Nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho gamma delta t từ bệnh nhân ung thư phổi

Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T γδT và diệt tự nhiên NK trong điều trị ung thư phổi”,

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Quý Linh

NUÔI CẤY HOẠT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO LYMPHO GAMMA DELTA T (γδT)

TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Quý Linh

NUÔI CẤY HOẠT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TẾ BÀO LYMPHO GAMMA DELTA T (γδT)

TỪ BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung PGS.TS Trần Huy Thịnh

Hà Nội – Năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, Trưởng Bộ môn Sinh học tế bào, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và PGS.TS Trần Huy Thịnh, phó Trưởng Bộ môn Hóa sinh, Phó giám đốc Trung tâm kiểm định chất lượng xét nghiệm y học, Trường Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học, người thầy đã định hướng, tận tình truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS.BS Tạ Thành Văn, Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, Giám đốc Trung tâm nghiên cứu Gen-protein, Trường Đại học Y

Hà Nội , PGS.TS.BS Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa

Kỹ thuật Y Học, phó Giám đốc cùng toàn thể cán bộ Trung tâm nghiên cứu protein, Trường đại học Y Hà Nội, nơi tôi đã gắn bó 10 năm, đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu

Gen-Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS BS Nguyễn Thanh Bình và các anh chị Kỹ thuật viên Khoa Xét nghiệm Huyết Học bệnh viện Nhi Trung Ương đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các bệnh nhân và người tình nguyện đã giúp đỡ để tôi có thể thực hiện được nghiên cứu này

Cuối cùng tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu thương của cha mẹ tôi, vợ cùng hai con trai và những người thân trong gia đình cùng bạn

bè, những người đã luôn ở bên tôi, động viên tôi và là chỗ dựa vững chắc cho tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày 02 tháng 09 năm 2019

Học viên

Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp Nhà nước

“Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T (γδT) và diệt tự nhiên (NK) trong điều trị ung thư phổi”, mã số: KC.10.26/16-20, thuộc chương

trình: “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, KC.10/16-20

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Quý Linh, học viên cao học khóa 26 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, khoa Sinh học, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Trần Huy Thịnh và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

2 Công trình này không trùng lập với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung

thực và khách quan, là một phần kết quả trong Đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu

sử dụng tế bào miễn dịch tự thân Gamma Delta T (γδT) và diệt tự nhiên (NK) trong điều trị ung thư phổi”đã được chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 02 tháng 09 năm 2019

Người viết cam đoan

NGUYỄN QUÝ LINH

MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

C n TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về un t p ổi 3

1.1.1 Dịch tễ học ung thư phổi 3

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ 3

1.1.3 Đáp ứng miễn dịch trong ung thư phổi 6

1.2 Tổng quan về liệu pháp tế bào miễn dịch tự t ân γδT tách từ máu ngoại vi tron điều trị un t phổi 10

1.2.1 Giám sát miễn dịch và sự né tránh đáp ứng miễn dịch trong ung thư 10

1.2.2 Vi môi trường quanh khối u và tính sinh miễn dịch trong ung thư phổi 12 1.2.3 Liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư 12

1.2.4 Các liệu pháp miễn dịch được dùng trong điều trị ung thư 15

1.2.5 Vai trò, đặc điểm và chức năng của tế bào γδT 20

1.2.6 Sự hoạt hoá và nhận diện tế bào ung thư của tế bào T 22

1.2.7 Cơ chế tác dụng kháng ung thư của tế bào T 24

1.2.8 Liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân trong điều trị ung thư 26

1.2.9 Nuôi cấy hoạt hoá, biệt hoá và tăng sinh tế bào T ứng dụng trong liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân điều trị ung thư 28

1.2.10 Ứng dụng của tế bào T trong điều trị ung thư phổi 30

C n 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2 Đối t ợng nghiên cứu 33

2.1.1 Cỡ mẫu 33

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ đối tượng nghiên cứu 33

2 2 P n p áp n iên cứu 34

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 34

2.2.2 Nội dung và các chỉ số nghiên cứu thu thập ban đầu 35

2.2.3 Phương pháp thu thập mẫu 36

2.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 36

2.2.5 Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng 38

2.3 Xử lý số liệu 43

2.4 Đạo đức trong nghiên cứu 44

C n 3 KẾT QUẢ 45

3.1 Chuẩn hóa quy trình phân lập, nuôi cấy tế bào γδT trên mẫu n ời khỏe mạnh 45

3.2 Số l ợng tế bào miễn dịc γδT t u đ ợc sau nuôi cấy 52

3.2.1 Số lượng tế bào miễn dịch γδT thu được sau nuôi cấy của người tình nguyện khỏe mạnh 52

3.2.2 Số lượng tế bào miễn dịch γδT thu được sau nuôi cấy của bệnh nhân ung thư phổi 55

3 3 Xác định tỷ lệ tế bào γδT tron quần thể tế bào t u đ ợc sau nuôi cấy 57 3.3.1 Xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào sau nuôi cấy của người khỏe mạnh 58

3.3.2 Xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào sau nuôi cấy của bệnh nhân ung thư phổi 61

3 4 Đán iá mức độ hoạt hóa và hoạt tính của tế bào miễn dịc γδT sau nuôi cấy 64

3.4.1 Khả năng tiết IFNγ của tế bào γδT vào môi trường nuôi cấy sau hoạt hóa, tăng sinh 64

3.4.2 Hoạt tính gây độc cho tế bào của tế bào γδT sau nuôi cấy 70

KẾT LUẬN 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đáp ứng miễn dịch trong ung thư phổi 7 Hình 1.2 Tác dụng của chemokine đối với TAMs và MDSCs 10 Hình 1.3: Quá trình hoạt hoá, nhận diện kháng nguyên và đáp ứng miễn dịch kháng ung thư của tế bào T 23 Hình 1.4: Cơ chế tác dụng kháng ung thư của tế bào γδT 25 Hình 1.5: Minh hoạ các giai đoạn chính của quá trình sử dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân T trong điều trị ung thư 27 Hình 1.6: Minh hoạ khả năng ly giải tế bào ung thư phổi thực nghiệm của tế bào

T tách từ máu ngoại vi của người, được nuôi cấy và hoạt hoá với kháng nguyên phosphor 31 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm mô tả tiến cứu 35 Hình 2.2 Liệu trình phân lập, nuôi cấy hoạt hóa tăng sinh tế bào γδT 36 Hình 3.1: Đường cong sinh trưởng của tế bào miễn dịch ở các nồng độ zoledromate và IL-2 khác nhau 45 Hình 3.2: Hình ảnh tế bào miễn dịch γδT sau nuôi cấy tại các nồng độ zoledronate/IL-2 khác nhau 46 Hình 3.3: Hình ảnh xác định tỷ lệ tế bào γδT trong quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy tại các nồng độ zoledronate và IL-2 khác nhau 47 Hình 3.4: Hình ảnh tế bào của người khỏe mạnh C02 trước và sau nuôi cấy 53 Hình 3.6: Hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư BN01 trước và sau nuôi cấ 56 Hình 3.7: Hình ảnh tế bào của bệnh nhân ung thư BN05 trước và sau nuôi cấy 57 Hình 3.8: Kết quả đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu C02 59 Hình 3.9: Kết quả đếm dòng chảy tế bào xác định tỷ lệ tế bào γδT mẫu BN06 62 Hình 3.10: Mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trên tế bào γδT trước và sau nuôi cấy 66 Hình 3.11: Nồng độ IFNγ trong môi trường tế bào trước và sau nuôi cấy 68 Hình 3.12: Hoạt tính gây độc tế bào của tế bào lympho γδT sau 14 ngày nuôi

cấy 71

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm của các loại tế bào lympho T 20

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 41

Bảng 2.2 Trình tự mồi của gen IFNγ và Vγ9 41

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng Realtime PCR 42

Bảng 3.1: Số lượng tế bào miễn dịch γδT nuôi cấy ở các nồng độ zoledronate và IL-2 khác nhau 45

Bảng 3.2: Tỷ lệ tế bào lympho T và γδT trong quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy 48

Bảng 3.3: Số lượng tế bào của nhóm người tình nguyện khỏe mạnh sau nuôi cấy 52

Bảng 3.4: Số lượng tế bào của nhóm bệnh nhân ung thư phổi thu được sau nuôi cấy 55

Bảng 3.5: Tỷ lệ tế bào γδT của người tình nguyện khỏe mạnh trước và sau nuôi cấy 58

Bảng 3.6: Tỷ lệ tế bào γδT của bệnh nhân ung thư phổi trước và sau nuôi cấy 61

Bảng 3.7: Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trước và sau nuôi cấy 64

Bảng 3.8: Nồng độ IFNγ trước và sau nuôi cấy hoạt hóa (pg/ml) 67

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi là bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trong số các loại ung thư trên thế giới Theo ghi nhận của Globocan năm 2018, số ca mới mắc ung thư phổi trên toàn thế giới là 2,1 triệu ca, chiếm 11,6% tổng số ca mắc do ung thư và số

ca tử vong do ung thư phổi là 1,76 triệu ca, chiếm 18,4% tổng số ca tử vong do ung thư [11] Tại Mỹ, nước có hệ thống y tế hiện đại và phát triển, theo ACS ước tính năm 2019 sẽ có 234.030 ca mắc mới, chiếm 13% tổng số ca mắc do ung thư và 142.670 ca tử vong [110]

Tại Việt Nam, theo Globocan năm 2018, tỷ lệ mới mắc ung thư phổi xếp thứ hai đối với nam giới (chiếm 18,4%, sau ung thư gan) và xếp thứ ba đối với nữ giới (chiếm 9,4%, sau ung thư vú, ung thư đại trực tràng), có 164.671 ca mới mắc ung thư phổi và 114.871 người tử vong vì căn bệnh này [38]

Từ đó, việc phát triển các phương pháp điều trị mới cũng như việc phối hợp các phương pháp điều trị nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện chất lượng sống, thời gian sống thêm không bệnh và sống thêm toàn thể với bệnh nhân ung thư phổi là điều hết sức có ý nghĩa Trên thế giới hiện nay, liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân được phát triển để điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm cả ung thư phổi đã cho những kết quả ban đầu hứa hẹn [8,49,141] Từ năm 2017, trường Đại học Y Hà Nội

đã thiết lập được quy trình tách, nuôi cấy hoạt hóa, biệt hóa và tăng sinh tạo khối tế bào miễn dịch tự thân T-CD8 và đã được Bộ Y Tế cho ứng dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân T-CD8 điều trị thử nghiệm trên lâm sàng năm loại ung thư sau: ung thư phổi, ung thư gân, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng Việc

triển khai đề tài “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma delta ɣδT và

diệt tự nhiên NK trong điều trị ung thư phổi” tại trường Đại học Y Hà Nội, Học viện Quân Y, Bệnh viện K Trung ương là thiết thực và cung cấp thêm một liệu pháp điều trị mới cho bệnh nhân ung thư nước ta Với liệu pháp này, bệnh nhân chỉ cần đến cơ sở lấy một lượng máu nhất định, sau đó trở về nhà rồi quay lại cơ sở để truyền tế bào miễn dịch đã được nuôi cấy hoạt hóa, biệt hóa và tăng sinh sau 2 tuần Hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc nhiều vào việc tối ưu hóa môi trường

nuôi cấy tế bào miễn dịch, thúc đẩy sự biệt hóa và nhân lên của tế bào, đồng thời giữ được thẩm quyền miễn dịch, khả năng truyền ghép, di chuyển tới vị trí và thâm nhập được vào tổ chức khối u Vì vậy, để thực hiện bước đầu tiên tìm hiểu về liệu pháp sử dụng tế bào gamma delta T (γδ) trong điều trị ung thư phổi, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu “Nuôi cấy hoạt hóa và đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi”, với 2 mục tiêu sau:

Xây dựng quy trình phân lập và nuôi cấy hoạt hóa tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi

Bước đầu đánh giá tính đáp ứng miễn dịch của tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi đã hoạt hóa

C n 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về un t p ổi

1.1.1 Dịch tễ học un t p ổi

Ung thư phổi là ung thư phổ biến nhất trên thế giới trong các thập niên vừa qua Theo ghi nhận của Globocan, năm 2018, ước đoán số ca mới mắc trên toàn thế giới là 2,1 triệu ca, chiếm 11,6% tổng số ca mắc do ung thư Châu Á, đặc biệt ở các nước Đông Á, là khu vực có tỷ lệ mới mắc cao nhất, chiếm 58,5% số trường hợp trên toàn thế giới Điều này khác biệt so với năm 2012, khi mà tỷ lệ mới mắc cao nhất là ở các nước Bắc Mỹ, Bắc Âu[11,34] Bên cạnh đó, tỷ lệ mới mắc thấp nhất ở châu Phi (1,9%), châu Đại Dương (0,81%), giống với thống kê Globocan 2012, tỷ lệ mới mắc thấp nhất cũng rơi vào hai châu lục này [11,34] Tuy nhiên dù ở bất cứ khu vực nào, tỷ lệ mắc bệnh chuẩn hóa theo tuổi trên thế giới của nam đều cao hơn so với

nữ (31,5 trên 100.000 nam giới và 14,6 trên 100.000 nữ giới) [11] Ngoài ra,ung thư phổi cũng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do các bệnh ung thư trên thế giới Cũng theo báo cáo Globocan, năm 2018 có 1,76 triệu ca tử vong do ung thư phổi, chiếm 18,4% tổng số ca tử vong do ung thư [11]

Ở Mỹ, theo ACS ước tính năm 2019 có 234.030 ca mắc mới (116.440 ca ở nam và 111.710 ca ở nữ), chiếm 13% tổng số ca mắc do ung thư và 142.670 ca tử vong (76.650 ca ở nam và 66.020 ca ở nữ) Trong giai đoạn từ năm 2008 - 2014, tỷ

lệ sống thêm 5 năm của ung thư phổi tại Mỹ là 19%, thấp nhất so với các loại ung thư khác [110]

Theo ghi nhận của Globocan năm 2018, ở Việt Nam, tỷ lệ mới mắc ung thư phổi xếp thứ hai đối với nam giới (chiếm 18,4%, sau ung thư gan) và xếp thứ ba đối với nữ giới (chiếm 9,4%, sau ung thư vú, ung thư đại trực tràng), có 164.671 ca mới mắc ung thư phổi và 114.871 người tử vong vì căn bệnh này [38]

1.1.2 Các yếu tố n uy c

Yếu tố môi trường

40 năm cao gấp 20 lần người không hút thuốc lá Thêm vào đó, hút thuốc lá thụ động cũng làm tăng nguy cơ ung thư phổi thêm 27% [42,125,121]

- Phơi nhiễm nghề nghiệp

Phơi nhiễm nghề nghiệp với chất gây ung thư được ước tính chiếm 5-10% ung thư phổi Các chất gây ung thư phổi nghề nghiệp quan trọng nhất được báo cáo

là amiante, silica, radon, kim loại nặng (arsenic, chromium, nickel) và hydrocarbon thơm đa vòng Trong số này, amiante là phổ biến nhất Phơi nhiễm nghề nghiệp với amiante làm tăng nguy cơ ung thư phổi gấp 5 lần [4,46]

Yếu tố liên quan đến vật chủ

- Giới

Tỷ lệ mới mắc và tử vong của nam giới luôn lớn hơn nữ giới, điều này được giải thích do tỷ lệ hút thuốc lá ở nam nhiều hơn so với nữ Tuy nhiên, có nhiều báo cáo về một số đột biến gen được tìm thấy phổ biến hơn ở những phụ nữ hút thuốc dẫn đến sự phát triển ung thư phổi, như biểu hiện quá mức của gen CYP1A1, đột biến của enzyme glutathione S-transferase M1, đột biến gen ức chế khối u p53 [58]

- Tính đa hình đơn gen

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mối liên quan về nguy cơ của ung thư phổi với những biến đổi đa hình SNPs Đáng kể đến, SNPs trên vùng 15q25.1 chứa vùng mã hóa cho 3 gen thụ thể nicotin cholinergic điều hòa quá trình phơi nhiễm với nicotin SNPs trên vùng 5p15.33 chứa TERT, là gen phiên mã ngược của telomerase, cần thiết cho hoạt động của telomerase - một enzyme có chức năng duy trì các telomere

để tế bào ung thư phân chia không giới hạn [128]

- Nhiễm trùng

Ở bệnh nhân nhiễm HIV, ung thư phổi chiếm tỷ lệ tử vong gần 30% do ung thư và những người nhiễm HIV có nguy cơ mắc ung thư phổi cao gấp 2,5 lần[138]138 Tuy nhiên, virus HIV không liên quan đến sự phát sinh ung thư, mà là

do sự ức chế miễn dịch đóng vai trò tăng nguy cơ bệnh, vì người nhiễm HIV và người được ghép tạng có tỷ lệ ung thư tăng tương tự nhau [43]

- Các bệnh ở phế quản - phổi

Một phân tích tổng hợp đã chỉ ra nguy cơ ung thư phổi ở những người bị hen suyễn mà không bao giờ hút thuốc tăng 1,8 lần[104] Ngoài ra, cũng có nghiên cứu cho thấy bệnh lao phổi làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi, nguy cơ mắc ở những đối tượng có tiền sử bệnh lao tăng 1,5 lần và 20 năm sau khi chẩn đoán bệnh lao là 2,0 lần [146]

1.1.3 Đáp ứng miễn dịc tron un t p ổi

Trong ung thư phổi, các tế bào miễn dịch xâm nhập vào tổ chức khối u tạo ra

2 loại đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và đặc hiệu [130,93]

Theo nghiên cứu của Branislava Stankovic và cộng sự (2018) cho biết có mười ba loại tế bào miễn dịch khác biệt đã được xác định trong các khối u NSCLC Các tế bào lympho T chiếm ưu thế (47%) T CD4+ là quần thể tế bào T phong phú nhất (26%), theo sát là tế bào T CD8 + (22%), tế bào CD4- CD8- chiếm một phần nhỏ (1,4%) Các tế bào B CD19 + là loại tế bào miễn dịch phổ biến thứ hai trong các khối u NSCLC (16%) Đại thực bào và NK lần lượt chiếm 4,7 và 4,5% Ba loại tế bào tua (DC) đã được xác định chiếm 2,1% Trong số các bạch cầu hạt, bạch cầu trung tính (8,6%), tế bào mast (1,4%), basophils (0,4%) và bạch cầu ái toan (0,3%) ít phổ biến hơn Nghiên cứu cũng cho thấy chỉ có các tế bào B tăng lên đáng kể ,còn ngược lại, đại thực bào và tế bào NK trong khối u thì giảm đi [116]

Các tế bào miễn dịch xâm nhập thể hiện bởi sự xuất hiện các cấu trúc lympho bậc ba (TLS) trong khối u Cấu trúc này chứa tế bào lympho B, T hỗ trợ, đại thực bào và mạng lưới tế bào tua trình diện kháng nguyên, vùng giàu tế bào lympho T và tế bào tua trưởng thành, được bao quanh bởi các mạch máu nội mô Các thụ thể xuyên màng, phân tử bám dính và chemokine đóng vai trò quan trọng với sự xâm nhập tế bào T từ hệ thống tuần hoàn vào tổ chức khối u Trong ung thư phổi, có mối tương quan thuận giữa mật độ cấu trúc lympho bậc ba với gia tăng tỷ

lệ sống ở các bệnh nhân chứng tỏ vai trò đáp ứng miễn dịch bảo vệ của cấu trúc này [26,13] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Đáp ứng miễn dịch trong ung thư phổi [93]

Các tế bào lympho T xâm nhập khối u (TILs) đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch chống khối u Hầu hết các tế bào T CD8 +

là tế bào lympho T gây độc tế bào.Tế bào này nhận diện phức hợp kháng nguyên liên quan đến khối u (TAA) được xử lý gắn với MHC trên bề mặt tế bào ung thư để tiêu diệt: diệt trực tiếp bởi TNF (yếu tố hoại tử u), perforin (chất gây thủng), diệt phụ thuộc kháng thể (ADCC), thông qua hoạt hóa chết theo chương trình apotosis [45]

Các tế bào T trợ giúp CD4 +

phân loại thành Th1, Th2, Th17 và T điều hòa (Treg) dựa vào các cytokine tiết ra và các phân nhóm này cũng có chức năng khác nhau [29] Các cytokine IL-2, IFN-γ,TNF- ɑ được tiết ra bởi các tế bào Th1 kích thích tế bào T độc, trong khi đó cytokine do Th2 tiết ra thì lại ức chế [100] Bên cạnh đó, Th17 cũng có chức năng chống lại ung thư do các cytokine mà chúng tiết

ra, như IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IFN-γ và GM-CSF và đồng thời kích thích các tế bào Th1, Tc1 và NK74 Con đường phát triển của tế bào Th17 và Treg có liên quan chặt chẽ với nhau Trong trường hợp không có cytokine tiền viêm như IL-6 hoặc IL-21 xuất hiện, TGF-β thúc đẩy quá trình biệt hóa tế bào Treg thay vì Th17 [149] Treg điều hòa sự tăng trưởng và kích hoạt của các tế bào T CD4 +, ức chế sự xâm nhập các tế bào lympho T CD8 + trong các khối u Tuy nhiên, chính điều đó cũng quan trọng để ức chế sự phát triển của khối u phổi, ngăn ngừa sự tự miễn dịch [149,148] Tóm lại mô hình Th1 / Th2 / Th17 / Treg rất cần thiết để duy trì cân bằng nội môi miễn dịch, dựa trên việc sản xuất cytokine và môi trường cytokine mà chúng tạo ra quyết định số phận của khả năng chống ung thư

Ở cấu trúc lympho bậc ba, sau khi nhận biết kháng nguyên, tế bào lympho B tăng sinh, biệt hóa thành tương bào, sản xuất được kháng thể Tác dụng kháng ung thư được chứng minh khi định lượng các IgG và IgA đặc hiệu với kháng nguyên ung thư phân lập từ các cấu trúc lympho này

Tế bào tua DC là các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp và có thể bộc lộ các phân tử MHC-I, MHC-II và các phân tử đồng kích thích trên bề mặt

tế bào của chúng, tất cả đều kích hoạt tế bào T Khi chưa trưởng thành trong mô ngoại biên, các DC biểu hiện các thụ thể chemokine khác nhau, chẳng hạn như thụ thể CCR1, CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8 và thụ thể CXCR4 Khi gặp phải các kháng nguyên khối u, các DC bắt đầu trưởng thành để đáp ứng với các kích thích viêm như tín hiệu qua trung gian thụ thể Các tế bào DC trưởng thành bắt đầu biểu hiện các thụ thể chemokine như CCR7 và nhờ hướng dẫn bởi chemokine, các

tế bào DC xâm nhập vào khu vực tế bào T ở các cấu trúc bạch huyết [99]

NK không có thụ thể như tế bào lympho T hay B, nhưng có hạt chứa các perforin và granzyme Với thụ thể hoạt hóa, NK sản xuất perforin để gây tan tế bào ung thư, khi những tế bào này không hoăc ít biểu lộ MHC lớp I Ngoài ra, NK còn tham gia vào phức hợp gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể [14]

Cũng giống như nhiều loại ung thư khác, tế bào ung thư phổi đã phát triển cơ chế thoát miễn dịch.Tế bào ung thư phổi giảm biểu hiện phân tử MHC-I trong quá trình ung thư phát triển, điều chỉnh tính nhạy cảm của tế bào ung thư với sự ly giải của các tế bào T-CD8 và NK [115] Thêm vào đó, tế bào ung thư phổi có khả năng tiết ra các yếu tố ức chế miễn dịch trong môi trường ung thư như thể hòa tan của phân tử kháng nguyên liên kết chuỗi MHC-I A (MICA), hay thúc đẩy sự giảm biểu hiện thụ thể NKG2D ở tế bào NK, do đó ức chế khả năng ly giải tế bào ung thư của lympho T và NK [102] Không chỉ thế, tế bào ung thư phổi đã được chứng minh là tiết ra các cytokine ức chế miễn dịch như IL-10, TGF-β, enzym tổng hợp tryptophan indolamine 2,3-dioxygenase, là những yếu tố chủ chốt liên quan đến ức chế đáp ứng miễn dịch và thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi [77]

Tế bào ung thư phổi biểu hiện các thụ thể chemokine và sản xuất các chemokine điều khiển sự di chuyển của tế bào miễn dịch và tế bào ung thư Các chemokine được chia thành 4 nhóm nhỏ: CXC, CC, CX3C và C Đặc biệt là việc thu hút các tế bào ức chế miễn dịch như TAMs, MDSCs Các đại thực bào liên quan đến khối u (TAMs) thúc đẩy sự tiến triển của khối u do tăng sinh mạch, ức chế miễn dịch [76] MDSCs (tế bào ức chế nguồn gốc tủy xương) đóng vai trò quan trọng trong ức chế miễn dịch, mất khả năng bảo vệ chống ung thư của cơ thể Bằng việc sản xuất các yếu tố tăng trưởng nội mô , yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng khối u , MDSCs tạo môi trường thuận lợi cho khối u phát triển, xâm lấn , di căn và sinh mạch [83] MDSCs hạn chế sự tăng trưởng tế bào T trong khối u bằng cách sử dụng hai enzyme liên quan đến chuyển hóa L-arginine: arginase-1 (ARG-1), làm cạn kiệt L-arginine và nitric oxide synthase 2 (iNOS2), tạo ra oxit nitric (NO) [88] TAMs bị thu hút bởi các chemokine như CCL2, CCL5, CCL7, CCL8 và CXCL12 và yếu tố kích thích đại thực bào (M-CSF), trong đó CCL2 đóng vai trò quan trọng [108].Tế bào MDSCs biểu hiện CXCR2 thì được phát hiện rất nhiều trong NSCLC Các phối tử của CXCR2 bao gồm CXCL1, CXCL2 và CXCL5, có nhiều trong mô ung thư phổi [66]

Hình 1.2 Tác dụng của chemokine đối với TAMs và MDSCs [147]

Một vấn đề quan trọng khác đối với đáp ứng miễn dịch trong ung thư phổi là

sự tích lũy đột biến gen và hiện tượng methyl hóa ở các tế bào ung thư, như các gen

có tần suất đột biến cao TP53, EGFR, KRAS và hay bị methyl hóa p16, FHIT, RASSF1A Các quá trình này làm thay đổi sự biểu hiện của phân tử bề mặt, chuyển dạng tế bào ung thư làm ảnh hưởng đến khả năng nhận diện và tác động của tế bào miễn dịch [48,120,67]

Như vậy, trong đáp ứng miễn dịch ở ung thư phổi, các tế bào ung thư phát triển cơ chế thoát khỏi miễn dịch để tránh tác động của tế bào miễn dịch, do đó khôi phục lại đáp ứng miễn dịch ở tổ chức ung thư đóng vai trò then chốt để cơ thể kiểm soát và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi

1.2 Tổng quan về liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân γδT tách từ máu ngoại vi tron điều trị un t phổi

1.2.1 Giám sát miễn dịch và sự né trán đáp ứng miễn dịc tron un t

Khái niệm hệ miễn dịch giúp chống lại ung thư bắt nguồn từ rất lâu Năm

1909, nhà khoa học người Đức Paul Ehrlich cho rằng tỉ lệ ung thư sẽ cao hơn rất nhiều nếu hệ miễn dịch không giúp nhận diện và tiêu diệt tế bào ung thư trong cơ thể [32] Nửa thế kỷ sau, hai nhà khoa học Lewis Thomas và Frank Macfarlane Burnet dựa trên ý tưởng của Ehrlich để xây dựng nên một mô hình gọi là “sự giám sát của hệ

tra khắp cơ thể tìm kiếm và tiêu diệt các tế bào ung thư ngay từ khi chúng bắt đầu hình thành [32] Tuy nhiên, các tế bào ung thư được trang bị một số cơ chế giúp chúng điều chỉnh hệ thống miễn dịch và né tránh các tế bào miễn dịch hiệu ứng Sự giảm biểu hiện các protein HLA (lớp I và II) và các phân tử tạo thuận lợi cho việc xử

lý, trình diện kháng nguyên là một đặc điểm chung của các tế bào ung thư Hơn nữa, các tế bào ung thư có thể biểu hiện các phối tử kiểm soát miễn dịch như PD-L1 thông qua sự tăng cường đáp ứng với IFN-γ tiết ra bởi các tế bào T ở vị trí khối u [132] Chức năng giám sát miễn dịch thông qua cơ chế "immunoediting" có một vai trò không thể tách rời trong sinh học ung thư Immunoediting đóng một vai trò kép trong ung thư bằng cách thúc đẩy tăng trưởng khối u và trung gian cho việc loại trừ bệnh [31] Hiểu được vai trò mâu thuẫn này dường như đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc hơn về

sự tương tác lẫn nhau giữa các tế bào miễn dịch khác nhau, tế bào ung thư, mô đệm khối u (các tế bào stroma) và các cytokine

Trong sinh học ung thư, toàn bộ quá trình immunoediting trải qua ba giai đoạn then chốt: loại bỏ, cân bằng và tránh thoát [31,105] Trong giai đoạn loại bỏ, các tế bào u đang phát triển được phát hiện bởi các tế bào của hệ miễn dịch đặc hiệu

và không đặc hiệu (các tế NK, các tế bào TCD8+ và TCD4+) nhận biết sự tái tạo của

mô đệm và các thay đổi trong vi môi trường quanh khối u Các tế bào miễn dịch tiết

ra interferon gamma và cytokine ức chế sự hình thành mạch máu cũng như sự phát triển của tế bào u Các tế bào tua (DCs) cũng được huy động đến khối u, giải phóng các cytokine và trình diện kháng nguyên cho các tế bào T Cuối cùng, các tế bào TCD4+,TCD8+ nhận diện và tiêu diệt các tế bào ung thư Các khối u tồn tại qua giai đoạn loại bỏ sẽ bước vào giai đoạn dài nhất trong ba giai đoạn, giai đoạn cân bằng- giai đoạn mà tế bào DC, tế bào ung thư và tế bào TCD8+

tồn tại trong một trạng thái cân bằng Các tế bào khối u không phát triển mà chung sống dưới sự quản thúc của

hệ thống miễn dịch Trong quá trình này, các khối u không ổn định về mặt di truyền

có thể tồn tại và có sức đề kháng, dẫn đến giai đoạn tránh thoát Ở giai đoạn tránh thoát, tế bào T điều hòa (Treg) là trung gian gây ức chế miễn dịch và thúc đẩy các tế bào hiệu ứng của hệ miễn dịch trải qua apoptosis Khả năng sinh miễn dịch chống

lại khối u cũng có thể bị đóng lại bởi nồng độ cao của các cytokine ức chế miễn dịch bao gồm TGFβ, yếu tố hoại tử khối u-α (TNFα) và IL-10 trong vi môi trường quanh khối u [105,80]

1.2.2 Vi môi tr ờng quanh khối u và tính sinh miễn dịc tron un t p ổi

Vi môi trường giàu các tế bào viêm là một thành phần thiết yếu của các khối

u ác tính Môi trường quanh khối u bao gồm nhiều thành phần như tế bào u, tế bào lympho, nguyên bào sợi, tế bào trung mô, các yếu tố tăng sinh mạch… [135] Tế bào ung thư tiết ra các yếu tố tăng trưởng và các protease khác nhau cùng kích hoạt, làm thay đổi môi trường vi mô của chúng Mặt khác, các tế bào stroma cũng ảnh hưởng đến tế bào ung thư bằng cách giải phóng các yếu tố tăng trưởng và cytokine [52] Toàn bộ vi môi trường có tính linh động cao, trong đó mỗi thành phần có khả năng tương tác với nhau dẫn đến sự phát triển và tiến triển của khối u Các thành phần của hệ thống miễn dịch đặc hiệu đóng vai trò chính trong miễn dịch chống lại ung thư Ở những bệnh nhân ung thư dạ dày, sự thâm nhiễm của tế bào T gây độc

và tế bào T nhớ vào khối u có liên quan đến tiên lượng tốt hơn và tỷ lệ sống sót [18] Trong vi môi trường quanh khối u dạ dày, các đại thực bào tạo thành một trong những quần thể tế bào miễn dịch phong phú nhất và những đại thực bào bị thu hút tới khối u được gọi là các đại thực bào liên quan đến khối u (TAMs) Nhiễm TAMs dẫn đến sự không hoạt động miễn dịch của tế bào T trong ung thư dạ dày và

là dấu hiệu tiên lượng xấu [51,144] Mặc dù sinh học và tính miễn dịch trong ung thư phổi vẫn chưa được sáng tỏ, các chiến lược gần đây tác động lên hệ thống miễn dịch chống lại ung thư đang mang lại tiềm năng cho việc quản lý lâm sàng và điều trị hiệu quả ung thư phổi

1.2.3 Liệu pháp miễn dịc tron điều trị un t

Từ hơn 100 năm trước, giám sát miễn dịch khối u (immune surveillance) được bác sĩ người Đức Paul Ehrlich đưa ra, cho rằng quá trình tiến triển ung thư được kiểm soát bởi hệ thống phòng thủ của cơ thể tương tự như khi mắc bệnh từ bên ngoài Hiện nay, miễn dịch khối u (tumor immunology) được định nghĩa là sự

dịch khối u thông qua cơ chế chỉnh sửa miễn dịch ung thư (immunoediting) có vai trò kép trong ung thư bằng việc loại trừ bệnh nhưng đồng thời lại thúc đẩy khối u phát triển [31] Hiểu được vai trò mâu thuẫn này cần sự hiểu biết sâu sắc về sự tương tác lẫn nhau giữa các tế bào miễn dịch khác nhau, tế bào ung thư, mô đệm khối u (các tế bào stroma) và các cytokine

Toàn bộ quá trình immunoediting trải qua ba giai đoạn then chốt: loại bỏ, cân bằng và tránh thoát [31] Khi một tế bào bắt đầu biến đổi thành một tế bào ác tính

có thể gây ra tín hiệu nguy hiểm cho hệ thống miễn dịch Ở đây, các tế bào ác tính giai đoạn đầu này được loại bỏ bằng hệ thống miễn dịch, bắt đầu từ hệ thống miễn dịch không đặc hiệu vì không cần mẫn cảm trước để kích hoạt Khi các tế bào ung thư bị tiêu diệt hoặc trải qua quá trình apoptosis, đại thực bào hoặc tế bào tua sẽ đến nuốt, xử lý và trình diện kháng nguyên khối u cho hệ thống miễn dịch đặc hiệu Các

tế bào miễn dịch nhận diện và tiêu diệt các tế bào u Ngoài ra, chúng cũng tiết ra interferon gamma (IFNγ) và cytokine ức chế sự hình thành mạch máu cũng như sự phát triển của tế bào u Quá trình này dẫn đến ức chế tiến triển hoặc thậm chí loại

bỏ khối u hoàn toàn Nếu các tế bào u tồn tại được sau sự loại bỏ ban đầu của hệ thống miễn dịch thì chúng sẽ bước vào giai đoạn tiếp theo và dài nhất, giai đoạn cân bằng Khi đó, hệ thống miễn dịch kiểm soát sự phát triển ung thư nhưng không loại

bỏ được Điều này thường được giải thích do các tế bào ung thư phát triển quá nhanh và các yếu tố ức chế chức năng của hệ thống miễn dịch được tạo ra Ví dụ về kiểu hình của đại thực bào thay đổi từ M1 sang M2, vì khi đại thực bào ở trạng thái M2 thì sẽ không trình diện kháng nguyên khối u cho tế bào miễn dịch và làm tế bào

u phát triển nhờ sản xuất ra các chất làm tăng trưởng khối u Các yếu tố ức chế có nguồn gốc từ khối u ảnh hưởng đến khoang tủy xương, dẫn đến việc sản xuất các tế bào ức chế có nguồn gốc tủy xương (MDSCs) làm thay đổi hệ miễn dịch và môi trường vi mô khối u Miễn dịch chống lại khối u cũng có thể bị ức chế bởi TGF-β, IL-10 Giai đoạn cân bằng tạo điều kiện cho sự tiến triển của khối u để trốn tránh mục tiêu miễn dịch Khi mất cân bằng giám sát miễn dịch, các tế bào ung thư đã bước vào giai đoạn tránh thoát Ở đây, các tế bào ung thư đã thay đổi và điều chỉnh

phản ứng miễn dịch tại chỗ để cho phép trốn tránh các cơ chế giám sát miễn dịch Các tế bào khối u giảm bộc lộ MHC-I, nhằm tránh sự nhận biết và tiêu diệt của tế bào T-CD8+ Không chỉ thế, trong vi môi trường ung thư, các tế bào u thường tăng cường biểu hiện CTLA-4 ligand/CTLA-4, PD1/PDL1 ligand nên làm bất hoạt tế bào T miễn dịch tiếp cận chúng Bên cạnh đó, tế bào T điều hòa (Treg) là trung gian gây ức chế miễn dịch và thúc đẩy các tế bào hiệu ứng (effector T cell) của hệ miễn dịch trải qua apoptosis Ngoài ra, một số khối u làm thay đổi biểu hiện của IL-6, IL-

10, yếu tố tăng trưởng biểu mô mạch máu (VEGF) hoặc yếu tố kích thích bạch cầu đơn nhân (GM-CSF), làm suy giảm chức năng, bất hoạt hoặc ức chế sự trưởng thành DCs Vi môi trường quanh khối u có tính linh động cao,bao gồm nhiều thành phần như tế bào u, tế bào lympho, nguyên bào sợi, tế bào trung mô, các yếu tố tăng sinh mạch Trong đó mỗi thành phần có khả năng tương tác với nhau dẫn đến

sự phát triển, tiến triển và di căn của khối u [31,72]

Phẫu thuật, hóa trị và xạ trị là các phương pháp điều trị ung thư truyền thống; tuy nhiên, sự phát triển của kháng thuốc hoặc phóng xạ dẫn đến tỷ lệ tái phát khối u đáng kể Những tiến bộ khoa học lớn gần đây đã chứng minh tầm quan trọng của hệ thống miễn dịch trong các khối u kháng thuốc, di căn [14] Không chỉ thế, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy việc hóa xạ trị khối u có thể gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên ung thư đó Nhờ vậy, hệ miễn dịch giúp loại

bỏ các tế bào ung thư còn sót lại (những tế bào không bị tiêu diệt bằng hóa trị liệu) góp phần kiểm soát ung thư [150]

Tóm lại, hệ miễn dịch có vai trò tích cực trong việc loại bỏ khối u kháng thuốc, hoặc u di căn và phối hợp tốt cùng với hóa xạ trị tiêu diệt nốt khối u Mối quan hệ giữa ung thư và hệ thống miễn dịch được làm sáng tỏ là cơ sở vững chắc cho những liệu pháp miễn dịch ung thư ra đời Sự thành công của liệu pháp miễn dịch ung thư trong những thập kỷ gần đây như sử dụng kháng thể đơn dòng, vaccine ung thư, liệu pháp tế bào miễn dịch đã biến đổi (ACT), liệu pháp ức chế điểm kiểm tra miễn dịch đã cách mạng hóa việc điều trị ung thư, giúp liệu pháp miễn dịch trở

điều trị truyền thống [143] Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng, có những thách thức đòi hỏi nghiên cứu sâu và thử nghiệm lâm sàng để đánh giá tính hiệu quả cũng như an toàn của phương pháp.Ví dụ như liệu pháp sử dụng tế bào T mang CAR được hoạt hóa có thể tạo nên “cơn bão cytokine”, gây ra đáp ứng viêm quá mức và không dễ dàng để loại bỏ hoàn toàn như việc ngưng các liệu trình hóa-xạ trị khi có biến chứng [81] Khi xu hướng mới y học hiện đại là y học chính xác,mỗi người biểu hiện kháng nguyên ung thư không giống nhau thì khả năng đáp ứng điều trị cũng khác nhau, do đó cần “cá nhân hóa” liệu pháp miễn dịch, bằng cách xác định trình tự gen đột biến sinh kháng nguyên ung thư hoặc liệu pháp tế bào TIL riêng cho từng bệnh nhân trong điều trị

1.2.4 Các liệu pháp miễn dịc đ ợc dùn tron điều trị un t

Liệu pháp miễn dịch có thể được chia làm hai loại chính, dựa trên hình thức can thiệp đối với tế bào ung thư: bị động và chủ động Sự phân loại này dựa trên cơ chế hoạt động của các yếu tố trong liệu pháp cũng như tình trạng của hệ thống miễn dịch của bệnh nhân Nói chung, liệu pháp miễn dịch bị động được sử dụng trên bệnh nhân có hệ thống miễn dịch yếu, không đáp ứng hoặc đáp ứng thấp Quy trình điều trị sử dụng những tế bào hay phân tử được hoạt hóa bên ngoài cơ thể, bù đắp cho sự thiếu hụt chức năng miễn dịch Liệu pháp miễn dịch bị động bao gồm truyền các kháng thể đặc hiệu khối u, các cytokine tái tổ hợp và truyền các tế bào miễn dịch được nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh vào cơ thể nhằm ly giải các tế bào ung thư Liệu pháp miễn dịch chủ động nhằm mục đích kích thích tăng cường chức năng của các tế bào trong hệ thống miễn dịch Liệu pháp chủ động quan trọng nhất gồm những vaccine chứa các peptide khối u hay các tế bào ngoại sinh, sử dụng tế bào

DC tự thân như phương tiện để trình diện kháng nguyên khối u, truyền kháng thể đặc hiệu với các điểm kiểm soát hoạt hóa tế bào T

Liệu pháp miễn dịch bị động

- Kháng thể đơn dòng (mAb) đặc hiệu khối u

Kháng thể đơn dòng được sử dụng nhiều nhất trong liệu pháp miễn dịch là IgG do có thời gian sống dài và ổn định trong huyết thanh Kháng thể kháng ung thư thực hiện chức năng bằng gây con đường chết theo chương trình thông qua liên kết với khối u đích và gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể (CDC) và thực bào phụ thuộc kháng thể (ADCP) Kháng thể mô phỏng rituximab nhận biết CD20 trên bề mặt tế bào lympho B ác tính, thúc đẩy sự nhận biết của các tế bào miễn dịch, gây ra sự chết theo chương trình bởi tế bào NK thông qua tiết perforin/granzyme và tương tác với Fas/FasL, và thực bào bởi đại thực bào [91] Trong quá trình gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể, hoạt hóa của các yếu tố bổ thể dẫn đến hình thành các phức hệ tấn công màng tế bào cũng như thu hút các tế bào miễn dịch khác tập trung đến [30] Kháng thể kháng CD52 alemtuzumab biểu hiện hoạt tính kháng ung thư thông qua gây độc tế bào thông qua

bổ thể ở bệnh nhân ung thư máu [75] Thêm vào đó, sự thực bào phụ thuộc kháng thể thúc đẩy sự trình diện chéo của các peptide khối u nhận được từ các tế bào chết theo chương trình được trình diện trên phân tử MHC và tăng sinh tế bào T CD8+

và CD4+ kích thích tế bào B sản xuất kháng thể kháng khối u Hiện nay, nhiều kháng thể được sử dụng trong điều trị ung thư nhận biết và liên kết với kháng nguyên cụ thể trên bề mặt tế bào ung thư, khoá các con đường tín hiệu đặc hiệu và kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào Điển hình là cetuximab và panitumumab, nhận biết EGFR

Cả hai kháng thể này ngăn cản việc liên kết giữa phối tử EGF và thụ thể, qua đó khoá con đường tín hiệu PI3K/AKT và Ras/MAPK [57,70] Một kháng thể khác ức chế miễn dịch vi môi trường khối u đem đến những hiệu quả tích cực trong điều trị lâm sàng Bevacizumab ngăn cản sự liên kết của VEGF với thụ thể, qua đó ức chế

sự hình thành mạch Kháng thể này được sử dụng điều trị một số u dạng đặc (như ung thư đại trực tràng), kết hợp với điều trị hoá trị [33] Kháng thể có 2 đầu đặc hiệu cũng có nhiều hứa hẹn Chúng hoạt động như một cầu nối tế bào miễn dịch với các tế bào ung thư và thúc đẩy quá trình tiêu diệt tế bào ung thư Blinatumomab là loại kháng thể 2 đầu đặc hiệu duy nhất hiện nay được FDA chấp thuận trong điều trị ung thư máu dòng tế bào B

- Cytokine

Mặc dù là một trong những liệu pháp điều trị ung thư đầu tiên được tìm ra nhưng cytokine được sử dụng độc lập đã không còn phổ biến Những cytokine được

sử dụng nhiều nhất là IFN-alpha, IL2 và IL-12 IL-2 liều cao cũng như IFN-alpha

đã được FDA chấp nhận trong điều trị ung thư da di căn lần lượt vào các năm 1992

và 2011 và ung thư tế bào thận vào các năm 1998 và 2009 [9.36] IFN-alpha ức chế hoạt động của tế bào T trợ giúp trong vi môi trường khối u IL-2 thường được sử dụng kết hợp với những liệu pháp truyền thống khác như hoá trị, kết hợp với các cytokine khác, vaccine peptide và kháng thể Sử dụng kết hợp IL-2 và IFN-alpha ở bệnh ung thư đại trực tràng di căn phổi giúp tăng tỷ lệ sống sót của bệnh nhân [3] Il-12 cũng là một loại cytokine được sử dụng rộng rãi IL-12 được tiết ra bởi tế bào nhận biết kháng nguyên (APC) để đáp ứng lại kích thích kháng nguyên IL-12 làm tăng khả năng biển đổi T CD4+ thành tế bào T trợ giúp, đáp ứng chống ung thư và

ức chế tế bào T điều hoà [56,145]

- Tế bào miễn dịch tự thân

Với liệu pháp sử dụng tế bào miễn dịch tự thân, các tế bào miễn dịch sẽ được nuôi cấy hoạt hoá, tăng sinh bên ngoài cơ thể, sau đó sẽ truyền lại cho bệnh nhân Các loại tế bào thường được sử dụng trong liệu pháp này là tế bào lympho thâm nhiễm khối u (TIL) và tế bào diệt gây ra bởi cytokine (CIK) TIL được phân lập từ khối u thành các tế bào riêng biệt, sau đó sẽ được tăng sinh trong phòng thí nghiệm với nồng độ cao IL-2 Điều trị TIL trên bệnh nhân ung thư da di căn mang lại hiệu quả CIK thường bao gồm quần thể tế bào CD3+CD56+, được tạo ra bằng cách kích thích tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi (PBMC) bởi kháng thể kháng CD3, IL-1beta và IFN-gamma, có bổ sung IL-2 và IL-15 [136] Các tế bào CIK không bị phụ thuộc vào phức hệ MHC, di chuyển đến khối u và biểu hiện độc tính thông qua thụ thể NKG2D, có thể được áp dụng rộng rãi trong điều trị lâm sàng các dạng u đặc cũng như ung thư máu [50,103]

Tế bào T được biến đổi bằng kỹ thuật di truyền để biểu hiện thụ thể TCR có hoạt tính cao với các kháng nguyên đặc hiệu khối u Gen mã hoá cho TCR được tách dòng, chuyển vào các vector virus và truyền lại cho bệnh nhân CAR, lần đầu được tạo ra năm 1989, là những protein bề mặt, kết hợp các chuỗi biến đổi (Fc) của kháng thể nhận biết kháng nguyên khối u với các domain tín hiệu tế bào T nội bào Hiện nay liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào CAR-T đã phát triển đến thế hệ thứ tư CAR-T thế hệ thứ nhất không mang lại những kết quả đáp ứng điều trị lâm sàng rõ rệt Tuy nhiên, sử dụng tế bào CAR-T thế hệ hai và ba trên bệnh nhân ung thư máu

đã có những kết quả đáng chú ý [44] Tuy nhiên, liệu pháp sử dụng CAR-T tồn tại một số phản ứng phụ do việc điều hoà không kiểm soát hay hoạt hoá quá mức Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu một số biện pháp để làm giảm phản ứng phụ này như tích hợp thêm các gen gây chết theo chương trình (caspase-9 cảm ứng), nhưng vẫn chưa đạt được hiệu quả mong muốn

Liệu pháp miễn dịch chủ động

- Vaccine peptide

Vaccine kháng ung thư được tạo ra nhằm gây ra các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu khối u bên trong cơ thể Vaccine được sử dụng nhiều nhất hiện nay là vaccine chứa peptide, thường là các epitope gây miễn dịch thu được từ các kháng nguyên đặc hiệu khối u (TSA) hoặc kháng nguyên liên quan đến khối u (TAA) Hầu hết các kháng nguyên khối u là sản phẩm của các gây gây ung thư bị đột biến (K-RAS, BCR/ABL) hay gen ức chế khối u (p53), virus gây ung thư (HBV, EBV) hay là các glycolipid và glycoprotein (MUC-1, CA-125) Ban đầu, các vaccine peptide được

sử dụng như một liệu pháp độc lập, nhưng không đem lại hiệu quả do đáp ứng miễn dịch trong phổ hẹp và do hạn chế trong việc trình diện với phân tử MHC [126] Các vaccine peptide kháng ung thư thế hệ mới bao gồm hỗn hợp nhiều peptide, các peptide dài nhân tạo hay các peptide lai, bao gồm các epitope của tế bào CTL và T trợ giúp Chúng được sử dụng kết hợp với các liệu pháp khác trong điều trị nhiều loại ung thư như ung thư phổi, ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày, ung thư vú…

Đặc biệt trong ung thư vú, vaccine chứa epitope của HER2/neu, MUC1 và CEA đã được thử nghiệm lâm sàng ở pha I - III, mang lại nhiều kết quả hứa hẹn [140]

- Vaccine tế bào tua (DC)

Tế bào tua có đặc điểm như một phụ tá tự nhiên bởi khả năng khởi nguồn và

hỗ trợ cho các đáp ứng miễn dịch [7] Hai phương pháp sử dụng vaccine DC được

áp dụng rộng rãi, hướng đích tác dụng của kháng nguyên đến thụ thể của DC in vitro và ex vivo, tạo ra các tế bào DC mang kháng nguyên Dòng DC được sử dụng rộng rãi nhất trong lâm sàng hiện nay được biệt hoá từ các tế bào đơn nhân máu ngoại vi, nuôi cấy ex vivo cùng GM-CSF và IL-4 tái tổ hợp Mức độ an toàn cũng như hiệu quả của các vaccine DC để hoạt hoá tế bào T CD4+

và CD8+ đã được thử nghiệm lâm sàng pha I - III trong hơn 10 năm Sipuleucel-T là loại vaccine DC duy nhất được FDA cho phép sử dụng trong điều trị ung thư đại trực tràng

- Các chất ức chế điểm kiểm soát tế bào

Tế bào ung thư có thể bị tiêu diệt thông qua quá trình miễn dịch của cơ thể, khi tế bào T nhận diện và đáp ứng lại kháng nguyên khối u được trình diện trên bề mặt của APC Tế bào T được hoạt hoá cũng biểu hiện CTLA-4, một chất điều hoà

âm tính của quá trình hoạt hoá tế bào T, cạnh tranh liên kết với B7, phân tử đồng hoạt hoá tế bào T, qua đó trung hoà tín hiệu hoạt hoá trung gian qua CD28 Protein chết theo chương trình (PD1) và phối tử của nó (PD-L1/2) có thể dẫn đến giảm sinh trưởng tế bào T và độc tính tế bào, tăng cường tính nhạy cảm của tế bảo T với quá trình chết theo chương trình [55] Tế bào ung thư lợi dụng tương tác PD-1/PD-L1 như một cơ chế bảo vệ, nhằm ức chế hoàn toàn đáp ứng miễn dịch kháng khối u Hiện nay, mới chỉ có ba chất ức chế điểm kiểm soát tế bào được FDA chấp thuận trong điều trị ung thư, là chất ức chế CTLA-4 ipilimumab (năm 2011) và chất ức chế PD-1 là nivolumab và pembrolizumab (năm 2014)

- Virus làm tan tế bào ung thư

Virus làm tan tế bào nhân lên trong tế bào chủ, sau đó sẽ phá vỡ tế bào để phát tán ra ngoài Các virus làm tan tế bào ung thư có thể nhận diện và tiêu diệt tế

bào ung thư, nhưng cũng gây miễn dịch trung gian tế bào đặc hiệu khối u Đặc biệt,

sự nhân lên của virus trong tế bào ung thư, sau đó ly giải tế bào, dẫn đến sự giải phóng ra nhiều virus cũng như các kháng nguyên khối u [86] Sau đó, các kháng nguyên này được hấp thu bởi tế bào APC gián tiếp tăng cường đáp ứng miễn dịch tế bào T [29] Kỹ thuật di truyền thực hiện trên các virus làm tan tế bào có thể tăng cường đặc tính ly giải tế bào và loại trừ chúng ở những vùng lân cận khối u [5] Talimogene laherparepvec (T-VEC), virus herpes được chuyển gen GM-CSF, là virus làm tan tế bào được sử dụng rộng rãi trong liệu pháp miễn dịch và là loại virus đầu tiên được FDA chấp thuận trong điều trị ung thư da Liệu pháp sử dụng virus làm tan tế bào được sử dụng kết hợp với các phương pháp khác như ACT hay chất

ức chế điểm kiểm soát tế bào

1.2.5 Vai trò, đặc điểm và c ức năn của tế bào γδT

Trong máu ngoại vi của người trưởng thành, phần lớn các tế bào lympho T biểu hiện thụ thể anpha, beta (TCR-; tế bào T), chỉ có khoảng từ 1-5% biểu hiện thụ thể gamma, delta (TCR-; tế bào T) và <1% biểu hiện thụ thể V24 và V11 (tế bào NKT) Giống như tế bào T, tế bào T cũng có nguồn gốc từ tế bào đầu dòng lympho trong tuỷ xương Sự biệt hoá thành dòng tế bào / diễn ra trong quá trình phát triển và biệt hoá tại tuyến ức Phân tích hoạt động gen ở tế bào

T cho thấy, đặc điểm gen của dòng tế bào này lai giữa dòng tế bào T và dòng

tế bào NK với sự biểu hiện nhiều “gen dòng tế bào NK” hơn tế bào T và nhiều

“gen dòng tế bào T” hơn tế bào NK [53,85] Đặc điểm của các dòng tế bào T,

T và NKT được mô tả và so sánh trong bảng 1.1:

Bảng 1.1 Đặc điểm của các loại tế bào lympho T

Tế bào T Tế bào T Tế bào NKT

Tổ chức lympho Biểu mô

Tổ chức lympho

Tuỷ xương Gan, thận

Phân tử bề mặt TCR-

CD3 CD4/CD8

TCR-; CD3 CD4-

CD8/CD8+NKG2D

V24,V11 CD3; CD4/CD8 Thụ thể NK

TCR-Kháng nguyên MHC/Phức hợp

peptid

IPP, ApppI MICA/B

Điều hoà miễn dịch

Tế bào T có vai trò điều hoà, kiểm soát và cân bằng miễn dịch đến những tác động gây rối loạn cấu trúc mô, cơ quan Đáp ứng kiểm soát tác động lympho được khởi đầu bởi sự biểu hiện của nhiều dạng cấu trúc bề mặt của các phối tử được sinh ra từ những tác động này đối với các thụ thể TCR- hoặc NKG2D và ngay lập tức cung cấp nguồn cytokine, chemokine và các yếu tố khác có thể ảnh hưởng đáng

kể đến đáp ứng miễn dịch đặc hiệu [10] Ở người, có 2 phân lớp chính của tế bào

T: phân lớp thứ nhất biểu hiện thụ thể bề mặt TCR-V9 và -V2, là thành phần tế bào T chính trong máu ngoại vi; phân lớp thứ hai biểu hiện thụ thể bề mặt TCR-V9 và -V1, tập trung chủ yếu ở biểu mô, nơi mà tế bào này đóng vai trò là hàng

rào tế bào đầu tiên bảo vệ chống lại sự nhiễm khuẩn và ác tính hoá tế bào Trong giai đoạn phát triển tại tuyến ức, tế bào đầu dòng T biểu hiện các yếu tố điều hoà sao chép như PLZF1, T-bet, Eomes, RORγt and SOX13 Sự khác biệt về mức độ biểu hiện của các yếu tố điều hoà sao chép ở các phân lớp tế bào T quyết định sự sắp xếp các nhóm thụ thể tế bào TCR-V định hướng cụ thể đến từng cơ quan ngoại

vi và ảnh hưởng đến chức năng của chúng thông qua việc giới hạn cách thức biểu hiện các cytokine [16,63]

1.2.6 Sự hoạt hoá và nhận diện tế bào un t của tế bào T

Tế bào T được hoạt hoá bởi kháng nguyên phospho do các vi sinh vật và các tế bào chuyển dạng ác tính sản xuất (Hình 2) Tiếp xúc với (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMB-PP), một sản phẩm chuyển hoá trung gian của quá trình tổng hợp isoprenoid ở vi sinh vật và Isopentenyl pyrophosphate (IPP), được sản xuất bởi các tế bào bị chuyển dạng ác tính thông qua con đường mevalonate, dẫn đến hoạt hoá tế bào T phụ thuộc thụ thể TCR làm chúng có khả năng đáp ứng nhanh với sự nhiễm trùng ngoại sinh và các tế bào bị chuyển dạng ác tính nội sinh [53,118,39] Kháng nguyên phospho tương tác với protein đặc hiệu thay vì được nhận dạng trực tiếp bởi thụ thể TCR F1-ATPase biểu hiện trên tế bào khối u được xác định là phân tử nhận dạng kháng nguyên đối với sự hoạt hoá tế bào

T qua trung gian kháng nguyên phospho Ngoài ra, Butyrophilin3A1 cũng là một phương thức nhận dạng kháng nguyên phosphoryl quan trọng giúp hoạt hoá tế bào

T Hơn nữa, kháng nguyên phospho đồng đẳng MutS-2, một protein liên quan đến sửa chữa DNA, biểu hiện bất thường ở tế bào ung thư, được nhận diện bởi tế bào T thông qua thụ thể TCR [106,15]

Thụ thể Toll-like (TLTs) và thụ thể diệt tự nhiên (NKRs) cũng đã được chứng minh phối hợp với thụ thể TCR giúp hoạt hoá tế bào T Tác nhân gây bệnh

có nguồn gốc từ vi sinh vật kích hoạt tế bào T hoạt hoá thông qua TLRs và thúc đẩy sản xuất cytokine và chemokine [107] Hơn nữa, tế bào T thông qua thụ thể NKG2D cũng nhận diện các kháng nguyên liên kết chuỗi MHC-I A và B (MICA/B)

cùng các phân tử protein nằm trong họ MIC-A như UL-16 binding proteins (ULBPs) 1-4 và Retinoic acidc early transcript 1 (RAET1) Đây là những phân tử được tăng cường biểu hiện ở tế bào chuyển dạng ác tính hoặc bị nhiễm virus [62] Thụ thể diệt tự nhiên DNAM-1 tham gia vào hoạt hoá tế bào T khi bám vào phối

tử của nó là nectin-like-5, được biểu hiện trên tế bào ung thư, từ đó tăng cường tính năng gây độc của tế bào T Ngoài ra, tế bào T cũng đáp ứng với các kháng nguyên có bản chất là các độc tố như độc tố của tụ cầu, độc tố của các vi khuẩn Gram âm [10,139]

Hình 1.3: Quá trình hoạt hoá, nhận diện kháng nguyên và đáp ứng miễn dịch

kháng ung thư của tế bào T [53]

Kiểm soát ung thư là một hoạt động quan trọng của kiểm soát tác động lympho Những thay đổi gây ra bởi chuyển dạng ác tính tế bào được nhận diện một cách hiệu quả bởi tế bào T dẫn đến tăng cường miễn dịch chống ung thư [111] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen p53, xảy ra ở hơn 60% các tế bào ung thư phổi, đã gia tăng rõ rệt hoạt động của con đường mevalonate ở các tế bào ung thư phổi này Do đó, IPP và đồng phân của nó dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP), tích luỹ trong tế bào ung thư phổi và được nhận diện bởi tế bào T [35] Aminobisphosphonates, thuốc dùng để điều trị loãng xương và chống huỷ xương do

di căn xương của nhiều loại ung thư ức chế tổng hợp farensyl pyrophospate (FPP) gián tiếp chuyển IPP và DMAPP thành FPP, dẫn đến tích luỹ nội bào của các phân

tử khởi đầu quá trình chuyển hoá bao gồm IPP và DMAPP Điều này cho thấy tế bào ung thư nhạy cảm với bisphosphonate dễ dàng bị nhận diện bởi tế bào T [96] Gần đây, một con đường chuyển hoá khác, triphosphoric acid 1-adenosin-5'-yl ester 3-(3-methylbu-3-enyl) ester (ApppI), được tổng hợp từ IPP và ATP, được coi là một chất hoạt hoá tự nhiên của tế bào T Đáng lưu ý là ApppI được phát hiện ở tế bào ung thư không điều trị bằng bisphosphonate và do đó có thể coi là thụ thể tự nhiên của tế bào T [112] Hơn nữa thụ TCR- tương tác với F1-ATPase biểu hiện trên

bề mặt tế bào ung thư, MICA, MICB và ULBP 1-4 biểu hiện tại nhiều loại tế bào ung thư biểu mô khác nhau được nhận diện bởi tế bào γδT nhờ thụ thể NKG2D phụ thuộc MHC Như vậy, bào T có thể nhận diện trực tiếp các phân tử biểu hiện ở tế bào ung thư có hoặc không có sự trình diện kháng nguyên Điều này cho thấy tế bào

T có thể tác động hiệu quả lên những tế bào ung thư đích có sự tăng cường biểu hiện của phân tử bề mặt được trình diện bởi MHC-I Kết quả này thể hiện khả năng ứng dụng hiệu quả tế bào T trong liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư [68,17]

1.2.7 C c ế tác dụn k án un t của tế bào T

Sau khi được hoạt hoá dưới tác động của sự nhận diện kháng nguyên, tế bào

T trở thành tế bào có thẩm quyền miễn dịch và có khả năng kháng ung thư theo

nhiều cơ chế khác nhau Cơ chế kháng ung thư của các tế bào này bao gồm: i) tiết

phối tử bề mặt Fas-L và TRAIL-L; iii) tiết các cytokine IFN-γ và các chemokine MIP-1α/β, RANTES; iv) gia tăng biểu hiện thụ thể CD16 gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) [14,64,111] (Hình 4)

Hình 1.4: Cơ chế tác dụng kháng ung thư của tế bào γδT [14]

Việc tiết các protein gây độc tế bào perforin và granzyme xảy ra trong giai đoạn sớm, ngay sau khi tế bào T tiếp xúc và được hoạt hoát bởi tế bào ung thư Các enzyme này tác động lên màng tế bào và có thể ly giải và diệt các tế bào ung thư trong thời gian từ 20-30 phút [113] Bên cạnh đó, sự tăng cường biểu hiện các phối tử bề mặt Fas-L và TRAIL-L trên bề mặt tế bào T làm tăng sự gắn kết và tương tác với các thụ thể tương ứng Fas, TRAIL trên bề mặt tế bào ung thư để truyền tín hiệu và thúc đẩy sự chết theo chương trình của các tế bào ung thư này Tế bào T hoạt hoá biểu hiện thụ thể CD16 có khả năng bám vào vùng Fc của các kháng thể đơn dòng tác động trực tiếp vào các tế bào ung thư, do đó kích hoạt chức năng gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể ADCC bằng cách tiết các protein gây độc

tế bào perforin và granzyme tác động trực tiếp lên các tế bào ung thư Ngoài ra, các cytokine và chemokine được tiết bởi tế bào T hoạt hoá cũng đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong cơ chế đáp ứng miễn dịch chống ung thư Các cytokine IFN, TNF… có vai trò trung gian trong nhiều đáp ứng miễn dịch chống ung thư, chúng tác động trực tiếp lên chính tế bào ung thư hay huy động, hoạt hoá và thúc đẩy nhiều loại tế bào miễn dịch khác tham gia vào cơ chế chống ung thư [133,40,94]

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, IFN có khả năng thúc đẩy các tế bào ung thư tăng cường trình diện kháng nguyên và khả năng miễn dịch hay gia tăng sự biểu hiện của thụ thể Fas trên bề mặt tế bào ung thư [114,90] IFN đồng thời sẽ giúp hỗ trợ quá trình tiết các kháng thể IgG2a và IgG3 bởi các tế bào lympho B sinh kháng thể Hoạt động của hai phân lớp kháng thể này giúp cơ thể gia tăng hiệu quả trong việc nhận biết và bắt cặp với kháng nguyên đặc hiệu của tế bào ung thư Ngoài ra, IFN còn giúp tăng cường chức năng của các tế bào miễn dịch khác gồm các đại thực bào và tế bào diệt tự nhiên [90.37]

Điều này cho thấy, tế bào T và tế bào NK đóng vai trò là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh và kháng ung thư Đặc biệt là tính năng gây độc mạnh mẽ và tiết ra các cytokine như IFN-γ đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống ung thư, thể hiện khả năng ứng dụng rộng lớn của loại tế bào này trên lâm sàng [79]

1.2.8 Liệu pháp tế bào miễn dịch tự t ân tron điều trị un t

Liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân (Autologous Immune Enhancerment Therapy: AIET) trong đó có liệu pháp tế bào T và tế bào NK sử dụng trong điều trị ung thư đã được phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây [17,54] Theo đó các tế bào miễn dịch được lấy ra khỏi cơ thể người bệnh từ nhiều nguồn khác nhau:

tổ chức ung thư, hạch lympho và máu ngoại vi, sau đó được phân tách thành các dòng tế bào T và tế bào NK, nuôi cấy hoạt hoá, biệt hoá và tăng sinh với số lượng lớn rồi cuối cùng truyền trở lại cơ thể bệnh nhân để điều trị Nghiên cứu ứng dụng

cận chính cho liệu pháp sử dụng tế bào miễn dịch tự thân trong điều trị ung thư hiện nay [53,54,22]

Hình 1.5: Minh hoạ các giai đoạn chính của quá trình sử dụng liệu pháp tế bào

miễn dịch tự thân T trong điều trị ung thư [53]

Hiện nay, trong liệu pháp sử dụng tế bào T và tế bào NK tự thân điều trị ung thư, phần lớn các tế bào T và tế bào NK được phân lập từ máu ngoại vi của bệnh nhân Ưu điểm của phương pháp này là ít xâm lấn tạo điều kiện thuận lợi tối

đa và không ảnh hưởng đến sinh hoạt cũng như công việc của bệnh nhân Bệnh nhân chỉ cần đến cơ sở điều trị lấy một lượng máu nhất định sau đó trở về nhà và quay lại cơ sở đó để truyền tế bào T hoặc tế bào NK đã được hoạt hoá, biệt hoá và tăng sinh sau khoảng thời gian từ 2-3 tuần Trong khoảng thời gian này bệnh nhân vẫn sinh hoạt và làm việc bình thường 2-3 tuần cũng là khoảng thời gian các bác sỹ dùng để phân tách, nuôi cấy hoạt hoá, biệt hoá và tăng sinh để đảm bảo nhân đủ số lượng tế bào T hoặc tế bào NK dùng cho điều trị Tế bào T hoặc tế bào NK đóng vai trò là tế bào có thẩm quyền miễn dịch chính của liệu pháp điều trị [53,22]

Bên cạnh đó chúng còn huy động các tế bào khác của hệ thống miễn dịch cùng tham gia đáp ứng điều trị ung thư [27] Hiệu quả của các phương pháp này phụ thuộc vào việc tối ưu hoá môi trường nuôi cấy, tiếp xúc đặc hiệu với kháng nguyên, thúc đẩy

sự biệt hoá và nhân lên của tế bào đồng thời vẫn giữ được thẩm quyền miễn dịch và khả năng truyền ghép, di chuyển đến vị trí và thâm nhập vào tổ chức khối u của các

tế bào T hoặc tế bào NK [53,22]

1.2.9 Nuôi cấy hoạt hoá, biệt oá và tăn sin tế bào T ứng dụng trong liệu

pháp tế bào miễn dịch tự t ân điều trị un t

Các tế bào tế bào T phân lập từ máu ngoại vi phần lớn không tiếp xúc trực tiếp với các tế bào ung thư do đó chúng có thể ở trạng thái chưa hoạt hoá và ít có tính đặc hiệu với kháng nguyên ung thư [1,89] Chính vì vậy, sau khi được thu thập, các tế bào tế bào T được nuôi cấy trong môi trường chứa kháng nguyên ung thư, các chất hoạt hoá cùng với một số cytokine chức năng nhằm tạo ra các tế bào có thẩm quyền miễn dịch sử dụng trong điều trị ung thư như mô tả theo cơ chế ở trên Các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II và III trong những năm gần đây bằng cách sử dụng kháng nguyên liên kết đặc hiệu nhận biết bởi tế bào T (melanoma-asociated antigen recognized by T cells, MART-1-specific) trong điều trị ung thư hắc tố đã mang lại những kết quả hết sức khả quan [98] Tương tự như vậy là việc tách các tế bào T từ tổ chức ung thư hắc tố để nuôi cấy, tăng sinh và truyền trở lại cho bệnh nhân nhằm mục đích điều trị Đây là những tế bào đã mẫn cảm với kháng nguyên ung thư nên duy trì được tính đặc hiệu cao trong đáp ứng miễn dịch chống ung thư Tuy nhiên, việc mẫn cảm với kháng nguyên ung thư cho các tế bào T nhằm mục đích điều trị vẫn còn hạn hẹp ở một số loại hình ung thư nhất định, đáng kể nhất là ung thư hắc tố [98] Chính vì vậy, đối với hầu hết các loại hình ung thư khác, đặc biệt là ung thư phổi các tế bào T thường được nuôi cấy hoạt hoá, biệt hoá và tăng sinh với các chất hoạt hoá là kháng nguyên phospho và các cytokine như IL-2, IL-

12, IL-15, IL-18 và IL-21 Để duy trì chức năng của các tế bào T trong quá trình nuôi cấy, các nhà khoa học đã từng bước tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy nhằm tăng

bào Đây cũng là những điều kiện cần thiết để tạo ra các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trong điều trị [61,65]

Tế bào T được hoạt hoá bằng cách nuôi cấy trong môi trường có chứa kháng nguyên phospho như bromohydrin pyrophosphate (BrHPP), 4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP) và Isopentenyl pyrophosphate (IPP) Đây là các chất trung gian trong con đường chuyển hoá mevalonate/cholesterol và bacteria/DOXP có tác dụng kích thích hoạt hoá tế bào T theo cơ chế đã mô tả ở trên Ngoài ra, môi trường nuôi cấy có thể bổ sung aminobisphosphonate, một chất

ức chế trong con đường chuyển hoá mevalonate/cholesterol, dẫn đến sự tích luỹ Isopentenyl pyrophosphate (IPP) nội bào từ đó giúp hoạt hoá tế bào T [142]

Bên cạnh đó, nhằm tăng cường khả năng biệt hoá, tăng trí nhớ miễn dịch và tăng sinh các tế bào T đạt số lượng lớn đủ cho điều trị, môi trường nuôi cấy tế bào được bổ sung thêm các cytokine như IL-2 và IL-15 và IL-21[85] IL-2 nằm trong họ cytokine kích thích sự phát triển của tế bào lympho, trong đó có tế bào T sử dụng chung một hệ thống tín hiệu qua thụ thể tế bào có tác dụng thúc đẩy sự hoạt hoá và tăng trưởng của các tế bào này [39] IL-2 tác động vào phức hợp thụ thể trimeric () trên bề mặt tế bào để thực hiện chức năng sinh học của mình Thụ thể  tạo vị trí bám cho IL-2, trong khi đó các thụ thể  và  có tác dụng truyền tín hiệu vào bên trong tế bào Tác động của IL-2 phụ thuộc vào sự có mặt của các thụ thể trên bề mặt

tế bào Các thụ thể  và  đề có trên về mặt các tế bào lympho B và tế bào diệt tự nhiên, nhưng chỉ tế bào lympho T có mặt đầy đủ cả ba thụ thể ,  và , chính vì vậy chúng cũng là loại tế bào chịu tác dụng lớn nhất từ IL-2 [6] Trong liệu pháp tế bào miễn dịch trị liệu, IL-2 có vai trò kích thích phân bào, tăng cường sự sống sót đồng thời duy trì tác dụng của các tế bào lympho T tại tổ chức ung thư Chính vì vậy IL-2 là cytokine được sử dụng đầu tiên trong nuôi cấy tế bào nhằm mục đích điều trị Các nghiên cứu được công bố đều cho thấy nuôi cấy tế bào với IL-2 đã gia tăng đáng kể tỷ lệ sống cũng như chức năng sinh học của các tế bào T [134]

Giống như IL-2, IL-15 cũng thuộc họ cytokine kích thích sự phát triển của tế bào lympho có tác dụng thúc đẩy sự hoạt hoá và tăng trưởng của các tế bào T IL-

15 tác động trực tiếp lên tiểu thụ thể c trên bề mặt tế bào ngăn cản các tế bào chết theo chương trình, đồng thời thúc đẩy sự biệt hoá tế bào lympho T thành các tế bào

có trí nhớ miễn dịch và đảm bảo cho sự tồn tại của chúng [95] Nhờ tác dụng của IL-15, mà các tế bào có trí nhớ miễn dịch duy trì tác dụng chống ung thư lâu dài tại

tổ chức khối u IL-15 được sử dụng trong nuôi cấy tế bào trong các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng của liệu pháp tế bào miễn dịch trị liệu và đã có những bằng chứng

rõ ràng cho thấy tác dụng của IL-15 đối với sự phát triển và biệt hoá của các tế bào

tế bào T và tế bào NK [47] Cuối cùng, IL-21, một thành viên thuộc nhóm 1 cytokine, cũng đóng vai trò quan trọng đối với việc nuôi cấy tế bào lympho phục vụ cho điều trị ung thư IL-21 tác dụng trực tiếp lên tiểu thụ thể c và thụ thể đặc hiệu

 kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào STAT1 và STAT3 [123] IL-21 có nhiều tác dụng, bao gồm thúc đẩy tế bào T sinh trưởng, đồng thời tăng cường tính gây độc của các tế bào này và tế bào diệt tự nhiên [23] IL-21 cần thiết cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và là yếu tố quan trọng để hệ thống miễn dịch chuyển từ đáp ứng miễn dịch tự nhiên sang miễn dịch đặc hiệu IL-21 cũng được chứng minh tác dụng một cách rõ ràng trong các thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch tế bào tự thân với vai trò thúc đẩy sự sinh trưởng của tế bào và tăng cường ái lực với kháng nguyên đặc hiệu tế bào T [23,25]

1.2.10 Ứng dụng của tế bào T tron điều trị un t p ổi

Mặc dù mới được phát triển trong những năm gần đây nhưng liệu pháp sử dụng tế bào T tự thân trong điều trị ung thư đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau trên nhiều loại hình ung thư, trong đó có ung thư phổi và cho những kết quả hết sức khả quan [78] Nghiên cứu phân tích tế bào lympho thâm nhiễm trong tổ chức ung thư cho thấy tế bào T có khả năng ly giải các dòng tế bào ung thư phổi người N592 Tế bào T được hoạt hoá bởi kháng nguyên phospho như acid zoledronic có khả năng gây độc tế bào với các tế bào

hoá này ly giải tế bào ung thư không phân biệt thể giải phẫu bệnh, đột biến gen, nhạy cảm với hoá chất đã mở ra tiềm năng ứng dụng của tế bào T trong điều trị ung thư phổi [53]

Hình 1.6: Minh hoạ khả năng ly giải tế bào ung thư phổi thực nghiệm của tế bào

T tách từ máu ngoại vi của người, được nuôi cấy và hoạt hoá với kháng

nguyên phosphor [53]

Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng pha I năm 2010 của Nakajima và cộng sự trên bệnh nhân ung thư phổi thể không tế bào nhỏ giai đoạn cuối tái phát cho thấy trong khoảng thời gian theo dõi của nghiên cứu, trung vị là 401 ngày, bệnh nhân có

sự dung nạp tốt, không có tác dụng phụ đáng kể nào được ghi nhận [84] Ngoài ra, nhóm này cũng thực hiện một nghiên cứu tương tự trong thử nghiệm lâm sàng pha

II năm 2011 và 2014, kết quả đã chỉ ra trung vị thời gian sống toàn thể của các bệnh nhân ung thư phổi trong thử nghiệm là 589 ngày, thời gian sống bệnh không tiến triển là 126 ngày; thể trạng bệnh nhân tăng lên đáng kể và không có tác dụng phụ đáng lưu ý nào được ghi nhận [101,59] Thử nghiệm pha II của Ratto và cộng sự, khi sử dụng liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân kết hợp với IL-2 liều thấp trên 113 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn II, IIIa và IIIb cho kết quả tăng

tỷ lệ sống trên 3 năm của các bệnh nhân; thời gian sống trung bình của nhóm điều trị tế bào miễn dịch là 22,4 tháng so với 14,1 tháng ở nhóm đối chứng, sự khác biệt

có ý nghĩa thống kê [92] Nghiên cứu của Li và cộng sự năm 2012 trên 174 bệnh