ĐỀ TÀI : “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan và một số polysaccarit khác từ sinh khối nấm Linh chi và Hầu thủ "

Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường… Đề tài đã nghiên cứu tách chiết được polysaccharide từ nấm hầu thủ v

BỘ CÔNG THƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHCN TRỌNG ĐIỂM QUỐC GIA PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP HÓA DƯỢC ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP

ĐỀ TÀI : “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan và một

số polysaccarit khác từ sinh khối nấm Linh chi và Hầu thủ "

Mã số: CNHD.ĐT052/14-16

Chủ nhiệm đề tài (dự án): PGS.TS Lê Mai Hương

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên

Hà Nội, 2017

BỘ CÔNG THƯƠNG CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHCN TRỌNG ĐIỂM QUỐC GIA PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP HÓA DƯỢC ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP

ĐỀ TÀI : “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan và một số

polysaccarit khác từ sinh khối nấm Linh chi và Hầu thủ "

DANH MỤC TÀI LIỆU

1 Lời cảm ơn

2 Báo cáo thống kê

3 Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

4 Mục lục

5 Danh mục bảng

6 Danh mục các hình ảnh, đồ thị

7 Báo cáo tổng kết

LỜI CẢM ƠN

Chủ nhiệm đề tài và các thành viên tham gia đề tài chân thành cám ơn Cu ̣c Hóa chất - Bô ̣ Công thương ; Văn phòng Chương trình Hóa dược ; Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng các ban ngành đã tạo mọi điều kiện để chúng tôi hoàn thành đề tài đúng tiến độ và đạt được mục tiêu đề ra

Xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo và đồng nghiệp Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, cùng các học viên và sinh viên đã giúp đỡ, cộng tác và tạo điều kiện cho chúng tôi hoàn thành đề tài

Xin cảm ơn các cơ quan phối hợp là Bộ môn Sinh lý bệnh, Học Viện Quân y

và Viện Khoa học vật liệu đã cùng đồng hành trong quá trình thực hiện đề tài

Vì báo cáo tổng kết quá nhiều nội dung, không thể tránh khỏi những sai sót Tập thể tác giả thực hiên đề tài rất mong được sự góp ý chân thành của toàn thể mọi người quan tâm để chúng tôi sửa chữa và bổ sung cho hoàn chỉnh, phù hợp hơn với mục tiêu và nội dung của đề tài

Xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài:

―Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan và một số polysaccarit

khác từ sinh khối nấm Linh chi và Hầu thủ‖

2 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Mai Hương

Học hàm: Phó giáo sư Năm được phong học hàm: 2007

Học vị: Tiến sĩ Năm đạt học vị: 1993

Chức danh khoa học: NCVCC Chức vụ: Chủ tịch Hội đồng KH

Điện thoại:

Cơ quan: 844-8361899 NR: 844-7613424 Mobile: 0936180907

Fax: 844-7562390 E-mail: lehuong1258@gmail.com

Tên cơ quan đang công tác: Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Điện thoại: 844-8361899 Fax: 844-7562390

Địa chỉ: 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam

Họ và tên thủ trưởng cơ quan: GS.TS Phạm Quốc Long

Số tài khoản: 301.01.010.02.16 tại Kho bạc Cầu Giấy, Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài:

- Theo hợp đồng đã kí kết: từ tháng 6/2014 đến tháng 6/2016

- Thực tế thực hiện: từ tháng 6/2014 đến tháng 12/2016

- Được gia hạn (nếu có): 06 tháng

2 Kinh phí được duyệt và sử dụng kinh phí:

Kinh phí được cấp: 2500 triệu đồng

a, Tổng số kinh phí thực hiện: 2500 triệu đồng, trong đó:

+ Kinh phí hỗ trợ từ SNKH: 2500 triệu đồng

+ kinh phí từ các nguồn khác: 0 triệu đồng

+ Tỷ lệ kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): 0

b, Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:

Đơn vị tính: triệu đồng

Thời gian Kinh phí

4 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài

STT Số, Thời gian ban

hành văn bản

1 Số 4684/QĐ-BCT

Ngày 8/7/2013

Quyết định về việc phê duyệt kinh phí các

đề tài, dự án khoa học và công nghệ thuộc

―Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp Hóa dược đến năm 2020‖ năm 2014;

Bộ CT

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt đƣợc

Ghi chú

Lên men tạo sinh khối

ổn định từ hai loài nấm linh chi và hầu thủ

-Phối hợp để cùng xây dựng qui trình lên men nấm linh chi và hầu thủ để thu sinh khối

Nghiên cứu cấu trúc của polysaccarit

- Một số kết quả về hình ảnh của polysaccarit và các sản phẩm

- Phối hợp công bố bài báo

3 Khoa Dƣợc

lý, Học viện

quân y

Khoa Dƣợc lý, Học viện quân

y

Thử nghiệm dƣợc lý sản phẩm

- Một số kết quả về thử nghiệm sản phẩm trên động vật thử nghiệm

6 Danh sách cán bộ tham gia thực hiện đề tài:

Nội dung tham gia

chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú

1 PGS.TS Lê

Mai Hương

Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên

Chủ nhiệm đề tài, chịu trách nhiệm chung

Báo cáo tổng kết đề tài

2 TS Đỗ Hữu

Nghị

Viện Hóa học các HCTN

NC chọn giống nấm và tham gia lên men dịch thể

Đã chọn được 02 chủng nấm có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường dịch thể

4 ThS Trần Thị

Hồng Hà

Viện Hóa học các HCTN

Nghiên cứu tách chiết và chuyển hóa polysaccarit bằng enzym

- Báo cáo kết quả

Nghiên cứu tách chiết và chuyển hóa polysaccarit bằng enzym

Báo cáo kết quả tách chiết và chuyển hóa polysaccarit bằng enzym

6 TS Hà Phương

Thư

Viện Khoa học vật liệu

Nghiên cứu cấu

polysaccarit

Hình ảnh và dữ liệu phổ của polysaccarit

7 TS Trần Thị

Như Hằng

Viện Hóa học các HCTN

Đánh giá hoạt tính sinh học

Báo cáo kết quả hoạt tính sinh học

8 PGS.TS

Nguyễn Lĩnh

Toàn

Bộ môn sinh lý bệnh, Học viện quân y

Đánh giá hoạt tính kháng u và tăng cường miễn dịch

của sản phẩm in

Báo cáo kết quả hoạt tính kháng u và tăng cường miễn dịch của

sản phẩm in vivo

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra

khảo sát trong nước và nước ngoài)

Các nội dung, công việc

chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu)

Thời gian

(Bắt đầu, kết thúc) Cá nhân,

tổ chức thực hiện*

Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

1 Nội dung 1: Tạo nguồn sinh

khối ổn định, giàu polysaccarit

và các chất có hoạt tính sinh

học từ hai loài nấm linh chi và

hầu thủ

6/2014- 11/2014

6/2014- 11/2014

Lê Mai Hương, Nguyễn Đình Luyện, Cồ Thị Thùy Vân

2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình

9/2014- 12/2015

Lê Mai Hương, Lê Hữu Cường, Trần Thị Hồng Hà

3 Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính

9/2015- 9/2016

Lê mai Hương, Trần Thị Hồng Hà, Nguyễn Lĩnh Toàn

& CS

5 Nội dung 5:

Đăng kí chất lượng VSAT sản

phẩm, sở hữu trí tuệ, công bố và

tham gia đào tạo SĐH

Bản tiêu chuẩn

cơ sở sản phẩm 1-2 NCS,

2 bài trong nước

9/2015- 9/2016

Lê Mai Hương , Trần Thị Hồng Hà

& CS

III SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CỦA ĐỀ TÀI

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1 Chủng giống Chủng Chủng

thuần khiết

02 1 chủng giống nấm

Hầu thủ; 1 chủng giống nấm Linh chi

2 Sản phẩm dạng bột Kg Hàm lượng

β-D glucan≥30

%

5kg 10 kg: 3 kg bột β –

glucan, 7 kg bột β –glucan đã được phối trộn với curcumin theo

tỉ lệ 2:1

3 Sản phẩm dạng viên Kg Hàm lượng

β-D glucan≥6%

100.000 viên nang

1 Qui trình lên men lấy

sinh khối từ nấm Linh

chi

Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mô 30-80lít/mẻ

Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mô 30-80lít/mẻ

2 Qui trình lên men lấy

sinh khối từ từ nấm

Hầu thủ

Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mô 30-80lít/mẻ

Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mô 30-80lít/mẻ

3 Qui trình tách chiết thu

nhận polysaccarit từ

nấm Linh chi

Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mô 0,5-1kg/mẻ

Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mô 1-1,5kg/mẻ

4 Qui trình tách chiết thu

nhận polysaccarit từ

nấm Hầu thủ

Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mô 0,5-1kg/mẻ

Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mô 1-1,5kg/mẻ

5 Hồ sơ về phân tích hóa

học của sản phẩm

01 bộ 01 bộ hồ sơ về hóa học có

đầy đủ các dữ liệu phổ của sản phẩm β –glucan

6 Hồ sơ về hoạt tính sinh

8 Bản tiêu chuẩn cơ sở

sản phẩm

01 công bố TCCS

Về một số chỉ tiêu như: hàm lượng betaglucan 30±5%, độ

ẩm ≤ 10%, tro toàn phần ≤ 28%, vi sinh vật hiếu khí

≤10000 CFU/g, tổng số Enterbacteria ≤ 500CFU/g, không có các vi sinh vật gây bệnh cho người

01 công bố TCCS

Về một số chỉ tiêu như: hàm lượng betaglucan 30±5%, độ ẩm ≤ 10%, tro toàn phần ≤ 28%, vi sinh vật hiếu khí ≤10000 CFU/g, tổng số Enterbacteria ≤ 500CFU/g, không có các

vi sinh vật gây bệnh cho người

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt đƣợc

1 Bài báo 02 bài Quốc gia - 01 bài báo Quốc tế

- 04 bài Quốc gia

- Adv Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol

- 03 bài Tạp chí Dƣợc học

2 Sở hữu trí tuệ 02 (Đăng kí bảo

hộ tên sản phẩm/Giải pháp hữu ích/Sáng chế)

02 (Đăng kí bảo hộ tên sản phẩm/Giải pháp hữu ích/Sáng

chế)

03 (Đăng kí bảo hộ tên sản phẩm/Giải pháp hữu ích/Sáng chế)

d) Kết quả đào tạo: Vƣợt

Theo kế hoạch

Thực tế đạt đƣợc

1 Góp phần đào tạo NCS, thạc

sĩ và sinh viên tốt nghiệp

02 NCS 03 NCS (2 NCS đã

bảo vệ đã nhận bằng,

01 NCS đã BV và chuẩn bị nhận bằng)

2015-2016

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã đƣợc ứng dụng vào thực tế

1 Bioglucumin G

2 Bioglucumin Plus

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

Đề tài đã tạo ra sản phẩm là thực phẩm chức năng thử nghiệm trên động vật cho kết quả tốt: An toàn đối với động vật thử nghiệm, tác dụng dự phòng ung thƣ và

tác dụng kích thích tế bào miễn dịch

Bồi dƣỡng, đào tạo nâng cao kiến thức và kỹ năng chuyên môn cho các cán bộ khoa học tham gia đề tài

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Đề tài đã nghiên cứu tách chiết được polysaccharide từ nấm hầu thủ và linh chi,

đã xử dụng enzyme để phân cắt các chất polymer để tăng hoạt tính và độ tan giúp nâng cao hiệu quả sử dụng Ngoài ra, đề tài còn có ý nghĩa vô cùng to lớn trong việc tạo ra các sản phẩm thực phẩm chức năng có hoạt tính quí giá phục vụ y học Xu hướng nghiên cứu khả năng chống ung thư của các polisaccarit từ nấm thực sự có kết quả bởi các nhà khoa học Nhật Bản và Trung Quốc khi phát hiện ra polisaccarit, Fucoidan từ rong nâu và hàng loạt các polysacarit từ nấm dược liệu có khả năng kháng u Nhưng ở Việt Nam thì còn rất hạn chế, nhóm đề tài là nhóm đầu tiên nghiên

cứu về khả năng chống ung thư của sản phẩm từ nấm dược liệu

Đề tài đã thu được một số kết quả khá khả quan, từ các kết quả đánh giá hiệu quả của các sản phẩm thực phẩm chức năng giúp hỗ trợ miễn dịch và tăng cường sức khỏe, tác dụng dự phòng ung thư và tác dụng kích thích tế bào miễn dịch Những nghiên cứu trên chuột của sản phẩm Bioglucumin có thể được xem xét đưa vào quá trình xét nghiệm ung thư trên người cũng như tìm ra mục tiêu cho các loại thuốc phòng tránh ung thư giai đoạn đầu Một trong những vai trò quan trọng nhất của mô hình thử nghiệm trên chuột là để tìm và phát triển thuốc trị ung thư cho người Các kết quả này mở ra một hướng nghiên cứu mới, đặc biệt là các nghiên cứu về enzyme chuyển hóa các polysaccharide tự nhiên thành các sản phẩm có giá trị cao hơn trong thực tiễn Nếu tiếp tục được hỗ trợ theo hướng này thì có thể đem lại hiệu quả cao về kinh tế- xã hội

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

- Lựa chọn được 2 chủng nấm có khả năng sinh trưởng tốt nhất trên cơ chất dịch thể

và xác định điều kiện tối ưu (môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian,…) cho quá trình lên men dịch thể tạo sinh khối giàu polysaccarit

Lần 2: Tình hình thực

hiện đề tài năm 2015

Tháng 12/2015

- Tách chiết và thu nhận sản phẩm chứa β-

D glucan từ nấm Linh chi và Hầu thủ theo phương pháp lên men chìm

- Phân tích cấu trúc Polysaccarit và β glucan từ nấm Linh chi và nấm Hầu thủ

- Đánh giá hoạt tính in vitro của sản phẩm

- Đánh giá độc tính cấp củ a sản phẩm Lần 3: Tình hình thực

hiện đề tài năm 2016

Tháng 4/2016

- Nghiên cứu lựa chọn phương pháp lên men để nâng cao hiệu suất tổng hợp và polysaccaarit từ nấm trên thiết bị lên men quy mô Pilot 80 lít

- Thử nghiệm lên men hỗn hợp tạo sản phẩm hỗn hợp polysaccarit của hai loài nấm ở qui mô PTN

- Phối sản phẩm lên từ men dịch thể với từ bột quả thể của nấm linh chi và hầu thủ

- Nghiên cứu tạo sản phẩm hỗn hợp bằng hai phương pháp: lên men hỗn hợp và riêng rẽ sau đó phối trộn theo tỷ lệ thích hợp nhất

Đề tài thực hiện đúng tiến độ, đảm bảo đầy

đủ các nội dung đề ra

Lần 3: Tình hình thực

hiện đề tài năm 2016

Tháng 4/2016

Đa số các nội dung thực hiện đúng tiến độ, một số nội dung đã vượt yêu cầu đề ra Thử nghiệm hiệu lực của chế phẩm trên động vật

vì thời gian thử nghiệm kéo dài nên xin được gia hạn đến hết tháng 12/2016 để hoàn thành

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AST Serum aspartat transaminase

ALT Serum alanin transaminase

DEAE-

cellulose

cellulose Diethylaminoethyl

ESI-MS Electron Spray Ionization Mass

Spectra

Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

1

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Chromatography

Sắc kí lỏng cao áp hiệu năng cao

HSQC Heteronuclear single-Quantum

Conherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50%

SC% % scavenging capacity % khả năng trung hòa gốc

tự do

SRB Sulforhodamine B

BÁO CÁO TỔNG HỢP

MỞ ĐẦU

Hàng nghìn năm nay, con người đã sử dụng nấm lớn (mushroom) làm thực phẩm và làm thuốc chữa bệnh Nấm lớn có khoảng 140.000 loài, trong đó có 14.000 loài đã được biết, và khoảng 50% trong số đó được cho là có thể ăn được, hơn 2.000 loài là an toàn với người và khoảng 700 loài có hoạt tính sinh học có thể dùng cho ngành y dược Vì vậy, nấm lớn là nguồn tài nguyên rất phong phú phục vụ cho phát triển các sản phẩm có giá trị lớn cho ngành y và dược học Mô ̣t số loài được sử dụng

rô ̣ng rãi phải kể đến nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), Hầu thủ (Hericium

erinaceus), nấm Hương (Lentinula edodes), nấm Vân chi (Trametes versicolor), nấm

Chân chim (Schizophyllum commune)…

Ngày nay, khoa học đã chứng minh nấm dược liệu có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người, chữa các bệnh ung thư, tim mạch, tiểu đường, mỡ máu, béo phì, suy giảm miễn dịch do virus (HIV), chống viêm nhiễm, bệnh tổn thương thần kinh, v.v (Wasser, 2002; Chang và cs., 2004) Các hoạt chất trong nấm có thể là các phân tử

nhỏ như triterpenoids (hơn 130 loại) ở nấm Linh chi G lucidum (Huie và cs., 2004), các hericinone (8 loại) và erinapyron của nấm Hầu thủ H erinaceus (Arnone và cs.,

1994), và đặc biệt là hoạt tính chữa bệnh chính là nhờ các chất phân tử lượng lớn gồm như polysaccarit và glycoprotein Phần nhiều, polysaccarit ở nấm có hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học (biological response modifiers, BRM) với vai trò ngăn chặn và tiêu diệt tế bào lạ (ung thư, vi sinh vật, v.v.) mà không gây hại tới tế bào chủ Thành phần được xem như quan trọng nhất của nấm là các polysaccarit có hoạt tính tăng cường miễn dịch, đặc biệt là các beta-1,3/1,6- glucan

Ở Việt Nam, đã từ lâu nấm lớn đóng một vai trò nhất định trong đời sống xã hội Nấm có thể được thu hái từ tự nhiên hoặc chủ động nuôi trồng, du nhập giống mới từ nước ngoài Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, trong khoảng hơn

10 năm trở lại đây, nấm dược liệu được sử dụng nhằm bổ sung nguồn dinh dưỡng, tăng cường sức khoẻ và hệ miễn dịch, điều trị hỗ trợ phòng và chống các bệnh hiểm nghèo Bên cạnh các phương pháp nuôi trồng truyền thống, nuôi trồng nấm trên môi trường dinh dưỡng dịch thể ngày càng được nghiên cứu và phát triển do tính ưu việt

về thời gian tích lũy các chất có hoạt tính sinh học quí giá, về khả năng tạo nguồn cơ chất dinh dưỡng một cách chủ động nhằm thu nhận chuyển hóa theo định hướng các sản phẩm có hoạt tính, làm tăng tính sinh khả dụng của sản phẩm

Trong số các loại nấm dược liệu quan trọng được nghiên cứu và ứng dụng

nhiều nhất phải kể đến là nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) và nấm Đầu khỉ hay

còn gọi là nấm Hầu thủ (Hericium erinaceus) với các đặc tính quí giá và thành phần

chủ yếu có hoạt tính tăng cường miễn dịch của chúng là beta-1,3/1,6-glucan Trong

các nghiên cứu trước, chúng tôi đã tạo được sản phẩm Heriglucan từ nấm đầu khỉ có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống phóng xạ, và sản phẩm Bioglucumin là hỗn

hợp của Heriglucan và curcumin từ tinh nghệ vàng Trong phần nghiên cứu này, để

kế thừa và phát huy các lợi thế của các sản phẩm trên, chúng tôi muốn nghiên cứu hỗn hợp giữa nấm Hầu thủ và nấm Linh chi cùng sự cộng hợp quí giá của hai loài nấm này với curcumin để tạo ra sản phẩm mới phục vụ sức khỏe Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan và một số polysaccarit khác từ sinh khối nấm linh chi và hầu thủ”

Mục tiêu của đề tài:

- Tạo được nguồn sinh khối ổn định, giàu polysaccarit từ nấm Linh chi và nấm Hầu thủ;

- Xây dựng được quy trình chiết polysaccarit ổn định từ nấm Hầu thủ, qui mô 10 kg sinh khối nấm/mẻ;

- Tạo được 01 sản phẩm hỗn hợp Linh chi và Hầu thủ chứa ít nhất 30% β-D-glucan, đạt TCCS

Đối tượng nghiên cứu:

- Các chủng nấm Linh chi và nấm Hầu thủ được cung cấp bởi viện Di truyền nông nghiệp, hiện lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm, viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về nấm lớn

1.1.1 Giới thiệu về nấm lớn

Trong nhiều thế kỷ, nấm lớn đã được con người sử dụng làm nguồn thức ăn và dược liệu chữa bệnh Nấm lớn được định nghĩa là ―nấm có quả thể rõ ràng xuất hiện trên cây hoặc dưới đất và có thể nhìn thấy bằng mắt thường, hái bằng tay‖ (Chang & Miles, 1992)

Hiện nay, việc nuôi trồng nấm lớn phục vụ thương mại chủ yếu được áp dụng đối với nấm Basidiomycetes (nấm đảm), vì nấm Ascomycetes (nấm túi) khó nuôi trồng Các nấm có thể ăn được đã được dùng làm thực phẩm và thực phẩm chức

năng, như nấm thuộc chi Lentinula (ví dụ: nấm Hương), Hericium (ví dụ: nấm Hầu thủ), Grifola (ví dụ: nấm Maitake), Flammulina (ví dụ: nấm Kim châm), Pleurotus (ví dụ: nấm Sò) và Tremella (ví dụ: Mộc nhĩ) Bên cạnh đó, một số nấm dược liệu như nấm Linh chi (Ganoderrma lucidum) và nấm Vân chi (Trametes versicolor) chỉ

được sử dụng làm thuốc bởi chúng có vị đắng hoặc rất cứng

và giá trị dinh dưỡng có thể so sánh ngang với quả thể Năm 1978, Crisan và Sands

đã đưa ra thành phần phần hóa học của một số loài nấm ăn nuôi trồng, tiếp theo đó Chang và cộng sự (2004) cũng đã đề cập đến các thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của nấm lớn như protein, chất béo thô, carbohyđrat, v.v

Protein và axit amin: Protein thô (% trọng lượng khô) ở nấm thường cao, và khác nhau tùy thuộc loài Hàm lượng protein ở một số loài nấm ăn phổ biến như sau:

nấm Hương L edodes (15-23%), nấm Chân chim S commune (16-27%), nấm Sò P

ostreatus (19,9-34,7%), nấm Đùi gà P eryngii (23,2%) Hàm lượng các axit amin

quan trọng (g/100 g protein) dao động từ 34-47%, trong đó axit glutamic (12,6-24%), axit aspactic (9,1-12,1%) và arginine (3,7-13,9) Ngoài ra, threonine và valine cũng có hàm lượng cao ở nấm

Chất béo: Nấm thực phẩm có hàm lượng chất béo thấp hơn 10% trọng lượng khô, tuy nhiên chúng được cho là một nguồn cung cấp các chất béo chưa bão hòa và

đặc biệt các axit oleic và linoleic, một số loài có lượng chất béo < 2% (L edodes, S

commune và P ostreatus) Theo như các tài liệu đã công bố, lượng axit béo chưa bão

hòa chiếm tới 75% tổng axit béo, trong đó palmitic (19,2%), oleic (8,3%) và linoleic (68,8-84%)

Tro và chất khoáng: Chất khoáng trong nấm thường chiếm khoảng 6-10,9% (trọng lượng khô) và rất đa dạng về chất khoáng Hàm lượng khoáng ở một số nấm

điển hình như sau: P ostreatus (6,9%), P eryngii (8,6%), L edodes (5,27%), và H

erinaceus (9,35%) Các nấm nuôi trồng như P ostreatus, L edodes và A bisporus rất

giầu các khoáng (K, P, Mg, Zn và Cu), trong đó hàm lượng của các khoáng (mg/100

g nấm khô) như sau: K (26704730 mg), P (4931390 mg), Mg (20200 mg), Zn (4.99.2 mg), Cu (0,523,50 mg)

Vitamin: Nấm nuôi trồng là nguồn cung cấp dồi dào các vitamin như riboflavin (B2), niacin và folate, với hàm lượng dao động tương ứng là 1,85,1,

3165 và 0,30,6 mg/100 g nấm khô Đặc biệt vitamin B2 ở nấm là cao hơn so với rau và thậm chí ngang với ở trứng hoặc pho mát Ngoài ra, ở nấm còn các vitamin C

và B1, lượng nhỏ B12 và D2

Chất xơ: Tất cả thành tế bào nấm đều có hỗn hợp các chất xơ Ở nấm đảm, thành phần chính là chitin, và các thành phần tạo matrix gồm các polysaccarit như 1,3-α và 1,3-β-D-glucan và mannan Các chất xơ này không có bản chất tinh bột và được coi là chất xơ, gồm cả xơ không tan trong nước và tan trong nước Glucose là đơn vị chính và chiếm tới 43,182,8% tổng số chất xơ, một lượng nhỏ đường là mannose, xylose, rhamnose, galactose và axit uronic

Năng lượng: năng lượng trong nấm ăn rất thấp, vì vậy nấm được sử dụng làm

thức ăn cung cấp ít năng lượng Nấm Tricholoma robustus cung cấp 3,02 Kcal/g khô,

A bisporus cung cấp 4,174,20 Kcal/g, P ostreatus cung cấp 4,16 Kcal/g Với một

khẩu phần ăn 100 g nấm tươi chỉ cho ta 1,44,4% năng lượng cho một người/ngày

Các thành phần khác: Nấm chứa rất ít hợp chất phenolic, các hợp chất flavonoid và lignan thường dưới ngưỡng phát hiện Axit phytic chiếm 160360 mg/100g khô, oxalate từ 80220 mg/100g khô tương tự như ở cây đậu đũa và đậu nành

1.1.3 Giá trị y dược học

Các nước Đông Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã sử dụng nấm để phòng và chữa một số bệnh chính, kéo dài tuổi thọ Trung Quốc và Nhật Bản ghi nhận khoảng 270 loài nấm có đặc tính chữa bệnh Một số loài nấm thường được sử

dụng phổ biến trong y dược là Lentinus edodes, Ganoderma lucidum, nấm Grifola

frondosa, nấm kim châm (enokitake) và gần đây là nấm hầu thủ Ở các nước châu

obliquus, Laricifomes officinalis Hiện nay, thị trường Mỹ cũng đã mở cửa để đón

nhận những sản phẩm thuốc từ nấm dược liệu, đặc biệt là nấm Linh chi và nấm Maitake Năm 1994, thế giới tiêu thụ nấm dược liệu và các sản phẩm từ nấm với ước tính tới 3,8 tỉ USD và tăng lên tới 6 tỉ vào năm 1999 với thị trường chính (chiếm tới 99%) là châu Á và châu Âu Các sản phẩm quan trọng từ nấm dược liệu thường có

nguồn gốc từ các nấm Ganoderma spp., L edodes, S commune, Tremella fusiformis,

Trametes versicolor (nấm vân chi), Grifola frondosa, và gần đây là từ Phellinus

(Thượng hoàng) và Hericium erinaceus (Wasser và Weis, 1999)

Các chất có hoạt tính trong nấm bao gồm polysaccarit, phức polysaccarit, glycoproteins (lectins), triterpenoid, tocophenol, glycoside, flavonoid, carotenoid, ascorbic acid enzyme và các axit hữu cơ Sự có mặt của nhiều hợp chất khác nhau trong nấm làm cho các nấm lớn có các hoạt tính sinh học phong phú Trong số các hoạt tính dược lý của nấm, hoạt tính tăng cường miễn dịch, kháng ung thư là được quan tâm nhiều hơn cả 660 loài trong số 37 nhóm nấm có chứa polysaccarit có hoạt tính kháng ung thư hoặc tăng cường miễn dịch 77,3% polysaccarit chiết từ quả thể, 20,8% từ sợi nấm và chỉ 2% từ dịch nuôi cấy nấm Một

protein-số nấm đã được nghiên cứu đầy đủ cho hoạt tính chữa bệnh gồm: G lucidum, L

edodes, G frondosa, A blazei

1.2 Polysaccarit từ nấm dược liệu

Trong số các đại phân tử (macromolecule), polysaccarit được cho rằng có khả năng chứa đựng nhiều thông tin sinh học nhất, vì chúng rất đa dạng về hóa học cũng như lý học Theo lý thuyết thì số lượng các polysaccarit có được từ sự kết hợp các loại đường là rất lớn Tuy nhiên, trong tự nhiên, polysaccarit có khoảng 300 loại Các polysaccarit cũng tạo nên cấu trúc bậc 2, bậc 3 tùy thuộc vào cấu trúc các đơn vị đường, khối lượng phân tử và các liên kết hydro bên trong và ngoài chuỗi Polysaccarit được gọi là glycan là polymer trong đó có chứa nhiều đơn vị monosaccarit (glycose) liên kết với nhau bằng liên kết O-glycosidic Các loại monosaccarit có thể gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và axit gluconic Polysaccarit có thể là là mạch thẳng (linear) hoặc có phân nhánh (branching) Tùy thuộc vào các loại đường xuất hiện trong phân tử, polysaccarit có thể được chia thành 2 nhóm: (i) homopolyssachride có chứa duy nhất một loại đường đơn; và (ii) heteropolysaccarit chứa 2 hoặc nhiều hơn loại đường đơn (bảng 1 và 2) Hơn nữa, polysaccarit có thể kết hợp với protein thành phức hợp glycan-protein, còn gọi là proteoglycan Điều này có thể dẫn tới làm tăng hoạt tính hơn là glycan riêng rẽ

Trong số các hoạt tính y dược từ nấm, hoạt tính tăng cường miễn dịch và kháng u là được quan tâm nhiều hơn cả Nhiều polysaccarit có hoạt tính sinh học là glucan (polymer của đường glucose) với các kiểu liên kết glycosidic khác nhau, một

số là heteroglucan, một số gắn với protein tạo thành phức proteoglucan (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Nguồn gốc, kiểu và hoạt tính polysaccarit từ một số nấm lớn

Ganoderma

Lucidum

Quả thể, dịch nuôi cấy

Heteroglycan, mannoglucan, glycopeptide

Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch, kháng u, chống oxi hóa

Auricularia

auricula

cường miễn dịch, kháng u, kháng viêm, chống bức xạ

và sợi nấm Heteroglycan, glycopeptide, krestin (PSK)

Chống tăng đường huyết, tăng cường miễn dịch, kháng u, kháng viêm, chống bức xạ

Grifola

frondosa

galatomannan, heteroglycan, grifolan

Tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan, kháng u, kháng vi rút

Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học của một số polysaccarit chống ung thư (Zhang, 2007)

Polysaccarit Liên kết và kiểu Loài nấm Mạch chính Mạch

nhánh

Mw

Homoglucans (1  3)- β

-D-glucan với các nhánh 1-6

Lentinan từ

Lentinus edodes

(1  3)- β glucan

-D-(1  6)- β - 5 x 105

Schizophyllan

từ

Schizophyllum commune

(1  3)- β glucan

-D-(1  6)- β -

Grifola từ

Grifola frondosa

(1  3)- β glucan

-D-(1  6)- β - 5 x 105

Scleroglucan

từ

Sclerotium sclerotia

(1  3)- β glucan

-D-(1  6)- β –

Akali tan trong kiềm từ

Pleurotus tuber-regium

(1  3)- β glucan

-D-(1  6)- β - 2 x 105

Mạch thẳng (1

 3)- β glucan

-D-Auricularia auricular

(1  3)- β glucan

Lyophyllum decastes

Mạch thẳng (1

 6)- β glucan

-D-Armillariella tabescents

(1  6)- β glucan

(1  3)- β glucan với các nhánh 1-2 hoặc 1-6

-D-Pachyman từ

Poria cocos

(1  3)- β glucan

-D-(1  2)-

β-hoặc (16) – β –

1 x 105

(1  3)-α

glucan

Armillariella tabescens

(1  3)- α –glucan

Mạch thẳng

α-(1  3)-glucan (1  4)-α- ; (1

(1 6) – β – –

Heteroglucans (13)-β –

glucuronoglucan

Ganoderma lucidum

-glucuronoglucan

Axit glucuronic

5.3 x

104 Xyloglucan Grifola

frondosa

Polyporus confluens

–

Pleurotus pulmonarius

Galactomannoglucan

Galactoxylogluc

an

Hericium erinaceus

Mannogalactan Pleurotus

pulmonarius

Fucomannogalactan

Grifola frondosa

Grifola frondosa

(13)- α - mannan

(1  2)-β-; (1  3)-β-

Glucomannan

Agricus blazei Mannan (1 

3)-β-linked mannose

(1  glucan

2)-β-–

Galactoglucomannan

and glucose

Coriolus versicolor

glucoside α -1,4

và β -1,3 glucoside có

arabinose và rhamnosenhưng không có

fucose

Peptide được cấu thành chủ yếu từ axit aspartic

Peptide được cấu thành chủ yếu từ axit aspartic

và không tan trong nước, kiềm Trong đó, β-1,3 glucan (có thể phân nhánh) tạo vách

tế bào, và một số tan được trong nước, kiềm (S-glucan) và không tan trong kiềm glucan) Các β-1,3 glucan có chứa các nhánh glucosidic β-1,4 hoặc β-1,6 liên kết với

(R-chitin và khoảng trống được lấp đầy bởi protein Các sợi với liên kết glucosidic β-1,4 trong mạch chính cũng có thể hiện diện trong vách tế bào nấm Ở vách tế bào nấm men, chitin chiếm 1,47,9%, mannan (dạng manoprotein chủ yếu là mannan) chiếm

2867%, β-1,3 glucan chiếm 2846%, β-1,6 glucan chiếm 511%, và các polymer này nối với nhau tạo thành một đơn vị thống nhất của thành tế bào nấm (Hình 1.1)

Hình 1.1: Kết nối các polymer trong thành tế bào nấm

(Leung và cs., 2006)

Hoạt tính tăng cường miễn dịch, chống khối u của β-1,3 ;1,6-D-glucan

Các polysaccarit có hoạt tính tăng cường miễn dịch hay chống u tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm, trong đó β-1,3/1,6-D-glucan và α-1,3-mannan (liên kết với protein) là hai chất có hoạt tính chính β-1,3-glucan là polymer gồm các đơn phân tử

là glucose nối với nhau bằng liên kết β-glucosidic trong mạch chính tại vị trí C-1 và C-3 Ở đa số nấm, polymer này còn có các liên kết mạch nhánh β-1,6 glucosidic Ở nấm lớn, các mạch nhánh thường ngắn (1 đơn vị glucose) Vì vậy, có sự khác biệt về cấu trúc β-1,3-glucan giữa các nấm khác nhau Ngoài ra, các β-1,3 glucan có nguồn gốc khác nhau sẽ khác nhau ở mức độ polymer hóa (hay trọng lượng phân tử), độ phân nhánh (degree of branching, DB) Hoạt tính tăng cường miễn dịch sẽ phụ thuộc vào mức độ phức tạp về cấu trúc hóa học và lý học của mỗi glucan Βeta-1,3-glucan cũng có thể được phát hiện ở vi khuẩn, tuy nhiên, chúng không chứa cấu trúc phân nhánh Cấu trúc của một β-1,3-glucan với phân nhánh β-1,6-glucosidic được trình bày tại Hình 1.2

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học điển hình của β-1,3/1,6-glucan

Các β-1,3/1,6- glucan có hoạt tính tăng cường miễn dịch tốt, được nghiên cứu

kỹ, là từ các nấm L edodes, G frondosa, S commune và Scleroninia sclerotiorum

Mối liên quan giữa cấu trúc β-glucan và hoạt tính chống u

Các β-glucan có hoạt tính chống u có sự khác nhau về thành phần hóa học, mức độ phân nhánh, cấu trúc không gian và các đặc tính vật lý khác Hoạt tính chống

u được thấy ở các glucan từ dạng homoglucan tới dạng phức hợp heteroglucan Mặc

dù rất khó có thể đưa ra mối liên quan cấu trúc và hoạt tính của các glucan phức tạp, tuy nhiên vẫn có mối liên quan chung giữa cấu trúc và hoạt tính Các cấu trúc với liên kết β-1,3-glucan trong mạch chính và có nhánh bên là β-1,6-glucosidic là cần thiết để có hoạt tính Trong khi đó, β-glucan chứa liên kết β-1,6-glucosidic là chính thì hoạt tính yếu hơn hẳn

Ảnh hưởng của trọng lượng phân tử

Bằng cách xử lý nhiệt tại 150oC với thời gian khác nhau, β-1,3-glucan từ nấm

G frondosa cho các phân đoạn có trọng lượng phân tử khác nhau Phân đoạn có trọng

lượng cao nhất, 800 kDa, luôn luôn có hoạt tính chống u, tăng cường miễn dịch tốt nhất PSK từ nấm vân chi được lọc và chia thành 4 phân đoạn: 50 kDa, 50-100 kDa, 100-200 kDa và >200 kDa Hoạt tính kháng tăng miễn dịch tốt nhất ở phân đoạn có Mw>200 kDa Sasaki (1976) xử lý lentinan (β-1,3/1,6-glucan từ nấm hương (1.000.000 Da) bằng axit formic thành 7 phân đoạn với Mw 2.870‒110.000 Da Hoạt tính kháng u của các phân đoạn có Mw <16.000 Da giảm rõ rệt, trong khi các phân đoạn có Mw lớn vẫn giữ nguyên hoạt tính như ban đầu (Sasaki và cs, 1976) Nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng trọng lượng phân tử cao là cần thiết để β-glucan có hoạt tính tốt nhất (Yanaki và cs, 1983)

Ảnh hưởng của độ phân nhánh

Ở nấm, các β-glucan có độ phân nhánh khác nhau, dọc theo mạch chính Lentinan (2/5), β-1,3/1,6 glucan với 2 nhánh cho 5 đơn vị glucose, schizophyllan (DB 1/3) là β-1,3/1,6 glucan với mỗi phân nhánh cho 3 đơn vị glucose Mạch nhánh là yếu

tố cần thiết để đảm bảo hoạt tính cho β-glucan Tuy nhiên, mối liên hệ giữa độ phân nhánh và hoạt tính của β-glucan là rất phức tạp Các nghiên cứu chỉ ra rằng β-1,3-glucan mạch chính là cần thiết và hoạt tính sẽ đạt mức độ tốt nhất khi mức độ phân nhánh (DB) nằm trong khoảng từ 0,20,33

Ảnh hưởng của cấu trúc tới hoạt tính

Cấu trúc của β-glucan gồm các dạng xoắn đơn (single helix), xoắn ba (triple helix) và vô định hình (random coil) Cấu trúc xoắn ba thường bền vững hơn xoắn đơn bởi xoắn đơn luôn có xu hướng chuyển thành dạng xoắn ba Các phân tử β-glucan như lentinan, schizophyllan và PSK ở dạng xoắn ba Các dạng cấu trúc của β-glucan có thể chuyển đổi lẫn nhau dưới tác động của các yếu tố như nhiệt độ, hóa chất v.v… (Hình 1.3) (Adachi et al 1999)

Hình 1.3: Các dạng cấu trúc của β-glucan và sự chuyển đổi giữa chúng

Schizophyllan khi ở trạng thái xoắn ba (tương ứng với Mw > 9104) thì hoạt tính tốt nhất, khi ở cấu trúc xoắn đơn thì hoạt tính giảm và mất hoạt tính hoàn toàn khi không còn trạng thái xoắn (Mw < 5103) (Yanaki & cs., 1983)

Cơ chế tác dụng của β-glucan lên hệ miễn dịch

Các β-glucan ở nấm là chất điều hòa đáp ứng sinh học (biological response modifiers, BRM) bởi chúng không gây tổn thương và tạo stress lên cơ thể, nhưng giúp cơ thể thích nghi với môi trường và stress sinh học, và thể hiện các hoạt động không đặc hiệu lên cơ thể chủ Các β-glucan nấm hỗ trợ một vài hoặc toàn hệ thống chính của cơ thể, bao gồm cả thần kinh, dịch thể và hệ miễn dịch cũng như chức năng

điều khiển Các glucan không trực tiếp tấn công tế bào ung thư hoặc tế bào lạ trực tiếp, mà chúng kích thích các đáp ứng miễn dịch trong cơ thể chủ (Wasser, 2002)

Glucan gây đáp ứng miễn dịch ở động vật nhờ vào sự tương tác giữa glucan với các thụ thể màng của tế bào miễn dịch như đại thực bào (macrophage), bạch cầu trung tính (neutrophil) và tế bào giết tự nhiên (natural killer cell, NK cell) Ở động vật có 4 thụ thể đặc hiệu với β-glucan, đó là thụ thể của bổ thể (complement receptor 3, CR3), lactosylceramide, thụ thể lao công, và dectin-1 (Leung và cs, 2006)

Βeta-glucan gây đáp ứng cả hệ thống miễn dịch bẩm sinh (innate immunity) và miễn dịch thích nghi (adaptive immunity), giúp cơ thể tiêu diệt tế bào lạ (vi sinh vật,

tế bào u, vi rut v.v ) Hệ miễn dịch bẩm sinh gồm các tế bào miễn dịch: đại thực bào,

tế bào trung tính, tế bào giết tự nhiên và tế bào hình sao (dendritic cell, DCs) Các tế bào này được điều khiển bởi cytokine (là protein tín hiệu) và bởi sự hoạt hóa viêm v.v Hệ miễn dịch thích nghi hoạt động trên kháng nguyên lạ và có liên quan tới tế bào miễn dịch B và T Tế bào B tạo kháng thể và điều khiển miễn dịch dịch thể (humoral immunity), trong khi tế bào T kích thích tính miễn dịch dựa trên tế bào (cell-mediated immunity) Tế bào hình sao DCs liên quan đến miễn dịch thích nghi, đồng thời trình diện kháng nguyên lạ đến tế bào T và gây đáp ứng miễn dịch

Hình 1.4: Hệ thống miễn dịch bẩm sinh và thích nghi ở động vật

(Volman & cs., 2008)

+ Thụ thể CR3: là glycoprotein màng, có nhiều vùng (domain) thực hiện chức năng khác nhau, trong đó vùng A là để bám và thực hiện chức năng thực bào của các phần tử đã được phủ yếu tố iC3b, còn domain lectin là vùng bám không đặc hiệu của CR3 Các tế bào bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân (monocytes) và NK cell có

nhiều thụ thể CR3, trong khi đó, đại thực bào (macrophage) xuất hiện ít hơn thụ thể CR3 Khi thụ thể này bám β-glucan, con đường iC3b được hoạt hóa và dẫn tới quá trình gây độc tế bào ung thư Tế bào miễn dịch B và T có CR3 ở mức độ ít hơn

+ Thụ thể Lactosylceramide được tìm thấy ở màng sinh chất của nhiều tế bào động vật Sự tương tác giữa β-glucan với thụ thể này dẫn đến cảm ứng tổng hợp các protein viêm của đại thực bào (macrophage inflammatory protein, MIP-2) và hoạt hóa

NFB, thúc đẩy sự oxi hóa tạo bởi bạch cầu trung tính (neutrophil) và chức năng kháng vi sinh vật Thụ thể này nằm trên mang tế bào bạch cầu trung tính và tế bào màng trong (endothelia cell)

+ Thụ thể Dectin-1 (ở người được gọi β-glucan receptor, β-GR) nhận biết các carbohyđrat có chứa liên kết β-1,3 và/hoặc β-1,6 glucosidic Dectin-1 chứa 4 thành phần với chức năng riêng Thụ thể này được tổng hợp trên màng tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, bạch cầu trung tính Tế bào hình sao (dendritic cell) và các tế bào miễn dịch T biểu hiện thụ thể Dectin-1 ở mức ít hơn Dectin-1 được cho là thụ thể quan trọng nhất, làm hoạt hóa miễn dịch bẩm sinh, hoạt hóa đại thực bào

+ Thụ thể TRL-2 (Toll like receptor 2): có mặt trên màng các tế bào tủy xương như bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào sao), tế bào màng trong, bạch cầu trung tính

Bảng 1.3: Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccarit

Viết tắt: TLR (Toll-like receptor); SR (scavenger receptor); CR3 (complement receptor type

3); MR (mannose receptor); MBL (mannan binding lectin)

Hình 1.5: Mô hình glucan hoạt hóa tế bào miễn dịch gây phá hủy tác nhân

bệnh (Leung và cs., 2006)

β-Glucan trực tiếp hoạt hóa con đường bổ thể, tế bào miễn dịch T, B và tế bào giết tự nhiên hoặc thông qua hoạt động của đại thực bào; tế bào DCs làm gián tiếp kích hoạt tế bào T, B, NK β-Glucan kích thích tế bào DCs và đại thực bào tiết các cytokine như IL-1, qua đó kích thích tế bào hỗ trợ T tiết cytokine để điều khiển hoạt động của tế bào đại thực bào, tế bào T, B và NK, tiến hành loại bỏ tác nhân gây bệnh β-Glucan bám vào các thụ thể, dẫn đến hoạt hóa đại thực bào và các tế bào thực bào khác Sự hoạt hóa bao gồm một vài quá trình tương tác giữa các tế bào, dẫn tới tăng mức hóa vận động, giải phóng các chất gây độc trong tế bào miễn dịch (degranulation), làm tăng tổng hợp các chất bám dính trên bề mặt đại thực bào v.v Hơn nữa, β-glucan kích thích hoạt hóa nội bào (ví dụ: tạo NO) Tế bào đại thực bào, bạch cầu đơn nhân, và tế bào miễn dịch khác sẽ tiết các interleukin 1 (IL-1), IL-9, IL-

8 hoặc yếu tố phá tumor (TNF-α), gây sự viêm sưng

β-Glucan có thể được sử dụng qua đường tiêm tĩnh mạch hoặc đường miệng Với đường miệng, các tế bào ở trong ruột non tương tác với β-glucan để vận chuyển tới tế bào lympho ruột non (Peyer’s patches) và dẫn tới sản xuất các cytokine Ngoài

ra, các đại thực bào trong hệ thống đường ruột sẽ dẫn β-glucan tới lá lách, tủy xương

Ở tủy xương, glucan bị cắt nhỏ bởi đại thực bào và thu nhận bởi các bạch cầu hạt (granulocyte), đi vào tuần hoàn máu để thực hiện vai trò của chúng (Novak và Vetvicka, 2009)

1.3 Nấm linh chi (Ganoderma lucidum)

Nấm Linh chi thuộc chi Ganoderma, loài đƣợc sử dụng rộng rãi nhất và cũng

đã đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là Ganoderma lucidum Ganoderma thuộc họ

Ganodermataceae, bộ Aphyllophorales, lớp phụ Hymeromycetidae, lớp Hymenomycetes, ngành phụ Basidiomycotina, ngành Eumycota, lớp Nấm (Fungi, Mycota)

1.3.1 Thành phần hoá học cơ bản của nấm Linh chi

Vào những năm 1970-1980 các nhà khoa học Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam đã có những nghiên cứu về thành phần cơ bản của nấm Linh chi Năm 1993 Bùi Chí Hiếu và cộng sự đã phân tích thành phần có trong nấm Linh chi nhƣ sau:

Bảng 1.4: Thành phần hoá học của nấm Linh chi

13C NMR), sắc ký lỏng cao áp (HPLC) người ta đã xác định được gần 100 hoạt chất

và dẫn suất có trong nấm Linh chi Điều đáng lưu ý là các nhóm chất này gặp phổ biến cả trong thể mang bào tử, trong bào tử đảm, lẫn trong hệ sợi nấm, trong cả nấm

tự nhiên lẫn nuôi trồng nhân tạo Trong nhóm hoạt chất, nổi bật lên cả là Lingzhi-8 với bản chất là protein, được các nhà khoa học Nhật Bản tìm ra và chứng minh rằng chúng là tác nhân chống dị ứng có phổ rộng và có tác dụng điều hoà miễn dịch hữu hiệu (Boh & cs 2007; Choong & cs., 2011)

1.3.2 Giá trị y dược học của nấm Linh chi

Suốt những năm 1970-1980, khả năng chống dị ứng của nấm Linh chi là hướng được nghiên cứu nhiều ở Trung Quốc và Nhật Bản Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng dịch chiết nấm linh chi có tác dụng chống lại cả 4 loại dị ứng Năm 1990, những nhà nghiên cứu ở Trung tâm nghiên cứu sức khoẻ bang Texas (Mỹ) đã phát hiện thấy nấm linh chi có thể được sử dụng hiệu quả trong điều trị chứng cứng cổ, cứng vai, viêm màng kết, viêm phế quản, thấp khớp Họ cũng đã chứng minh được chúng có tác dụng tốt đến hệ thống miễn dịch mà không gây tác dụng phụ nào

Trong những nghiên cứu gần đây trên nấm dược liệu, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng nhiều kỹ thuật phân tích hiện đại và thu được nhiều thành phần có hoạt tính sinh học khác, ví dụ như hoạt tính kháng sinh Một nghiên cứu ở Nhật Bản năm 1994

đã tìm thấy ba loại hợp chất kháng khuẩn trong nấm Linh chi có tác dụng chống lại

Streptococcus spp., Actinomyces spp., và Lactobacillus spp

Hiệu quả chống ung thư của nấm linh chi đã được biết đến từ lâu Nấm Linh chi đã được sử dụng trong điều trị bệnh nhân ung thư phổi, ung thư màng tử cung, ung thư dạ dày Các phương pháp xạ trị, hoá trị và giải phẫu đã được kết hợp với phương pháp trị liệu bằng nấm Tại Tokyo (Nhật Bản), sử dụng phương pháp kết hợp nấm linh chi với xạ trị cho kết quả tốt với bệnh nhân ung thư cổ tử cung

Linh chi được gọi là ―Tiềm lực của hệ miễn dịch‖ và nó làm gia tăng quá trình sản xuất Interleukin-1 & 2 Một báo cáo cho biết dịch chiết nấm linh chi có tác dụng hạn chế sự phát triển có hại của nhiều loại mô Một công trình nghiên cứu gần đây chỉ

ra rằng linh chi còn có nhiều tác dụng khác như: giảm đau, chống viêm, tiêu đờm, chống ho, chống oxy hoá, chống virut thông qua phản ứng kháng nguyên- kháng thể Làm giảm áp lực trong máu, đóng vai trò như một loại thuốc trợ tim bằng cách giảm lượng cholestrol Ngoài ra, nó còn có tác dụng tiêu độc và bảo vệ gan, chống ion hoá, kháng khuẩn Linh chi còn chứa canxi, sắt và photpho, các vitamin nhóm B, C, D, và axit pantothenic, nó có vai trò thiết yếu với hoạt động của tuyến thượng thận (Dharmananda, 1998; Chang, 1996)

Thành phần có khả năng kháng tế bào ung thư của Linh chi là β-D-glucan, đây

là polysaccarit liên kết với các axit amin, nó kích thích hay điều hoà hệ thống miễn dịch bằng cách hoạt hoá những tế bào như: đại thực bào, tế bào T, tăng hàm lượng glolubin miễn dịch giúp tăng đáp ứng miễn dịch đối với các tế bào lạ như vi khuẩn, vi rút, hay tế bào khối u (Kim và Kim, 1999)

Trên thế giới, có nhiều nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu về nấm Linh chi Đến nay, có tới hàng chục dẫn xuất ganoderic khác nhau đã được khám phá kèm với tác dụng dược lý của chúng (Wang & cs., 2006)

Bảng 1.6: Thành phần các chất cơ bản trong nấm Linh chi có giá trị dược học

Cyclooctasulfur Ức chế giải phóng histamine

Adenosin dẫn xuất Nucleotid Ức chế kết dính tiểu cầu, giãn cơ,

giảm đau Lingzhi-8 Protein Chống dị ứng, điều hoà miễn dịch Ganmodosterone Steroid Giải độc gan

Lanosporeric acid A Steroid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Lanosterol Steroid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

II, III, IV, V Steroid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Ganoderan A, B, C Polysaccarit Hạ đường huyết

-D-glucan Polysaccarit Chống ung thư, tăng tính miễn

dịch D-6 Polysaccarit Tăng tổng hợp protein, tăng

chuyển hoá axit nucleic Ganoderic axit R, S Triterpenoid Ức chế giải phóng histamine

Ganoderic axit Triterpenoid Ức chế ACE, hạ đường huyết

B, D, F, H, K, Y Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Ganodermadiol Triterpenoid Ức chế ACE, hạ đường huyết

Ganodermic axit M, F Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Ganodermic axit M, O Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol Lucidenol Triterpenoid Bảo vệ gan

Lucidenol A Triterpenoid Bảo vệ gan

Ganosporelacton A, B Triterpenoid Chống khối u

Oleic axit dẫn xuất Axit béo Ức chế giải phóng histamine

1.4 Nấm Hầu thủ (Hericium erinaceus)

Nấm Hầu thủ (H erinaceus) là một loại nấm quí đã được đưa vào Sách đỏ cần

được bảo vệ và bảo tồn Nấm Hầu thủ còn có tên là: đầu khỉ, đầu sư tử, đầu gấu, đầu ông già, râu thần rừng, hầu đầu cô, thích khuẩn, vị khuẩn, Yamabushitake, hay Lion’s Mane Nấm Hầu thủ thuộc chi Hericium, họ phụ Hericicoideae, lớp Hymenomycetes, ngành phụ Basidiomicotina, ngành Eumycota, giới Mycota (fungi)

1.4.1 Giá trị dinh dưỡng của nấm Hầu thủ

Các dẫn liệu kiểm tra về thành phần dinh dưỡng của nấm H erinaceus cho

thấy nấm này là một loại thực phẩm bổ dưỡng, có mức cung cấp nhiệt lượng vừa phải, cân đối về thành phần dinh dưỡng, giàu khoáng và vitamin Tuy nhiên, mỗi điều kiện nuôi cấy hay phương pháp nuôi trồng khác nhau cũng dẫn đến việc thu được các thành phần trong nấm khác nhau Kết quả so sánh sản phẩm nấm hầu thủ ở Cát Lâm (Trung Quốc) và Nagano (Nhật Bản) được thể hiện qua Bảng 1.7 (Mizuno, 1992)

Bảng 1.7: Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm H erinaceus (% nấm khô)

Hàm lượng khoáng trong nấm H erinaceus cũng khá phong phú (Fe, Ca, Na,

K,…) Các vitamin, đặc biệt B1, B2 có hàm lượng khá cao, có Niacin, ít vitamin A,

vitamin C chưa phát hiện thấy Provitamin D có hàm lượng đặc biệt cao trong nấm H

erinaceus khô ở Nhật Bản, có khả năng chuyển thành vitamin D2 khi được chiếu

sáng giúp cho hấp thụ và chuyển hóa Canxi, phòng bệnh loãng xương, yếu xương

Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể trồng ở Cát Lâm (Trung Quốc) và ở Nagano (Nhật Bản) (Mizuno và cs.,1992 được ghi lại qua Bảng 1.8

Bảng 1.8: Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm H erinaceus

1.4.2 Giá trị y dược học của nấm Hầu thủ

Ngoài giá trị về mặt dinh dưỡng, thì nấm H erinaceus có tác dụng về dược lý

như nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể, phục hồi niêm mạc dạ dày, chữa viêm loét ruột, nâng cao khả năng đề kháng với tình trạng thiếu oxi, chống mệt mỏi, chống oxi hoá, chống đột biến, làm giảm mỡ máu, xúc tiến việc tuần hoàn máu, chống lão hoá, ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư, v.v Các nghiên cứu về độc tính từ trước

đến nay cho thấy quả thể và hệ sợi nấm H erinaceus không hề có độc tính đối với

con người Theo một số tác giả, trong nấm H erinaceus có một số thành phần diterpenoit có khả năng kháng các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro, trong đó có

dòng tế bào HeLa

Trong quả thể non (YF), trong hệ sợi nấm (YM) và trong dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm hầu thủ (YE), người ta đã dùng phương pháp đặc biệt để có được các chế phẩm có tác dụng làm đổi mới tế bào lách, tăng cường sản sinh interleukine Với tác dụng làm tăng thực bào các tế bào ung thư với cơ chế hoạt hoá yếu tố gây hoại tử (INF) thì cả 3 chế phẩm YF, YM, YE đều biểu hiện hoạt tính (Mori và cs., 1999) Cũng năm 1999, Mizuno và cộng sự còn công bố trong nấm hầu thủ có một số hợp chất có khả năng xúc tiến sinh tổng hợp yếu tố tăng cường thần kinh (NGF) có khả năng điều trị bệnh lú lẫn Alzheimer như: hericinone, hericinone D, hericinone E

Các phân đoạn polysaccarit khác từ nấm H erinaceus như xylan, glucoylan,

heteroxyglucan và các phức hợp protein của chúng có các đặc tính như là các yếu tố cải biến đáp ứng sinh học (BRM), đó chính có thể là lợi ích của chúng trong liệu pháp

miễn dịch (Zhang & cs., 2007) Từ hệ sợi nấm H erinaceus sau khi lên men chìm đã

chiết bằng nước nóng (100oC), dung dịch 1% ammonium oxalate (100oC) và 5% dung dịch NaOH (30oC), theo thứ tự thu được các polysaccarit là FI, FII, FIII-1 và FIII-2 Mỗi loại polysaccarit được chia nhỏ thành các phân đoạn và sử dụng các phương pháp làm sạch trên các cột sắc ký lọc gel và sắc ký ái lực, cuối cùng thu được

15 polysaccarit Trong nghiên cứu thực nghiệm kháng ung thư, có 5 loại polysaccarit (FIo-a-α, FIo-a-β, FIo-b, FIIo-1 và FIII-2b ) có hoạt tính kháng ung thư rõ ràng (Mizuno, 1999) Ngoài ra, chúng còn có tác dụng kéo dài thời gian sống (Bảng 1.9)

Bảng 1.9: Hoạt tính kháng ung thư của các polysaccarit từ nấm H erinaceus được

thử nghiệm trên chuột

(Số lượng tế bào ung thư: 6 x 106/ chuột Sau khi tiêm 2 giờ, cho uống trong 10 ngày,

liều lượng: 10 mg/kg/ngày)

Polysaccarit

Tỷ lệ ức chế khối u (%) (Ngày thứ 28)

Tỷ lệ chữa trị hoàn toàn (Ngày thứ 28)

Tỷ lệ tăng ngày sống (Ngày thứ 61)

Tỷ lệ chết (Ngày thứ 81) Đối chứng

Dịch chiết từ hệ sợi và quả thể nấm H erinaceus còn có tác dụng chống gây đột biến rất mạnh trên 5 dòng đột biến của Salmonella typhimurium TA 98 Dịch

chiết cồn của hệ sợi hoặc quả thể tốt hơn là dịch chiết nước (p< 0,05) và dịch thể có tác dụng chống gây đột biến tốt hơn từ hệ sợi (Wang & cs., 2001) Trong y học cổ truyền Trung Quốc, sử dụng nấm sấy khô và chiết bằng nước nóng giúp tăng sức tiêu hóa và làm cho cơ thể cường tráng Vì thế, sản phẩm chiết xuất từ hệ sợi nấm và quả thể mang tên houton đã trở thành thức uống thể thao của vận động viên Trung Quốc trong Thế vận hội châu Á (1990) Guanosine monophotphat (5′ GMP) trong thành phần của nấm Hầu thủ có tác dụng đối với người cao tuổi, mắc bệnh tim mạch Ngoài

ra, GMP chiết xuất từ nấm H erinaceus đang được nghiên cứu sử dụng cho những

người bị nhược dương (Cheung, 2010)

Các nghiên cứu gần đây đã xác định nhiều loại nấm (như H erinaceus) có thể

có những chức năng sinh lý quan trọng với con người, bao gồm chống oxi hóa, điểu chỉnh hàm lượng lipít trong máu và làm giảm lượng đường glucose trong máu (Wang

& cs., 2005) Trong một nghiên cứu dùng metanol để chiết từ quả thể nấm bám trên các cột silica gel và tách rửa bằng các gradient phân cực của chloroform/ etylacetate/ axeton/ metanol, các hợp chất chính được chiết ra là D-threitol, D-arabinitol và axit

palmitic Các chiết xuất của nấm H erinaceus được cô đặc tới khi loại bỏ được các

dung môi hòa tan và thu được phần cặn (gọi là HEM), có thể đưa vào sử dụng trong các chế độ ăn kiêng Hiệu quả của việc điều trị bằng HEM để nghiên cứu bệnh đái đường trên chuột đã được ghi nhận như sau: những con chuột bị đái đường và không được cho ăn HEM thì khát nhiều hơn những con chuột cũng bị bệnh như vậy nhưng được nuôi bằng HEM Những con chuột được cho ăn HEM có tỉ lệ đường glucose trong máu thấp hơn đáng kể so với những con chuột không được cho ăn HEM Hiệu quả làm giảm lượng đường trong máu và tổng cholesterol là đáng kể đối với những con chuột được ăn HEM hàng ngày ở liều lượng trong khoảng 100mg/ kg tới 200mg/

kg trọng lượng cơ thể Ngoài ra, nấm hầu thủ còn biểu hiện hoạt tính kháng nhiễm trùng với hoạt phổ rộng (Wang & cs., 2005; Kawagishi & cs., 1994)

Nấm Hầu thủ khá phong phú về nguồn khoáng chất, đặc biệt có cả Ge (germanium), một kim loại cực hiếm có hoạt tính chống ung thư Thành phần amino axit cũng có giá trị cân đối về dinh dưỡng, đáng chú ý là hàm lượng glutamic và tryptophan rất cao (Mizuno, 1999)

1.5 Nuôi trồng nấm bằng phương pháp lên men dịch thể

Hướng nghiên cứu lên men dịch thể để tách chiết polysaccarit từ nấm được bắt đầu từ những năm 1950 ở Mỹ, ở Nhật năm 1977, ở Trung Quốc bắt đầu từ năm 1958

Từ những năm 1960, nuôi trồng bằng lên men dịch thể đã trở thành hướng sản xuất

công nghiệp nấm dược liệu các nấm nổi tiếng như Linh chi, Hầu thủ Những năm

1990, do sự phát hiện ra hoạt tính kháng u và tăng cường miễn dịch của các polysaccarit từ nấm, ngành công nghiệp lên men thu nhận polysaccarit đã phát triển không những ở Trung Quốc mà còn ở nhiều Hàn Quốc hiện nay cũng là nước có sản lượng nấm từ công nghệ lên men rất phát triển, sau đó đến Nga, Ba Lan, Cộng hoà Séc, Hungary… Có thể nói đây là ngành công nghiệp mới mang lại nhiều hứa hẹn cho kinh tế thế giới trong hiện tại và tương lai (Hobbs, 2002; Elisashvili, 2012)

Lợi thế của lên men dịch thể nấm để thu nhận sản phẩm là: chu kì quay vòng nhanh, có thể sản xuất lượng lớn sản phẩm có chất lượng ổn định, tiết kiệm diện tích

và nhân lực, phù hợp với các cơ sở sản xuất hiện đại, có qui mô ứng dụng lớn từ công nghiệp thực phẩm cho đến ứng dụng trong công nghệ sinh y dược và mỹ phẩm Sản xuất thực phẩm chức năng từ nấm lên men dịch thể mang lại ích lợi về kinh tế và cải thiện sức khỏe con người Trong xu thế nghiên cứu lên men có định hướng tạo sản phẩm polysaccarit có chất lượng cao hơn, phải kể đến các nghiên cứu của Malinowska và cộng sự (2009) khi bổ sung các thành phần vi lượng vào môi trường lên men nấm Hầu thủ có định hướng như selenium, tạo ra được các polysaccarit ngoại bào chứa selen có hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn nhiều lần so với lên men thông thường, tạo ra nguyên liệu cho sản phẩm thực phẩm chức năng có tiềm năng chống ôxy hóa Nghiên cứu nuôi trồng lên men nấm Hầu thủ khi bổ sung các cơ chất khác nhau của các tác Malinowska và cộng sự (2009) cho thấy sử dụng các cơ chất khác nhau sẽ cho các sản phẩm có tỷ lệ khác nhau Chẳng hạn, cơ chất đường mật sẽ cho hàm lượng polysaccarit cao hơn, trong khi nước chiết ngô sẽ thu nhận được nhiều các chất phân tử nhỏ có hoạt tính Trong một trường hợp khác, việc thay đổi thành phần các đường cơ chất trong môi trường nuôi trồng nấm có thể tạo ra các sản phẩm polysaccarit nội và ngoại bào có hàm lượng và hoạt tính sinh học cao hơn hẳn so với nhóm đối chứng (Zhong & Tang, 2004) Tiếp theo quá trình lên men, cần có qui trình tách chiết, phân cắt và thu hoạch các sản phẩm polysaccarit hiệu quả, triệt để nhất Một số tác giả khác đã sử dụng sóng siêu cao tần kết hợp với các enzyme trong phân cắt, chế biến ra các polysaccarit từ dịch lên men nhằm thu hoạch triệt để cũng như tạo

ra được các sản phẩm có khả năng ứng dụng cao hơn để sản xuất thực phẩm chức năng từ nấm Hầu thủ (Zhu & cs., 2014)

Tương tự như đối với nấm Hầu thủ, nếu sử dụng các phương pháp nuôi trồng truyền thống nấm Linh chi, thường thì thời gian nuôi trồng phải kéo dài hàng từ vài tháng đến 1 năm Tuy nhiên, nếu sử dụng qui trình lên men dịch thể thì có thể làm giảm thời gian nuôi trồng và làm tăng hiệu quả thu nhận chất có hoạt tính, thậm chí có thể định hướng chất có hoạt tính Ngoài ra, cơ chất cho quá trình lên men cũng

đóng vai trò quan trọng trong việc tích lũy các chất có hoạt tính Trong trường hợp lên men dịch thể thu nhận axit protocatechuic, các tác giả nhận thấy cơ chất vỏ đậu đen hay sản phẩm từ các cây họ đậu nói chung đều là cơ chất làm tiền chất thích hợp cho quá trình lên men dịch thể tích lũy các chất có hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi (Chen & cs., 2009) Kết quả tương tự đã được công bố bởi Chien và cs (2011) về khả năng bảo vệ gan của các thành phần thu được trong dịch lên men của nấm Linh chi khi sử dụng cơ chất đậu đen làm cơ chất chính chỉ sau 11 ngày lên men dịch thể trong bình lên men 5 lít

Song hành với việc thu nhận được triệt để và hiệu quả nhất các sản phẩm của quá trình nuôi trồng, phải có việc đánh giá hoạt tính của sản phẩm để điều chỉnh quá trình tổng hợp tự nhiên có định hướng nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị phục vụ hỗ

trợ điều trị ung thư cũng như các bệnh khác