hệ gen [106] Trước đó, hệ gen ty thể hoàn chỉnh của nấm P

digitatum đã được công bố bởi một nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc [174] Phân

tích so sánh bởi Marcet-Houben và cộng sự (2012) về trình tự hệ gen ty thể ở hai chủng của Tây Ban Nha và Trung Quốc cho thấy sự phát triển mở rộng của loài này

trên thế giới So sánh với loài nấm sinh kháng sinh là P chrysogenum cho thấy một

số lượng nhỏ gen chỉ có ở P digitatum và điều này phù hợp với cách sinh trưởng

chuyên biệt của chúng trên vật chủ Các phân tích về dữ liệu hệ gen cũng làm sáng

tỏ cơ sở phân tử của việc tại sao P digitatum không có khả năng sử dụng nguồn

nitơ là nitrat hoặc tạo sản phẩm trao đổi chất bậc hai là penicillin [106] Cơ sở dữ

liệu hệ gen của các chủng nấm mới P digitatum và P chrysogenum đã được tải lên

cơ sở dữ liệu công cộng PhylomeDB (www.phylomedb.org)

1.1.5.2 Cơ chế gây bệnh của nấm P digitatum trên quả có múi

Mối quan hệ “vật chủ - mầm bệnh - môi trường” được coi là tam giác bệnh

của nấm P digitatum trên quả có múi sau thu hoạch Tam giác này cho thấy mối

quan hệ giữa nguồn gây bệnh, trái cây vật chủ và điều kiện môi trường quy định sự biểu hiện của bệnh Bệnh trên quả có múi sau thu hoạch được chia thành hai nhóm khác nhau dựa trên thời điểm lây nhiễm: nhiễm trước thu hoạch bị gây ra bởi nguồn

bệnh tiềm ẩn, nhiễm sau thu hoạch do nhiễm vào các vết xước P digitatum gây

bệnh trên quả có múi thuộc nhóm thứ 2 [15]

P digitatum chỉ nhiễm qua vết xước của quả có múi Thông thường những

vết xước này có do quá trình thu hoạch và các bước xử lý tiếp theo trong nhà kính hoặc trong quá trình lưu thông trên thị trường Đôi khi lây nhiễm có thể xảy ra trước

thu hoạch, do quả bị tổn thương, vỡ hoặc xước do côn trùng gây ra Sẽ không có sự lây nhiễm nếu như vỏ quả còn nguyên vẹn, bởi vì bào tử đính tự do trên bề mặt quả không thể nảy mầm Ngược lại, bào tử nằm trên vết thương hở, làm vỡ tuyến dầu và xâm nhập vào cùi, nảy mầm trong đó, vì thế quá trình xâm nhiễm nhất định sẽ xảy

ra sau 48 giờ lây nhiễm ở 20-25°C [15]

Nhiều bằng chứng đã cho thấy rằng, các chất dễ bay hơi tiết ra từ mô tế bào

quả có múi đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh trên quả của nấm P

digitatum Thành phần dầu chính trong vỏ các loại quả có múi như cam, quýt, chanh

và bưởi là monoterpene limonene (4-isopropenyl-1-methylcyclohexene), chiếm 60 – 95% tổng số chất bay hơi [35] Các hợp chất dễ bay hơi sinh ra từ quả có múi là khác nhau trong các trường hợp quả còn nguyên vẹn, quả bị hỏng thông thường và

quả bị hỏng do nhiễm nấm P digitatum Những quả cam nguyên vẹn có chứa các

hợp chất thuộc nhóm sesquiterpene như valencene cùng một lượng nhỏ các monoterpene như limonene Đối với những quả cam bị dập hoặc bị xước, một lượng lớn limonene và các monoterpene khác được giải phóng ra thay vì sesquiterpene Limonene và các hợp chất dầu khác như terpenes myrcene, α-pinene, β-pinene, sabinene được chứng minh có tác động kích thích sự nảy mầm bào tử và kéo dài hệ

sợi của nấm P digitatum, đây được coi như một cơ chế nhận biết vật chủ của loài nấm này [51, 52] Khi nghiên cứu trên các nấm gây bệnh khác như P expansum hoặc P sclerotiorum không thấy có hiện tượng trên hoặc có khi còn gây ức chế sự

nảy mầm và kéo dài hệ sợi [198] Trên những quả cam chuyển gen làm giảm hàm

lượng limonene cho thấy nấm P digitatum giảm khả năng gây bệnh đáng kể [9]

Nhiều nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của nấm P digitatum ở mức độ phân

tử cho thấy một số gen đóng vai trò quy định khả năng gây bệnh của nấm P

digitatum Gen PdMpkB được chứng minh là gen giữ vai trò quan trọng trong cơ

chế gây bệnh của nấm P digitatum Gen PdMpkB điều hòa biểu hiện của một loạt

các gen mã hóa enzym phân giải thành tế bào vỏ quả như cellulase, pectinase và

chitinase Khi hệ sợi nấm P digitatum bắt đầu xâm nhiễm vào quả có múi tại vị trí vết xước trên vỏ quả, gen PdMpkB điều hòa biểu hiện của một loạt các gen hoạt

động để tiết các enzym phân giải phá hủy thành tế bào vỏ quả Khi thành tế bào vỏ

quả bị phá hủy bởi các enzym, hệ sợi nấm P digitatum tiếp tục đâm xuyên vào trong quả Khi gen PdMpkB bị ức chế biểu hiện hoặc bị xóa bỏ làm giảm biểu hiện của các gen mã hóa enzym phân giải dẫn tới hệ sợi nấm P digitatum không có khả

năng đâm xuyên gây hỏng quả [105] Ngoài ra, có rất nhiều các nghiên cứu về gen

liên quan tới khả năng gây bệnh của nấm P digitatum Gen PdSNF1 được chứng

minh trong môi trường có pectin - thành phần của vỏ quả có múi ảnh hưởng tới sự

hình thành bào tử, kéo dài hệ sợi nấm P digitatum và phân giải thành phần pectin [217] Sự hoạt động của gen PdSNF1 khiến cho bào tử nấm khi nhiễm vào quả qua

vết xước (gặp được thành phần pectin trong vỏ quả) sẽ kích thích sự này chồi hình

thành hệ sợi và phát sinh bào tử nấm P digitatum làm tăng quá trình sinh tổng hợp enzym phân giải pectin làm quả hỏng nhanh hơn Khi gen PdSNF1 bị xóa bỏ cho thấy sự giảm khả năng gây bệnh đáng kể của nấm P digitatum Tuy nhiên cho tới hiện nay, việc điều tra vai trò của các gen quy định khả năng gây bệnh của nấm P

digitatum vẫn đang tiếp tục được thực hiện

1.2 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN

A tumefaciens (ATMT)

Để thực hiện các nghiên cứu về cải biến di truyền nấm sợi thì phương pháp chuyển gen là một công cụ không thể thiếu Hiện nay, một số phương pháp chuyển gen được sử dụng phổ biến ở nấm sợi là chuyển gen qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện (electroporation) và chuyển gen trung gian qua vi khuẩn

tốn nhiều công sức, chi phí cao và không ổn định, đòi hỏi người thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm, không thể áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ Đặc biệt protoplast phải được sử dụng ngay sau khi chuẩn bị [103, 110]

Phương pháp chuyển gen bằng xung điện là phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử DNA vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Cơ chế của phương pháp này là tạo ra một xung điện cao thế trong khoảng thời gian ngắn để làm rối loạn cấu trúc lớp màng phospholipid kép, tạo ra lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai xâm nhập vào bên trong tế bào Chuyển gen bằng xung điện gồm ba pha: pha thứ nhất là tạo ra các lỗ trên màng, diễn ra trong vòng vài micro giây; pha thứ hai là sự mở rộng kích thước lỗ màng xảy ra trong vài trăm micro giây đến vài mili giây và pha cuối cùng là sự đóng lại của các lỗ màng, diễn

ra trong vòng vài phút sau khi kết thúc xung điện [76] Phương pháp này mới chỉ áp dụng thành công với một số loài nấm sợi và đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho quá trình chuyển gen

Phương pháp chuyển gen vào nấm gián tiếp thông qua vi khuẩn A

tumefaciens kể từ khi công bố đến nay đã được áp dụng thành công trên nhiều loài

nấm khác nhau, bởi đây thực sự là phương pháp đơn giản, tiện dụng mà hiệu quả đạt được cao [113, 170]

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn A tumefaciens

A tumefaciens là vi khuẩn Gram âm sống trong đất, được chú ý và nghiên

cứu nhiều bởi khả năng chèn gen của nó vào tế bào vật chủ Loài vi khuẩn này sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen đó dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng, tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân cây (Hình 1.6)

Cơ chế hình thành khối u ở thực vật của A tumefaciens đã được làm sáng tỏ

trong nhiều nghiên cứu: vi khuẩn này chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u là Ti plasmid vào tế bào chủ Các gen nằm trên T-DNA mã hóa cho các enzym ảnh hưởng đến sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào thực vật, do

đó dẫn đến khối u [113]

Hình 1.6 Hình thái vi khuẩn A tumefaciens dưới kính hiển vi điện tử [133]

Khả năng chuyển gen hiệu quả của A tumefaciens đã mang lại nhiều thành

tựu quan trọng trong chuyển gen vào thực vật và vi nấm [131] Kể từ lần đầu tiên

chuyển gen vào nấm sợi thông qua A tumefaciens thành công vào năm 1998, vi

khuẩn này đã được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen

vào nhiều loài nấm khác nhau như Aspergillius awamori, Aspergillus fumigatus…

[63, 131]

1.2.2 Cơ chế chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens

Trong quá trình hình thành khối u, một phần T-DNA trên Ti plasmid của vi

khuẩn A tumefaciens sẽ được chèn vào hệ gen của nấm Lợi dụng cơ chế này, khi

chuyển gen, vùng T-DNA chứa các gen gây ra khối u trên Ti plasmid sẽ bị loại bỏ

và thay thế bằng gen mong muốn Ti plasmid mang các gen mã hóa cho protein phân giải opine, cắt và vận chuyển đoạn T-DNA Ti plasmid chứa vùng gen độc lực

vir (virulence region) giúp vận chuyển T-DNA [70] Các gen vir mã hóa cho các

protein tham gia vào quá trình vận chuyển T-DNA được cảm ứng bởi hợp chất acetosyringone (AS) có nguồn gốc từ thực vật, nhờ vào đó để thu được thể chuyển gen [59] Sự có mặt của cấu trúc tích hợp T-DNA để khẳng định quá trình chuyển gen vào nấm là nhờ hệ thống trung gian [66] Vùng T-DNA được giới hạn bởi biên trái (LB - Left Border) và biên phải (RB - Right Border), chứa một trình tự lặp lại dài 24 bp là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA Gen tổng hợp auxin, cytokinin

và opine trên T-DNA là các gen gây ra khối u sẽ bị loại bỏ và thay thế bằng gen

mong muốn (Hình 1.7) Gen mong muốn nằm trong vùng trình tự giữa biên trái và biên phải của T-DNA sẽ được chuyển vào tế bào nấm và tích hợp vào hệ gen của nấm ở vị trí ngẫu nhiên [66]

Hình 1.7 Cơ chế chuyển gen vào vi nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens

[201]

Ngoài việc chèn ngẫu nhiên vào hệ gen, ở nấm còn xảy ra hiện tương xóa gen nhờ sự tái tổ hợp tương đồng Hiện tượng xóa gen theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng và hiện tượng chèn ngẫu nhiên T-DNA vào hệ gen nấm có thể xảy ra với tần

số gần bằng nhau khi sử dụng các vector nhị thể chứa T-DNA gồm một marker sàng lọc ở giữa hai trình tự tương đồng với gen đích ở tế bào nhận [32, 191] Quá trình xóa gen theo cơ chế tái tổ hợp tương đồng có thể xảy ra hay không còn tùy thuộc vào từng loài nấm Quá trình này cũng phụ thuộc vào độ dài trình tự tương đồng của gen đích có trong vector Ở một số loài nấm, trình tự tương đồng dài hơn sẽ thúc đẩy sự xóa gen theo cơ chế trao đổi chéo tương đồng [114, 212] Ngoài ra, sự tích hợp T-DNA xảy ra ở các vị trí ngẫu nhiên trong hệ gen của nấm có thể gây bất hoạt gen tại vị trí chèn, dẫn đến đột biến chèn, vì thế ATMT được sử dụng để tạo ra các

bộ sưu tập các đột biến chèn ở nấm, như ở nấm gây bệnh trên người Cryptococcus

neoformans [197] và Blastomyces dermatitidis [121], nấm gây bệnh thực vật

Fusarium oxysporum [115], Leptosphaeria maculans [30], Magnaporthe oryzae

[22, 73]

Cơ chế chuyển gen của A tumefaciens đóng một vai trò quan trọng trong

việc tạo ra các thể biến nạp Một số thông số ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen

như chủng Agrobacterium và chủng nấm sử dụng, nồng độ acetosyringone, điều

kiện đồng nuôi cấy Mỗi loài nấm khác nhau đòi hỏi các thông số tối ưu khác nhau

để đạt được hiệu suất chuyển gen cao nhất

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào nấm sợi thông

qua vi khuẩn A tumefaciens

Phương pháp chuyển gen vào nấm sợi gián tiếp qua vi khuẩn A tumefaciens

gồm các thao tác đơn giản, ổn định và hiệu suất tương đối cao Tuy nhiên, thực nghiệm cho thấy hiệu suất chuyển gen giữa các loài nấm khác nhau là khác nhau

Do vậy, để đạt được hiệu suất chuyển gen cao nhất, các yếu tố và thông số chuyển gen cần được tối ưu hóa

* Chủng vi khuẩn A tumefaciens

Chủng vi khuẩn được sử dụng cho chuyển gen thông qua A tumefaciens rất

đa dạng Mỗi chủng vi khuẩn có thể mang lại hiệu quả khác nhau khi chuyển gen

vào các loài nấm khác nhau Bởi vậy, không thể đưa kết ra kết luận chủng A

tumefaciens nào là chủng thích hợp nhất để chuyển gen vào nấm [113]

* Vật liệu chuyển gen

Phương pháp chuyển gen trung gian qua A tumefaciens được áp dụng với rất

nhiều dạng vật liệu ban đầu của nấm như: bào tử, tế bào trần hay bào tử nảy mầm Thông thường, bào tử nấm là vật liệu chuyển gen được ưu tiên sử dụng nhất bởi sự tiện dụng, dễ thao tác và không tốn kém Nếu sử dụng tế bào trần sẽ cần rất nhiều hóa chất, enzym đắt tiền để tác động phá vỡ thành tế bào, hơn nữa tế bào trần rất dễ

bị vỡ nên hiệu suất chuyển gen thường không cao và cần có thao tác thí nghiệm tốt

Sử dụng bào tử nảy mầm để chuyển gen không gặp khó khăn trong thao tác nhưng

dễ có hiện tượng mọc nền - các bào tử nấm không nhận được gen chuyển mong

muốn nhưng vẫn mọc được trên môi trường chọn lọc, dẫn tới giảm hiệu suất chuyển gen [113]

* Tỷ lệ nồng độ vi khuẩn A tumefaciens và bào tử nấm

Tỷ lệ phối trộn ban đầu của vi khuẩn và bảo tử nấm là yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất đến hiệu quả chuyển gen Nếu tỷ lệ này không đạt đến thông số tối ưu, hiệu suất chuyển gen sẽ bị giảm đi đáng kể bởi hiện tượng mọc nền của vi khuẩn hoặc nấm Tăng nồng độ vi khuẩn hay bào tử nấm đều có khả năng làm tăng hiệu suất chuyển gen, tuy nhiên mỗi nồng độ sử dụng đều có giới hạn nhất định Vì vậy, với mỗi loài nấm và vi khuẩn khác nhau, cần lập ra một quy trình tối ưu riêng thích hợp nhất [113, 114]

* Điều kiện đồng nuôi cấy vi khuẩn - bào tử nấm

Thời gian, nhiệt độ và màng chuyển gen là các yếu tố quan trọng nhất trong giai đoạn đồng nuôi cấy vi khuẩn - bào tử nấm Nhiệt độ đồng nuôi cấy thường dao động khoảng 20ºC-28ºC, thời gian khoảng 16-96 giờ tùy loài Màng chuyển gen có thể là cellulose, nitrocellulose hay Hybond N+, mỗi loại màng có thể cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [113, 114]

* Nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS)

Chất cảm ứng AS được bổ sung vào giai đoạn đồng nuôi cấy vi khuẩn - bào

tử nấm, bởi đây là hợp chất có khả năng cảm ứng các gen vir để chuyển đoạn

T-DNA chứa gen mong muốn từ vector nhị thể vào tế bào chủ Để đạt hiệu quả tối ưu

nhất, AS thường được bổ sung từ giai đoạn tiền nuôi cấy vi khuẩn A tumefaciens

[113]

1.2.4 Vector dùng trong chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens

Trong nghiên cứu chuyển gen, một trong số các công cụ quan trọng nhất đã được phát triển đó là các vector Năm 1973, lần đầu tiên một plasmid được chỉnh sửa bằng việc trao đổi gen kháng tetracycline từ pSC101 với gen kháng kanamycin trở thành pSC102 [38] Sau đó, pBR322 được xây dựng và được sử dụng làm mô-đun cơ sở cho các công cụ di truyền khác nhau [28] Từ đó đến nay, rất nhiều các

loại vector đã được nghiên cứu và cải biến theo hướng mà con người mong muốn (Hình 1.8)

Hình 1.8 Mốc thời gian quan trọng về nghiên cứu phát triển vector từ năm

1970 đến nay [129]

Trong một vector, marker chọn lọc là thành phần rất quan trọng cho phép chọn lọc các thể đột biến Chúng có thể là các marker trợ dưỡng hay marker kháng kháng kháng sinh Xét một cách đơn giản, vector có thể được chia thành ba loại điển hình dựa theo mục đích nghiên cứu, gồm vector nhân dòng (cloning vector), vector biểu hiện (expression vector) và vector chỉ thị (reporter vector) Vector nhân dòng được sử dụng để tạo ra nhiều bản sao của một trình tự DNA mong muốn [149, 164] Vector biểu hiện được sử dụng để sản xuất một lượng lớn protein, loại vector này thường gồm một promoter điều khiển sự biểu hiện của gen mã hóa protein [166, 180] Với các vector chỉ thị, sử dụng để đánh giá promoter quan tâm trong điều hòa biểu hiện gen thông qua việc sử dụng gen mã hóa protein chỉ thị như protein huỳnh quang [161], protein phát quang [206] hoặc enzym [74] Những vector chỉ thị này

cho phép phân tích in vivo động học biểu hiện gen trong suốt quá trình phát triển

của sinh vật [55]

Đối với nghiên cứu chuyển gen sử dụng vi khuẩn A tumefaciens, các thành phần cơ bản phải có của vector là T-DNA, các gen vir mã hóa các protein giúp vận

chuyển T-DNA mang gen mong muốn từ vi khuẩn sang vật chủ Có hai hệ thống

vector thường được dùng trong chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens là hệ

thống vector đồng tích hợp (co-integrated vector) và hệ thống vector nhị thể (binary vector) [188]

Hình 1.9 Cấu trúc vector đồng tích hợp [133]

Vector đồng tích hợp là sản phẩm của sự tái tổ hợp tương đồng giữa plasmid nhỏ có nguồn gốc vi khuẩn và Ti plasmid (Hình 1.9) Ti plasmid có chứa hệ thống

gen vir và đã được loại bỏ gen liên quan đến sự hình thành khối u Plasmid nhỏ

được thiết kế để mang gen cần chuyển nằm giữa vùng biên trái (LB) và vùng biên

phải (RB) [188] Khi cả hai vector này cùng có mặt trong cùng một tế bào A

tumefaciens, tái tổ hợp xảy ra khiến gen cần chuyển tích hợp vào vị trí T-DNA

[116] Vector đồng tích hợp trở nên ít phổ biến hơn trong những năm gần đây do khó khăn trong việc thiết kế và sử dụng chúng [188]

Hệ thống vector nhị thể là hệ thống phổ biến nhất trong phương pháp chuyển

gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens [188] Hệ thống này gồm hai plasmid là Ti

plasmid (plasmid hỗ trợ) và vector nhị thể (Hình 1.10) Ti plasmid đã bị loại bỏ

T-DNA và có chứa một số lượng lớn các gen vir mã hóa cho bộ máy chuyển T-T-DNA

Các hợp chất phenol, chẳng hạn như acetosyringone (AS) được dùng để cảm ứng

cho các gen vir và bộ máy chuyển T-DNA này Vector nhị thể có chứa T-DNA nằm

giữa hai vùng biên lặp lại dài 24 bp Sau khi cảm ứng bộ máy chuyển T-DNA, đoạn DNA nằm giữa vùng biên lặp lại sẽ được chuyển một phân tử sợi đơn sang tế bào chủ và tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ [12, 113]

Hình 1.10 Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể [113]

Việc sử dụng vector nhị thể có nhiều thuận lợi hơn so với vector đồng tích

hợp, chẳng hạn như không cần sự tái tổ hợp in vivo Tốc độ chuyển gen của vector

nhị thể là 2-3 ngày, trong khi đó tốc độ chuyển gen của vector đồng tích hợp lâu hơn, mất từ 4-7 ngày Hơn nữa, hiệu quả chuyển gen của vector nhị thể cao hơn so với vector đồng tích hợp [116]

1.2.5 Marker chọn lọc cho chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A

tumefaciens

Marker chọn lọc là gen có mang các đặc điểm thích hợp để phục vụ mục đích chọn lọc nhân tạo và được đưa vào trong tế bào Chúng là một kiểu gen báo cáo để

có thể nhận biết DNA quan tâm đã được chuyển vào trong tế bào hay chưa Hiện

nay, quy trình chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens thường sử

dụng 2 loại marker chọn lọc: gen kháng kháng sinh và gen trợ dưỡng

khuẩn, nấm và các sinh vật nhân chuẩn cao hơn bằng cách ức chế tổng hợp protein [140] Kháng sinh nourseothricin, tên thương mại là clonNAT, được sản sinh bởi xạ

khuẩn Streptomyces noursei, gây ức chế tổng hợp protein bằng cách gây lỗi mã hóa

Kháng sinh này được dùng làm marker chọn lọc trên phạm vi rộng, bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tế bào thực vật [88] Phleomycin có nguồn gốc từ xạ

khuẩn Streptomyces verticillus, là một kháng sinh phổ rộng có khả năng chống lại

hầu hết các loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, thực vật và tế bào động vật Nó gây chết tế bào bằng cách xen vào DNA và làm phá vỡ sợi kép của DNA [37] Các gen

chọn lọc kháng lại các kháng sinh này được ký hiệu lần lượt là: hph, nat1, và ble,

được sử dụng phổ biến làm marker chuyển gen ở rất nhiều các loài sinh vật [140] [88, 167]

* Gen trợ dưỡng

Phần lớn các nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi hiện nay sử dụng các loại gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc Tuy nhiên, các loại kháng sinh này thường có giá thành cao làm tăng chi phí thí nghiệm, gây hạn chế cho việc nghiên cứu chuyển gen Bên cạnh đó, nhiều loại nấm sợi có khả năng kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh rất cao, tiêu biểu là

A oryzae khiến cho việc dùng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc là không

khả thi [175] Vấn đề này đã được khắc phục bằng cách cải biến di truyền của một

số loài nấm sợi để có thể dùng các gen trợ dưỡng làm marker chọn lọc Marker sử dụng gen trợ dưỡng thường là các gen liên quan đến sinh tổng hợp các chất thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của nấm Marker trợ dưỡng là gen bù vào các đột biến khuyết dưỡng trong hệ gen của vật chủ Các chủng sau khi gây đột biến khuyết dưỡng sẽ mất đi khả năng sinh tổng hợp một chất cần thiết cho sinh trưởng bình thường, do vậy nó chỉ có thể sinh trưởng được trên môi trường có bổ sung thêm chất đó Sử dụng marker trợ dưỡng cho phép sàng lọc các thể chuyển gen trên môi trường không có các chất dinh dưỡng thiết yếu mà nó bị khuyết dưỡng Gen trợ

dưỡng được sử dụng phổ biến nhất ở nấm sợi là pyrG Ngoài gen pyrG, các gen trợ dưỡng khác cũng được sử dụng làm marker như gen adeA, met, trp, argB Chuyển

gen sử dụng marker trợ dưỡng giúp giảm chi phí, an toàn đối với môi trường và có

tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực tiễn [219]

Gen pyrG mã hóa decarboxylase orotidine-5'-monophosphate (OMP), một

enzym của con đường tổng hợp pyrimidine quan trọng cho tổng hợp uridine Axit fluoroorotic dạng đột biến (5-FOA) ức chế sự phát triển của tế bào ở hầu hết các sinh vật bằng cách đi vào con đường tổng hợp pyrimidine, nơi nó được chuyển đổi thành chất tương tự pyrimidine là fluoroorotidine monophosphate [23] Khả năng chống lại 5-FOA có thể đạt được bằng cách ngăn chặn đường dẫn pyrimidine thông qua việc khử orotidine-5'-monophosphate (OMP) decarboxylase làm xúc tác decarboxyl hoá orotidine monophosphate (OMP) để hình thành uridine

5-monophosphate (UMP) Trong các loài nấm sợi, đột biến gen pyrG tạo ra các thể

khuyết dưỡng đối với uridine và/hoặc uracil và kháng với 5-FOA [67]

1.2.6 Promoter điều hòa biểu hiện gen ở nấm sợi

Promoter là vùng trình tự nucleotit nằm về phía đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã, đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen Kích thước của một promoter có thể dao động từ 100 - 1000 bp [162] Promoter được chia làm hai loại chính: promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định và promoter đặc hiệu (gồm promoter đặc hiệu mô tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển

và promoter cảm ứng) Promoter cơ định là loại promoter tham gia điều khiển hoạt động của gen ở hầu như tất cả các loại mô, ở tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của sinh vật Promoter đặc hiệu quy định biểu hiện đặc hiệu của gen ở một hoặc một vài loại mô và ở một hoặc một vài giai đoạn phát triển Promoter cảm ứng

là loại promoter hoạt động mạnh khi môi trường xuất hiện điều kiện cảm ứng [2]

Ở nấm sợi, promoter cơ định được sử dụng rộng rãi nhất là gpdA mã hóa glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase từ A nidulans Do có mức độ tương đồng cao và khả năng tăng cường mức độ biểu hiện nên promoter gpdA được sử

dụng ở nhiều loài nấm sợi Năm 2002, Wasylnka và Moore đã biểu hiện thành công

gen GFP được điều khiển bởi promoter gpdA ở nấm sợi A fumigatus [202] Năm

2016, Nguyễn Thị Khuyến và cộng sự đã chứng minh promoter gpdA của A

nidulans điều khiển gen DsRed hoạt động mạnh ở A oryzae Toàn bộ hệ sợi và cấu

trúc sinh bào tử của các thể chuyển gen A oryzae cho tín hiệu huỳnh quang đỏ

mạnh khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Đặc biệt, một số thể chuyển gen cho kiểu hình màu hồng nhạt đến đậm trên đĩa chuyển gen và hoàn toàn quan sát

được bằng mắt thường [124] Bên cạnh gpdA, promoter trpC (sinh tổng hợp tryptophan) từ A nidulans cũng thường được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen

và biểu hiện gen ở nấm sợi [64, 94]

Ngoài các loại promoter cơ định, các promoter cảm ứng cũng đã được ứng dụng rộng rãi trong việc biểu hiện gen ở nấm sợi Ưu điểm của việc biểu hiện enzym và protein tái tổ hợp dưới sự kiểm soát của promoter cảm ứng là mức độ

biểu hiện cao hơn nhiều lần Các promoter cảm ứng thường được sử dụng gồm glaA

ở A niger và A awamori, amyB (mã hóa cho amylase), thiA (gen liên quan đến sinh tổng hợp thiamine) ở A oryzae [117] GlaA là gen mã hóa cho glucoamylase - một trong những enzym tiết nhiều ở A niger [57] Vì hiệu quả hoạt động cao nên promoter glaA được sử dụng phổ biến trong sản xuất protein tái tổ hợp Taka- amylase A là sản phẩm của gen amyB được tìm thấy ở nấm sợi A oryzae Quá trình

sinh tổng hợp của sản phẩm bậc hai này được cảm ứng bởi tinh bột hoặc ologosacharides như maltose, iso-maltose, panose và bị kiềm chế bởi glucose [185,

malto-209] Cụ thể, vùng promoter amyB dài 617 bp đóng vai trò chủ yếu trong quá trình dịch mã của gen amyB, đặc biệt vùng trình tự từ vị trí -377 đến -290 đã được chứng

minh liên quan trực tiếp tới quá trình điều hòa và biểu hiện mạnh của gen này [177,

187] Tuy nhiên, vùng trình tự từ vị trí -290 đến -233 của promoter amyB mới giữ vai trò chính trong khả năng được cảm ứng bởi maltose [77] Promoter amyB đã

được chứng minh khả năng biểu hiện mạnh và ổn định mà không phụ thuộc vào

nhiệt độ ở nấm sợi A oryzae [86]

1.2.7 Gen chỉ thị DsRed và GFP dùng trong chuyển gen ở nấm sợi

Gen chỉ thị mã hóa các protein tương ứng được sử dụng trong đánh giá hiệu quả chuyển gen hoặc dùng như dấu hiệu để sàng lọc các thể chuyển gen Sự có mặt

của gen chỉ thị khiến các tế bào/khuẩn lạc của thể chuyển gen có kiểu hình khác biệt

và dễ dàng phân biệt với các chủng tự nhiên Gen chỉ thị không gây ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sinh trưởng của các thể chuyển gen [4] Các gen chỉ thị

có thể được gắn liền với gen đích và được điều khiển dưới cùng một promoter hoặc biểu hiện độc lập mà không có gen đích đi kèm Một số các gen chỉ thị hay được sử

dụng như: GFP, DsRed, GUS, lacZ,…[90, 119, 130]

1.2.7.1 Gen mã hóa huỳnh quang xanh (GFP)

Gen GFP có chiều dài 720 bp được phân lập lần đầu tiên từ sứa

Aequoreavictoria bởi Osamu Shimomura năm 1962 GFP mã hóa protein có kích

thước 238 axit amin (26,9 kDa) Protein này phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh

lá cây khi tiếp xúc với ánh sáng bước sóng 509 nm [142, 163]

Trong lĩnh vực sinh học phân tử, gen GFP thường được sử dụng như một gen chỉ thị trong chuyển gen và biểu hiện gen (Hình 1.11) GFP thường được đưa vào tế bào thông qua các kỹ thuật chuyển gen và sự tích hợp của GFP trong hệ gen của tế bào có thể đủ bền vững qua các thế hệ sau Đến nay, GFP đã được biểu hiện

ở nhiều loài, bao gồm cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, trong đó có nấm sợi [104]

Gen huỳnh quang GFP rất hữu ích trong việc nghiên cứu xác định vị trí của protein

hoặc kiểm tra mức độ biểu hiện của một gen mong muốn Trong nghiên cứu phát

triển các phương pháp chuyển gen, biểu hiện gen chỉ thị GFP đã được chứng minh

là thành công trên nhiều loài nấm sợi như A fumigatus [79], A oryzae [109], A

nidulans [31], A niger [62], Fusarium oxysporum [99]…